一種組織工程細(xì)胞培養(yǎng)支架的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種組織工程細(xì)胞培養(yǎng)支架的制備方法，以金屬纖維為原料，對其進(jìn)行預(yù)處理，將預(yù)處理后的纖維或結(jié)構(gòu)體壓制成型得到細(xì)胞培養(yǎng)支架的預(yù)制體。接著對預(yù)制體進(jìn)行清洗和真空干燥處理。隨后，將預(yù)制體放入圓片式加壓裝置中在真空或氬氣保護(hù)下燒結(jié)，得到組織工程細(xì)胞培養(yǎng)支架。本發(fā)明制備的組織工程細(xì)胞培養(yǎng)支架具有較好的生物相容性，優(yōu)良的力學(xué)性能，連通的孔結(jié)構(gòu)和較高的孔隙率，有利于進(jìn)行細(xì)胞的三維培養(yǎng)和組織工程的體內(nèi)植入。
【專利說明】一種組織工程細(xì)胞培養(yǎng)支架的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種組織工程細(xì)胞培養(yǎng)支架。
【背景技術(shù)】
[0002]組織工程細(xì)胞培養(yǎng)支架是一種三維多孔開放式網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)框架，它能引導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行粘附、生長、增殖和分化等活動，使之最終形成所需的三維組織或器官。組織工程細(xì)胞培養(yǎng)支架起到模擬細(xì)胞外基質(zhì)的作用，它不但為細(xì)胞的生長提供三維空間和代謝場所，而且影響細(xì)胞的生物學(xué)行為和培養(yǎng)效率，同時決定著植入后能否與機(jī)體很好的適應(yīng)和結(jié)合，進(jìn)而影響整個組織修復(fù)的效果。因此，組織工程細(xì)胞培養(yǎng)支架的制備是組織工程研究中最為關(guān)鍵的環(huán)節(jié)之一。
[0003]目前，使用高分子材料和生物活性陶瓷材料制備的組織工程細(xì)胞培養(yǎng)支架已經(jīng)用于韌帶、肌腱、皮膚、血管、人工臟器、骨和牙齒等人體軟、硬組織及器官的修復(fù)。從當(dāng)前的研究成果來看，這些材料制備的組織工程細(xì)胞培養(yǎng)支架還存在一些亟待解決的問題，如高分子材料很難達(dá)到力學(xué)性能與生物相容性的統(tǒng)一。生物活性陶瓷模量高脆性大且制備的細(xì)胞培養(yǎng)支架的孔徑分布、孔隙形狀和孔隙率等·難以控制，這都限制了其在硬組織工程中的應(yīng)用。
[0004]使用金屬材料制備的組織工程細(xì)胞培養(yǎng)支架具有優(yōu)良的力學(xué)性能，其不但可以進(jìn)行細(xì)胞的體外三維培養(yǎng)，還可以植入體內(nèi)用于骨、關(guān)節(jié)和牙齒等硬組織損傷的修復(fù)。目前，使用金屬材料制備組織工程細(xì)胞培養(yǎng)支架的方法有:(1)粉末冶金法，是將金屬粉末與造孔劑等發(fā)泡粉末按比例混合后，通過加壓成型，燒結(jié)等手段制備而成。該方法的優(yōu)點(diǎn)是結(jié)構(gòu)組織均勻，孔徑在一定范圍內(nèi)可調(diào)，缺點(diǎn)是孔隙率不高且工藝復(fù)雜、步驟繁瑣。(2)氣體發(fā)泡法，是在液態(tài)金屬中吹入氣體，冷卻后形成多孔金屬。此方法的優(yōu)點(diǎn)是制備工藝簡單，缺點(diǎn)是多孔金屬結(jié)構(gòu)組織的均勻性和孔隙率難以控制。(3)固-氣相共晶凝固法，在金屬凝固時氣體作為共晶相中的一部分析出形成泡沫狀多孔金屬。(4)金屬電沉積法，是以有機(jī)高分子發(fā)泡材料為骨架，進(jìn)行電沉積后除去骨架形成多孔金屬。此類材料孔徑分布均勻，孔隙連通率高但強(qiáng)度受一定影響，且厚度受到工藝的限制。
