一種聚乳酸-聚乙二醇-腫瘤穿透肽復合物及制備和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種聚乳酸-聚乙二醇-腫瘤穿透肽復合物，所述復合物是由聚乳酸（PLA）、聚乙二醇（PEG）和具有腫瘤穿透性能的靶向多肽iNGR三部分通過共價連接而成的線性嵌段共聚物（縮寫為PLA-PEG-iNGR），三者的摩爾比例為1:1:1。本發(fā)明還提供該聚乳酸-聚乙二醇-腫瘤穿透肽復合物的制備方法，可用于制備具有腫瘤穿透性能的靶向膠束或納米粒，提高其在腫瘤靶向性和腫瘤穿透性。
【專利說明】一種聚乳酸-聚乙二醇-腫瘤穿透肽復合物及制備和應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬藥物制劑領(lǐng)域，涉及一種聚乳酸-聚乙二醇-腫瘤穿透肽復合物PLA-PEG-1NGR,具體說是一種具有腫瘤穿透性能的靶向聚合物材料及制備和應用。
【背景技術(shù)】
[0002]腫瘤是威脅人類健康和生命的主要疾病，近年來其發(fā)病率呈明顯上升趨勢。目前臨床上對腫瘤的常規(guī)治療方法是切除腫瘤原發(fā)灶和實施淋巴清掃之后，進行全身化療或放療。但是，外科手術(shù)不能徹底清除腫瘤細胞和腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)，易導致腫瘤復發(fā)，或者不適用于某些特殊病人或特殊部位的腫瘤；放療往往會引起患者嚴重的局部皮膚反應、血象變化、局部粘膜反應等；傳統(tǒng)化療藥物靜注給藥后，對腫瘤組織無選擇性，具有嚴重的全身性毒副作用。腫瘤細胞或腫瘤血管內(nèi)皮細胞上表達有一系列特異性受體，利用其配體修飾生物相容性材料而制備得到的腫瘤靶向材料，由于其在體內(nèi)可主動尋靶定位至腫瘤組織而受到研究者的廣泛關(guān)注。但是由于腫瘤靶向性能差、藥效提高不明顯等問題，目前絕大部分腫瘤靶向材料仍未進入臨床應用。因此，研究開發(fā)高性能腫瘤靶向材料、提高對腫瘤的靶向性能和治療效果迫在眉睫。
[0003]iNGR多肽是近期設(shè)計出來的一種腫瘤穿透肽，它由腫瘤血管靶向多肽NGR連接腫瘤穿透序列而成。NGR與iNGR均可以靶向至腫瘤血管，但后者與向前相比的優(yōu)勢在于其能滲透進入腫瘤組織。iNGR與NGR均為血管內(nèi)皮細胞上⑶13的特異性配體，此外，iNGR通過降解后，還可與神經(jīng)氈蛋白-1受體特異性結(jié)合，從而介導其腫瘤穿透行為。目前尚未見利用iNGR多肽修飾的靶向材料的報道。
[0004]本發(fā)明采用iNGR修飾PLA-PEG，合成具有穿透腫瘤血管和腫瘤組織能力的腫瘤靶向材料，為制備具有 腫瘤穿透性能的藥物載體提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種聚乳酸-聚乙二醇-腫瘤穿透肽復合物及制備和應用。
[0006]一種聚乳酸-聚乙二醇-腫瘤穿透肽復合物，其特征在于，所述復合物是由聚乳酸(PLA)、聚乙二醇(PEG)和具有腫瘤穿透性能的靶向多肽iNGR三部分通過共價連接而成的線性嵌段共聚物(縮寫為PLA-PEG-1NGR)，三者的摩爾比例為1:1:1。
[0007]所述的腫瘤穿透肽iNGR的氨基酸序列為CRNGRGPDC，其使復合物具有了腫瘤穿透性能。
[0008]所述的聚乙二醇的重均分子量為1800~3800。
[0009]所述的聚乳酸的重均分子量為1000~5000。
[0010]所述的腫瘤穿透肽通過共價鍵形式與聚乙二醇-聚乳酸連接而成的復合物。
[0011]所述聚乳酸-聚乙二醇提供一個馬來酰亞胺基，腫瘤穿透肽提供一個游離巰基，兩者發(fā)生加成反應而連接成共價復合物。[0012]一種制備所述聚乳酸-聚乙二醇-腫瘤穿透肽復合物的方法，其特征在于該方法的具體步驟是:
