火木層孔菌中甲基苯二酚在抗禽流感h5n1病毒上的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種從火木層孔菌Phellinus?igniarius?(Lex?Fr)Quel（裂蹄木層孔菌phellinus?linteus(Berket?Curt)Teng、鮑氏層孔菌Phellinus?baumii、哈蒂針層孔菌Phellinus?hartigii(Alleschet?Schnabl)Imaz）發(fā)酵液和子實體中分離的具有抗禽流感活性的甲基苯二酚。本發(fā)明首次公開了甲基苯二酚的一種新活性，證明其具有抗禽流感病毒H5N1作用。本方法較一般化合物應(yīng)用的優(yōu)點在于：發(fā)現(xiàn)了這種甲基苯二酚的新活性，證明其具有抗禽流感病毒的作用，為禽類生產(chǎn)中，禽流感的治療增添了一種新藥物。
【專利說明】火木層孔菌中甲基苯二酚在抗禽流感H5N1病毒上的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種抗禽流感H5N1病毒的火木層孔菌中活性物質(zhì)的提取制備方法，尤其涉及的火木層孔菌菌種，已于2013年8月26日保藏在“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，保藏編號為CGMCC N0.8108，分類名稱為火木層孔菌Phellinusigniarius，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所。
【背景技術(shù)】
[0002]苯二酚能與蒸汽一起揮發(fā)，是強還原劑，遇明火能燃燒，受高熱散發(fā)出有毒、有腐蝕性氣味，能經(jīng)皮膚引起中毒，能升華，對中樞神經(jīng)、呼吸系統(tǒng)有刺激作用，大鼠經(jīng)口 LD50為3890mg/kg,與間苯二酹及對苯二酹不同。
[0003]目前，抗禽流感病毒的藥物種類主要集中于單克隆抗體，種類單一，有一定的局限性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明公開了一種從藥用菌中分離的具有抗禽流感活性的甲基苯二酚。本方法較一般化合物應(yīng)用的優(yōu)點在于:發(fā)現(xiàn)了該種甲基苯二酚的新活性，具有抗禽流感病毒的作用。為抗球流感病毒提供了新的思路與方向。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
首先制備火木層孔菌粗提物，由下述方法制得:
(1)發(fā)酵培養(yǎng)基配方以克/100毫升計是:`
玉米淀粉 1-5%葡萄糖 1-5%
蛋白胨 0.1-0.5%酵母膏 0.1-0.5%
硫酸鎂 0.1-0.5%磷酸二氫鉀0.01-0.05%
(2)將火木層孔菌菌種以常規(guī)方法接種到裝有液體培養(yǎng)基的三角燒瓶內(nèi)，以20~35°C溫度，搖瓶轉(zhuǎn)速為80~280r/min，pH 3~8條件下，震動培養(yǎng)7~15天；培養(yǎng)中當(dāng)pH值降到2.5~4時，將搖瓶中的種子接種到50L發(fā)酵罐的培養(yǎng)液中，以溫度20~35°C，發(fā)酵罐壓力0.1~0.2公斤/平方厘米，pH 3~8，通氣量0.5~1.1vvm,攪拌速度100~280轉(zhuǎn)/分的條件，培養(yǎng)7~15天，即可利用火木層孔菌菌絲體發(fā)酵全液制備火木層孔菌粗提物；
(3)取步驟(2)中所得火木層孔菌菌絲體發(fā)酵全液，將其以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/2~1/5 ；
(4)用體積百分比為60~95%的乙醇對上述步驟(3)濃縮后的發(fā)酵液進行提取，其中，加入乙醇的量是濃縮液體積的2~8倍，能夠使提取液中乙醇濃度達到60~90%，乙醇優(yōu)選為濃度65-95%的食用乙醇，所用體積優(yōu)選為濃縮液體積的3-6倍；
(5)對步驟(4)所得提取液在50~70°C條件下，加熱I~2小時；以常規(guī)方法進行分離，并通過二級過濾除去雜質(zhì)，分離獲得乙醇提取液；將上述乙醇提取液以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/5~1/10 ；
(6)將將步驟(5)所得的濃縮液以低溫冷凍干燥的方法進行干燥，得火木層孔菌粗提物。
[0006]然后從火木層孔菌粗提物中甲基苯二酚，步驟如下:火木層孔菌粗提物一正相硅膠層析一氯仿與甲醇梯度洗脫一TLC檢測一正相硅膠層析一甲醇凝膠層析一TLC檢測一正相硅膠層析一TLC檢測一減壓蒸干一為3-甲基-1，2-苯二酚。
[0007]具體方法為:
(1)制備火木層孔菌粗提物；
(2)將步驟(1)所得的乙醇沉淀物與正相硅膠混勻攪拌，干燥后進行硅膠正相柱層析，使用洗脫劑洗脫2-5次，得到洗脫液；
(3)將步驟(2)中最后一次洗脫液減壓蒸干，等體積硅膠拌樣，進行正相硅膠層析，使用洗脫劑洗脫；
