miR-493基因在制備抑制癌細(xì)胞增殖藥物中的用途
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及miR-493基因在制備抑制癌細(xì)胞增殖藥物中的用途。95D細(xì)胞系中miR-493的一種靶基因，miR-493通過與靶基因mRNA的3’-UTR互補(bǔ)，抑制靶基因mRNA的翻譯或直接降解靶基因的mRNA。結(jié)合生理生化實(shí)驗(yàn)，確定了miR-493與E2F1有相互作用。這種相互作用影響了95D細(xì)胞的增殖等生命活動(dòng)。本實(shí)驗(yàn)通過軟件預(yù)測，測序分析，并構(gòu)建載體，在HEK293T細(xì)胞中利用熒光素酶報(bào)告基因分析驗(yàn)證了E2F1是miR-493的靶基因，并在95D細(xì)胞中利用過表達(dá)和Western-blot的技術(shù)，以及干擾E2F1基因表達(dá)作為對照，進(jìn)一步證實(shí)了該發(fā)現(xiàn)。所公開的為在95D細(xì)胞系中E2F1是miR-493的靶基因的首次報(bào)道，該發(fā)明為在臨床上利用miRNA來診斷和治療非小細(xì)胞肺癌，以及提供藥物靶點(diǎn)方面提供了應(yīng)用價(jià)值。
【專利說明】miR-493基因在制備抑制癌細(xì)胞增殖藥物中的用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生 物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地講，涉及miR-493基因在抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]microRNAs CmiRNAs)是一類進(jìn)化上保守、長約19_25個(gè)核苷酸的非編碼小分子RNA。Lee及Reinhart等相繼在線蟲中發(fā)現(xiàn)具有基因調(diào)控作用的非編碼單鏈RNA分子，lin-4和let-7。隨后大量的研究發(fā)現(xiàn)在各種生物體中均存在這種小分子RNA，它們具有組織特異性和時(shí)空性。這種具有基因調(diào)控作用的非編碼小RNA分子被稱作microRNAs (miRNAs)。miRNAs以完全或不完全互補(bǔ)配對的方式與靶基因的mRNA的3’端非翻譯區(qū)(3’UTR)結(jié)合，導(dǎo)致靶mRNA的降解或者抑制其翻譯，進(jìn)而對功能基因的表達(dá)發(fā)揮精細(xì)調(diào)控功能。miRNAs參與各種細(xì)胞進(jìn)程，如分化、增殖、凋亡以及應(yīng)激反應(yīng)。此外，它們還是某些腫瘤的關(guān)鍵調(diào)節(jié)點(diǎn)。自2002年Calin等首次發(fā)現(xiàn)miRNAs與B細(xì)胞慢性淋巴性白血病有關(guān)后，miRNAs與腫瘤的關(guān)系備受關(guān)注。此后的大量研究都表明miRNAs與多種腫瘤(肺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌等)的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，在腫瘤細(xì)胞的增殖、血管發(fā)生、EMT、腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移、耐藥以及腫瘤干細(xì)胞等生物學(xué)功能中起著重要的調(diào)節(jié)作用。在此基礎(chǔ)上，尋找miRNA在特定時(shí)空中的靶基因，揭示其作用機(jī)制是目前研究的重點(diǎn)，也是進(jìn)一步闡述腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制、識(shí)別和鑒定新的腫瘤標(biāo)志物的重要研究手段。
[0003]肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，近十年其發(fā)病率和死亡率均迅速上升，在我國高居惡性腫瘤死亡率的首位，已成為嚴(yán)重威脅人們生命健康的重大疾病。根據(jù)肺癌的生物學(xué)特性，分為非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)和小細(xì)胞肺癌(SCLC)，其中NSCLC約占80_85%，近年來，隨著治療方式的改進(jìn)，治療方案的調(diào)整，肺癌的治療取得了長足的進(jìn)步，但是大部分的NSCLC患者預(yù)后仍然較差，5年生存率仍低于15%。缺乏有效的針對肺癌的早期診斷和治療手段是導(dǎo)致肺癌患者死亡的最主要原因之一。miRNA通過調(diào)控靶基因的mRNA翻譯，在肺癌的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。miRNA可能成為新的肺癌早期診斷和進(jìn)展相關(guān)標(biāo)記物，有助于肺癌的準(zhǔn)確診斷及個(gè)性化治療。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種可以有效抑制癌細(xì)胞增殖的藥物。