(1)采用固相多肽合成法合成C端外接半胱氨酸(Cys)的祀向多肽C-1NGR(2Acm)(氨基酸序列為C-C (Acm) RNGRGPDC (Acm))，將其溶于ρΗ7.0的磷酸鹽緩沖液(PBS)中備用；
(2)取馬來酰亞胺-聚乙二醇-聚乳酸復合物(PLA-PEG-Mal)溶于乙腈中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，加入PBS (pH 8.0，0.2M)在37°C水化形成膠束；加入過量的C-1NGR (2Acm)并反應過夜，透析(分子量3kDa)去除過量的多肽與鹽，冷凍干燥，得到PLA-PEG-1NGR (2Acm)；
(3)將PLA-PEG-1NGR(2Acm)其溶于甲醇中，加入檸檬酸溶液和IM的鹽酸溶液，后逐滴加入碘甲醇溶液使溶液始終保持微黃色持續(xù)反應2hr，反應結(jié)束后加入適量抗壞血酸溶液使微黃色褪去，反應液透析除去鹽類(截留分子量3.5kDa，透析介質(zhì)為水)，冷凍干燥得到PLA-PEG-1NGR。
[0013]一種聚乳酸-聚乙二醇-腫瘤穿透肽復合物在制備膠束、納米粒等藥物載體中的應用。
[0014]上述的PLA-PEG-1NGR復合物可用于制備具有腫瘤穿透性能的藥物載體，如膠束、納米粒等，這些藥物載體靜脈注射進入腫瘤動物模型體內(nèi)之后，與普通藥物載體相比，表現(xiàn)出良好的腫瘤靶向性和腫瘤穿透性能，其在腫瘤部位分布明顯增加，免疫熒光分析結(jié)果顯示能穿透腫瘤血管滲透進入整個腫瘤組織。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]附圖1、PLA-PEG-1NGR的核磁圖譜。
[0016]圖中I為P LA-PEG-Mal的核磁圖譜，2為PLA-PEG-1NGR的核磁圖譜，由圖可看出，I圖顯示出馬來酰亞胺峰，而2圖中該峰消失，而其余峰基本保持不變，顯示PLA-PEG-Mal中的馬來酰亞胺基團已與iNGR發(fā)生反應。
[0017]附圖2、利用PLA-PEG-1NGR制備得到的熒光素膠束被U87腫瘤細胞攝取照片。
[0018]利用PLA-PEG-1NGR制備得到的熒光素膠束與普通的熒光素膠束于37°C分別與U87腫瘤細胞作用2小時后的熒光顯微照片，由圖可知，腫瘤細胞對PLA-PEG-1NGR修飾膠束的攝取量遠大于普通膠束。
【具體實施方式】
[0019]通過下述實施例將有助于進一步理解本發(fā)明，但并不限制本發(fā)明的內(nèi)容。
[0020]實施例1:復合物PLA-PEG-1NGR的合成、純化和表征。
[0021]將4-甲基二苯基甲胺樹脂(MBHA)用三氟乙酸(TFA)脫保護I分鐘，兩次，將Boc保護氨基酸溶解在0.5M的HBTU (溶劑為DMF)中，室溫反應20min，DMF洗滌，TFA脫除Boc保護，按照氨基酸序列依次反應連接所有氨基酸。反應結(jié)束后洗滌樹脂、TFA脫保護基，真空干燥后，放入多肽切割管中，加入適量P-cresol，然后通入HF，冰浴攪拌反應I小時；反應結(jié)束后減壓抽去管中HF，殘液用適量冰乙醚沉淀，過濾得沉淀并用冰乙醚洗滌沉淀；沉淀重新用TFA溶解，過濾得濾液；濾液再于冰乙醚中沉淀，過濾，濾渣以水復溶，凍干得iNGR(2Acm)(序列為 C-C (Acm) RNGRGPDC (Acm))純品。將 80mg PLA-PEG-Mal (PLA 分子量:2000 ;PEG分子量:2000)溶解在IOml乙腈中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，成膜，加入6ml PBSCpH 8.0,0.2M)在37°C水化形成膠束。8h內(nèi)加入49.2mg C-C(Acm)RNGRGPDC(Acm)并反應過夜，HPLC檢測反應。過量的iNGR (2Acm)通過透析(MWCO 3kDa, ]\^11丨口0代)除去，凍干得？1^^^6-丨吣1?(2Acm)。取 26mg PLA-PEG-1NGR (2Acm)溶于 5ml 甲醇中，加入 20ml 檸檬酸溶液(0.2M)和