[0005]對現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，Yuejun Chen等人在《Journal of MaterialsScience !Materials in Medicine》(材料科學(xué)雜志-醫(yī)學(xué)材料)期刊2011年22卷839-844頁中報道了“Preparation and characterization of a novel porous titanium scaffoldwith 3D hierarchical porous structures”(具有三維分層多孔結(jié)構(gòu)的新型多孔鈦支架的制備及其性能表征)，該文中采用粉末冶金法制備多孔鈦支架，具體方法是:首先將純鈦粉、粘合劑、分散劑和發(fā)泡劑混合，充分?jǐn)嚢栊纬蓾{料；其次，將漿料注入模具中，待其干燥后進(jìn)行真空燒結(jié)；最后，對燒結(jié)后的樣品進(jìn)行酸-堿處理。這種方法工藝過程復(fù)雜，成本較高，且制備出的多孔鈦支架的孔徑分布不均勻，孔隙率難以得到較大提高。
[0006]綜上所述，使用傳統(tǒng)的制備多孔金屬的方法來制備組織工程細(xì)胞培養(yǎng)支架，其難以達(dá)到優(yōu)良的力學(xué)性能、均勻的孔徑分布和連通性好的孔隙結(jié)構(gòu)三者相統(tǒng)一，同時這些方法還存在制造工藝明顯不足和生產(chǎn)成本較高等缺點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種金屬纖維基組織工程細(xì)胞培養(yǎng)支架的制備方法，此類細(xì)胞培養(yǎng)支架具有優(yōu)良的生物相容性、較高的孔隙率、可控的孔徑尺寸和優(yōu)良的力學(xué)性能，且制造工藝簡單，生產(chǎn)效率高，成本低。
[0008]本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案包括以下步驟:
[0009]1.采用金屬纖維為原料，對其進(jìn)行預(yù)處理，將預(yù)處理后的金屬纖維壓制成型得到細(xì)胞培養(yǎng)支架預(yù)制體；
[0010]2.將細(xì)胞培養(yǎng)支架預(yù)制體依次放入5_10%W/V的草酸水溶液、丙酮、無水乙醇和去離子水中超聲清洗10-30min ;然后將細(xì)胞培養(yǎng)支架預(yù)制體放入真空干燥箱中，在60_80°C下恒溫保持l_4h ；
[0011]3.再將細(xì)胞培養(yǎng)支架預(yù)制體放入圓片式加壓裝置中，通過調(diào)整螺母擰緊壓片使預(yù)制體厚度與壓制成型后的厚度一致，然后將中間夾有細(xì)胞培養(yǎng)支架預(yù)制體的圓片式加壓裝置放入真空燒結(jié)爐內(nèi)，真空或氬氣保護(hù)下燒結(jié)，隨爐冷卻至室溫；
[0012]所述金屬纖維為不銹鋼、鈦或鈦合金纖維；不銹鋼纖維直徑為6-500 μ m，鈦或鈦合金纖維直徑為50-500 μ m ;其中直徑為6_20 μ m的金屬纖維每500-3000根為一金屬纖維束進(jìn)行使用；
[0013]所述的預(yù)處理包括以下內(nèi)容:
[0014]對于直徑為6-20 μ m的金屬纖維，將金屬纖維束剪切成長度相等的短纖維束，其長度為10-80mm，由梳理機(jī)分散后成為單纖維，隨機(jī)填充于圓桶形模具中；
[0015]對于直徑為20-100μηι的金屬纖維,可米用以下三種方法中的任一方法:
[0016]①將金屬纖維剪切成長度相等的短纖維，其長度為3_15mm，將短纖維隨機(jī)填充于圓桶形模具中；
[0017]②將50-200根金屬纖維集成一束，將此金屬纖維束彎折成長度相等的Z字型纖維束后剪切，每一束Z字型纖維束長度為9-45mm，Z字型的三段長度相等；將Z字型纖維束分散成單根纖維后隨機(jī)放入圓錐形容器中堆積成為結(jié)構(gòu)體，然后將此結(jié)構(gòu)體填充于圓桶形模具中；
[0018]③將50-200根金屬纖維集成一束，將此金屬纖維束彎折成長度相等的V字型后剪切，每一束V字型纖維束長度為6-30mm，V字型的兩段長度相等；將V字型纖維束分散成單根纖維后隨機(jī)放入圓錐形容器中堆積成為結(jié)構(gòu)體，然后將此結(jié)構(gòu)體填充于圓桶形模具中；
[0019]對于直徑為100-500μηι的金屬纖維,可米用以下四種方法中的任一方法:
[0020]①將金屬纖維剪切成長度相等的短纖維，其長度為3_15mm，將短纖維隨機(jī)填充于圓桶形模具中；