[0005]發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的。
[0006]發(fā)明提供了 miR-493基因或含有該基因的表達(dá)載體在制備抑制癌細(xì)胞藥物中的用途。所述的藥物為抑制癌細(xì)胞增殖的藥物。
[0007]進(jìn)一步地，所述的癌細(xì)胞的增殖機(jī)制與E2F1相關(guān)。
[0008]作為優(yōu)選的方案，所述的癌為肺癌、卵巢癌、頭頸部腫瘤等。更優(yōu)選地，癌細(xì)胞為非小細(xì)胞肺癌。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述的癌細(xì)胞為95D。
[0009]所述的miR-493基因序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2所示。[0010]所述的藥物的制劑形式可以是常規(guī)的制劑，如液體制劑、顆粒劑、片劑或膠丸。其還包括要學(xué)上可接受的載體。
[0011]發(fā)明同時(shí)提供了 miR-493基因或含有該基因的表達(dá)載體在制備E2F1抑制劑中的用途。
[0012]本發(fā)明首次提供了 miR-493基因作為在癌中抑制腫瘤增殖新的應(yīng)用，為抗腫瘤藥物的設(shè)計(jì)和篩選提供了新的靶點(diǎn)。本發(fā)明的研究思路進(jìn)一步簡述如下:
發(fā)明人首先利用RT-PCR檢測2株正常細(xì)胞和6株肺癌細(xì)胞miRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)相比于正常肺細(xì)胞，miR-493在肺癌細(xì)胞中普遍低表達(dá)，以高轉(zhuǎn)移潛能的非小細(xì)胞肺癌％D細(xì)胞株尤為明顯。
[0013]進(jìn)一步，構(gòu)建miR-493過表達(dá)慢病毒載體pEZX-MR03/eGFP_miR-493 (該載體帶綠色熒光蛋白)及空白對照載體，分別轉(zhuǎn)染％D細(xì)胞，建立過表達(dá)miR-493的穩(wěn)定細(xì)胞系95D/miR-493，以及對照組95D/control。并用實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。應(yīng)用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞生長曲線檢測各組細(xì)胞的增殖能力，流式分析細(xì)胞周期，發(fā)現(xiàn)肺癌細(xì)胞的增殖能力明顯受抑制。
[0014]進(jìn)一步，利用生物信息學(xué)在線預(yù)測軟件分析并結(jié)合生物學(xué)功能，篩選出miR-493可能的靶基因。采用實(shí)時(shí)定量PCR、WesternBlot技術(shù)檢測靶基因的表達(dá)，并將miR-493的成熟序列minics和重組有靶基因的3’UTR區(qū)序列的雙熒光素酶報(bào)告基因共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，24h后檢測熒光素酶報(bào)告基因的活性。同時(shí)利用RNAi技術(shù)干擾肺癌細(xì)胞中靶基因的表達(dá)水平作為對照。
[0015]生物信息學(xué)在線預(yù)測軟件分析篩選出miR-493的靶基因E2F1。實(shí)時(shí)定量PCR及WesternBlot發(fā)現(xiàn)E2F1的轉(zhuǎn)錄和蛋白水平表達(dá)均與miR-493成負(fù)相關(guān)。雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果證實(shí)miR-493對E2F1表達(dá)具有直接抑制作用。E2F1的表達(dá)沉默能使％D細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例增高，S期細(xì)胞比例減少，生長曲線結(jié)果顯示E2F1干擾后細(xì)胞增殖速度減`慢。
[0016]這一結(jié)果支持miR-493抑制％D肺癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制與E2F1有關(guān)。
