火木層孔菌中環(huán)二肽c1在抗禽流感h5n1病毒上的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種從火木層孔菌Phellinusigniarius(LexFr)Quel（裂蹄木層孔菌phellinuslinteus(BerketCurt)Teng、鮑氏層孔菌Phellinusbaumii、哈蒂針層孔菌Phellinushartigii(AlleschetSchnabl)Imaz）發(fā)酵液和子實(shí)體中分離的具有抗禽流感活性的一種環(huán)二肽C1。本發(fā)明首次公開了一種環(huán)二肽的一種新活性，證明其具有抗禽流感作用。本方法較一般化合物應(yīng)用的優(yōu)點(diǎn)在于：發(fā)現(xiàn)了這種環(huán)二肽的新活性，具有抗禽流感病毒的作用。
【專利說明】火木層孔菌中環(huán)二肽Cl在抗禽流感H5N1病毒上的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種抗禽流感H5N1病毒的火木層孔菌中活性物質(zhì)的提取制備方法，尤其涉及的火木層孔菌菌種，已于2013年8月26日保藏在“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，保藏編號為CGMCC N0.8108，分類名稱為火木層孔菌Phellinusigniarius，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所。
【背景技術(shù)】
[0002]通常生物學(xué)中所指的環(huán)肽是指以氨基酸肽鍵形成的化合物，在植物化學(xué)中這一概念被擴(kuò)大成以酰胺鍵形成的一類化合物，因此范圍被擴(kuò)大至包括有機(jī)胺類和大環(huán)生物堿類，根據(jù)成環(huán)與否分為環(huán)肽和直鏈肽。已報道的環(huán)肽類化合物具有多方面的生物活性，包括抗腫瘤、抗HIV、抗菌、抗瘧、安眠、抑制血小板聚集、降壓、抑制酪氨酸酶、抑制環(huán)氧化酶、抑制脂質(zhì)過氧化酶、雌性激素樣、免疫抑制等生物活性。
[0003]由于環(huán)肽的前體-直鏈肽所包含的氨基酸的數(shù)目和種類的千差萬別，造成了環(huán)肽合成方法的多樣化。對某種直鏈肽表現(xiàn)出高效，快速縮合作用的試劑和方法對另外一種肽鏈就可能變得低效或無效。
[0004]一種環(huán)二肽具有抗菌等多種重要的生理活性，如今，未見到有抗情流感病毒活性的報到。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明公開了一種從藥用菌中分離的具有抗禽流感活性的一種環(huán)二肽Cl的方法。本發(fā)明首次公開了這種一`種環(huán)二肽的一種新活性，證明其具有抗禽流感作用。
[0006]本方法較一般化合物應(yīng)用的優(yōu)點(diǎn)在于:發(fā)現(xiàn)了該種一種環(huán)二肽Cl的新活性，具有抗禽流感病毒的作用。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
首先制備火木層孔菌粗提物，由下述方法制得:
(1)發(fā)酵培養(yǎng)基配方以克/100毫升計是:
玉米淀粉 1-5%葡萄糖 1-5%
蛋白胨 0.1-0.5%酵母膏 0.1-0.5%
硫酸鎂 0.1-0.5%磷酸二氫鉀0.01-0.05%
(2)將火木層孔菌菌種以常規(guī)方法接種到裝有液體培養(yǎng)基的三角燒瓶內(nèi)，以20~35°C溫度，搖瓶轉(zhuǎn)速為80~280r/min，pH 3~8條件下，震動培養(yǎng)7~15天；培養(yǎng)中當(dāng)pH值降到2.5~4時，將搖瓶中的種子接種到50L發(fā)酵罐的培養(yǎng)液中，以溫度20~35°C，發(fā)酵罐壓力0.1~0.2公斤/平方厘米，pH 3~8，通氣量0.5~1.lvvm,攪拌速度100~280轉(zhuǎn)/分的條件，培養(yǎng)7~15天，即可利用火木層孔菌菌絲體發(fā)酵全液制備火木層孔菌粗提物。