[0021]②將金屬纖維彎折成長度相等的Z字型纖維后剪切，Z字型纖維束長度為9_45mm，Z字型的三段長度相等；將Z字型纖維隨機(jī)放入圓錐形容器中堆積成為結(jié)構(gòu)體，然后將此結(jié)構(gòu)體填充于圓桶形模具中；
[0022]③將金屬纖維彎折成長度相等的V字型纖維后剪切，V字型纖維束長度為6_30mm，V字型的兩段長度相等；將V字型纖維隨機(jī)放入圓錐形容器中堆積成為結(jié)構(gòu)體，然后將此結(jié)構(gòu)體填充于圓桶形模具中；
[0023]④將金屬纖維纏繞成彈簧狀螺旋體，彈簧狀螺旋體的線圈直徑為金屬纖維直徑的10-20倍；將彈簧狀螺旋體均勻拉開，其螺距與線圈直徑相等，然后將其剪切成長度為10-30mm的短螺旋纖維，將長度相等的短螺旋纖維隨機(jī)填充于圓桶形模具中；
[0024]所述圓片式加壓裝置包括等直徑的兩片圓形的氧化鋁陶瓷片和兩片圓形的不銹鋼壓片，不銹鋼壓片分別緊貼兩片氧化鋁陶瓷片相背的一側(cè)，細(xì)胞培養(yǎng)支架預(yù)制體夾于兩片陶瓷片之間，若干個螺栓穿過氧化鋁陶瓷片和不銹鋼壓片，使氧化鋁陶瓷片緊壓細(xì)胞培養(yǎng)支架預(yù)制體。
[0025]所述的壓制成型是使用棒狀壓頭從上方對填充于圓桶形模具中的纖維或者纖維堆積而成的結(jié)構(gòu)體進(jìn)行壓制，根據(jù)要達(dá)到的孔隙率和厚度的要求進(jìn)行壓制，壓制成型后取出，得到所需孔隙率和厚度的圓柱形的細(xì)胞培養(yǎng)支架預(yù)制體。
[0026]所述燒結(jié)的參數(shù)為:燒結(jié)溫度900-1400°C，燒結(jié)時間l_5h ;真空燒結(jié)時真空度為1.0Χ10-2-1.0XKT3Pa ;氬氣保護(hù)時爐內(nèi)氬氣壓力為0.02-0.05MPa。
[0027]本發(fā)明的有益效果是:不銹鋼、鈦和鈦合金具有良好的生物相容性，是一種較好的制備組織工程細(xì)胞培養(yǎng)支架的材料；可以通過選擇不同的金屬材料和控制細(xì)胞培養(yǎng)支架的孔隙率、孔徑尺寸和孔徑分布等參數(shù)設(shè)計制備力學(xué)性能良好的組織工程細(xì)胞培養(yǎng)支架，在相同孔隙率下這種細(xì)胞培養(yǎng)支架比粉末冶金法制備細(xì)胞培養(yǎng)支架的強(qiáng)度高出好幾倍；這種方法不使用造孔劑，無污染，制備的組織工程細(xì)胞培養(yǎng)支架孔隙率最高可達(dá)95%，孔隙為三維貫通孔結(jié)構(gòu)且連通 率> 98% ;其具有良好的透過性，滲透性比粉末冶金法制備的細(xì)胞培養(yǎng)支架高出十幾倍；這種方法制備的細(xì)胞培養(yǎng)支架具有較大的表面積，對其進(jìn)行表面修飾如沉積生物陶瓷等可以進(jìn)一步提高其生物相容性，有利于細(xì)胞在其表面的粘附和增殖。總之，這種金屬纖維基組織工程細(xì)胞培養(yǎng)支架具有較好的生物相容性，優(yōu)良的力學(xué)性能，連通的孔結(jié)構(gòu)和較高的孔隙率，有利于進(jìn)行細(xì)胞的三維培養(yǎng)和組織工程的體內(nèi)植入。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1為圓片式加壓裝置；
[0029]圖中，1-螺栓，2-耐高溫不銹鋼壓片，3-氧化鋁陶瓷片，4-細(xì)胞培養(yǎng)支架預(yù)制體，
5-氧化鋁陶瓷片，6-耐高溫不銹鋼壓片，7-螺母。
【具體實(shí)施方式】
[0030]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)一步說明，本發(fā)明包括但不僅限于下述實(shí)施例。
[0031]本發(fā)明包括以下步驟:
[0032]1.采用金屬纖維為原料，對其進(jìn)行預(yù)處理，將預(yù)處理后的纖維或結(jié)構(gòu)體壓制成型得到細(xì)胞培養(yǎng)支架的預(yù)制體。
[0033]2.將細(xì)胞培養(yǎng)支架預(yù)制體依次放入草酸水溶液(5_10%W/V)、丙酮、無水乙醇和去離子水中超聲清洗10-30min。隨后，將預(yù)制體放入真空干燥箱中，恒溫保持l_4h，真空干燥箱溫度為60-80°C。