[0017]本發(fā)明所提供的基因藥物可以有效地抑制與E2F1有關(guān)的癌細(xì)胞的增殖。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1顯示％D/miR-493與％D/control穩(wěn)定細(xì)胞系的構(gòu)建:
A:轉(zhuǎn)染72小時(shí)后在倒置熒光顯微鏡下觀測細(xì)胞內(nèi)綠色熒光信號(hào)；
B:實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測％D/miR-493與95D/control細(xì)胞系miR-493的表達(dá)水平，*:p〈0.05，#:p〈0.01。
[0019]圖2顯示為過表達(dá)miR-493對％D細(xì)胞增殖能力的影響:
A:95D,95D/control和％D/miR_493平板克隆形成實(shí)驗(yàn)的典型圖；
B:95D,95D/control和％D/miR_493各組細(xì)胞的克隆形成率的統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，95D/miR_493 vs 95D, **p < 0.01 ；
C:MTS法繪制各組細(xì)胞生長曲線圖3為TCRPl在繼發(fā)性耐藥腫瘤細(xì)胞株中表達(dá)量。
[0020]圖3顯示為流式細(xì)胞儀檢測％D、％D/control和％D/miR_493的細(xì)胞周期分布。各組細(xì)胞的增殖指數(shù)分別為:48.49%，56.30%, 19.23%。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)分析顯示％D/miR-493組與另兩組細(xì)胞的增殖指數(shù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
[0021]圖4顯示miR-493直接靶向E2F1并抑制其表達(dá):
A:生物信息學(xué)分析E2F1的3’ UTR區(qū)miR-493存在的結(jié)合位點(diǎn)；
B: 95D/miR-493及對照組細(xì)胞E2F1的蛋白水平的差異；
C:95D/miR-493及對照組細(xì)胞E2F1 mRNA水平的差異；
D:miR-493對E2F1的3’ UTR區(qū)構(gòu)建載體的報(bào)告基因活性的影響。
[0022]圖5顯示為s1-RNA干擾％D細(xì)胞E2F1基因表達(dá):
A:在mRNA水平檢測3條siRNA干擾效果； B:在蛋白水平檢測3條siRNA干擾效果。
[0023]圖6顯示作為miR-493作用的對照，siRNA干擾E2F1表達(dá)后，對肺癌細(xì)胞增殖的影響:
A:流式檢測干擾前后細(xì)胞周期分布；其中橫坐標(biāo)DNA content指DNA含量；縱坐標(biāo)cell number指細(xì)胞數(shù)量；
B =MTS繪制干擾前后細(xì)胞的生長曲線。
[0024]上述圖中，所涉及的％D/control所指為％D對照細(xì)胞系，其不含有miR-493。
【具體實(shí)施方式】
[0025]下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的描述；實(shí)施例僅作為本發(fā)明技術(shù)方案的解釋，而非限制。
[0026]實(shí)施例1:細(xì)胞培養(yǎng)
人低轉(zhuǎn)移肺癌細(xì)胞95C及人高轉(zhuǎn)移肺癌細(xì)胞％D購自上海中科院細(xì)胞庫。均用含10%胎牛血清的RPM1-1640培養(yǎng)，置于37°C，5% C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)。293T細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存，用含10%胎牛血清及DMEM培養(yǎng)。
[0027]實(shí)施例2:細(xì)胞轉(zhuǎn)染
PEZX-MR03/eGFP-miR-493表達(dá)載體、陰性對照表達(dá)載體的構(gòu)建由廣州復(fù)能基因有限公司協(xié)助完成。轉(zhuǎn)染前一天以2-10X IO4個(gè)/孔的密度將％D細(xì)胞接種至24孔培養(yǎng)板，每孔500 u I培養(yǎng)基。確保轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞匯合度約達(dá)到60%。10 u I的病毒顆粒原液加入500 u I的完全培養(yǎng)基制備成稀釋好的病毒懸液，同時(shí)加入適量的polybrene使其終濃度為5_8 ii g/ml。