一株擬微綠球藻突變株及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種擬微綠球藻(Nannochloropsis?sp)及其應(yīng)用，本發(fā)明的擬微綠球藻具有環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)，高溫耐受能力強(qiáng)，油脂尤其是二十碳五烯酸含量高，對(duì)CO2的處理能力強(qiáng)的更加適于工業(yè)應(yīng)用等優(yōu)點(diǎn)，可用于生物柴油生產(chǎn)，食品、保健品、飼料、水產(chǎn)品餌料、藥物的生產(chǎn)并可用于高溫養(yǎng)殖。
【專利說明】一株擬微綠球藻突變株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，尤其涉及一種擬微綠球藻突變株ENNl 1-3 (Nannochloropsis sp)及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著世界化石燃料儲(chǔ)備量的逐步耗竭，二氧化碳排放量的不斷增加以及全球氣候的日益趨暖，人類的生存和發(fā)展?fàn)顩r已經(jīng)面臨前所未有的挑戰(zhàn)。因此，因此，世界各國(guó)都在積極尋找能夠替代石油產(chǎn)品的可再生能源，其中，生物柴油就是一種重要的生物能源，然而，常見的油料作物例如玉米和大豆等培育周期較長(zhǎng)，占用農(nóng)田較多，會(huì)產(chǎn)生“與人爭(zhēng)糧，與糧爭(zhēng)地”問題，從而導(dǎo)致“解決了能源危機(jī)，卻出現(xiàn)糧食危機(jī)”的尷尬結(jié)果。
[0003]微藻是一類在陸地、海洋分布廣泛，營(yíng)養(yǎng)豐富，生長(zhǎng)周期短，光合利用度高的以光合自養(yǎng)產(chǎn)生能量的低等植物，是自然界起源最早、分布最廣、種類和數(shù)量最大的生物質(zhì)資源。在一定條件下許多微藻能夠在細(xì)胞中大量積累儲(chǔ)藏性三酰甘油(微藻油)(類似于植物油)，其最高含量可達(dá)到細(xì)胞干重的50%以上。與高等陸生油料作物相比，微藻的單位面積油產(chǎn)量是油料植物油產(chǎn)量的數(shù)十倍，經(jīng)過生物冶煉可以生產(chǎn)生物柴油等多種生物燃料，被認(rèn)為是最有可能最有潛力成為石油替代品的生物質(zhì)資源。
[0004]除了油產(chǎn)量非常高之外，微藻還富含蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、各種氨基酸、維生素、抗生素、高不飽和脂肪酸以及其它多種生物活性物質(zhì)，因此，在保健食品、醫(yī)藥和飼料等領(lǐng)域也同樣具有很好的開發(fā)前景，例如，用于食料和醫(yī)藥業(yè)(人和動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充物:維生素、蛋白質(zhì)、脂肪酸、多糖等)；提取化工產(chǎn)業(yè)如化妝品、精細(xì)化工產(chǎn)品等；作為能源產(chǎn)生沼氣、燃料；用于餌料和飼料業(yè)(魚蝦、甲殼動(dòng)物等水產(chǎn)動(dòng)物的餌料(CN1742570)、家禽飼料等)；農(nóng)業(yè)上作為土壤調(diào)節(jié)劑、肥料等。
[0005]擬微綠球藻(Nannochloropsis sp.)是一種重要的海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)微藻，其生長(zhǎng)速度快，抗逆性強(qiáng)，脂肪酸組成簡(jiǎn)單，富含EPA，是一種非常有潛力的藻種。擬微綠球藻的最適生長(zhǎng)溫度為25°C~30°C，當(dāng)溫度超過35°C時(shí)，其生長(zhǎng)完全被抑制，藻細(xì)胞會(huì)逐漸死亡。我國(guó)大部分地區(qū)夏季炎熱高溫，擬微綠球藻難以在夏季進(jìn)行大規(guī)模養(yǎng)殖。如果能通過誘變獲得耐受高溫的藻株，將擴(kuò)大該藻的應(yīng)用范圍，對(duì)我國(guó)擬微綠球藻養(yǎng)殖具有重要意義。