[0034]3.將2步處理后的細(xì)胞培養(yǎng)支架預(yù)制體放入圓片式加壓裝置中，通過調(diào)整螺母擰緊壓片使預(yù)制體厚度與壓制成型后的厚度一致，然后將中間夾有預(yù)制體的圓片式加壓裝置放入真空燒結(jié)爐內(nèi)，真空或氬氣保護(hù)下燒結(jié)，隨爐冷卻至室溫。
[0035]所述金屬纖維為不銹鋼、鈦或鈦合金纖維。不銹鋼纖維直徑為6-500 μ m，鈦或鈦合金纖維直徑為50-500 μ m，其中直徑為6-20 μ m的金屬纖維以金屬纖維束的形式得到，每束纖維束由500-3000根單根金屬纖維集束而成，直徑20-500 μ m的金屬纖維為單根纖維。
[0036]所述的金屬纖維預(yù)處理方法:
[0037]對于直徑為6-20 μ m的金屬纖維，將金屬纖維束剪切成長度相等的短纖維束，其長度為10-80mm，放入小型梳理機(jī)中，短的纖維束經(jīng)梳理機(jī)分散后成為單纖維，將這些單纖維隨機(jī)填充于圓桶形模具中。
[0038]對于直徑為20-100μηι的金屬纖維,可米用以下三種方法中的任一方法:
[0039]①將金屬纖維剪切成長度相等的短纖維，其長度為3-15_，將這些短纖維隨機(jī)填充于圓桶形模具中。
[0040]②將50-200根金屬纖維集成一束，將此金屬纖維束彎折成長度相等的“Ζ”字型纖維束后剪切，“Ζ”字型纖維束長度為9-45mm，它是直的纖維束經(jīng)兩次彎折后形成的三段纖維束，每段長度相等均為3-15mm。將“Z”字型纖維束分散成單根“Z”字型纖維后隨機(jī)放入圓錐形容器中堆積成為結(jié)構(gòu)體，然后將此結(jié)構(gòu)體填充于圓桶形模具中。
[0041]③將50-200根金屬纖維集成一束，將此金屬纖維束彎折成長度相等的“V”字型后剪切，“V”字型纖維束長度為6-30_，它是直的纖維束經(jīng)一次彎折后形成的兩段纖維束，每段長度相等均為3-15mm。將“V”字型纖維束分散成“V”字型纖維后隨機(jī)放入圓錐形容器中堆積成為結(jié)構(gòu)體，然后將此結(jié)構(gòu)體填充于圓桶形模具中。
[0042]對于直徑為100-500μηι的金屬纖維,可米用以下四種方法中的任一方法:
[0043]①將金屬纖維剪切成長度相等的短纖維，其長度為3-15_，將這些短纖維隨機(jī)填充于圓桶形模具中。
[0044]②將金屬纖維彎折成長度相等的“Ζ”字型纖維后剪切，“Ζ”字型纖維長度為
9-45mm,它是直的纖維經(jīng)兩次彎折后形成的三段纖維，每段長度相等均為3_15mm。將長度相等的“Z”字型纖維隨機(jī)放入圓錐形容器中堆積成為結(jié)構(gòu)體，然后將此結(jié)構(gòu)體填充于圓桶形模具中。
[0045]③將金屬纖維彎折成長度相等的“V”字型纖維后剪切，“V”字型纖維長度為
6-30_，它是直的纖維經(jīng)一次彎折后形成的兩段纖維，每段長度相等均為3-15_。將長度相等的“V”字型纖維隨機(jī)放入圓錐形容器中堆積成為結(jié)構(gòu)體，然后將此結(jié)構(gòu)體填充于圓桶形模具中。
[0046]④將金屬纖維纏繞成彈簧狀螺旋體，彈簧狀螺旋體的線圈直徑為金屬纖維直徑的
10-20倍。將此螺旋體均勻拉開，其螺距與線圈直徑相等，然后將其剪切成長度為10-30mm的短螺旋纖維，將長度相等的短螺旋纖維隨機(jī)填充于圓桶形模具中。
[0047]所述的壓制成型是使用棒狀壓頭從上方對填充于圓桶形模具中的纖維或者纖維堆積而成的結(jié)構(gòu)體進(jìn)行壓制，根據(jù)要達(dá)到的孔隙率和厚度的要求進(jìn)行壓制，壓制成型后取出，得到所需孔隙率和厚度的圓柱形的細(xì)胞培養(yǎng)支架預(yù)制體。
[0048]所述圓片式加壓裝置如圖1所示，中間為兩片圓形氧化鋁陶瓷片，兩邊為兩片直徑與陶瓷片相等的圓形耐高溫不銹鋼壓片，三個螺栓穿過不銹鋼壓片和陶瓷片上對應(yīng)的孔，將細(xì)胞培養(yǎng)支架預(yù)制體夾入兩片陶瓷片中，擰緊螺母使不銹鋼壓片緊壓陶瓷片中夾著的預(yù)制體。
[0049]所述燒結(jié)參數(shù)為:燒結(jié)溫度900-1400°C，燒結(jié)時間l_5h。真空燒結(jié)時真空度為1.0X10_2-1.0X10_3Pa。氬氣保護(hù)時爐內(nèi)氬氣壓力為0.02-0.05MPa。