2.5ml鹽酸溶液(1M)，后逐滴加入5mM碘甲醇溶液使溶液始終保持微黃色持續(xù)反應2hr，反應結(jié)束后加入適量抗壞血酸溶液使微黃色褪去，反應液透析除去鹽類(截留分子量3.5kDa，透析介質(zhì)為水)，冷凍干燥得到PLA-PEG-1NGR。1H-NMR表征結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，PLA-PEG-Mal圖譜在6.67ppm處顯示Mal的特征峰，而PLA-PEG-1NGR圖譜上此峰消失，說明PLA-PEG-1NGR合成成功。
[0022]實施例2:復合物PLA-PEG-1NGR的合成、純化和表征。
[0023]將4-甲基二苯基甲胺樹脂(MBHA)用三氟乙酸(TFA)脫保護I分鐘，兩次，將Boc保護氨基酸溶解在0.5M的HBTU (溶劑為DMF)中，室溫反應25min，DMF洗滌，TFA脫除Boc保護，按照氨基酸序列依次反應連接所有氨基酸。反應結(jié)束后洗滌樹脂、TFA脫保護基，真空干燥后，放入多肽切割管中，加入適量P-cresol，然后通入HF，冰浴攪拌反應I小時；反應結(jié)束后減壓抽去管中HF，殘液用適量冰乙醚沉淀，過濾得沉淀并用冰乙醚洗滌沉淀；沉淀重新用TFA溶解，過濾得濾液；濾液再于冰乙醚中沉淀，過濾，濾渣以水復溶，凍干得iNGR(2Acm)(序列為 C-C (Acm) RNGRGPDC (Acm))純品。將 80mg PLA-PEG-Mal (PLA 分子量:4000 ;PEG分子量:3500)溶解在IOml乙腈中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，成膜，加入6ml PBSCpH 8.0,0.2M)在37°C水化形成膠束。8h內(nèi)加入49.2mg C-C(Acm)RNGRGPDC(Acm)并反應過夜，HPLC檢測反應。過量的iNGR (2Acm)通過透析(MWCO 3kDa, ]\^11丨口0代)除去，凍干得？1^^^6-丨吣1?(2Acm)。取 26mg PLA-PEG-1NGR (2Acm)溶于 5ml 甲醇中，加入 20ml 檸檬酸溶液(0.2M)和
2.5ml鹽酸溶液(1M)，后逐滴加入5mM 碘甲醇溶液使溶液始終保持微黃色持續(xù)反應2hr，反應結(jié)束后加入適量抗壞血酸溶液使微黃色褪去，反應液透析除去鹽類(截留分子量3.5kDa，透析介質(zhì)為水)，冷凍干燥得到PLA-PEG-1NGR。1H-NMR表征結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，PLA-PEG-Mal圖譜在6.67ppm處顯示Mal的特征峰，而PLA-PEG-1NGR圖譜上此峰消失，說明PLA-PEG-1NGR合成成功。
[0024]實施例3:復合物PLA-PEG-1NGR的合成、純化和表征。
