用于治療擴張型心肌病的免疫吸附劑及其制備方法
【專利摘要】用于治療擴張型心肌病的免疫吸附劑及其制備方法。其中，用于治療擴張型心肌病的免疫吸附劑包括作為吸附劑基質(zhì)的多孔高分子載體和利用化學交聯(lián)固定在所述載體表面的配基，其中配基為3-吲哚基-BETA-D-葡萄糖醛酸鈉鹽。該用于治療擴張型心肌病的免疫吸附劑具有安全無毒、成本低等優(yōu)點。
【專利說明】用于治療擴張型心肌病的免疫吸附劑及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用于血液凈化的免疫吸附劑及其制備方法，特別是用于治療擴張型心肌病的免疫吸附劑及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]據(jù)估計，擴張型心肌病(DCM)的年診斷率約為8/10萬，患病率約為37/10萬，在我國預(yù)計患者有50萬人以上，其中半數(shù)患者年齡在55歲以下，5年生存率僅40%。DCM的特點是以左心室(多數(shù))或右心室有明顯擴大，且均伴有不同程度的心肌肥厚，心室收縮功能減退，以心臟擴大、心力衰竭、心律失常、栓塞為基本特征。
[0003]近年來,科學家通過對DCM臨床和發(fā)病機制的研究發(fā)現(xiàn)，自身抗體介導的免疫過程引起分子水平上的心肌細胞結(jié)構(gòu)和功能紊亂，是引發(fā)DCM發(fā)病的重要機理之一。DCM患者的血清可檢測出多種抗心肌的自身抗體，如抗β?腎上腺素能受體抗體、抗M2膽堿受體抗體和抗肌球蛋白抗體等， 這些抗體會擾亂心肌細胞的正常生理活性，同時這些抗體可以經(jīng)由補體激活途徑以及通過與自身抗原結(jié)合形成免疫復(fù)合物的途徑而對組織產(chǎn)生直接損傷?；趯CM的免疫發(fā)病機制的認識逐漸加深，免疫抑制劑治療、血漿置換療法和免疫吸附療法等免疫相關(guān)治療方法也不斷引入到DCM的治療中。
[0004]免疫吸附療法是近年來發(fā)展起來的一種新的血液凈化方法，它通過體外循環(huán)，利用抗原-抗體免疫反應(yīng)或物理化學作用除去血漿中的致病性自身抗體或免疫復(fù)合物等致病因子，從而達到治病或減輕癥狀的目的。對于DCM患者，可以通過免疫吸附療法清除患者體內(nèi)的抗β I腎上腺素能受體抗體、抗M2膽堿受體抗體和抗肌球蛋白重鏈抗體等多種抗心肌的自身抗體從而減少其對心肌的損傷。
[0005]費森尤斯醫(yī)療的Immunosorba蛋白A免疫吸附劑可以用于治療擴張型心肌炎。有研究報道證實采用蛋白A免疫吸附柱治療DCM患者后，可以增加左心室射血分數(shù)和心指數(shù)，降低左室直徑，改善血流動力學。但是，蛋白A免疫吸附劑價格昂貴，治療成本過高。另外，蛋白A免疫吸附劑米用硫柳萊溶液作為保存液,各易造成患者萊中毒。美國FDA的一起不良反應(yīng)報道(Model Number 9797200)中顯示一名患者在使用費森尤斯公司的immunoadsorbacolumn (蛋白A免疫吸附劑)治療一段時間后，其體內(nèi)血液中汞含量達到107 ug/L。此外，任何免疫吸附劑的配基都存在脫落的可能，而蛋白A作為一種有生物活性的蛋白質(zhì)，其作為配基一旦脫落容易造成免疫性反應(yīng)，存在潛在的治療隱患。因此蛋白A免疫吸附劑存在價格昂貴、配基的穩(wěn)定性差等缺點，同時蛋白A作為一種有生物活性的蛋白質(zhì)，其配基脫落容易造成免疫性反應(yīng)綜上，有必要開發(fā)更多新的用于治療擴張型心肌病的免疫吸附劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之一是提供一種新的可用于治療擴張型心肌病的免疫吸附劑。