[0050]實(shí)施例1
[0051]取直徑為30 μ m的316L型不銹鋼纖維1.0g,將其剪切成長度為5mm的短纖維后隨機(jī)填充于內(nèi)徑為20mm的圓桶形模具中，使用棒狀壓頭從上方進(jìn)行壓制，按照設(shè)計孔隙率為90%和預(yù)制體厚度為4mm進(jìn)行壓制,得到厚度為4_的圓柱形的細(xì)胞培養(yǎng)支架預(yù)制體。將壓制后得到圓柱形的細(xì)胞培養(yǎng)支架預(yù)制體依次放入草酸水溶液(5%W/V)、丙酮、無水乙醇和去離子水中進(jìn)行超聲清洗，每次超聲清洗lOmin。然后，將預(yù)制體放入真空干燥箱中，溫度60°C，恒溫保持2h。接著，將預(yù)制體夾入圓片式加壓裝置中，調(diào)整螺母擰緊壓片使預(yù)制體保持4_的厚度，將中間夾有預(yù)制體的圓片式加壓裝置置于真空(真空度為1.0X 10_3Pa)條件下燒結(jié)，燒結(jié)溫度為1200°C，燒結(jié)時間為2h。燒結(jié)后，隨爐冷卻至室溫，最后得到不銹鋼纖維基組織工程細(xì)胞培養(yǎng)支架。細(xì)胞培養(yǎng)支架經(jīng)掃描電鏡觀測其孔徑為40-200 μ m，經(jīng)介質(zhì)浸泡法測得孔隙率為90.2%?？紫哆B通性良好，力學(xué)性能優(yōu)良。
[0052]實(shí)施例2
[0053]取直徑為30 μ m的316L型不銹鋼纖維1.0g,將其剪切成長度為5mm的短纖維后均勻分散填充于內(nèi)徑為20mm的圓桶形模具中，使用棒狀壓頭進(jìn)行壓制，按照設(shè)計孔隙率為80%和預(yù)制體厚度為2mm進(jìn)行壓制，得到厚度為2mm的圓柱形的細(xì)胞培養(yǎng)支架預(yù)制體。。將壓制后得到圓柱形的細(xì)胞培養(yǎng)支架預(yù)制體依次放入草酸水溶液(5%W/V)、丙酮、無水乙醇和去離子水中進(jìn)行超聲清洗，每次超聲清洗lOmin。然后，將預(yù)制體放入真空干燥箱中，溫度60°C，恒溫保持2h。接著，將預(yù)制體夾入圓片式加壓裝置中，調(diào)整螺母擰緊壓片使預(yù)制體保持2_的厚度，將中間夾有預(yù)制體的圓片式加壓裝置置于真空(真空度為1.0X 10_3Pa)條件下燒結(jié)，燒結(jié)溫度為1200°C，燒結(jié)時間為2h。燒結(jié)后，隨爐冷卻至室溫，最后得到不銹鋼纖維基組織工程細(xì)胞培養(yǎng)支架。細(xì)胞培養(yǎng)支架經(jīng)掃描電鏡觀測其孔徑為40-150 μ m,經(jīng)介質(zhì)浸泡法測得孔隙率為79.7%?？紫哆B通性良好，力學(xué)性能優(yōu)良。
[0054]實(shí)施例3
[0055]取直徑為30 μ m的316L型不銹鋼纖維1.0g,將其集成一束，彎折成總長度為15mm的“Z”字型纖維束后剪切(“Z”字型纖維束是經(jīng)兩次彎折后形成的三段纖維束，每段長度相等均為5mm)，接著將長度相等的“Z”字型纖維束分散單根“Z”字型纖維后隨機(jī)放入圓錐形容器中堆積成結(jié)構(gòu)體，然后將此結(jié)構(gòu)體填充于內(nèi)徑為20_圓桶形模具中。按照設(shè)計孔隙率為90%和預(yù)制體厚度為4_進(jìn)行壓制,得到厚度為4_的圓柱形的細(xì)胞培養(yǎng)支架預(yù)制體。將壓制后得到圓柱形的細(xì)胞培養(yǎng)支架預(yù)制體依次放入草酸水溶液(5%W/V)、丙酮、無水乙醇和去離子水中進(jìn)行超聲清洗，每次超聲清洗20min。然后，預(yù)制體放入真空干燥箱中，溫度60°C，恒溫保持2h。接著，將預(yù)制體夾入圓片式加壓裝置中，調(diào)整螺母擰緊壓片使預(yù)制體保持4_的厚度，將中間夾有預(yù)制體的圓片式加壓裝置置于真空(真空度為1.0X 10_3Pa)條件下燒結(jié)，燒結(jié)溫度為1200°C，燒結(jié)時間為2h。燒結(jié)后，隨爐冷卻至室溫，最后得到不銹鋼纖維基組織工程細(xì)胞培養(yǎng)支架。細(xì)胞培養(yǎng)支架經(jīng)掃描電鏡觀測其孔徑為50-300 μ m，經(jīng)介質(zhì)浸泡法測得孔隙率為90.1%。孔隙連通性良好，力學(xué)性能優(yōu)良。[0056]實(shí)施例4
