葛根素在tbbpa誘導(dǎo)心臟發(fā)育毒性中的保護作用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了環(huán)境污染物TBBPA所誘導(dǎo)毒害的研究和評價方法及一種中藥有效成分在環(huán)境污染物TBBPA所致病害的防護方面的新應(yīng)用，尤其涉及葛根素在TBBPA誘導(dǎo)毒害方面的保護作用。本發(fā)明通過對不同濃度的TBBPA暴露斑馬魚胚胎后的形態(tài)學指標測試，毒性靶器官的探尋，凋亡及凋亡機制的觀察與解析，深入解釋TBBPA毒性機制。結(jié)果顯示葛根素對TBBPA誘導(dǎo)的在斑馬魚胚胎心血管發(fā)育過程中有重要意義的相關(guān)基因Tbx1,Bmp2b及Raldh2的異常表達具有顯著抑制作用。探討了葛根素對TBBPA誘導(dǎo)斑馬魚胚胎發(fā)育毒性的保護作用，既有助于探討中藥有效成分的藥用價值和作用機理，也可為環(huán)境污染物危害防治提供新路徑。
【專利說明】葛根素在TBBPA誘導(dǎo)心臟發(fā)育毒性中的保護作用
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001]本發(fā)明涉及中藥有效成分在環(huán)境污染物所致病害的防護方面的新應(yīng)用，尤其是涉及葛根素在TBBPA誘導(dǎo)心臟發(fā)育毒性方面的保護作用。
[0002]背景研究:
[0003]近年來，隨著合成材料工業(yè)的迅速發(fā)展，高分子材料廣泛應(yīng)用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、國防等領(lǐng)域，與人們的生活密切相關(guān)。高分子材料在給生活帶來便利的同時也帶來許多安全隱患，比如易燃性，這就迫使人們對各種合成材料提出了阻燃的要求。研究發(fā)現(xiàn)，通過添加阻燃劑或者通過化學反應(yīng)在高分子材料中引入阻燃基團，能有效提高材料的抗燃性。溴代阻燃劑(BFRs)是合成高分子材料的重要助劑之一，其功能是使合成材料具有難燃性、自熄性和消煙性，其工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用始于60年代的美國，此后阻燃劑的用量隨著社會的現(xiàn)代化發(fā)展而持續(xù)增長。
[0004]四溴雙酚A (Tetrabromo-bisphenol A, TBBPA)是目前全球生產(chǎn)量和使用量最大的溴代阻燃劑(BRFs)之一，被廣泛應(yīng)用于印刷線路板、丙烯腈-苯乙烯-丁二烯共聚物(ABS)、耐沖擊性聚苯乙烯(HIPS)等多種材料的合成中，以提高阻燃性。全球TBBPA年產(chǎn)量已超過170000噸，其中76%在亞洲，我國年產(chǎn)量約為18000噸，約為全球的1/10左右，近些年，它在各種環(huán)境介質(zhì)如沉積物、土壤、水體、大氣及生物體中被檢測到，德國河流水體TBBPA濃度范圍為0.2-20.4ng/L。湖泊是陸源TBBPA等有機污染物重要的富集庫，我國巢湖、青島和珠江三角洲近岸海域的水體、沉積物和魚體中也均已檢出TBBPA的存在。TBBPA在魚類體內(nèi)檢出含量可高達245ng/g，巢湖沉積物和水體中濃度為分別為21.96-481.80 μ g/kg和0-4.77 μ g/L,為全球已有報道的最高值；最新數(shù)據(jù)顯示，Hongfeng等檢測到珠江三角洲表層沉積物中TBBP`A含量為干重0.03-31.6ng/g,且結(jié)合在沉積物中的TBBPA含量有上升趨勢。
[0005]就生態(tài)毒理效應(yīng)而言，TBBPA對哺乳動物的免疫毒性、細胞和神經(jīng)毒性、內(nèi)分泌干擾效應(yīng)等研究方面已取得一定進展，但對水生生物毒理學的研究開展較少。TBBPA對魚類具有強毒性，同時具有高親脂性、良好熱穩(wěn)定性及一定溶解性，使其容易通過水環(huán)境介質(zhì)沿食物鏈累積并向上傳遞，最終對魚類及人體具有潛在毒害威脅，考慮到我國水體TBBPA環(huán)境暴露水平較高的特點，魚類毒理學的研究日益成為關(guān)注的重點。然而，TBBPA對魚類的毒性仍然數(shù)據(jù)不足，這也正是歐盟未能同時提供TBBPA生態(tài)風險評估報告的重要原因。因此當前迫切需要加強TBBPA對魚類等水生動物的毒理學研究，以對其生態(tài)風險做出準確和全面的評估。