[0007]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為:用于治療擴張型心肌病的免疫吸附劑，包括作為吸附劑基質(zhì)的多孔高分子載體和利用化學交聯(lián)固定在所述載體表面的配基，其中，所述配基為3-吲哚基-BETA-D-葡萄糖醛酸鈉鹽。
[0008]本發(fā)明用于治療擴張型心肌病的免疫吸附劑可以安全、高效和有選擇性地吸附體液中(例如血液、血漿)的抗β?腎上腺素能受體抗體、抗M2膽堿受體抗體和抗肌球蛋白抗體等多種抗心肌的自身抗體，且價格便宜。3-吲哚基-BETA-D-葡萄糖醛酸鈉鹽是一種同時含有吲哚基疏水基團和吡喃葡萄糖醛酸負電荷基團的物質(zhì)，其中吡喃葡萄糖醛酸基團中的羥基可以作為活性點與載體通過化學鍵鍵合，3-吲哚基-BETA-D-葡萄糖醛酸鈉鹽配基可以通過電荷誘導作用和疏水作用達到對致病性抗體和循環(huán)免疫復(fù)合物的吸附作用。3-吲哚基-BETA-D-葡萄糖醛酸鈉鹽作為一種糖類物質(zhì)，安全無毒，由于其不屬生物活性物質(zhì)，即使作為配基脫落亦不會造成免疫性反應(yīng)。此外，相對生物活性物質(zhì)高昂的生產(chǎn)成本，3-吲哚基-BETA-D-葡萄糖醛酸鈉鹽作為配基的免疫吸附劑，成本低廉，易于保存。固載3-吲哚基-BETA-D-葡萄糖醛酸鈉的吸附劑只需保存在滅菌注射用水中即可，不會引入其它毒害物質(zhì)。
[0009]另一技術(shù)方案為，3-吲哚基-BETA-D-葡萄糖醛酸鈉鹽配基的固載量至少為40 μ mol/mL。
[0010]另一技術(shù)方案為，3-吲哚基-BETA-D-葡萄糖醛酸鈉鹽配基的固載量為40 —60 μ mol/mL。
[0011]另一技術(shù)方案為，多孔高分子載體采用親水性天然高分子材料。由于親水性天然高分子材料本身不會對蛋白質(zhì)產(chǎn)生吸附，因此不會造成凝血機制激活等不良反應(yīng)，具備優(yōu)秀的血液相容性。本發(fā)明中的親水性天然高分子材料可以是瓊脂糖、纖維素、殼聚糖等。
[0012]本發(fā)明要解決的另一技術(shù)問題是提供一種制備上述免疫吸附劑的方法。
[0013]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為:制備用于治療擴張型心肌病的免疫吸附劑方法，用于治療擴張型心肌病的免疫吸附劑包括作為吸附劑基質(zhì)的多孔高分子載體和利用化學交聯(lián)固定在所述載體表面的配基，其中配基為3-吲哚基-BETA-D-葡萄糖醛酸鈉鹽；該方法包括以下步驟:
步驟一:在濃度為0.05-0.5M、pH值為10-12的磷酸鈉緩沖溶液中，投入3-吲哚基-BETA-D-葡萄糖醛酸鈉鹽配制成質(zhì)量分數(shù)在2-8%的3-吲哚基-BETA-D-葡萄糖醛酸鈉鹽溶液；