[0006]目前擬微綠球藻的研究和篩選工作已經(jīng)展開，Ratnesh Chaturvedi和Yuj iFujita (A Isolation of enhanced eicosapentaenoic acid producing mutants ofNannochloropsis oculata ST_6using ethyl methane sulfonate induced mutagenesistechniques and their characterization at mRNA transcript level, PhycologicalResearch54:208 - 219，2006.)針對(duì)擬微綠球藻藻株的脂肪酸含量進(jìn)行了篩選，但所篩選出來的藻株的高溫耐受能力并沒有顯著提高，而且這一藻株是否能推廣至室外培養(yǎng)也有待驗(yàn)證。楊官品等人(溫度逆境處理提高擬微球藻(Nannochloropsis oculata)研究了溫度逆境處理?xiàng)l件下擬微綠球藻藻株的脂肪酸含量變化，并沒有得到高溫耐受能力提升的藻株。
[0007]因此，在本領(lǐng)域中需要具有高溫耐受能力的擬微綠球藻藻株。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于提供一種對(duì)環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)，高溫耐受能力強(qiáng)，油脂含量高，對(duì)CO2的處理能力強(qiáng)的更加適于工業(yè)應(yīng)用的擬微綠球藻。
[0009]為達(dá)此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0010]在第一方面,本發(fā)明提供了一種擬微綠球藻ENN11-3 (Nannochloropsis sp.),保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期為2012年9月5日，保藏編號(hào)為CGMCC N0.6446。
[0011]本發(fā)明提供的擬微綠球藻ENN11-3的生長(zhǎng)耐受最高溫度為42°C。。
[0012]本發(fā)明提供的擬微綠球藻ENN11-3 可以在 25°C、26°C、27°C、28°C、29°C、30°C、31°〇、321:、331:、341:、351:、361:、371:、381:、391:、401:、411:或421:下生長(zhǎng)。
[0013]在第二方面，本發(fā)明提供了如第一方面所述的擬微綠球藻ENN11-3的培養(yǎng)方法，包括將擬微綠球藻藻株ENN11-3綠色細(xì)胞接種在海水培養(yǎng)基中，其中光照強(qiáng)度 50-500 μ mol/m2.s,優(yōu)選 100-450 μ mol/m2.s,更優(yōu)選 150-400 μ mol/m2.s,還更優(yōu)選200-350 μ mol/m2.s,最優(yōu)選 250-300 μ mol/m2.s ；ρΗ 值 7-9,優(yōu)選 7.5-8.5，更優(yōu)選 8 ;溫度25-42°C，優(yōu)選30-38°C ;且在培養(yǎng)期內(nèi)，通過向培養(yǎng)液中通入二氧化碳體積分?jǐn)?shù)為1.5-2%的空氣。
[0014]在本發(fā)明的擬微綠球藻ENN11-3的培養(yǎng)方法中，光照強(qiáng)度可以為50ymol/m2.S、80 μ mol/m2.S、100 μ mol/m2.S、120 μ mol/m2.S、150 μ mol/m2.S、180 μ mol/m2.S、200 μ mo I/m2.s、220 μ mol/m2.s、250 μ mol/m2.s、280 μ mol/m2.s、300 μ mol/m2.s、320 μ mol/m2.s、350 μ mol/m2.s、380 μ mol/m2.s、400 μ mol/m2.s、420 μ mol/m2.s、450 μ mol/m2.s、480 μ mol/m2.s 或 500ymol/m2.s ;pH 值可以為 7、7.2、7.5、7.8、8、8.2、8.5、8.8 或9 ;溫度可以為 25°C、26 °C >27 °C >28 °C >29 °C >30 °C >31 °C >32 °C >33 °C >34 °C >35 °C >36 °C >37 °C >38 °C >39 °C >40 °C >41°C或 42°C。