[0006]斑馬魚(Danio rerio)是常見的暖水性(21_32°C )觀賞魚，鯉科，由于其常年產(chǎn)卵，魚卵易收集，而且小規(guī)模飼養(yǎng)技術(shù)簡單，20世紀90年代初開始，被用于有機污染物急、慢性毒性的檢測。斑馬魚胚胎發(fā)育技術(shù)具有材料方便易得、操作簡單、可重復(fù)性及可靠性較高等優(yōu)點，而且與傳統(tǒng)的魚類急性毒性實驗相比，成本低、影響因素少、靈敏度更高、毒性終點觀察項多，并且各個發(fā)育階段可直接在顯微鏡下觀察。近幾年，TBBPA對斑馬魚的毒性作用研究逐漸成為一個研究熱點，相關(guān)毒性機理方面的研究也同時開展，國內(nèi)有關(guān)TBBPA對斑馬魚甲狀腺分泌干擾作用，及國外有關(guān)TBBPA對斑馬魚胚胎發(fā)育性別失調(diào)，神經(jīng)毒性分泌等方向弓丨起極大關(guān)注。然而至今，分子和基因水平的毒性機理研究較少。
[0007]葛根(Radixpuerariae)為豆科植物野葛(Pueraia lobata (Wild.) Ohwi )的干燥根，在我國遼寧、河北、河南、江蘇、福建等地均有分布。它是一種藥食同源中藥，具有極高的營養(yǎng)價值和藥用價值，在我國享有“南葛北參”的美譽，廣泛用于心絞痛、心肌梗及其他心臟疾病的治療。葛根素(Puerarin)是從葛根中提取的異黃酮化合物類主要有效成分之一，化學名為4，7- 二羥基-8- β -d-葡萄糖基異黃酮，分子式為C21H2tlO9,分子量416。葛根素具有降血壓、抗心律失常、保護血管、改善微循環(huán)、抗凋亡、擴張冠狀動脈、抗心肌缺血、抗過氧化、抗缺血-再灌注損傷等多種作用。研究表明，葛根素具有多種心血管藥理作用，且安全低毒，但其作用機制有待深入研究。有學者提出應(yīng)更多地從分子水平，作用靶點等方面揭示其藥理作用，為臨床拓寬其心血管疾病的治療范圍提供依據(jù)。
[0008]目前極少有關(guān)于中藥有效成分對環(huán)境污染物毒性效應(yīng)的保護作用研究。本發(fā)明人深入研究了葛根素對TBBPA誘導(dǎo)斑馬魚胚胎發(fā)育毒性的保護作用，一方面有助于探討中藥有效成分的藥用價值和作用機理，另一方面也對日益引起重視的環(huán)境污染物危害防治提供新的思路。

【發(fā)明內(nèi)容】
:
[0009]本發(fā)明的目的在于提供葛根素的一種新用途，具體即葛根素在環(huán)境污染物TBBPA誘導(dǎo)心臟發(fā)育毒性方面的保護作用。本發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，葛根素對TBBPA誘導(dǎo)的斑馬魚胚胎形態(tài)學發(fā)育毒性具有保護作用，其中，葛根素對TBBPA誘導(dǎo)的斑馬魚胚胎心血管發(fā)育過程中Tbxl，Bmp2b及Raldh2基因的異常表達具有顯著抑制作用。
[0010]在本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供一種葛根素在制備防治環(huán)境污染物所致水生生物病害方面的藥物制劑應(yīng)用。
`[0011]在如上所述的本發(fā)明的應(yīng)用中，其中所述環(huán)境污染物所致病害為四溴雙酚A(TBBPA)誘導(dǎo)的胚胎心臟發(fā)育毒害。
[0012]在如上所述的本發(fā)明的應(yīng)用中，其中所述水生生物為斑馬魚。
[0013]在如上所述的本發(fā)明的應(yīng)用中，其中所述葛根素的使用濃度為1.0mg/L。
[0014]在如上所述的本發(fā)明的應(yīng)用中，其中所述葛根素具有降低TBBPA所致胚胎發(fā)育形態(tài)異常的作用。
[0015]在如上所述的本發(fā)明的應(yīng)用中，其中所述葛根素具有逆轉(zhuǎn)TBBPA所致胚胎心臟發(fā)育相關(guān)基因Tbxl，Raldh2和Bmp2b表達下調(diào)的作用。
[0016]在本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供一種葛根素在制備降低TBBPA所致水生生物胚胎發(fā)育形態(tài)異常的藥物中的應(yīng)用。
