一種牛心樸子總生物堿及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種牛心樸子總生物堿，所述牛心樸子總生物堿是將牛心樸子的乙醇提取物用水溶解后，先以濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值，再以濃氨水或氫氧化鈉水溶液調(diào)pH值，最后以有機溶劑萃取得到的，并提供了其制備方法和在制備預(yù)防和治療肝癌或胃癌的藥物中應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明提供的一種牛心樸子總生物堿，是純天然藥物提取，取自天然的動植物，毒副作用相對較小，采用MTT法驗證其體外對肝癌細胞和胃癌細胞的生長抑制作用，結(jié)果顯示，牛心樸子總生物堿對肝癌細胞HepG2和胃癌細胞BGC-823的體外增殖均表現(xiàn)出了較強的抑制作用，對BGC-823細胞比對HepG2細胞更為敏感；小鼠實驗表明，不同劑量的牛心樸子總生物堿能明顯抑制小鼠H22肝癌細胞的生長。
【專利說明】—種牛心樸子總生物堿及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種中醫(yī)藥的提取和應(yīng)用，具體涉及一種牛心樸子總生物堿及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]目前臨床采用的治療肝癌和胃癌的藥物均呈現(xiàn)出不同程度的不良反應(yīng)，如對造血系統(tǒng)的毒性作用，對胃腸道的強烈刺激作用等，致使患者難以接受，最終導致治療失敗。牛心子 Cynanchum komarovii Al Iljinski (Asclepiadaceae)屬于蘿摩科鵝絨藤屬植物，其別名又稱老瓜頭、蘆芯草等。生物堿是牛心樸子中的主要活性成分，從其中分離的7-脫甲氧基娃兒藤堿、氧化脫氧娃兒藤次堿，當濃度為lmg/ml時對P388白血病細胞的抑制率分別達到73.1%和87.5%，其生物堿在農(nóng)業(yè)上對蚜蟲、菜青蟲也有一定防治作用，并對煙草花葉病毒(TMV)有特效。但到目前為止，尚未見牛心樸子總生物堿關(guān)于抗人肝癌和胃癌作用的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的就是針對上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供了一種不良反應(yīng)小，毒副作用低的牛心樸子總生物堿。
[0004]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為:一種牛心樸子總生物堿，所述牛心樸子總生物堿是將牛心樸子的乙醇提取物用水溶解后，先以濃鹽酸調(diào)節(jié)PH值，再以濃氨水或氫氧化鈉水溶液調(diào)PH值，最后以有機溶劑萃取得到的。
[0005]進一步的，上述的一種牛心樸子總生物堿，所述牛心樸子的乙醇提取液是將牛心樸子以質(zhì)量百分濃度為90%的乙醇回流提取后得到的。
[0006]進一步的，上述的一種牛心樸子總生物堿，所述濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值為1-2 ;所述濃氨水或氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)PH值為9-11 ;所述有機溶劑為氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醚中的一種或幾種。
[0007]進一步的，上述的一種牛心樸子總生物堿，所述濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值為2 ;所述濃氨水或氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)PH值為10 ;所述有機溶劑萃取為以等體積的二氯甲烷、氯仿、乙醚和乙酸乙酯依次各萃取3次。
[0008]本發(fā)明的第二個目的是提供了上述一種牛心樸子總生物堿的制備方法，包括以下步驟:
1)將牛心樸子以質(zhì)量百分濃度為90%的乙醇溶液回流提取得到牛心樸子乙醇提取物；
2)將步驟I)得到的牛心樸子乙醇提取物以水溶解后，再以濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值為1-2，并過濾，得到酸性濾后牛心樸子乙醇提取物；
3)將步驟2)得到的酸性濾后牛心樸子乙醇提取物以濃氨水或氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH值為9-11，得到堿性牛心樸子乙醇提取物；
4)將步驟3)得到的堿性牛心樸子乙醇提取物以有機溶劑進行萃取，即得牛心樸子總生物堿。
[0009]進一步的，上述的一種牛心樸子總生物堿的制備方法，所述步驟I)中，牛心樸子的乙醇回流提取條件為以質(zhì)量百分濃度為90%的乙醇，在溫度75°C下提取4次；
所述步驟2)中，濃鹽酸的質(zhì)量百分濃度為36%，濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值為2 ;
所述步驟3)中，濃氨水的質(zhì)量百分濃度為25%，氫氧化鈉水溶液的質(zhì)量百分濃度為4%，濃氨水或氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH值為10 ；
所述步驟4)中，有機溶劑為氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醚中的一種或幾種。