棄去舊的培養(yǎng)基，將制備好的含有病毒顆粒的培養(yǎng)基加入培養(yǎng)板，混勻后置于37°C，5%C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24小時(shí)后更換成新鮮的完全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞在熒光顯微鏡觀察可見綠色突光，用選擇性培養(yǎng)(2iig/ml puromycin)培養(yǎng),約2_3周出現(xiàn)單個(gè)抗性克隆，經(jīng)熒光顯微鏡觀察后，挑取單個(gè)克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，并建立穩(wěn)定的細(xì)胞系，經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證后，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。miR-493的前體序列為SEQ ID NO: 2: CUGGCXUCCAGGGCUUUGUACAUGGUAGG⑶UUCAUUCAUUCGUUUGCACAUUCGGUGAAGGUCUACUGUGUGCCAGGCCXUGUGCCAG0
[0028]實(shí)施例3: %D肺癌細(xì)胞增殖能力的檢測 (I)平板克隆檢測細(xì)胞增殖能力
取對數(shù)生長期細(xì)胞，按300個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種于6孔培養(yǎng)板中，使細(xì)胞均勻分布。于37°C，5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)直至出現(xiàn)肉眼可見的克隆，然后棄去培養(yǎng)液，用PBS清洗2次，_20°C預(yù)冷的甲醇固定30min，結(jié)晶紫染色lOmin，后用流水緩慢沖洗干凈，晾干后計(jì)算克隆數(shù)，并通過公式:克隆形成率=(克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))X100%計(jì)算出各組細(xì)胞的克隆形成率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
[0029](2) MTS法繪制生長曲線:
將常規(guī)培養(yǎng)的細(xì)胞消化收集制成細(xì)胞懸液，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以每孔1000個(gè)細(xì)胞、180 u I接種于96孔板中，每種細(xì)胞設(shè)6個(gè)平行孔，于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于Oh、24h、48h、72h、96h、120h加入20 u IMTS培養(yǎng)箱中孵育2小時(shí)后，酶標(biāo)儀上檢測各孔490nm處吸光值，吸光值與細(xì)胞數(shù)成正比，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制各組細(xì)胞的生長曲線。
[0030](3)細(xì)胞周期分析
按試劑盒說明書上的操作步驟進(jìn)行，采用一步法。具體步驟簡述如下:常規(guī)方法收集生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，PBS漂洗一次,離心,棄上清。加入500 ill的DNA Staining Solution,vortex上混勻5~10秒。室溫避光孵育30分鐘后用流式細(xì)胞儀檢測。用增殖指數(shù)衡量細(xì)胞增殖能力，增殖指數(shù)=(G2+S)/ (G1+G2+S) X 100%
結(jié)論:通過平板克隆形成實(shí)驗(yàn)和MTS繪制細(xì)胞生長曲線檢測miR-493對％D細(xì)胞的體外增殖能力的影響。平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞克隆形成能力，結(jié)果顯示(見附圖2)，％D、95D/control,95D/miR-493 組的克隆形成率分別為:65±4.8%、63±3.3%、9.3±0.9%,與95D,95D/control組相比，％D/miR_493細(xì)胞的克隆形成率顯著降低(p〈0.01)。通過MTS法在分別在0、1、2、3、4、5天測定各組細(xì)胞的A490，并繪制生長曲線，結(jié)果顯示(見附圖2)，95D/miR-493細(xì)胞的增殖能力減弱。說明過表達(dá)miR-493能抑制％D細(xì)胞的增殖能力。采用流式細(xì)胞術(shù)分析95D、95D/control、95D/miR-493的細(xì)胞周期。結(jié)果顯示各組細(xì)胞的增殖指數(shù)分別為:47.49%,56.30%、19.23%。這提示miR-493能抑制95D細(xì)胞從Gl期進(jìn)入S期。