[0057]取316L型不銹鋼纖維束(規(guī)格為2000芯，每根不銹鋼纖維直徑為6 μ m)l.0g，將其剪切成30mm的短纖維束后放入小型梳理機(jī)中，不銹鋼纖維束經(jīng)梳理機(jī)分散后成為單纖維，將這些單纖維填充于內(nèi)徑為20mm的圓桶形模具中，使用棒狀壓頭從上方進(jìn)行壓制，按照設(shè)計孔隙率為60%和預(yù)制體厚度為Imm進(jìn)行壓制,得到厚度為Imm的圓柱形的細(xì)胞培養(yǎng)支架預(yù)制體。將壓制后得到圓柱形的細(xì)胞培養(yǎng)支架預(yù)制體放入草酸水溶液(10%W/V)、丙酮、無水乙醇和去離子水中進(jìn)行超聲清洗，每次超聲清洗30min。然后，將預(yù)制體放入真空干燥箱中，溫度80°C，恒溫保持4h。接著，將預(yù)制體夾入圓片式加壓裝置中，調(diào)整螺母擰緊壓片使預(yù)制體保持1_的厚度，將中間夾有預(yù)制體的圓片式加壓裝置置于真空(真空度為1.0X 10_3Pa)條件下燒結(jié)，燒結(jié)溫度為1050°C，燒結(jié)時間為lh。燒結(jié)后，隨爐冷卻至室溫，最后得到不銹鋼纖維基組織工程細(xì)胞培養(yǎng)支架。細(xì)胞培養(yǎng)支架經(jīng)掃描電鏡觀測其孔徑為15-50 μ m，經(jīng)壓汞法測得孔隙率為59.6%?？紫哆B通性良好，力學(xué)性能優(yōu)良。
[0058]實(shí)施例5
[0059]取直徑為100 μ m的TAl型鈦纖維1.5g，將其纏繞成螺徑為2mm的彈簧狀螺旋體，均勻拉開此螺旋體，其螺距為2mm，然后將其剪切成長度為15mm的螺旋纖維，使其隨機(jī)填充于內(nèi)徑為20mm的圓桶形模具中。使用棒狀壓頭從上方進(jìn)行壓制，按照設(shè)計孔隙率為83%和預(yù)制體厚度為6mm進(jìn)行壓制，得到厚度為6mm的圓柱形的細(xì)胞培養(yǎng)支架預(yù)制體。將壓制后得到圓柱形的細(xì)胞培養(yǎng)支架預(yù)制體依次放入草酸水溶液(10%W/V)、丙酮、無水乙醇和去離子水中進(jìn)行超聲清洗，每次超聲清洗30min。然后，將預(yù)制體放入真空干燥箱中，溫度60°C，恒溫保持lh。接著，將預(yù)制體夾入圓片式加壓裝置中，調(diào)整螺母擰緊壓片使預(yù)制體保持6_的厚度，將中間夾有預(yù)制體的圓片式加壓裝置置于氬氣氣氛下燒結(jié)，燒結(jié)溫度為1400°C，燒結(jié)時間為4h。燒結(jié)后，隨爐冷卻至室溫，最后得到鈦纖維基組織工程細(xì)胞培養(yǎng)支架。細(xì)胞培養(yǎng)支架經(jīng)掃描電鏡觀測其孔徑為200-800 μ m，經(jīng)介質(zhì)浸泡法測得孔隙率為83.2%，孔隙連通性良好，力學(xué)性能優(yōu)良。
[0060]實(shí)施例6
[0061]取直徑為30μπι的316L型不銹鋼纖維2.0g，將其集成一束，彎折成總長度為16mm的“V”字型纖維束后剪切(“V”字型纖維束是經(jīng)一次彎折后形成的兩段纖維束，每段長度相等均為8mm)，接著將長度相等的“V”字型纖維束分散成單根“V”字型纖維后隨機(jī)放入圓錐形容器中堆積成結(jié)構(gòu)體，然后將此結(jié)構(gòu)體填充于內(nèi)徑為30_圓桶形模具中。使用棒狀壓頭從上方進(jìn)行壓制，按照設(shè)計孔隙率為92%和預(yù)制體厚度為4mm進(jìn)行壓制，得到厚度為4mm的圓柱形的細(xì)胞培養(yǎng)支架預(yù)制體。將壓制后得到的圓柱形細(xì)胞培養(yǎng)支架預(yù)制體依次放入草酸水溶液(5%W/V)、丙酮、無水乙醇和去離子水中進(jìn)行超聲清洗，每次超聲清洗20min。然后，將預(yù)制體放入真空干燥箱中，溫度60°C，恒溫保持2h。接著，將預(yù)制體夾入圓片式加壓裝置中，調(diào)整螺栓擰緊壓板使預(yù)制體保持4_的厚度，將中間夾有預(yù)制體的圓片式加壓裝置置于真空(真空度為1.0X 10_3Pa)條件下燒結(jié)，燒結(jié)溫度為1200°C，燒結(jié)時間為2h。燒結(jié)后，隨爐冷卻至室溫。將細(xì)胞培養(yǎng)支架放入50mlIOM的NaOH溶液中浸泡，溫度60°C，時間24h。