步驟二:將環(huán)氧活化后的多孔高分子載體投入到步驟一所制得的3-吲哚基-BETA-D-葡萄糖醛酸鈉鹽溶液中，所述3-吲哚基-BETA-D-葡萄糖醛酸鈉鹽溶液與載體的體積比為1-5:1，將反應(yīng)溫度升至40-60 °C，反應(yīng)6-24h，用水沖洗至中性，并洗凈未反應(yīng)的3-吲哚基-BETA-D-葡萄糖醛酸鈉鹽，即得用于治療擴張型心肌病的免疫吸附劑。
[0014]通過本發(fā)明上述方法制備的吸附劑可以用于清除多種抗心肌的自身抗體，可以作為治療擴張型心肌病一種新選擇。其中本發(fā)明所述的用于治療擴張型心肌病的免疫吸附劑可以根據(jù)患者需求選用血漿吸附用的吸附劑或全血灌流用的吸附劑，因此本發(fā)明為擴張型心肌病患者提供了更多的治療方法。
另一技術(shù)方案為，3-吲哚基-BETA-D-葡萄糖醛酸鈉鹽配基的固載量至少為40 μ mol/
mLo
[0015]另一技術(shù)方案為，3-吲哚基-BETA-D-葡萄糖醛酸鈉鹽配基的固載量為40 —60 μ mol/mL。
[0016]另一技術(shù)方案為，多孔高分子載體采用親水性天然高分子材料。由于新水性天然高分子材料本身不會對蛋白質(zhì)產(chǎn)生吸附，因此不會造成凝血機制激活等不良反應(yīng)，具備優(yōu)秀的血液相容性。本發(fā)明中的親水性天然高分子材料可以是瓊脂糖、纖維素、殼聚糖等。瓊脂糖、纖維素及殼聚糖等載體的制備方法可以與現(xiàn)有技術(shù)相同。下面以瓊脂糖載體為例，舉例說明其制備及環(huán)氧活化方法。
[0017]瓊脂糖載體制備及環(huán)氧活化方法可以包括以下步驟:
步驟1:瓊脂糖凝膠球的制備:
將配制好的質(zhì)量分數(shù)為2-6%的瓊脂糖溶液緩慢傾入含有質(zhì)量分數(shù)為0.1-3%聚山梨酯-80 (吐溫-80)的甲苯和三氯甲烷混合液的三口瓶中，其中三口瓶置于40-60 °C水浴中，甲苯和三氯甲烷的體積比為0.5-5:1 ;調(diào)節(jié)攪拌速度，使瓊脂糖溶液在有機相中分散成大小適宜的液滴。待瓊脂糖液滴冷卻成凝膠球后,過篩并用大量水沖洗,血漿用DCM免疫吸附劑粒徑以50 μ m-300 μ m為宜；全血灌流用DCM免疫吸附劑粒徑以300-1000 μ m為宜。
[0018]步驟2:瓊脂 糖凝膠球的交聯(lián)
將步驟I所得的瓊脂糖凝膠球，加入到濃度為0.5-2.5M的NaOH水溶液中，NaOH水溶液和凝膠球體積比為0.5-5:1，加入體積為瓊脂糖凝膠球體積0.1-1倍的環(huán)氧氯丙烷，在25-500C的條件下反應(yīng)0.5-2h，反應(yīng)完成后先用水沖洗至中性，再用酒精沖洗凈未反應(yīng)完全的環(huán)氧氯丙烷，最后再用水將酒精沖凈。如果用于制備血漿吸附用DCM吸附劑則按上述步驟進行一次交聯(lián)即可；如果用于制備全血灌流用DCM吸附劑則需按上述條件進行一次交聯(lián)反應(yīng)后，再按上述條件再進行第二次交聯(lián)，經(jīng)過兩次交聯(lián)后，瓊脂糖載體強度大幅提高，既能滿足全血灌流要求。
[0019]步驟3:瓊脂糖凝膠球的環(huán)氧氯丙烷活化
取步驟2所得交聯(lián)瓊脂糖載體，加入體積為交聯(lián)瓊脂糖載體的體積0.1-1 二甲基亞砜，加入體積為交聯(lián)瓊脂糖載體的體積0.1-1環(huán)氧氯丙烷，加入體積為瓊脂糖凝膠球體積