(4)收集步驟(3)得到的洗脫液，減壓濃縮，使用甲醇溶解，進行甲醇凝膠柱層析，使用洗脫劑洗脫，使用TLC檢測收集的洗脫液，適當(dāng)合并洗脫液，減壓干燥；
(5)用步驟4得到的產(chǎn)物再次進行正相硅膠層析，洗脫劑為氯仿與甲醇；
(6)TLC檢測，適度合并洗脫液，加壓干燥，即為甲基苯二酚。
[0008]優(yōu)選的，提取步驟(2)中所述的拌樣硅膠為100-200目正相硅膠，層析硅膠為正相200-300目，洗脫劑為氯仿和/或甲醇；
提取步驟(3)中所述的硅膠用量為等體積，洗脫劑為石油醚:丙酮=20:1-40:1 ; 提取步驟(4)中所述的凝膠為S^hadex LH-20，洗脫劑為甲醇；
提取步驟(5)所述的洗脫劑為氯仿:甲醇=100:1-150:1 ;
提取步驟(6)所述的TLC檢測，展開劑為氯仿:甲醇=25:1-40:1。
[0009]實例1:
火木層孔菌粗提物，由下述方法制得:
(1)發(fā)酵培養(yǎng)基配方以克/100毫升計是:
玉米淀粉 1%葡萄糖 1%
蛋白胨 0.1%酵母膏 0.1%
硫酸鎂 0.1%磷酸二氫鉀0.01%
(2)將火木層孔菌菌種以常規(guī)方法接種到裝有液體培養(yǎng)基的三角燒瓶內(nèi)，以25°C溫度，搖瓶轉(zhuǎn)速為110r/min，pH 7條件下，震動培養(yǎng)7天；培養(yǎng)中當(dāng)pH值降到3時，將搖瓶中的種子接種到50L發(fā)酵罐的培養(yǎng)液中，以溫度25°C，發(fā)酵罐壓力0.1公斤/平方厘米，pH 3，通氣量0.5-1.lvvm，攪拌速度100轉(zhuǎn)/分的條件，培養(yǎng)7天，即可利用火木層孔菌菌絲體發(fā)酵全液制備火木層孔菌粗提物。
[0010](3)取步驟(2)中所得火木層孔菌菌絲體發(fā)酵全液，將其以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/3 ；
(4)用體積百分比為70%的乙醇對上述步驟(3)濃縮后的發(fā)酵液進行提取，其中，加入乙醇的量是濃縮液體積的5倍，能夠使提取液中乙醇濃度達到55% ；
(5)對步驟(4)所得提取液在70°C條件下，加熱1小時；以常規(guī)方法進行分離，并通過二級過濾除去雜質(zhì)，分離獲得乙醇提取液；將上述乙醇提取液以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/5 ；
(6)將將步驟(5)所得的濃縮液以低溫冷凍干燥的方法進行干燥，得火木層孔菌粗提物。
[0011]將上述粗提物稱取100g與等體積100目正相硅膠混勻攪拌，進行硅膠正相柱層析。層析固定相為200-300目正相硅膠，柱高0.8m，直徑10cm，洗脫劑為分別為氯仿，氯仿:甲醇=100:1，分別洗脫3，4個柱體積。并將所得洗脫液分別命名為Fr-l，F(xiàn)r-2。將Fr_2等體積硅膠拌樣，使用硅膠為100目正相硅膠，五倍體積硅膠層析，使用的硅膠為200— 300目正相硅膠。洗脫劑為石油醚:丙酮=20:1。減壓濃縮洗脫液，使用甲醇溶解，甲醇凝膠柱層析。使用TLC檢測收集的洗脫液適當(dāng)合并，減壓蒸干，再次進行正相硅膠層析，洗脫劑為氯仿與甲醇，對洗脫液進行TLC檢測，適當(dāng)合并，加壓干燥，進行1D-HNMR核磁共振分析，頻率為400MHZ，分析結(jié)果為δ 6.71 (s, 1H)，2.26 (s, 1H).證明是為3-甲基-1，2-苯二酚。
[0012](7)采用步驟(6)得到的麥角甾酮進行對MDCK細(xì)胞毒性的測定，確定其半數(shù)中毒濃度(CC5tl)及最大安全濃度。
[0013]在96孔板上，100 μ I/孔加入4X IO5Iiir1濃度的MDCK細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24 h后，在單層細(xì)胞上分別加入不同濃度的含樣維持液，每種濃度重復(fù)3孔，并設(shè)正常細(xì)胞對照。置370C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，棄培養(yǎng)液上清，100 μ I/孔加入5 mg.Hir1MTT的維持液，繼續(xù)培養(yǎng)Ih后，棄MTT上清，每孔加溶解液(DMSO) 100 μ 1，振蕩5_10 min，待結(jié)晶完全溶解，酶標(biāo)儀測492nm處的OD值。計算出樣品的半數(shù)中毒濃度(CC5tl)及最大安全濃度。當(dāng)加樣組的OD492值不顯著低于細(xì)胞對照組OD492時，此濃度即為樣品的最大安全濃度。
[0014]表1 3-甲基-1，2-苯二酚各濃度對細(xì)胞生長的影響
【權(quán)利要求】