[0008](3)取步驟(2)中所得火木層孔菌菌絲體發(fā)酵全液，將其以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/2~1/5 ；(4)用體積百分比為60~95%的乙醇對上述步驟(3)濃縮后的發(fā)酵液進(jìn)行提取，其中，加入乙醇的量是濃縮液體積的2~8倍，能夠使提取液中乙醇濃度達(dá)到60~90%，乙醇優(yōu)選為濃度65-95%的食用乙醇，所用體積優(yōu)選為濃縮液體積的3-6倍；
(5)對步驟(4)所得提取液在50~70°C條件下，加熱I~2小時；以常規(guī)方法進(jìn)行分離，并通過二級過濾除去雜質(zhì)，分離獲得乙醇提取液；將上述乙醇提取液以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/5~1/10 ；
(6)將將步驟(5)所得的濃縮液以低溫冷凍干燥的方法進(jìn)行干燥，得火木層孔菌粗提物。
[0009]然后從火木層孔菌粗提物中環(huán)二肽Cl，步驟如下:火木層孔菌粗提物一正相硅膠層析一氯仿與甲醇梯度洗脫一TLC檢測一正相硅膠層析一甲醇凝膠層析一TLC檢測一反相硅膠層析一HPLC檢測一減壓蒸干一環(huán)二肽Cl。
[0010]具體方法為:
(1)制備火木層孔菌粗提物；
(2)將上述步驟(1)所得的粗提物與正相硅膠混勻攪拌，并干燥，進(jìn)行硅膠正相柱層析，用洗脫劑洗脫2-7次；
(3)收集步驟(2)中最后一次洗脫液，減壓干燥，與等體積硅膠拌樣，再次進(jìn)行正相硅膠層析，用洗脫劑洗脫；
(4)收集上述步驟(3)中得到的洗脫液，減壓濃縮，使用甲醇溶解，甲醇凝膠柱層析，用洗脫劑洗脫，使用TLC檢測收集的洗脫液，適當(dāng)合并洗脫液，減壓干燥；
(5)將步驟(4)得到的產(chǎn)物進(jìn)行反相硅膠層析，洗脫劑為甲醇和水；
(6)HPLC檢測，適度合并洗脫液，減壓干燥，即為環(huán)二肽Cl。
[0011]優(yōu)選的，提取步驟(2)中所述的拌樣硅膠為100-200目正相硅膠，層析硅膠為正相200-300目，洗脫劑為氯仿和/或甲醇。
[0012]提取步驟(3)中所述的硅膠用量為等體積，洗脫劑為氯仿與甲醇。
[0013]提取步驟(4)中所述的凝膠為Sephadex LH-20, Sephadex LH-25,洗脫劑為甲醇。
[0014]提取步驟(5)所述的反相材料為C-18或者C-8，洗脫劑為甲醇:水=1:10_1:1。
[0015]提取步驟(6)所述的HPLC條件為，Omin，100%A水一IOmin, 100%甲醇，出鋒時間為
5.3-5.8min。
[0016](四)【具體實(shí)施方式】 實(shí)例1:
火木層孔菌粗提物，由下述方法制得:
(1)發(fā)酵培養(yǎng)基配方以克/100毫升計是:
玉米淀粉 1%葡萄糖 1%
蛋白胨 0.1%酵母膏 0.1%
硫酸鎂 0.1%磷酸二氫鉀0.01%
(2)將火木層孔菌菌種以常規(guī)方法接種到裝有液體培養(yǎng)基的三角燒瓶內(nèi)，以25°C溫度，搖瓶轉(zhuǎn)速為110r/min，pH 7條件下，震動培養(yǎng)7天；培養(yǎng)中當(dāng)PH值降到3時，將搖瓶中的種子接種到50L發(fā)酵罐的培養(yǎng)液中，以溫度25°C，發(fā)酵罐壓力0.1公斤/平方厘米，pH 3，通氣量0.5-1.lvvm，攪拌速度100轉(zhuǎn)/分的條件，培養(yǎng)7天，即可利用火木層孔菌菌絲體發(fā)酵全液制備火木層孔菌粗提物。
[0017](3)取步驟(2)中所得火木層孔菌菌絲體發(fā)酵全液，將其以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/3 ；
(4)用體積百分比為70%的乙醇對上述步驟(3)濃縮后的發(fā)酵液進(jìn)行提取，其中，加入乙醇的量是濃縮液體積的5倍，能夠使提取液中乙醇濃度達(dá)到55% ；
(5)對步驟(4)所得提取液在70°C條件下，加熱I小時；以常規(guī)方法進(jìn)行分離，并通過二級過濾除去雜質(zhì)，分離獲得乙醇提取液；將上述乙醇提取液以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/5 ；
(6)將將步驟(5)所得的濃縮液以低溫冷凍干燥的方法進(jìn)行干燥，得火木層孔菌粗提物。