[0010]進一步的，上述的一種牛心樸子總生物堿的制備方法，所述步驟4)中的萃取步驟，具體操作為:常溫下，用等體積的二氯甲烷、氯仿、乙醚和乙酸乙酯依次各萃取3次，或用其中的一種或幾種有機溶劑依次萃取，合并萃取液，濃縮至無水分，再以無水乙醇洗滌，蒸干得到的浸膏，即為牛心樸子總生物堿。
[0011]本發(fā)明的第三個目的是提供了上述牛心樸子總生物堿在制備預(yù)防和治療肝癌或胃癌的藥物中應(yīng)用。
[0012]本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明提供的一種牛心樸子總生物堿，是以西部廣泛生長的草原植物牛心樸子為主體，采用乙醇提取，酸溶堿沉，有機溶劑萃取的方法分離得到，是純天然藥物提取，取自天然的動植物，毒副作用相對較小，采用MTT法驗證其體外對肝癌細胞和胃癌細胞的生長抑制作用，結(jié)果顯示，牛心樸子總生物堿對肝癌細胞HepG2和胃癌細胞BGC-823的體外增殖均表現(xiàn)出了較強的抑制作用，對BGC-823細胞比對H印G2細胞更為敏感；同時，本發(fā)明還利用了鼠源性肝癌小鼠為研究對象，驗證牛心樸子總生物堿對其腫瘤生長的影響，結(jié)果顯示:不同劑量的牛心樸子總生物堿能明顯抑制小鼠H22肝癌細胞的生長，其抑瘤率分別達到了 51.7%,46.6%和42%，為臨床治療肝癌和胃癌藥物的研制奠定了堅實的基礎(chǔ)。`
【具體實施方式】
[0013]實施例1:
1、牛心樸子總生物堿的制備:
首先將牛心樸子草粉碎成粉末狀。第一次采用牛心樸子質(zhì)量5-8倍的比例加入90%乙醇熱回流提取l_3h ;第二次按照牛心樸子質(zhì)量2-5倍的比例加入90%乙醇熱回流提取l_2h。兩次的提取液合并濃縮至干，加適量水溶解，用IM的濃鹽酸調(diào)pH值到1-2，靜置12-18h后抽濾。濾液用濃氨水或氫氧化鈉水溶液調(diào)pH值到9-11，然后用有機溶劑(氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醚的一種或幾種混合)萃取2-3次，萃取液合并濃縮至干，得到牛心樸子總生物堿提取物。
[0014]2、牛心樸子總生物堿提取物抗肝癌和胃癌的體、內(nèi)外藥理學試驗:
本發(fā)明首先采用經(jīng)典的MTT方法(李儀奎.中藥藥理實驗方法學，2006，10:783)研究了牛心樸子總生物堿提取物在體外條件下對2種腫瘤細胞(HepG2細胞和BGC-823細胞)的抑制活性，結(jié)果表明，牛心樸子總生物堿提取物均具有良好的抑制HepG2和BGC-823腫瘤生長的活性。為了進一步證實牛心樸子總生物堿提取物的抗肝癌腫瘤生長作用，本發(fā)明研究了牛心樸子總生物堿提取物對小鼠H22肝癌腫瘤生長的影響(李儀奎.中藥藥理實驗方法學，2006，10:778-779)。結(jié)果顯示，牛心樸子總生物堿提取物能明顯抑制H22腫瘤的生長。以上結(jié)果提示，牛心樸子總生物堿提取物可以用于制備抗腫瘤藥物。
[0015]具體操作過程如下:
1、制備牛心樸子總生物堿:
稱取牛心樸子草0.5kg置于圓底燒瓶中，加入90%乙醇3L熱回流提取2h，抽濾得濾液；再加入90%乙醇2L熱回流提取lh，再抽濾，得濾液。兩次的濾液合并濃縮至干，加0.5L蒸餾水溶解，用濃鹽酸調(diào)pH值到1-2，靜置15h后抽濾。濾液用IM氫氧化鈉水溶液或濃氨水調(diào)PH值到9-11。每次加入0.6L氯仿萃取，共萃取3次，萃取液合并濃縮至干，得到牛心樸子總生物堿6.2g。
[0016]2、MTT法測定牛心樸子總生物堿對人HepG2細胞和BGC-823細胞生長的抑制作用:
利用經(jīng)典的MTT方法(李儀奎.中藥藥理實驗方法學，2006，10:783)分別測定了牛心樸子總生物堿對人腫瘤細胞(HepG2細胞和BGC-823細胞)的抑制率，以絲裂霉素作為陽性對照藥。具體實驗過程如下:
分別取對數(shù)生長期的ifepG2細胞和BGC-823細胞，棄去舊的培養(yǎng)液，加入0.25%胰酶+0.02%EDTA溶液消化，加入完全培養(yǎng)液，輕輕吹打，使其形成單細胞懸液。收集細胞至離心管中，1000r/min,離心5min。棄去上清,沉淀加入培養(yǎng)基懸浮混勻，臺盼藍排斥法進行細胞計數(shù)，調(diào)整細胞密度為5 X IOVmL的細胞懸液。取96孔板，每孔加入細胞懸液100 μ L，使每孔細胞數(shù)為5X IO3個?；靹蚝笾?7°C、5%C02、飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，每孔再加入用完全培養(yǎng)液配制的不同濃度的總生物堿溶液100 μ L，共設(shè)5個濃度梯度，由小到大依次為62.5 μ g/mL、125 μ g/mL、250 μ g/mL、500 μ g/mLUOOO μ g/mL，細胞對照組加 100 μ L 的完全培養(yǎng)液，陽性對照組加入不同濃度的絲裂霉素100 μ L(6.25 μ g/mL、12.5 μ g/mL,25 μ g/mL、50 μ g/mL、100 μ g/mL),`每個濃度設(shè)3個復(fù)孔?；靹蚝笾?7°C /5%C02、飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h后，直接加入濃度為5 mg/mL的MTT溶液20 μ L，37°C /5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)4h，吸去上清液，每孔加入150 μ L DMS0，在水平搖床上充分振蕩IOmin溶解，酶標儀490nm測定各孔OD值，每組實驗重復(fù)三次。按下式計算牛心樸子總生物堿對各腫瘤細胞的抑制率,并計算半數(shù)抑制濃度(IC50)。