[0015]在第三方面，本發(fā)明提供了如第一方面所述的擬微綠球藻ENN11-3在脂肪酸生產(chǎn)中的應(yīng)用，優(yōu)選地，所述脂肪酸是癸酸、月桂酸、豆蘧酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、十八碳烯酸、十八碳二烯酸、Y -亞麻酸、花生四烯酸和/或二十碳五烯酸，優(yōu)選為二十碳五烯酸。
[0016]在第四方面，本發(fā)明提供了如第一方面所述的擬微綠球藻ENN11-3在生物燃料生產(chǎn)中的應(yīng)用，優(yōu)選地，所述生物燃料是生物柴油或生物乙醇。
[0017]在第五方面，本發(fā)明提供了如第一方面所述的擬微綠球藻ENN11-3在環(huán)境保護(hù)中的應(yīng)用，優(yōu)選地所述環(huán)境保護(hù)為CO2減排。
[0018]在第六方面，本發(fā)明提供了如第一方面所述的擬微綠球藻ENN11-3在擬微綠球藻高溫養(yǎng)殖中的應(yīng)用，其中所述高溫為35-42°C。
[0019]在第七方面，本發(fā)明提供了如第一方面所述的擬微綠球藻ENN11-3在癸酸、月桂酸、豆蘧酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、十八碳烯酸、十八碳二烯酸、Y -亞麻酸、花生四烯酸和/或二十碳五烯酸的藥物的制備中的用途，優(yōu)選地在制備包含二十碳五烯酸的藥物中的應(yīng)用。
[0020]在第八方面，本發(fā)明提供了如第一方面所述的擬微綠球藻ENN11-3在包含癸酸、月桂酸、豆蘧酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、十八碳烯酸、十八碳二烯酸、Y -亞麻酸、花生四烯酸和/或二十碳五烯酸的食品、保健品、飼料和/或水產(chǎn)品餌料生產(chǎn)中的用途。
[0021 ] 在本發(fā)明中，海水培養(yǎng)基為本領(lǐng)域中最常用的藻類培養(yǎng)基，其具體組分見下文。 [0022]本發(fā)明的有益技術(shù)效果為:
[0023]1、本藻種性能穩(wěn)定、環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，高溫耐受能力強(qiáng)，適合產(chǎn)業(yè)化推廣
[0024]2、本藻種油脂積累快，含油量高，適合用來生產(chǎn)生物柴油
[0025]3、本藻種二十碳五烯酸含量較高，適合用來生產(chǎn)相關(guān)藥物、食品、保健品、飼料、水產(chǎn)品餌料等。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1是在室內(nèi)柱式反應(yīng)器中培養(yǎng)本發(fā)明的擬微綠球藻ENN11-3的溫度曲線圖。
[0027]圖2是在室內(nèi)柱式反應(yīng)器中培養(yǎng)本發(fā)明的擬微綠球藻ENN11-3的干重變化曲線。
[0028]圖3是在室內(nèi)柱式反應(yīng)器中培養(yǎng)本發(fā)明的擬微綠球藻ENNl 1-3的脂肪酸含量(占藻粉)變化圖。
[0029]圖4是本發(fā)明的擬微綠球藻ENN11-3進(jìn)行室外管式高溫養(yǎng)殖的溫度變化曲線。
[0030]圖5是本發(fā)明的擬微綠球藻ENN11-3進(jìn)行室外管式高溫養(yǎng)殖的干重變化曲線。
[0031]圖6是本發(fā)明的擬微綠球藻ENN11-3進(jìn)行室內(nèi)板式高溫養(yǎng)殖的溫度變化曲線。
[0032]圖7是本發(fā)明的擬微綠球藻ENN11-3進(jìn)行室內(nèi)板式高溫養(yǎng)殖的干重變化曲線。
[0033]圖8是本發(fā)明的擬微綠球藻ENNl 1-3進(jìn)行室外板式高溫養(yǎng)殖的脂肪酸含量(占藻粉)圖。
[0034]圖9是本發(fā)明的擬微綠球藻ENN11-3進(jìn)行室外板式廢氣養(yǎng)殖的溫度變化曲線。
[0035]圖10是本發(fā)明的擬微綠球藻ENNl 1-3進(jìn)行室外板式廢氣養(yǎng)殖的0D750變化曲線。
[0036]圖11是本發(fā)明的擬微綠球藻ENN11-3進(jìn)行室外板式廢氣養(yǎng)殖的脂肪酸含量(占藻粉)圖。
[0037]發(fā)明詳述
[0038]發(fā)明人已將所述藻株ENN11-3于2012年9月5日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，簡(jiǎn)稱CGMCC)，其保藏號(hào)為CGMCC N0.6446。