[0018]將上述得物稱取300g與等體積100目正相硅膠混勻攪拌，進(jìn)行硅膠正相柱層析。層析固定相為200目正相硅膠，柱高lm，直徑20cm，洗脫劑為分別為氯仿，氯仿:甲醇=100:1,50:1,10:1,5:1分別洗脫3個柱體積。并將所得洗脫液分別命名為Fr-1, Fr_2，F(xiàn)r-3，F(xiàn)r-4，F(xiàn)r_5。將Fr_5等體積硅膠拌樣，使用硅膠為100目正相硅膠，五倍體積硅膠層析，使用的硅膠為200— 300目正相硅膠。洗脫劑為氯仿與甲醇。收集洗脫液，減壓濃縮，使用甲醇溶解，進(jìn)行甲醇凝膠柱層析，用甲醇洗脫，使用TLC檢測收集的洗脫液，適當(dāng)合并洗脫液，減壓干燥。進(jìn)行反相硅膠層析，洗脫劑為甲醇:水=15%，HPLC檢測收集的洗脫液，HPLC條件為，Omin，100%A水一IOmin, 100%甲醇，出鋒時間為5.32min，適當(dāng)合并，減壓干燥，再次進(jìn)行甲醇凝膠層析，用甲醇洗脫，將洗脫液加壓蒸干，進(jìn)行1D-HNMR核磁共振分析，頻率為400MHZ，分析結(jié)果為 4.55 (ddd, J = 11.1, 6.4，1.3 Hz, 1H)，4.49 (t, J = 4.1 Hz,1H), 4.21 (dd, J = 6.8，3.9 Hz, 1H)，3.68 (dd, J = 12.8, 4.4 Hz, 1H)，3.46 (d,J= 12.8 Hz, 1H), 3.33 (dt, J = 3.2, 1.6 Hz, 2H)，2.30 (dd, J = 13.3, 6.4 Hz,1H), 2.15 - 2.08 (m, 1H)，1.92 (ddd, J = 10.9, 7.8，4.9 Hz, 2H)，1.54 (t, J =
8.1 Hz, 1H), 1.11 - 0.80 (m, 7H).證明是為六氫-7 -羥基_3 - (2 -甲基丙基)吡咯并[l，2-a〕吡嗪-1，4 - 二酮。
[0019](7)采用步驟(6)得到的麥角甾酮進(jìn)行對MDCK細(xì)胞毒性的測定，確定其半數(shù)中毒濃度(CC5tl)及最大安全濃度。
[0020]在96孔板上，100 μ I/孔加入ΑΧΙΟ^L-1濃度的MDCK細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24 h后，在單層細(xì)胞上分別加入不同濃度的含樣維持液，每種濃度重復(fù)3孔，并設(shè)正常細(xì)胞對照。置370C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，棄培養(yǎng)液上清，100 μ I/孔加入5 mg.Hir1MTT的維持液，繼續(xù)培養(yǎng)Ih后，棄MTT上清，每孔加溶解液(DMSO) 100 μ 1，振蕩5_10 min，待結(jié)晶完全溶解，酶標(biāo)儀測492nm處的OD值。計算出樣品的半數(shù)中毒濃度(CC5tl)及最大安全濃度。當(dāng)加樣組的OD492值不顯著低于細(xì)胞對照組OD492時，此濃度即為樣品的最大安全濃度。
[0021]表1環(huán)二肽Cl各濃度對細(xì)胞生長的影響
【權(quán)利要求】
1.環(huán)二肽Cl在制備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應(yīng)用，其特征在于所述環(huán)二肽Cl為六氫-7 -羥基-3 - (2 -甲基丙基)吡咯并[l，2-a〕吡嗪_1，4 - 二酮。
2.如權(quán)利要求1所述的環(huán)二肽Cl在制備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應(yīng)用，其特征在于甲基苯乙酮是從火木層孔菌中提取的，提取步驟順序如下: (1)制備火木層孔菌粗提物； (2)將上述步驟(1)所得的粗提物與正相硅膠混勻攪拌，并干燥，進(jìn)行硅膠正相柱層析，用洗脫劑洗脫2-7次； (3)收集步驟(2)中最后一次洗脫液，減壓干燥，與等體積硅膠拌樣，再次進(jìn)行正相硅膠層析，用洗脫劑洗脫； (4)收集上述步驟(3)中得到的洗脫液，減壓濃縮，使用甲醇溶解，甲醇凝膠柱層析，用洗脫劑洗脫，使用TLC檢測收集的洗脫液，適當(dāng)合并洗脫液，減壓干燥； (5)將步驟(4)得到的產(chǎn)物進(jìn)行反相硅膠層析，洗脫劑為甲醇和水； (6)HPLC檢測，適度合并洗脫液，減壓干燥，即為環(huán)二肽Cl。