[0017]抑制率(％)=(對照組OD值-給藥組OD值)/對照組OD值X 100%
結(jié)果表明，不同濃度的牛心樸子總生物堿對HepG2細胞和BGC-823細胞的體外增殖均顯示出了一定的抑制作用。其抑制率與牛心樸子總生物堿濃度呈現(xiàn)明顯的劑量依賴關(guān)系。在牛心樸子總生物堿濃度為0.5mg/mL時，對H印G2和BGC-823這2種腫瘤細胞株的抑制率分別達到79.8%和82.7%，但均低于5-氟尿嘧啶的抑制率(牛心樸子總生物堿對腫瘤細胞的抑制率數(shù)據(jù)如表I所示)，并且對H印G2細胞和BGC-823細胞的體外增殖抑制IC50值分別為163.0 μ g/mL和117.4 μ g/mL(牛心樸子總生物堿對腫瘤細胞抑制作用的IC50數(shù)據(jù)如表2所示)，由此結(jié)果可以看出，牛心樸子總生物堿對胃癌細胞BGC-823比對肝癌H印G2細胞更
加敏感。
[0018]
【權(quán)利要求】
1.一種牛心樸子總生物堿，其特征在于，所述牛心樸子總生物堿是將牛心樸子的乙醇提取物用水溶解后，先以濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值,再以濃氨水或氫氧化鈉水溶液調(diào)pH值，最后以有機溶劑萃取得到的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種牛心樸子總生物堿，其特征在于，所述牛心樸子的乙醇提取液是將牛心樸子以質(zhì)量百分濃度為90%的乙醇回流提取后得到的。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種牛心樸子總生物堿，其特征在于，所述濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值為1-2 ;所述濃氨水或氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH值為9-11 ;所述有機溶劑為氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醚中的一種或幾種。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種牛心樸子總生物堿，其特征在于，所述濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值為2 ;所述濃氨水或氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH值為10 ;所述有機溶劑萃取為以等體積的二氯甲烷、氯仿、乙醚和乙酸乙酯依次各萃取3次。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的一種牛心樸子總生物堿的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)將牛心樸子以質(zhì)量百分濃度為90%的乙醇溶液回流提取得到牛心樸子乙醇提取物； 2)將步驟I)得到的牛心樸子乙醇提取物以水溶解后，再以濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值為1-2，并過濾，得到酸性濾后牛心樸子乙醇提取物； 3)將步驟2)得到的酸性濾后牛心樸子乙醇提取物以濃氨水或氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH值為9-11，得到堿性牛心樸子乙醇提取物； 4)將步驟3)得到的堿性牛心樸子乙醇提取物以有機溶劑進行萃取，即得牛心樸子總生物堿。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種牛心樸子總生物堿的制備方法，其特征在于， 所述步驟I)中，牛心樸子的乙醇回流提取條件為以質(zhì)量百分濃度為90%的乙醇，在溫度75°C下提取4次； 所述步驟2)中，濃鹽酸的質(zhì)量百分濃度為36%，濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值為2 ； 所述步驟3)中，濃氨水的質(zhì)量百分濃度為25%，氫氧化鈉水溶液的質(zhì)量百分濃度為4%，濃氨水或氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH值為10 ； 所述步驟4)中，有機溶劑為氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醚中的一種或幾種。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種牛心樸子總生物堿的制備方法，其特征在于，所述步驟4)中的萃取步驟，具體操作為:常溫下，用等體積的二氯甲烷、氯仿、乙醚和乙酸乙酯依次各萃取3次，或用其中的一種或幾種有機溶劑依次萃取，合并萃取液，濃縮至無水分，再以無水乙醇洗滌，蒸干得到的浸膏，即為牛心樸子總生物堿。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的牛心樸子總生物堿在制備預(yù)防和治療肝癌或胃癌的藥物中應(yīng)用。
【文檔編號】A61K36/27GK103446211SQ201310436974
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年9月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月24日
【發(fā)明者】蒲秀瑛, 王鳴剛, 王恒瑞, 樊文博, 于雙 申請人:蘭州理工大學