[0039]下面結(jié)合附圖并通過【具體實(shí)施方式】來進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0040]實(shí)施例1ENN11-3藻株的誘變篩選、室內(nèi)養(yǎng)殖及油脂積累
[0041]取對(duì)數(shù)期的擬微綠球藻的新鮮無菌藻液進(jìn)行單功能烷化劑甲基硝基亞硝基胍(MNNG)誘變處理和室外高溫壓力處理，鋪設(shè)平板，挑取個(gè)體較大的單藻落共30株進(jìn)入高溫初篩和高溫復(fù)篩，獲得ENNl 1-3藻株。
[0042]將處在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ENN11-3綠色游動(dòng)細(xì)胞接種在配制好的海水培養(yǎng)基(配方見表1)中，使細(xì)胞密度達(dá)到0D750為0.8-1.2之間，以野生型ENNll為對(duì)照。培養(yǎng)過程光照強(qiáng)度控制在50-500umol/m2.s，在培養(yǎng)期內(nèi)，通過向培養(yǎng)液中通入1.5-2%的二氧化碳和空氣的混合氣體，將培養(yǎng)基的PH值調(diào)節(jié)在7-9之間。培養(yǎng)所使用的反應(yīng)器為40mm內(nèi)徑、長(zhǎng)度600mm的柱式反應(yīng)器。冷暖水機(jī)控溫，室溫25°C培養(yǎng)4天后，第五天溫度升至白天38°C 8小時(shí)，夜間30°C ;從第6天起溫度升至白天42°C6小時(shí)，其余時(shí)間30°C (溫度變化如圖1所示)。培養(yǎng)過程中，定時(shí)取樣測(cè)定干重，結(jié)果見圖2。培養(yǎng)進(jìn)行到第15天，將藻液收集，通過離心或自然沉降的方法獲得藻泥，將藻泥再進(jìn)行真空冷凍干燥。
[0043]表1
[0044]
組分/升
NaCl27.0g
MgSO4JH2O6.6g
MgCl2.6H205 6g
KNO31.45g
CaC12.2H20I 5g
KH2PO40.12g
NaHCO30.04g
Fe-EDTA 溶液I OmL
微量元素溶液I OmL
[0045]Fe-EDTA 溶液:將 2.76g FeCl3.6H20 溶于 IOOOmL0.05M Na2EDTA 溶液微量元素溶液
[0046]
組分/升
CuSO4-SH2OIOmg
ZnSO4JH222mg
[0047]
CoC12.6H20IOmg
MnCl2.4H20丨 80mg
Na2Mo04.2H206mg
[0048]干燥完成后，測(cè)定其油脂組分含量如下表2，分析方法如下:
[0049]I)脂肪酸提取 :
[0050]取50mg或IOOmg凍干藻粉放置在具Telfnon螺口瓶蓋的體積為15_20ml的小玻璃瓶中，再放置一小磁力棒，加入2-4mllO%DMSO-Methanol溶液，40°C砂浴(盛砂的燒杯放置恒溫加熱磁力攪拌器上)5分鐘；然后在4°C下磁力攪拌抽提30分鐘，3500轉(zhuǎn)離心，轉(zhuǎn)移上清液到另一小瓶中。剩下藻渣再加入1:1的乙醚、正己烷4-8ml4°C下磁力攪拌抽提I小時(shí)，3500轉(zhuǎn)離心，轉(zhuǎn)移上清液到上述一小瓶中?？芍貜?fù)上述過程直到藻渣變白。在上述合并抽提液中加入純水使四者(水、DMSO-Methanol、乙醚、正己烷)體積比例為1: 1: 1: 1，震蕩分相，移取有機(jī)相轉(zhuǎn)移到另一小玻璃瓶中，在通風(fēng)櫥中用氮?dú)獯抵脸蓾饪s液，然后轉(zhuǎn)移到事先稱重過的1.5ml塑料離心管中，再用氮?dú)獯蹈芍梁阒亍?br> [0051]2)脂肪酸分析:
[0052]照上面方法進(jìn)行提取后，用正己烷溶解，使用Agilent6820氣相色譜儀進(jìn)行氣相色譜分析(色譜條件為載氣:氮?dú)饬髁縧ml/min、氫氣流量30ml/min、空氣流量300ml/min,進(jìn)樣口溫度:280°C，檢測(cè)器溫度:280°C，檢測(cè)器類型:FID，色譜柱:DB_5毛細(xì)管色譜柱(30mX0.25mm, 0.25 μ m),分流比:4:1。分析方法:內(nèi)標(biāo)法(氣相色譜用氮?dú)庾鬏d氣,相當(dāng)于液相色譜的流動(dòng)相)。