[0017]在如上所述的本發(fā)明的應(yīng)用中,其中所述水生生物為斑馬魚。
[0018]在如上所述的本發(fā)明的應(yīng)用中，其中所述葛根素的使用濃度為1.0mg/L。
[0019]在本發(fā)明的又一個方面，本發(fā)明提供一種葛根素在制備逆轉(zhuǎn)TBBPA所致水生生物胚胎心臟發(fā)育相關(guān)基因Tbxl，Raldh2和Bmp2b表達下調(diào)的藥物方面的應(yīng)用。
[0020]在如上所述的本發(fā)明的應(yīng)用中，其中所述水生生物為斑馬魚。
[0021]在如上所述的本發(fā)明的應(yīng)用中，其中所述葛根素的使用濃度為1.0mg/L。[0022]本發(fā)明具有如下有益效果:
[0023]第一，本發(fā)明通過對不同濃度的TBBPA暴露斑馬魚胚胎后的形態(tài)學指標測試，毒性靶器官的探尋，凋亡及凋亡機制的觀察與解析，及分子水平層層深入解釋TBBPA毒性機制，特別是對相關(guān)基因異常表達的檢測，將有利于系統(tǒng)闡釋TBBPA毒性機制，甚至預(yù)測污染物潛在的毒性效應(yīng)。更為重要的是，分子水平的生化指標能夠標識低水平接觸環(huán)境毒物后的生物效應(yīng)，敏銳反映正常和應(yīng)激狀態(tài)下的變化，還將有助于發(fā)現(xiàn)新的生物標志物，建立起更加靈敏高效的安全性評價方法。
[0024]第二，本發(fā)明探討了葛根素對TBBPA誘導(dǎo)斑馬魚胚胎發(fā)育毒性的保護作用，一方面有助于探討中藥有效成分的藥用價值和作用機理，另一方面也對日益引起重視的環(huán)境污染物危害防治提供新的路徑
[0025]第三，本發(fā)明顯示，葛根素對TBBPA誘導(dǎo)的斑馬魚胚胎心血管發(fā)育過程中Tbxl，Bmp2b及Raldh2基因的異常表達具有顯著抑制作用。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0026]圖1斑馬魚胚胎暴露于不同濃度TBBPA后各形態(tài)學指標觀測結(jié)果，各指標與空白對照組比較，one-way ANOVA 分析，*ρ〈0.05;**ρ〈0.01;***ρ〈0.001 ；
[0027]圖2斑馬魚幼體暴露于TBBPA96h后卵凝結(jié)、心包水腫、畸形及AO染色觀測結(jié)果；其中，A示24h發(fā)育正常受精卵；B示卵凝結(jié)導(dǎo)致死亡；C示48h正常卵；D示48h心包水腫；E示畸形；F-J:分別為空白對照及從低到高不同濃度TBBPA暴露96h后的AO染色結(jié)果；
[0028]圖3斑馬魚胚胎暴露于不同濃度TBBPA后瓊脂糖凝膠電泳檢測DNAladder凋亡結(jié)果;
[0029]圖4PCR熔解曲線觀測；`
[0030]圖5TBBPA暴露96h后斑馬魚胚胎凋亡相關(guān)基因P53, Bax, Caspase9和Bcl-2的表達水平檢測結(jié)果；各指標與空白對照組比較，one-way ANOVA分析，*ρ〈0.05;**ρ〈0.01;***ρ〈0.001 ；
[0031]圖6葛根素保護作用下各實驗組斑馬魚胚胎的死亡率、畸形率和孵化率觀測結(jié)果；0ne-Way ANOVA分析，各指標與空白對照組比較顯著性差異用星號表示，P+T組與T組結(jié)果比較顯著性差異用井號表示，*Ρ〈0.05 ;**ρ〈0.01 ;***ρ〈0.001 ；#ρ<0.05 ；##ρ<0.01 ；###ρ<0.001 ；
[0032]圖7葛根素保護作用下各實驗組斑馬魚胚胎的24h、32h血流障礙及48h心包水腫檢測結(jié)果；one-way ANOVA分析，各指標與空白對照組比較顯著性差異用星號表示，P+T組與T組結(jié)果比較顯著性差異用井號表示，*ρ〈0.05 ;**ρ〈0.01 ;***ρ〈0.001 ；#ρ<0.05 ；##ρ<0.01 ；###ρ<0.001 ；
[0033]圖8葛根素保護作用下各實驗組斑馬魚胚胎心臟發(fā)育相關(guān)基因Tbxl，Bmp2b及Raldh2表達水平；one_way ANOVA分析,各指標與空白對照組比較顯著性差異用星號表示，P+T組與T組結(jié)果比較顯著性差異用井號表示，*ρ〈0.05 ;**ρ〈0.01 ;***ρ〈0.001 ；#ρ<0.05 ；##ρ<0.01 ；###ρ<0.001。
