人參糖蛋白在治療老年癡呆的藥物和保健食品中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)藥和保健食品開發(fā)【技術(shù)領(lǐng)域】，提供了一種人參水提物經(jīng)大孔吸附樹脂、中空纖維柱超濾分離、透析等技術(shù)，從傳統(tǒng)中藥人參中提取分離得到人參糖蛋白的方法，該糖蛋白中總糖含量為30%左右，酸性糖含量在5%左右，蛋白質(zhì)含量在60%以上，重均分子量(Mw)分布在1.6×104左右，蛋白質(zhì)部分由17種氨基酸組成，并通過藥效學(xué)試驗證明了人參糖蛋白具有治療老年癡呆的作用。
【專利說明】人參糖蛋白在治療老年癡呆的藥物和保健食品中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種從人參中提取分離得到的人參糖蛋白在治療老年癡呆藥物和保健食品中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]人參為五加科植物人參(Panax ginseng C.A.Meyer)的干燥根及根莖。為名貴藥材，具有獨特的藥用價值和醫(yī)療保健作用，一直深受人們的重視。多年的研究結(jié)果表明，人參具有調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、提高學(xué)習(xí)記憶能力的作用，但在公開發(fā)表的文獻中表明，人參皂苷類成分具有提高學(xué)習(xí)記憶能力。
[0003]至今，有關(guān)人參糖蛋白的研究報道甚少。經(jīng)文獻檢索，僅查到張彬等報道的人參糖蛋白的分離純化及其性質(zhì)研究(藥物分析雜志2006，(26) 2,272-276頁)，該文獻報道的人參糖蛋白的制備是將人參粗多糖提取物先經(jīng)Hiprep2660Sephacryl S200柱層析分離純化得到第一個組分峰I，再經(jīng)過HitrapQTM26/60柱層析梯度洗脫純化得到組分Pl，經(jīng)HPGPC檢測，該組分P1為一峰形對稱的蛋白質(zhì)-糖組分，重均分子量(Mw)分布在2.4KDa左右，該組分兌水透析，冷凍干燥，即為人參糖蛋白。張彬報道的人參糖蛋白僅是人參糖蛋白其中的一個片段(分子量在2.4KDa左右)，并對該片段的理化性質(zhì)進行了研究。而本權(quán)利要求書I所制得的人參糖蛋白重均分子量(Mw)分布在1.6KDa左右，所以，本權(quán) 利要求書I與張彬報道的人參糖蛋白有其本質(zhì)差異。
[0004]經(jīng)文獻檢索，有關(guān)人參糖蛋白生物活性方面報道很多，主要在鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗腫瘤、增強免疫的活性研究，至今尚未檢索到有關(guān)人參糖蛋白具有治療老年癡呆的活性報道。
[0005]近年來，國外對肽類作為增強學(xué)習(xí)和記憶能力活性成分的研究有一定的進展。2010 年 Matharu B.等人(Peptides, 2010，31,1866-1872 頁)發(fā)現(xiàn)一種妝(retro-1nverspeptides)可作為治療由β -淀粉樣蛋白引起的老年癡呆的藥物。Gozes 1.等人(Neurobiology of Aging, 2000，21,169頁)選用一種具有神經(jīng)保護作用的肽的片段(NAP)，通過鼻內(nèi)途徑給藥的方式治療AD。結(jié)果顯示，用膽堿能阻斷劑ethylcholineaziridium(AF64A)處理過的小鼠，經(jīng)鼻吸入NAP,可顯著提高空間學(xué)習(xí)記憶(水迷宮)能力。實驗結(jié)果還表明，該物質(zhì)可通過血腦屏障。體外實驗結(jié)果表明，NAP增加cGMP和一氧化氮產(chǎn)物的同時具有抗氧化作用。