[0025]將4-甲基二苯基甲胺樹脂(MBHA)用三氟乙酸(TFA)脫保護I分鐘，兩次，將Boc保護氨基酸溶解在0.5M的HBTU (溶劑為DMF)中，室溫反應20min，DMF洗滌，TFA脫除Boc保護，按照氨基酸序列依次反應連接所有氨基酸。反應結(jié)束后洗滌樹脂、TFA脫保護基，真空干燥后，放入多肽切割管中，加入適量P-cresol，然后通入HF，冰浴攪拌反應I小時；反應結(jié)束后減壓抽去管中HF，殘液用適量冰乙醚沉淀，過濾得沉淀并用冰乙醚洗滌沉淀；沉淀重新用TFA溶解，過濾得濾液；濾液再于冰乙醚中沉淀，過濾，濾渣以水復溶，凍干得iNGR(2Acm)(序列為 C-C (Acm) RNGRGPDC (Acm))純品。將 80mg PLA-PEG-Mal (PLA 分子量:5000 ;PEG分子量:3500)溶解在IOml乙腈中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，成膜，加入6ml PBSCpH 8.0,0.2M)在37°C水化形成膠束。8h內(nèi)加入49.2mg C-C(Acm)RNGRGPDC(Acm)并反應過夜，HPLC檢測反應。過量的iNGR (2Acm)通過透析(MWCO 3kDa, ]\^11丨口0代)除去，凍干得？1^^^6-丨吣1?(2Acm)。取 26mg PLA-PEG-1NGR (2Acm)溶于 5ml 甲醇中，加入 20ml 檸檬酸溶液(0.2M)和
2.5ml鹽酸溶液(1M)，后逐滴加入5mM碘甲醇溶液使溶液始終保持微黃色持續(xù)反應2hr，反應結(jié)束后加入適量抗壞血酸溶液使微黃色褪去，反應液透析除去鹽類(截留分子量3.5kDa，透析介質(zhì)為水)，冷凍干燥得到PLA-PEG-1NGR。1H-NMR表征結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，PLA-PEG-Mal圖譜在6.67ppm處顯示Mal的特征峰，而PLA-PEG-1NGR圖譜上此峰消失，說明PLA-PEG-1NGR合成成功。
[0026]實施例4:熒光素標記膠束的制備及其體外腫瘤細胞攝取實驗。
[0027]稱取Img PLA-PEG-1NGR (PLA 分子量:5000 ；PEG 分子量:3500)、19mg PLA-mPEG(PLA分子量:5000 ;PEG分子量:2000)和0.5mg香豆素6，溶解在3ml乙腈中，37°C水浴，減壓旋蒸成膜，室溫真空干燥過夜，加入3ml生理鹽水水化30min，0.22 μ m濾膜過濾，得到PLA-PEG-1NGR 膠束，備用；PLA_mPEG 膠束的制備，將 20mg PLA_mPEG(PLA 分子量:5000 ；PEG分子量:2000)和0.5mg香豆素6溶解在3ml乙腈中，成膜，其他同PLA-PEG-1NGR膠束的制備。兩種膠束與腫瘤細胞共孵育2h，吸棄上清，PBS清洗，激光共聚焦顯微鏡觀察細胞膠束攝取情況。結(jié)果顯示普通膠束被攝取量較少，而iNGR修飾的膠束則被大量攝取，說明iNGR修飾的靶向材料PLA-PEG-1NGR賦予了膠束對腫瘤細胞良好的體外靶向性。
[0028]實施例5:熒光素標記膠束的制備及其體外腫瘤細胞攝取實驗。
[0029]稱取Img PLA-PEG-1NGR (PLA 分子量:4000 ；PEG 分子量:3500)、19mg PLA-mPEG(PLA分子量:4000 ;PEG分子量:2000)和0.2mg香豆素6，溶解在3ml乙腈中，37°C水浴，減壓旋蒸成膜，室溫真空干燥過夜，加入3ml生理鹽水水化30min，0.22 μ m濾膜過濾，得到PLA-PEG-1NGR 膠束，備用；PLA_mPEG 膠束的制備，將 20mg PLA_mPEG(PLA 分子量:4000 ；PEG分子量:2000)和0.2mg香豆素6溶解在3ml乙腈中，成膜，其他同PLA-PEG-1NGR膠束的制備。兩種膠束與腫瘤細胞共孵育2h，吸棄上清，PBS清洗，激光共聚焦顯微鏡觀察細胞膠束攝取情況。結(jié)果顯示普通膠束被攝取量較少，而iNGR修飾的膠束則被大量攝取，說明iNGR修飾的靶向材料PLA-PEG-1NGR賦予了膠束對腫瘤細胞良好的體外靶向性。