【具體實施方式】[0034]為了更好的理解本發(fā)明的實質(zhì)，下面以非限制性的具體實施例的方式進一步詳細說明本發(fā)明。但并非以此意圖限制本發(fā)明的保護范圍，本發(fā)明并不限于這些實施例。
[0035]實施例1TBBPA誘導(dǎo)斑馬魚胚胎心臟發(fā)育毒性及機理
[0036](一)實驗用品
[0037]斑馬魚(AB種)，中國環(huán)境科學研究院水生生物實驗室；
[0038]四溴雙酚A (TBBPA)，分析純，購自美國Alfa Aesar化學試劑公司(B1138A)；
[0039]吖啶橙(A0)，購自上海綠葉生物科技有限公司(100910)；
[0040]PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit,購自美國 Omega Bio-tek 公司(D6210S)；
[0041]E.Z.N.A.?Total RNA Kitl，購自美國 Omega Bio-tek 公司(R6836-02);
[0042]SYBR Green Supermix，購自美國 Bio-Rad 公司(170-8862)；
[0043]Tricaine (MMS),購自美國 Sigma-Aldrich 公司(D33601);
[0044]乙醇分析純，購自北京化工廠(20110810)；
[0045]凋亡DNA Ladder快速提取試劑盒，購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司(ZP324)；
[0046]DNA Ladder Marker,購自Takara寶生物工程有限公司；
[0047]PBS 緩沖液，購自北京 Neuronbc 公司(1115203)；
[0048]引物序列見下表:
[0049]表I引物序列
【權(quán)利要求】
1.葛根素在制備防治環(huán)境污染物所致水生生物病害方面的藥物制劑方面應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中所述環(huán)境污染物所致病害為四溴雙酚A(TBBPA)誘導(dǎo)的胚胎心臟發(fā)育毒害。
3.如權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其中所述水生生物為斑馬魚。
4.如權(quán)利要求1-3任一所述的應(yīng)用，其中所述葛根素的使用濃度為1.0mg/L。
5.如權(quán)利要求1-3任一所述的應(yīng)用，其中所述葛根素具有降低TBBPA所致胚胎發(fā)育形態(tài)異常的作用。
6.如權(quán)利要求1-3任一所述的應(yīng)用，其中所述葛根素具有逆轉(zhuǎn)TBBPA所致胚胎心臟發(fā)育相關(guān)基因Tbxl，Raldh2和Bmp2b表達下調(diào)的作用。
7.葛根素在制備一種降低TBBPA所致水生生物胚胎發(fā)育形態(tài)異常的藥物中的應(yīng)用。
8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其中所述水生生物為斑馬魚。
9.如權(quán)利要求7或8所述的應(yīng)用，其中所述葛根素的使用濃度為1.0mg/L。
10.葛根素在制備一種逆轉(zhuǎn)TBBPA所致水生生物胚胎心臟發(fā)育相關(guān)基因Tbxl，Raldh2和Bmp2b表達下調(diào)的藥物方面的應(yīng)用。
11.如權(quán)利要求10所述的應(yīng)用，其中所述水生生物為斑馬魚。
12.如權(quán)利要求10或11所述的應(yīng)用，`其中所述葛根素的使用濃度為1.0mg/L。
【文檔編號】A61K31/352GK103432113SQ201310410522
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年9月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月10日
【發(fā)明者】楊蘇文, 鄭丙輝, 王圣瑞 申請人:中國環(huán)境科學研究院