使用去離子水沖洗樣品表面，接著，放入干燥箱中，溫度60°C，恒溫保持2h。接著將NaOH溶液理過的細(xì)胞培養(yǎng)支架加熱至600°C，保溫lh，隨爐冷卻。將熱處理后的細(xì)胞培養(yǎng)支架放入模擬體液溶液中浸泡，后置于溫度為37°C的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，每天更換模擬體液以保證浸泡過程中離子濃度的恒定。樣品浸泡6天后取出，用去離子水沖洗表面，空氣中自然干燥得到以不銹鋼纖維為基底表面沉積有羥基磷灰石的組織工程細(xì)胞培養(yǎng)支架。經(jīng)掃描電鏡觀測其孔徑為50-300 μ m，經(jīng)能譜、X射線衍射和X射線光電子能譜檢測不銹鋼纖維表面覆蓋有羥基磷灰石，經(jīng)介質(zhì)浸泡法測得孔隙率為91.7%。孔隙連通性良好，力學(xué)性能優(yōu)良。
[0062]實(shí)施例7
[0063]取直徑為30 μ m的316L型不銹鋼纖維2.0g,將其集成一束，彎折成長度為15mm的“Z”字型纖維束后剪切(“Z”字型纖維束是經(jīng)兩次彎折后形成的三段纖維束，每段長度相等均為5mm)，接著將長度相等的“Z”字型纖維束分散成單根“Z”字型纖維后隨機(jī)放入圓錐形容器中堆積成結(jié)構(gòu)體，然后將此結(jié)構(gòu)體填充于內(nèi)徑為30_圓桶形模具中。使用棒狀壓頭從上方施加壓力進(jìn)行壓制，按照設(shè)計孔隙率為92%和預(yù)制體厚度為4mm進(jìn)行壓制，得到厚度為4mm的圓柱形的細(xì)胞培養(yǎng)支架預(yù)制體。將壓制后得到的圓柱形細(xì)胞培養(yǎng)支架預(yù)制體依次放入草酸水溶液(5%W/V)、丙酮、無水乙醇和去離子水中進(jìn)行超聲清洗，每次超聲清洗20min。然后，將預(yù)制體放入真空干燥箱中，溫度60°C，恒溫保持2h。接著，將預(yù)制體夾入圓片式加壓裝置中，調(diào)整螺栓擰緊壓板使預(yù)制體保持4mm的厚度，將中間夾有預(yù)制體的圓片式加壓裝置置于真空(真空度為1.0 X 10_3Pa)條件下燒結(jié)，燒結(jié)溫度為1200°C，燒結(jié)時間為2h。燒結(jié)后，隨爐冷卻至室溫。將細(xì)胞培養(yǎng)支架放入50mll0M的NaOH溶液中浸泡，溫度60°C，時間24h。使用去離子水沖洗樣品表面，接著，放入干燥箱中，溫度60°C，恒溫保持2h。隨后將NaOH溶液理過的細(xì)胞培養(yǎng)支架加熱至600°C，保溫lh，隨爐冷卻。殼聚糖溶解在1% (V/V)稀醋酸中，配制成1% (W/V)的殼聚糖溶液，25°C恒溫，攪拌lh。將經(jīng)過堿處理和熱處理的細(xì)胞培養(yǎng)支架放入殼聚糖溶液中浸泡，后置于溫度為25°C的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中,浸泡Ih后，取出細(xì)胞培養(yǎng)支架放入干燥箱中烘干，溫度60°C，恒溫保持lh。然后重新放入殼聚糖溶液中浸泡，重復(fù)上述過程10次后，得到以不銹鋼纖維為基底表面覆蓋有殼聚糖薄膜的組織工程細(xì)胞培養(yǎng)支架。經(jīng)掃描電鏡觀測其孔徑為40-270 μ m，經(jīng)能譜和傅里葉紅外光譜分析不銹鋼纖維表面覆蓋有殼聚糖薄膜，經(jīng)介質(zhì)浸泡法測得孔隙率為91.8%，孔隙連通性良好，力學(xué)性能優(yōu)良。
【權(quán)利要求】
1.一種組織工程細(xì)胞培養(yǎng)支架的制備方法，其特征在于包括以下步驟: 1)采用金屬纖維為原料，對其進(jìn)行預(yù)處理，將預(yù)處理后的金屬纖維壓制成型得到細(xì)胞培養(yǎng)支架預(yù)制體； 2)將細(xì)胞培養(yǎng)支架預(yù)制體依次放入5-10%W/V的草酸水溶液、丙酮、無水乙醇和去離子水中超聲清洗10-30min ;然后將細(xì)胞培養(yǎng)支架預(yù)制體放入真空干燥箱中，在60-80°C下恒溫保持l_4h ； 3)再將細(xì)胞培養(yǎng)支架預(yù)制體放入圓片式加壓裝置中，通過調(diào)整螺母擰緊壓片使預(yù)制體厚度與壓制成型后的厚度一致，然后將中間夾有細(xì)胞培養(yǎng)支架預(yù)制體的圓片式加壓裝置放入真空燒結(jié)爐內(nèi)，真空或氬氣保護(hù)下燒結(jié)，隨爐冷卻至室溫； 