【權(quán)利要求】
1.一種聚乳酸-聚乙二醇-腫瘤穿透肽復合物，其特征在于，所述復合物是由聚乳酸(PLA)、聚乙二醇(PEG)和具有腫瘤穿透性能的靶向多肽iNGR三部分通過共價連接而成的線性嵌段共聚物(縮寫為PLA-PEG-1NGR)，三者的摩爾比例為1:1:1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種聚乳酸-聚乙二醇-腫瘤穿透肽復合物，其特征在于，所述的腫瘤穿透肽iNGR的氨基酸序列為CRNGRGPDC，其使復合物具有了腫瘤穿透性能。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種聚乳酸-聚乙二醇-腫瘤穿透肽復合物，其特征在于，所述的聚乙二醇的重均分子量為1800~3800。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種聚乳酸-聚乙二醇-腫瘤穿透肽復合物，其特征在于，所述的聚乳酸的重均分子量為1000~5000。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種聚乳酸-聚乙二醇-腫瘤穿透肽復合物，其特征在于，所述的腫瘤穿透肽通過共價鍵形式與聚乙二醇-聚乳酸連接而成的復合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種聚乳酸-聚乙二醇-腫瘤穿透肽復合物，其特征在于，所述聚乳酸-聚乙二醇提供一個馬來酰亞胺基，腫瘤穿透肽提供一個游離巰基，兩者發(fā)生加成反應而連接成共價復合物。
7.一種制備根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4、5、6任一項所述聚乳酸-聚乙二醇-腫瘤穿透肽復合物的方法，其特征在于該方法的具體步驟是: (1)采用固相多肽合成法合成C端外接半胱氨酸(Cys)的祀向多肽C-1NGR(2Acm)(氨基酸序列為C-C (Acm) RNGRGPDC (Acm))，將其溶于pH7.0的磷酸鹽緩沖液(PBS)中備用； (2)取馬來酰亞胺-聚乙二醇-聚乳酸復合物(PLA-PEG-Mal)溶于乙腈中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，加入PBS (pH 8.0, 0.2M)在37°C水化形成膠束； 加入過量的C-1NGR (2Acm)并反應過夜，透析(分子量3kDa)去除過量的多肽與鹽，冷凍干燥，得到 PLA-PEG-1NGR (2Acm)；` (3)將PLA-PEG-1NGR(2Acm)其溶于甲醇中，加入檸檬酸溶液和IM的鹽酸溶液，后逐滴加入碘甲醇溶液使溶液始終保持微黃色持續(xù)反應2hr，反應結(jié)束后加入適量抗壞血酸溶液使微黃色褪去，反應液透析除去鹽類(截留分子量3.5kDa，透析介質(zhì)為水)，冷凍干燥得到PLA-PEG-1NGR。
8.權(quán)利要求1所述的一種聚乳酸-聚乙二醇-腫瘤穿透肽復合物在制備膠束、納米粒等藥物載體中的應用。
【文檔編號】A61K9/107GK103536930SQ201310437613
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年9月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月24日
【發(fā)明者】閆志強, 楊一祎, 魏岱旭, 鐘建, 劉璐, 金彩虹, 何丹農(nóng) 申請人:上海納米技術(shù)及應用國家工程研究中心有限公司