`[0031]實(shí)施例3:E2F1瞬時(shí)干擾
轉(zhuǎn)染前一天，將狀態(tài)良好的細(xì)胞以適當(dāng)?shù)拿芏冉臃N至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，使轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞的匯合度能夠達(dá)到40%左右。稀釋siRNA:用250 ill不含血清培養(yǎng)基稀釋5 ill的20 ii mol的siRNA儲(chǔ)存液，輕輕混勻，室溫孵育5min。稀釋lipo2000:用250 U I不含血清培養(yǎng)基稀釋5iillipo2000，輕輕混勻并室溫孵育5min。將稀釋后的siRNA和稀釋后的lipo2000輕輕混勻，室溫孵育20min。將500 U I的siRNA-lipo2000混合液加入含有6孔板中，同時(shí)加入1.5ml的無血清培養(yǎng)基，輕輕混勻。培養(yǎng)4-6h后用新鮮的完全培養(yǎng)基進(jìn)行換液處理。將培養(yǎng)板置于37°C的C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-96h (培養(yǎng)時(shí)間與實(shí)驗(yàn)?zāi)康南嚓P(guān))后，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。設(shè)計(jì)針對E2F1基因的瞬時(shí)干擾寡核苷酸片段如下:
SiRNAl: 5’-CCUGAUGAAUAUCUGUACU-3’ (SEQ ID NO:3)
SiRNA2: 5’-UGGACCACCUGAUGAAUAU-3’ (SEQ ID NO:4)
SiRNA3: 5，-GAGAAGUCACGCUAUGAGA-3’ (SEQ ID NO:5)
siRNA 陰性對照:5’-UUGAGGUCGCGAUGGAACG-3’ (SEQ ID N0:6)
結(jié)論:為了確定miR-493是否通過下調(diào)E2F1抑制％D細(xì)胞增殖，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了干擾E2F1基因表達(dá)作為對照，設(shè)計(jì)針對E2F1 mRNA的3個(gè)siRNA干擾片段，將其分別轉(zhuǎn)染入％D細(xì)胞在24小時(shí)和48小時(shí)后，分別提取提取細(xì)胞總RNA和細(xì)胞總蛋白，在mRNA和蛋白水平上(圖
5)驗(yàn)證siRNA干擾效果。設(shè)計(jì)的3條干擾片段經(jīng)驗(yàn)證后顯示:s1-E2F 3#的干擾效果明顯高于其余2組。即將此干擾片段作為后續(xù)研究的對象。采用流式細(xì)胞術(shù)分析干擾E2F1前后的細(xì)胞周期分布，采用MTS法檢測2株細(xì)胞5天(每天檢測I次)的生長狀況并繪制生長曲線，結(jié)果顯示，％D/s1-con細(xì)胞中S期細(xì)胞分別占40.35±2.11%。95D/si_E2Fl細(xì)胞中S期細(xì)胞占19.05±1.02%。與95D/s1-con相比，95D/s1-E2Fl細(xì)胞中S期細(xì)胞明顯減少，GO/Gl期細(xì)胞比例明顯增高(如圖6);同時(shí)，％D/s1-E2Fl細(xì)胞的生長增殖速度明顯低于95D/s1-con細(xì)胞(如圖6)。提示miR-493抑制％D細(xì)胞生長增殖作用通過靶向抑制E2F1實(shí)現(xiàn)。
[0032]實(shí)施例4:實(shí)時(shí)定量PCR
miRNA提取
(I)取對數(shù)生長期細(xì)胞I X 106^1 X 107個(gè)，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌2次，加入Iml細(xì)胞裂解液(RNA-Solution Reagent)，充分裂解細(xì)胞，然后轉(zhuǎn)移至1.5mlEP管中，室溫孵育2~3分鐘。
[0033](2)按每ml的裂解液加入200 U I的氯仿，渦旋混勻后冰上孵育10分鐘。
[0034](3) 12，000g，4°C，離心15分鐘，RNA在上層水相，轉(zhuǎn)移上層水相(≤80%)至新的
1.5mlEP管,并加入0.5倍體積的無水乙醇，Vortex混勻。
[0035](4)取< 700 U I 的上述混合液至 HiBind RNA mini column, 10，OOOg,室溫離心3(T60秒，將離心下來的濾液轉(zhuǎn)移至新的1.5mlEP管。