其結(jié)果表明，NAP可以作為治療阿爾茨海默病藥物開發(fā)的先導(dǎo)化合物。Snow A.D.等人(Alzheimer，s and Dementia, 2008, 4(4),463-464頁)在轉(zhuǎn)基因鼠模型中發(fā)現(xiàn)一種新型可改善阿爾茨海默病情的小肽(DP-74)，這種肽具有可穿過血腦屏障降低腦淀粉樣蛋白沉積以及增強APP轉(zhuǎn)基因小鼠記憶的作用，揭示了新型小肽對AD和其相關(guān)異常疾病的治療與預(yù)防方面的發(fā)展提供了新的希望。Kita Y.等人(Neuropeptides, 2006, 40 (6)，434頁)發(fā)現(xiàn)一種新型的神經(jīng)保護性肽Colivelin,它可保護神經(jīng)免受AD相關(guān)損傷及Aβ引起的死亡。Windisch Μ.等人(Alzheimer’s andDementia, 2006，2 (3)，643頁)研究發(fā)現(xiàn)，β -突觸核蛋白衍生的小肽在慢性的和急性的神經(jīng)退行性病變的組織培養(yǎng)中表現(xiàn)出顯著地神經(jīng)保護作用。此小肽同樣在AD的動物模型中進行了研究，包括對認知功能的影響和同樣的減少淀粉樣蛋白的相關(guān)病理學(xué)改變，結(jié)果顯示突觸核蛋白衍生肽可能成為不同神經(jīng)退行性病變有效治療策略發(fā)展的基礎(chǔ)。上述研究結(jié)果為我們下一步對人參中肽對治療AD的活性研究提供了依據(jù)。
[0006]國內(nèi)外對糖肽作為可增強學(xué)習(xí)記和憶能力的活性成分研究的報道極少，2004年李佐剛(生物技術(shù)，2004，14 (34)，34-36頁)等人，對薄芝糖肽注射液進行了藥理學(xué)的系統(tǒng)研究，結(jié)果表明，薄芝糖肽注射液能減少小鼠的自發(fā)活動性，加強利血平、氯丙嗪的中樞鎮(zhèn)靜作用，拮抗苯丙胺的中樞興奮作用，延長戊巴比妥鈉睡眠時間，能增強小鼠記憶力，加強小鼠抗缺氧能力。以上研究結(jié)論為我們研究人參糖蛋白治療老年癡呆提供了科學(xué)依據(jù)。
[0007]本發(fā)明所得到的人參糖蛋白其重均分子量(Mw)分布在1.6KDa左右，其中人參糖蛋白中的總糖含量為30%左右，酸性糖含量為5%左右，蛋白質(zhì)含量在60%以上。通過藥效學(xué)實驗數(shù)據(jù)證明了人參糖蛋白具有改善老年癡呆的作用。在本發(fā)明之前，尚未見有關(guān)人參糖蛋白治療老年癡呆方面的研究報道。因此，本發(fā)明權(quán)利要求所保護的內(nèi)容具有創(chuàng)新性和新穎性，為今后以人參為原料開發(fā)新藥、保健食品或食品拓寬了開發(fā)空間。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的之一是從人參中提取分離出糖蛋白類化合物，即人參糖蛋白。
[0009]取人參5kg，粉碎成粗粉，加15倍量的水，煎煮2次，每次3小時，濾過，合并濾液，濾液濃縮至5升，通過已處理好的DlOl大孔吸附樹脂，20升水洗脫，水洗脫液通過截留分子量為30kD的中空纖維柱進行超濾，超濾液濃縮后再進行透析(采用截留分子量IOkD的透析袋)，透析內(nèi)液按常規(guī)工藝凍干，得到人參糖蛋白。
[0010](I)理化性質(zhì)結(jié)果
[0011]總糖含量的測定采.用苯酚-硫酸法，葡萄糖作為對照品，制作標準曲線，結(jié)果表明，人參糖蛋白中的總糖含量在28%。
[0012]酸性糖含量的測定采用間-羥基聯(lián)苯法，半乳糖醛酸作為對照品，制作標準曲線，結(jié)果表明，人參糖蛋白中的酸性糖含量為4%，
[0013]蛋白質(zhì)含量的測定采用Lowry法，牛血清蛋白作為對照品，制作標準曲線，結(jié)果表明，人參糖蛋白中的蛋白含量在68%。