[0053]如圖2所示，加高溫后野生型對(duì)照株ENNll生長(zhǎng)明顯變緩，培養(yǎng)至第10天野生型對(duì)照株ENNll變黃死亡，而突變株ENNl 1-3雖生長(zhǎng)也受到影響，但還能緩慢生長(zhǎng)，沒有死亡，表現(xiàn)出明顯的耐高溫優(yōu)勢(shì)。培養(yǎng)至第9天時(shí)，突變株ENN11-3的脂肪酸含量和EPA含量相比野生株都有一定程度的提高。之后野生對(duì)照株死亡，突變株ENN11-3的脂肪酸含量和EPA含量在高溫逆境下積累雖然受到一定影響，但還能有效積累。培養(yǎng)第13天時(shí)突變株ENNl 1-3的總脂肪酸含量和EPA含量達(dá)到最高，第15天有所下降(圖3)。
[0054]表2氣相色譜測(cè) 定的ENNl 1-3第13d收集樣品的總脂組分:
[0055]
【權(quán)利要求】
1.一種擬微綠球藻ENN11-3 (Nannochloropsis sp.),保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期為2012年9月5日，保藏編號(hào)為CGMCC N0.6446。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的擬微綠球藻ENN11-3，其特征在于，所述擬微綠球藻ENN11-3的生長(zhǎng)耐受:最聞溫度為42°C。
3.如權(quán)利要求1或2所述的擬微綠球藻ENN11-3的培養(yǎng)方法，所述方法包括將擬微綠球藻藻株ENN11-3綠色細(xì)胞接種在海水培養(yǎng)基中，其中光照強(qiáng)度50-500 μ mol/m2.s，優(yōu)選 100-450 μ mol/m2.s,更優(yōu)選 150-400 μ mol/m2.s,還更優(yōu)選 200-350 μ mol/m2.s,最優(yōu)選:250-300 μ mol/m2.s ；ρΗ 值 7-9，優(yōu)選 7.5-8.5，更優(yōu)選 8 ;溫度 25-42°C，優(yōu)選 30-38°C ;且在培養(yǎng)期內(nèi)，通過向培養(yǎng)液中通入二氧化碳體積分?jǐn)?shù)為1.5-2%的空氣。
4.如權(quán)利要求1或2所述的擬微綠球藻ENNl1-3在脂肪酸生產(chǎn)中的應(yīng)用，優(yōu)選地，所述脂肪酸是癸酸、月桂酸、豆蘧酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、十八碳烯酸、十八碳二烯酸、Y -亞麻酸、花生四烯酸和/或二十碳五烯酸，優(yōu)選為二十碳五烯酸。
5.如權(quán)利要求1或2所述的擬微綠球藻ENNl1-3在生物燃料生產(chǎn)中的應(yīng)用，優(yōu)選地，所述生物燃料是生物柴油或生物乙醇。
6.如權(quán)利要求1或2所述的擬微綠球藻ENNl1-3在環(huán)境保護(hù)中的應(yīng)用，優(yōu)選地所述環(huán)境保護(hù)為CO2減排。
7.如權(quán)利要求1或2所述的擬微綠球藻ENNl1-3在擬微綠球藻高溫養(yǎng)殖中的應(yīng)用，其中所述高溫為35-42 °C。
8.如權(quán)利要求1或2所述的擬微綠球藻ENNl1-3在制備包含癸酸、月桂酸、豆蘧酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、十八碳烯酸、十八碳二烯酸、Y -亞麻酸、花生四烯酸和/或二十碳五烯酸的藥物中的應(yīng)用，優(yōu)選地在制備包含二十碳五烯酸的藥物中的應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求1或2所述的擬微綠球藻ENNl1-3在包含癸酸、月桂酸、豆蘧酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、十八碳烯酸、十八碳二烯酸、Y-亞麻酸、花生四烯酸和/或二十碳五烯酸的食品、保健品、飼料和/或水產(chǎn)品餌料生產(chǎn)中的用途。
【文檔編號(hào)】A61K36/05GK103468577SQ201310433259
【公開日】2013年12月25日 申請(qǐng)日期:2013年9月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月22日
【發(fā)明者】李青, 羅少敬, 吳洪 申請(qǐng)人:新奧科技發(fā)展有限公司