[0036](5)重復(fù)(4)，直至全部過柱。(此時(shí)，該柱子中吸附Large RNA，可從該柱子中抽提大分子RNA)。
[0037](6)測量(4)、(5)步獲得的濾液的體積，加入0.9倍的無水乙醇，混勻。
[0038](7)取一個(gè)MicroElute RNA Column，置于2ml收集管上，將(6)步中的混合液分批全部過柱，10, OOOg,室溫離心3(T60秒，棄去離心下來的過濾液。
[0039](8)加入500 U I的RWB Wash Buffer (注意:使用前要加入無水乙醇稀釋)入柱，10，OOOg,室溫離心3(T60秒，棄濾液。重復(fù)一次。
[0040](9)≥13，000g，空甩2分鐘，以除凈柱子中殘留的液體。
[0041](10)洗脫miRNA:將柱子置于1.5mlEP管上，將15~30iU的DEPC水加到膜上，室溫放置2分鐘后，離心(> 13，00(^，1分鐘)。若想提高產(chǎn)量，可進(jìn)行第二次洗脫，也可預(yù)先加熱DEPC水至70°C，并加入柱子后室溫孵育5分鐘再離心。
[0042](11)于Nanodrop2000儀器上檢測miRNA的濃度后，立即進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄或于_80°C保存。
[0043]的逆轉(zhuǎn)錄
準(zhǔn)備逆轉(zhuǎn)錄試劑，冰上解凍后離心，加樣量及操作步驟如下:
miRNA: 0.5 u g (根據(jù)濃度計(jì)算體積)
miR-493逆轉(zhuǎn)錄引物:IiU
U6內(nèi)參逆轉(zhuǎn)錄引物:Iiil
5XBuffer: 4 u I
IOXdNTP MIX: 2 ill
逆轉(zhuǎn)錄酶:Iyl
逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑:0.5 ill
RNase-free water: 補(bǔ)足至 20 U I將反應(yīng)體系混勻后放入PCR儀，42°C逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)lh，70°C，5min。冷卻后將樣本于-20°C冰箱保存。
[0044]miRNA 實(shí)時(shí)定量 PCR
PCR試劑于冰上解凍，按下面的反應(yīng)體系(總體積20 Ul)加樣至PCR八連管中，每個(gè)樣本的每個(gè)基因設(shè)3個(gè)復(fù)孔:
2x QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix: 10 u I
引物:2u I
RNase-free water: 7 U I
模板 cDNA: I u I
經(jīng)瞬時(shí)離心、 輕彈混勻、再瞬時(shí)離心后于ABI7500 FAST儀器進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。以U6為內(nèi)參，按儀器默認(rèn)設(shè)置進(jìn)行熔解曲線分析，實(shí)驗(yàn)完成后，儀器將自動(dòng)分析計(jì)算相對倍數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
[0045]結(jié)論:實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測各組細(xì)胞中miR-493的相對表達(dá)量，以U6為內(nèi)參，比較各組細(xì)胞中miR-493表達(dá)水平差異。結(jié)果顯示(圖1)，以％D組miR-493的表達(dá)量為 l,95D/control 和 95D/miR_493 細(xì)胞的 miR-493 的相對表達(dá)量分別是(1.02±0.34)、(10.65±0.59)。提示成功構(gòu)建miR-493過表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞株。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測95D/control和％D/miR_493細(xì)胞中E2F1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)E2F1的轉(zhuǎn)錄和蛋白水平表達(dá)均與miR-493成負(fù)相關(guān)(圖4)。
[0046]實(shí)施例5:ffestern Blot 檢測