0.5-2倍NaOH水溶液，其中NaOH水溶液濃度為0.5-2.5M，并在30_60°C反應(yīng)2_6h，用水沖洗至中性，并洗凈未反應(yīng)的二甲基亞砜和環(huán)氧氯丙烷，即得到環(huán)氧氯丙烷活化的瓊脂糖微球，采用硫代硫酸鈉法滴定環(huán)氧密度值，活化密度在60-120 μ mol/mL之間為宜。
[0020]本發(fā)明制備用于治療擴張型心肌病的免疫吸附劑的方法可以通過控制吸附劑的粒徑范圍，根據(jù)需要選擇制備用于全血灌流用吸附劑或制備血漿用吸附劑。如，制備用于全血灌流用吸附劑時，可以將吸附劑粒徑范圍控制在300-1000μπι。制備血漿用吸附劑時，可以將吸附劑粒徑范圍控制50-300 μ m。
[0021 ] 下面結(jié)合【具體實施方式】對本發(fā)明予以詳細介紹。
【具體實施方式】
[0022]實施例1
一種血漿吸附用DCM免疫吸附劑制備方法如下:
步驟1:瓊脂糖凝膠球的制備:
將裝有攪拌裝置的500mL三口瓶置于60 °C水浴中，向瓶內(nèi)加入甲苯145 mL、三氯甲烷55mL、聚山梨酯-80 (吐溫-80)5 mL。攪拌均勻并保溫。將IOOmL配制好的質(zhì)量分數(shù)為4%的瓊脂溶液緩慢傾入三口瓶中，調(diào)節(jié)攪拌速度，使瓊脂溶液在有機相中分散成大小適宜的液滴。待分散均勻后(約30min)撤去水浴，在室溫下攪拌使體系自然冷卻。體系冷卻后，棄去上層有機溶劑，用大量水沖洗合成的球狀瓊脂凝膠載體，篩選出50-300 μ m的凝膠球，用蒸餾水洗滌數(shù)次，于4 °C冰箱中濕態(tài)保存。
[0023]步驟2:瓊脂糖凝膠球的交聯(lián):
在裝有攪拌裝置的500mL三口瓶中，依次投入上述瓊脂凝膠球lOOmL，1.5M的NaOH溶液200mL，環(huán)氧氯丙烷10mL，輕微攪拌并于40°C反應(yīng)30min。反應(yīng)完成后，將交聯(lián)后瓊脂糖微球濾出，并用大量水沖洗至中性。
[0024]步驟3:交聯(lián)瓊脂糖載體的環(huán)氧氯丙烷活化
取交聯(lián)瓊脂糖載體20 mL,依次加入20 mL 二甲基亞砜、15 mL的環(huán)氧氯丙燒和20 mL2M的NaOH溶液，并在40°C反應(yīng)2h，用水沖洗至中性，并洗凈未反應(yīng)的二甲基亞砜和環(huán)氧氯丙烷，即得到環(huán)氧氯丙烷活化的瓊脂糖微球，采用硫代硫酸鈉法滴定環(huán)氧密度值，為117 μ mo I /ml,η
[0025]步驟4:3-吲哚 基-BETA-D-葡萄糖醛酸鈉鹽配基固載
在36.8g濃度為0.2M、pH值為11的磷酸鈉緩沖溶液中，投入3-吲哚基-BETA-D-葡萄糖醛酸鈉鹽3.2g，攪拌溶解獲得質(zhì)量分數(shù)為8%的3-吲哚基-BETA-D-葡萄糖醛酸鈉鹽溶液，之后投入IOmL環(huán)氧活化瓊脂糖微球，于40 °C下反應(yīng)15h，反應(yīng)結(jié)束后用pH值為11的磷酸鈉緩沖溶液沖洗若干次，將未反應(yīng)的3-吲哚基-BETA-D-葡萄糖醛酸鈉鹽沖洗干凈，即得血漿吸附用治療擴張型心肌病的免疫吸附劑。利用凱氏定氮法測得吸附劑上3-吲哚基-BETA-D-葡萄糖醛酸鈉鹽配基的固載量為54.8 μ mol/mL。
[0026]吸附劑性能評價:
取擴張型心肌病患者血漿3mL加入到ImL實施I的吸附劑中，在37°C下震蕩2h后，采用ELISA法(酶聯(lián)免疫吸附測定法)分別測定上清液中抗β I腎上腺素能受體抗體、抗M2膽堿受體抗體和抗肌球蛋白抗體的變化，結(jié)果值參見表I。