[0014](2)分子量分布采用HPLC，示差檢測器，美國賽芬柱SRTSEC-100 (截留分子量100-100000),以色氨酸(分子量為204.23)、蛋白酶抑制劑(分子量為6512)、Vb12 (分子量為1355)、細胞色素C(分子量為12327)、牛血清白蛋白(分子量為66200)作為對照品，制作標準曲線，GPC軟件計算結(jié)果表明，人參糖蛋白重均分子量(Mw)分布在1.6KDa左右。
[0015]Ln (Mn) =Βο+Β1 X T+B2 X T2+B3 X T3
[0016]Bo=6.421077, Bl=-0.1460711, B2=0, B3=0
[0017]R2=0.996563
[0018](3)組成糖分析采用PMP-柱前衍生化法，將人參糖蛋白中糖部分制備成衍生物，以各單糖的衍生物作為對照品，HPLC結(jié)果表明，人參糖蛋白中糖部分主要為葡萄糖組成，此外還含有甘露糖、鼠李糖、巖藻糖、半乳糖醛酸、N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰半乳糖胺。
[0019](4)氨基酸分析，采用HPLC，將人參糖蛋白用6mol/L鹽酸水解20小時，以20種氨基酸作為對照品，分別制作標準曲線，結(jié)果表明，人參糖蛋白由天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、組氨酸、甘氨酸、精氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、丙氨酸、纈氨酸、半胱氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、酪氨酸、蛋氨酸17種氨基酸組成。
[0020]本發(fā)明的目的之二是根據(jù)中醫(yī)藥理論與治療經(jīng)驗，結(jié)合現(xiàn)代藥理學(xué)研究手段，表明人參糖蛋白可用作制備預(yù)防與治療老年癡呆藥物與保健食品。
[0021 ] 本發(fā)明對人參糖蛋白進行了治療老年癡呆的藥效學(xué)評價試驗。
[0022]1、實驗?zāi)康?
[0023]評價人參糖蛋白對老年癡呆的治療作用。
[0024]2、實驗方法:
[0025]取Wistar大鼠30只，雄性，體重400±50g，隨機分為三組:正常組、模型組與人參糖蛋白組，正常組腹腔注射生理鹽水80mg/kg。
[0026]2.1A β 25-35腦內(nèi)注射造成老年癡呆模型
·[0027]Wistar大鼠采用戊巴比妥鈉40mg/kg腹腔注射麻醉后，將大鼠置于立體定位儀上，固定頭部，剃去大鼠頭頂部的毛，常規(guī)消毒，剪開頭皮，暴露頂骨，參照大鼠腦立體定位圖譜，在頂骨上鉆兩個小孔。海馬CAl區(qū)的具體定位是:以前囟為零點，中線兩側(cè)由后向前距前囟點(AP) 3.0謹，兩側(cè)距中線(ML) ±2.0謹，硬膜下(DV) 2.8謹。即于前囟后3.0謹，中線右側(cè)旁開2mm，為穿刺點，用牙科鉆鉆開顱骨，用微量注射器刺破硬膜，垂直進針達硬膜下2.8_，即為海馬CAl區(qū)。用微量注射器向海馬CAl區(qū)內(nèi)緩慢注射Αβ 25-35，雙側(cè)海馬各5μ I (2 μ g/μ I )，每側(cè)海馬的注射時間5min，留針5min，防液體外溢，拔出，縫合切口。假手術(shù)組，經(jīng)所有手術(shù)步驟，只是用生理鹽水替換A β 25-35。術(shù)后肌肉注射青霉素，連續(xù)三天，防止感染。
[0028]2.2給藥與測定
[0029]第4天開始，模型組腹腔注射生理鹽水80mg/kg，人參糖蛋白組腹腔注射人參糖蛋白 80mg/kg。