所述金屬纖維為不銹鋼、鈦或鈦合金纖維；不銹鋼纖維直徑為6-500 μ m，鈦或鈦合金纖維直徑為50-500 μ m ;其中直徑為6_20 μ m的金屬纖維每500-3000根為一金屬纖維束進(jìn)行使用； 所述的預(yù)處理包括以下內(nèi)容: 對于直徑為6-20 μ m的金屬纖維，將金屬纖維束剪切成長度相等的短纖維束，其長度為10-80mm,由梳理機(jī)分散后成為單纖維,隨機(jī)填充于圓桶形模具中； 對于直徑為20-100 μ m的金屬纖維，可采用以下三種方法中的任一方法: ①將金屬纖維剪切成長度相等的短纖維，其長度為3-15mm，將短纖維隨機(jī)填充于圓桶形模具中； ②將50-200根金屬纖維集成一束，將此金屬纖維束彎折成長度相等的Z字型纖維束后剪切，每一束Z字型纖維束長度為9-45mm，Z字型的三段長度相等；將Z字型纖維束分散成單根纖維后隨機(jī)放入圓錐形 容器中堆積成為結(jié)構(gòu)體，然后將此結(jié)構(gòu)體填充于圓桶形模具中； ③將50-200根金屬纖維集成一束，將此金屬纖維束彎折成長度相等的V字型后剪切，每一束V字型纖維束長度為6-30mm，V字型的兩段長度相等；將V字型纖維束分散成單根纖維后隨機(jī)放入圓錐形容器中堆積成為結(jié)構(gòu)體，然后將此結(jié)構(gòu)體填充于圓桶形模具中； 對于直徑為100-500 μ m的金屬纖維，可采用以下四種方法中的任一方法: ①將金屬纖維剪切成長度相等的短纖維，其長度為3-15mm，將短纖維隨機(jī)填充于圓桶形模具中； ②將金屬纖維彎折成長度相等的Z字型纖維后剪切，Z字型纖維束長度為9-45mm，Z字型的三段長度相等；將Z字型纖維隨機(jī)放入圓錐形容器中堆積成為結(jié)構(gòu)體，然后將此結(jié)構(gòu)體填充于圓桶形模具中； ③將金屬纖維彎折成長度相等的V字型纖維后剪切，V字型纖維束長度為6-30mm，V字型的兩段長度相等；將V字型纖維隨機(jī)放入圓錐形容器中堆積成為結(jié)構(gòu)體，然后將此結(jié)構(gòu)體填充于圓桶形模具中； ④將金屬纖維纏繞成彈簧狀螺旋體，彈簧狀螺旋體的線圈直徑為金屬纖維直徑的10-20倍；將彈簧狀螺旋體均勻拉開，其螺距與線圈直徑相等，然后將其剪切成長度為10-30mm的短螺旋纖維，將長度相等的短螺旋纖維隨機(jī)填充于圓桶形模具中； 所述圓片式加壓裝置包括等直徑的兩片圓形的氧化鋁陶瓷片和兩片圓形的不銹鋼壓片，不銹鋼壓片分別緊貼兩片氧化鋁陶瓷片相背的一側(cè)，細(xì)胞培養(yǎng)支架預(yù)制體夾于兩片陶瓷片之間，若干個螺栓穿過氧化鋁陶瓷片和不銹鋼壓片，使氧化鋁陶瓷片緊壓細(xì)胞培養(yǎng)支架預(yù)制體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織工程細(xì)胞培養(yǎng)支架的制備方法，其特征在于:所述的壓制成型是使用棒狀壓頭從上方對填充于圓桶形模具中的纖維或者纖維堆積而成的結(jié)構(gòu)體進(jìn)行壓制，根據(jù)要達(dá)到的孔隙率和厚度的要求進(jìn)行壓制，壓制成型后取出，得到所需孔隙率和厚度的圓柱形的細(xì)胞培養(yǎng)支架預(yù)制體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織工程細(xì)胞培養(yǎng)支架的制備方法，其特征在于:所述燒結(jié)的參數(shù)為:燒結(jié)溫度900-1400 °C，燒結(jié)時間l_5h ;真空燒結(jié)時真空度為.1.0Χ12-1 .0XKT3Pa ;氬氣保護(hù)時爐內(nèi)氬氣壓力為0.02-0.05MPa。
【文檔編號】A61L27/04GK103433493SQ201310390103
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年8月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月30日
【發(fā)明者】尹大川, 李大為, 何進(jìn), 王鵬燕, 何鳳利, 陳瑞卿 申請人:西北工業(yè)大學(xué)