1.甲基苯二酚在制備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的甲基苯二酚在制備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應(yīng)用，其特征在于甲基苯二酚是從火木層孔菌中提取的，提取步驟順序如下: (1)制備火木層孔菌粗提物； (2)將步驟(1)所得的乙醇沉淀物與正相硅膠混勻攪拌，干燥后進行硅膠正相柱層析，使用洗脫劑洗脫2-5次，得到洗脫液； (3)將步驟(2)中最后一次洗脫液減壓蒸干，等體積硅膠拌樣，進行正相硅膠層析，使用洗脫劑洗脫； (4)收集步驟(3)得到的洗脫液，減壓濃縮，使用甲醇溶解，進行甲醇凝膠柱層析，使用洗脫劑洗脫，使用TLC檢測收集的洗脫液，適當(dāng)合并洗脫液，減壓干燥； (5)用步驟4得到的產(chǎn)物再次進行正相硅膠層析，洗脫劑為氯仿與甲醇； (6)TLC檢測，適度合并洗脫液，加壓干燥，即為甲基苯二酚。
3.如權(quán)利要求2所述的甲基苯二酚在制備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應(yīng)用，其特征在于所述火木層孔菌粗提物，由下述方法制得: (1)將火木層孔菌菌種以常規(guī)方法接種到裝有液體培養(yǎng)基的三角燒瓶內(nèi)，以20~35°C溫度，搖瓶轉(zhuǎn)速為80~280r/min，pH 3~8條件下，震動培養(yǎng)7~15天；培養(yǎng)中當(dāng)pH值降到2.5~4時，將搖瓶中的種 子接種到50L發(fā)酵罐的培養(yǎng)液中，以溫度20~35°C，發(fā)酵罐壓力0.1~0.2公斤/平方厘米，pH 3~8，通氣量0.5~1.lvvm,攪拌速度100~280轉(zhuǎn)/分的條件，培養(yǎng)7~15天，即可得到火木層孔菌菌絲體發(fā)酵全液； (2)取步驟(1)中所得火木層孔菌菌絲體發(fā)酵全液，將其以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/2~1/5 ； (3)用體積百分比為60~95%的乙醇對上述步驟(2)濃縮后的發(fā)酵液進行提取，其中，加入乙醇的量是濃縮液體積的2~8倍，能夠使提取液中乙醇濃度達到60~90% ； (4)對步驟(3)所得提取液在50~70°C條件下，加熱I~2小時；以常規(guī)方法進行分離，并通過二級過濾除去雜質(zhì)，分離獲得乙醇提取液；將上述乙醇提取液以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/5~1/10 ； (5)將將步驟(4)所得的濃縮液以低溫冷凍干燥的方法進行干燥，得火木層孔菌粗提物。
4.如權(quán)利要求3所述的甲基苯二酚在制備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應(yīng)用，其特征在于所述液體培養(yǎng)基配方以克/100毫升計是: 玉米淀粉 1-5%葡萄糖 1-5% 蛋白胨 0.1-0.5%酵母膏 0.1-0.5% 硫酸鎂 0.1-0.5%磷酸二氫鉀0.01-0.05%。
5.如權(quán)利要求3所述的甲基苯二酚在制備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應(yīng)用，其特征在于火木層孔菌粗提物制備步驟(3)的乙醇為濃度65%-95%食用乙醇，所用體積為3-6倍體積。
6.如權(quán)利要求2所述的甲基苯二酚在制備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應(yīng)用，其特征在于，步驟⑵中所述的拌樣硅膠為100-200目正相硅膠，層析硅膠為正相200-300目，洗脫劑為氯仿和/或甲醇。
7.如權(quán)利要求2所述的甲基苯二酚在制備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應(yīng)用，其特征在于，步驟(3)中所述的硅膠用量為等體積，洗脫劑為石油醚:丙酮=20:1-40:1。
8.如權(quán)利要求2所述的甲基苯二酚在制備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應(yīng)用，其特征在于，步驟(4)中所述的凝膠為S^hadex LH-20，洗脫劑為甲醇。
9.如權(quán)利要求2所述的甲基苯二酚在制備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應(yīng)用，其特征在于，步驟(5)所述的洗脫劑為氯仿:甲醇=100:1-150:1。
10.如權(quán)利要求2所述的甲基苯二酚在制備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應(yīng)用，其特征在于，步驟(6 )所述的TLC檢測，展開劑為氯仿:甲醇=25:1-40:1。
【文檔編號】A61P31/16GK103816137SQ201310401654
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2013年9月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月6日
【發(fā)明者】趙晨, 宋愛榮, 孔超, 黃芳, 梁大勇 申請人:青島農(nóng)業(yè)大學(xué)