[0027]實施例2
一種全血灌流用DCM免疫吸附劑制備方法如下:
步驟1:瓊脂糖凝膠球的制備:
將裝有攪拌裝置的500mL三口瓶置于60 °C水浴中，向瓶內(nèi)加入甲苯145 mL、三氯甲烷55mL、吐溫80 5 mL。攪拌均勻并保溫。將IOOmL配制好的質(zhì)量分數(shù)為6%的瓊脂溶液緩慢傾入三口瓶中，調(diào)節(jié)攪拌速度，使瓊脂溶液在有機相中分散成大小適宜的液滴。待分散均勻后(約30min)撤去水浴，在室溫下攪拌使體系自然冷卻。體系冷卻后，棄去上層有機溶劑，用大量水沖洗合成的球狀瓊脂凝膠載體，篩選出300-800 μ m的凝膠球，用蒸餾水洗滌數(shù)次，于4 °C冰箱中濕態(tài)保存。
[0028]步驟2:瓊脂糖凝膠球的一次交聯(lián)和二次:
在裝有攪拌裝置的500mL三口瓶中，依次投入上述瓊脂凝膠球lOOmL，1.5M的NaOH溶液200mL，環(huán)氧氯丙烷10mL，輕微攪拌并于40°C反應(yīng)30min，即完成一次交聯(lián)。將一次交聯(lián)后的瓊脂糖載體按上述條件再進行第二次交聯(lián)，將二次交聯(lián)后瓊脂糖微球濾出，并用大量水沖洗至中性，即得到高強度瓊脂糖載體。
[0029]步驟3:高強度瓊脂糖載體的環(huán)氧氯丙烷活化取高強度瓊脂糖載體20 mL，依次加入20 mL 二甲基亞砜、15 mL的環(huán)氧氯丙烷和20 mL2M的NaOH溶液，并在40°C反應(yīng)2h，用水沖洗至中性，并洗凈未反應(yīng)的二甲基亞砜和環(huán)氧氯丙烷，即得到環(huán)氧氯丙烷活化的高強度瓊脂糖微球，采用硫代硫酸鈉法滴定環(huán)氧密度值，為136 μ mol/mL。
[0030]步驟4:3-吲哚基-BETA-D-葡萄糖醛酸鈉鹽配基固載
在38g濃度為0.2M、pH值為11的磷酸鈉緩沖溶液中，投入3-吲哚基-BETA-D-葡萄糖醛酸鈉鹽2g、攪拌溶解獲得5%的3-吲哚基-BETA-D-葡萄糖醛酸鈉鹽溶液，之后投入IOmL上述環(huán)氧活化后的高強度瓊脂糖微球，于40 °C下反應(yīng)15h，反應(yīng)結(jié)束后用pH值為11的磷酸鈉緩沖溶液沖洗若干次，將未反應(yīng)的3-吲哚基-BETA-D-葡萄糖醛酸鈉鹽沖洗干凈，即得全血灌流用DCM免疫吸附劑。利用凱氏定氮法測得吸附劑的配基固載量為45.3 μ mol/mL。
[0031]吸附劑性能評價:
由于無法獲得DCM患者全血樣品，仍然采用DCM患者血漿對實施例2的吸附劑進行性能評價。取DCM患者血漿3mL加入到ImL實施2的吸附劑中，在37°C下震蕩2h后，采用ELISA法分別測定上清液中抗β I腎上腺素能受體抗體、抗M2膽堿受體抗體和抗肌球蛋白抗體的變化，結(jié)果值參見表I。
[0032]表1:DCM吸附劑對多種抗心肌自身抗體的吸附率
抗P I腎上腺素能受體抗體的吸附率抗M2膽堿受體抗體的吸附率抗肌球蛋白抗體的
【權(quán)利要求】