[0030]給藥30 天后用 Morris 水迷宮(the Morris water maze task)評測 Wistar 大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，持續(xù)4天。將大鼠面向池壁放入水中，大鼠自由游泳最長時限120s后，置于水下隱藏的平臺上休息10s，使其認知水池中的水下平臺為逃生點。在試驗間期置于籠中。入水點的選擇:假想通過水池中心的互相垂直的兩條直線把水池分為4個象限，水下平臺位于其中一個象限的中心。兩個象限之間的線與水池壁的交點作為大鼠訓(xùn)練時的入水點。每一只大鼠每天的訓(xùn)練中每次占用4個不同的入水點，4個入水點選擇的前后順序是隨機的。大鼠被從入水點放入水中后，在水中為逃避溺死尋找逃生點，發(fā)現(xiàn)水下平臺后會爬上水下平臺休息。記錄每次試驗中大鼠從入水點到發(fā)現(xiàn)并爬上水下平臺的時間，為逃避潛伏期(the escape latency, EL)。大鼠120s內(nèi)未能發(fā)現(xiàn)平臺，就將其置于平臺上10s,此時的EL記為120s。一只大鼠一天4個象限的EL的平均值就是平均逃避潛伏期(the averageescape latency, AEL)。AEL的長短反映了大鼠對水下平臺的學(xué)習(xí)記憶能力。AEL越短說明大鼠對入水點到水下平臺的路徑學(xué)習(xí)認知的越快，對水下平臺的空間位置的記憶越強。
[0031]空間探索試驗在定位航行試驗的最后一次訓(xùn)練后進行。經(jīng)過4天的訓(xùn)練，此時所有大鼠對水下平臺的空間位置均產(chǎn)生一定的認知和記憶。試驗是把水下平臺移走，仍從4個不同的入水點將大鼠面向池壁放入水中，每只大鼠自由游泳120s，記錄其通過原水下平臺位置的次數(shù)，即跨平臺次數(shù)。大鼠的跨平臺次數(shù)越多，說明大鼠對原水下平臺位置的空間記憶越強。
[0032]3、實驗結(jié)果
[0033]人參糖蛋白能明顯縮短平均逃避潛伏期(見表1)，且第八天能恢復(fù)到正常大鼠水平(P < 0.01)。在120s內(nèi)，大鼠尋找平臺所游的路程和時間成正比，根據(jù)軌跡顯示(如圖1所示)，其結(jié)果與平均逃避潛伏期一致，路程越短說明對平臺的記憶能力越強。而第九天的空間探索試驗結(jié)果(見表2)進一步證明人參糖蛋白具有改善大鼠老年癡呆作用，且能恢復(fù)到正常大鼠水平。
[0034]表1.大鼠水迷宮實驗平均逃避潛伏期測定結(jié)果土S )
[0035]
【權(quán)利要求】
1.一種人參糖蛋白，其特征在于:總糖含量為30%左右，酸性糖含量在5%左右，蛋白質(zhì)含量在60%以上；重均分子量Mw分布在1.6 X IO4左右；糖部分主要由葡萄糖組成，此外還含有甘露糖、鼠李糖、巖藻糖、半乳糖醛酸、N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰半乳糖胺；蛋白部分由天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、組氨酸、甘氨酸、精氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、丙氨酸、纈氨酸、半胱氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、酪氨酸、蛋氨酸17種氨基酸組成。
2.權(quán)利要求1 中所述的人參糖蛋白在制備治療老年癡呆的藥物和保健食品中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61P25/28GK103435692SQ201310385625
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年8月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月30日
【發(fā)明者】姜瑞芝, 王穎, 陳英紅, 洪鐵, 羅浩銘 申請人:姜瑞芝