3.如權(quán)利要求2所述的環(huán)二肽Cl在制備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應(yīng)用，其特征在于所述火木層孔菌粗提物，由下述方法制得: (1)將火木層孔菌菌種以常規(guī)方法接種到裝有液體培養(yǎng)基的三角燒瓶內(nèi)，以20~35°C溫度，搖瓶轉(zhuǎn)速為80~280r/min，pH 3~8條件下，震動培養(yǎng)7~15天；培養(yǎng)中當(dāng)pH值降到2.5~4時，將搖瓶中的種子接種到50L發(fā)酵罐的培養(yǎng)液中，以溫度20~35°C，發(fā)酵罐壓力0.1~0.2公斤/平方厘米，pH 3~8，通氣量0.5~1.lvvm,攪拌速度100~280轉(zhuǎn)/分的條件，培養(yǎng)7~15天，即可得到火木層孔菌菌絲體發(fā)酵全液； (2)取步驟(1)中所得火木層孔菌菌絲體發(fā)酵全液，將其以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/2~1/5 ； (3)用體積百分比為60~95%的乙醇對上述步驟(2)濃縮后的發(fā)酵液進(jìn)行提取，其中，加入乙醇的量是濃縮液體積的2~8倍，能夠使提取液中乙醇濃度達(dá)到60~90% ； (4)對步驟(3)所得提取液在50~70°C條件下，加熱I~2小時；以常規(guī)方法進(jìn)行分離，并通過二級過濾除去雜質(zhì)，分離獲得乙醇提取液；將上述乙醇提取液以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/5~1/10 ； (5)將將步驟(4)所得的濃縮液以低溫冷凍干燥的方法進(jìn)行干燥，得火木層孔菌粗提物。
4.如權(quán)利要求3所述的環(huán)二肽Cl在制備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應(yīng)用，其特征在于所述液體培養(yǎng)基配方以克/100毫升計是: 玉米淀粉 1-5%葡萄糖 1-5% 蛋白胨 0.1-0.5%酵母膏 0.1-0.5% 硫酸鎂 0.1-0.5%磷酸二氫鉀0.01-0.05%。
5.如權(quán)利要求3所述的環(huán)二肽Cl在制備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應(yīng)用，其特征在于火木層孔菌粗提物制備步驟(3)的乙醇為濃度65%-95%食用乙醇，所用體積為3-6倍體積。
6.如權(quán)利要求2所述的環(huán)二肽Cl在制備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應(yīng)用，其特征在于，步驟(2)中所述的拌樣硅膠為100-200目正相硅膠，層析硅膠為正相200-300目，洗脫劑為氯仿和/或甲醇。
7.如權(quán)利要求2所述的環(huán)二肽Cl在制備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應(yīng)用，其特征在于，步驟(3)中所述的硅膠用量為等體積，洗脫劑為氯仿與甲醇。
8.如權(quán)利要求2所述的環(huán)二肽Cl在制備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應(yīng)用，其特征在于，步驟(4)中所述的凝膠為Sephadex LH-20, Sephadex LH-25,洗脫劑為甲醇。
9.如權(quán)利要求2所述的環(huán)二肽Cl在制備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應(yīng)用，其特征在于，步驟(5)所述的反相材料為C-18或者C-8，洗脫劑為甲醇:水=1: 10-1: I。
10.如權(quán)利要求2所述的環(huán)二肽Cl在制備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應(yīng)用，其特征在于，步驟(6)所述的HPLC條件為，Omin，100%A水一IOmin, 100%甲醇，出鋒時間為5.3-5.8min。
【文檔編號】A61P31/16GK103800329SQ201310401649
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2013年9月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月6日
【發(fā)明者】趙晨, 宋愛榮, 孔超, 黃芳 申請人:青島農(nóng)業(yè)大學(xué)