1.用于治療擴張型心肌病的免疫吸附劑，包括作為吸附劑基質(zhì)的多孔高分子載體和利用化學交聯(lián)固定在所述載體表面的配基，其特征在于: 所述配基為3-吲哚基-BETA-D-葡萄糖醛酸鈉鹽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于治療擴張型心肌病的免疫吸附劑，其特征在于:所述3-吲哚基-BETA-D-葡萄糖醛酸鈉鹽配基的固載量至少為40 μ mol/mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于治療擴張型心肌病的免疫吸附劑，其特征在于:所述3-吲哚基-BETA-D-葡萄糖醛酸鈉鹽配基的固載量為40 — 60 μ mol/mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項所述的用于治療擴張型心肌病的免疫吸附劑，其特征在于: 所述多孔高分子載體采用親水性天然高分子材料。
5.制備用于治療擴張型心肌病的免疫吸附劑方法，所述用于治療擴張型心肌病的免疫吸附劑包括作為吸附劑基質(zhì)的多孔高分子載體和利用化學交聯(lián)固定在所述載體表面的配基，所述配基為3-吲哚基-BETA-D-葡萄糖醛酸鈉鹽；其特征在于: 所述方法包括以下步驟: 步驟一:在濃度為0.05-0.5M、pH值為10-12的磷酸鈉緩沖溶液中，投入3-吲哚基-BETA-D-葡萄糖醛酸鈉鹽配制成質(zhì)量分數(shù)為2-8%的3-吲哚基-BETA-D-葡萄糖醛酸鈉鹽溶液； 步驟二:將環(huán)氧活化后的多孔高分子載體投入到步驟一所制得的3-吲哚基-BETA-D-葡萄糖醛酸鈉鹽溶液中，所述3-吲哚基-BETA-D-葡萄糖醛酸鈉鹽溶液與載體的體積比為1-5:1，將反應(yīng) 溫度升至40-60 °C，反應(yīng)6-24h，用水沖洗至中性，并洗凈未反應(yīng)3-吲哚基-BETA-D-葡萄糖醛酸鈉鹽，即得用于治療擴張型心肌病的免疫吸附劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備用于治療擴張型心肌病的免疫吸附劑方法，其特征在于:所述3-吲哚基-BETA-D-葡萄糖醛酸鈉鹽配基的固載量至少為40 μ mol/mL。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備用于治療擴張型心肌病的免疫吸附劑方法，其特征在于:所述3-吲哚基-BETA-D-葡萄糖醛酸鈉鹽配基的固載量為40 — 60 μ mol/mL。
8.根據(jù)權(quán)利要求5至7任一項所述的制備用于治療擴張型心肌病的免疫吸附劑方法，其特征在于:所述多孔高分子載體采用親水性天然高分子材料。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備用于治療擴張型心肌病的全血灌流用免疫吸附劑方法，其特征在于:所述吸附劑的粒徑范圍為300-1000 μ m。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備用于治療擴張型心肌病的血漿吸附用免疫吸附劑方法，其特征在于:所述吸附劑的粒徑范圍為50-300 μ m。
【文檔編號】A61K47/48GK103446590SQ201310393958
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年9月3日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月3日
【發(fā)明者】董凡 申請人:珠海健帆生物科技股份有限公司