I)細(xì)胞蛋白樣品制備:①取對生長期的細(xì)胞，棄去細(xì)胞培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS漂洗細(xì)胞表面2次，除去培養(yǎng)基中的血清及死細(xì)胞；②用胰蛋白酶消化后，用培養(yǎng)基終止消化，轉(zhuǎn)移至離心管，1000rpm離心5分鐘后棄上清，加入ImlPBS重懸細(xì)胞后轉(zhuǎn)移至EP管，3000rpm離心5分鐘后棄上清，沉淀即為細(xì)胞(可于-80°C保存)；③每IOOul預(yù)冷的RAPI蛋白裂解液中加入Iul的cocktail蛋白酶抑制劑，備用。④每管細(xì)胞中加入適量的上述裂解混合液充分混勻后置于冰上裂解30分鐘，每隔數(shù)分鐘vortex混勻幾次。⑤4°C、以≥12000rpm的速度離心20分鐘以上，然后小心吸取上清，轉(zhuǎn)移至新的EP管中，即為細(xì)胞總蛋白。
[0047](2)測定蛋白濃度及蛋白變性:用NanoDrop 2000儀器測定蛋白濃度。操作步驟如下:①運(yùn)行NanoDrop 2000程序；②用2 U I去離子水清洗光纖表面,重復(fù)2次；③吸取2 U I蛋白裂解液加到光纖表面，點(diǎn)擊BLANK，做空白對照；④吸取2iU充分混勻后的樣品蛋白，點(diǎn)擊measure測量，軟件右邊顯示測量結(jié)果。⑤根據(jù)樣品蛋白的體積，加入相應(yīng)體積的5Xloading buffer, drybath上100°C、10分鐘,使蛋白變性,冰上驟冷,取出待用或-20°C保存。
[0048](3) SDS-PAGE電泳:將蛋白樣品加入到配置好的10% SDS-PAGE凝膠，各孔加入的不同細(xì)胞總蛋白量為50ii g，蛋白Marker的上樣量為5^1。開始電泳，濃縮膠的電壓為80V，當(dāng)樣品跑至分離膠時(shí)，將電壓上調(diào)至120V直到蛋白樣品前段快要跑出整個(gè)膠塊。取出SDS-PAGE凝膠置于轉(zhuǎn)膜緩沖溶液中，將轉(zhuǎn)膜用濾紙泡在轉(zhuǎn)膜液中，甲醇活化PVDF膜，用蛋白轉(zhuǎn)印儀半干轉(zhuǎn)法將SDS-PAGE中的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用麗春紅染色，檢測蛋白是否轉(zhuǎn)移至PVDF膜。[0049](4)封閉、抗體孵育及發(fā)光:將帶有蛋白的PVDF膜用含5%脫脂奶粉的TBST溶液封閉，4°C過夜。第二天取出膜，用各種一抗賦育，不同抗體采用不同的稀釋濃度。分別孵育不同的PVDF膜，室溫孵育2 h, TBST清洗3X10min。用1:5000的濃度稀釋二抗，室溫孵育lh，TBST洗滌3X IOmin。在暗室中用ECL孵育，用X光感光片檢測，顯色液中顯色，定影液中定影。得到的條帶可以半定量各種蛋白的表達(dá)量。
[0050]結(jié)論:過表達(dá)的miR-493能顯著抑制E2F1的蛋白水平的表達(dá)，并能顯著抑制95D細(xì)胞的增值能力(圖4)。以干擾E2F1的表達(dá)作為對照的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)論(圖6)。
[0051]實(shí)施例6:雙熒光素酶報(bào)告基因檢測
(1)克隆E2F1-3’ UTR的pMir-R印ort報(bào)告基因載體:根據(jù)E2F1-3’ UTR設(shè)計(jì)PCR引物上下游引入Spe I與Hind III酶切位點(diǎn)，在合成的DNA片段中將完整片段作為野生型，將與miR-493結(jié)合位點(diǎn)序列GACCUUCA突變成ACAAGG作為突變型。經(jīng)PCR擴(kuò)增基因的3’UTR序列，割膠回收目的片段，酶切后連接到雙熒光報(bào)告載體PMir-Report上，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)Ecol1.，鋪平板，挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定，最后DNA測序驗(yàn)證構(gòu)建的質(zhì)粒載體。
[0052](2)熒光素酶報(bào)告基因活性檢測分析:按5000個(gè)/孔的密度把293T細(xì)胞接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁后將相應(yīng)的插入3’ UTR序列的突變或者野生型pMir-r印orter載體，miR-493 minics,以及 pRL-TK (pRL-TK Renilla luciferase Vector,海腎突光素酶)在Iipofectamine 2000的介導(dǎo)下共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48h后，用熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測試劑盒在多功能酶標(biāo)儀上檢測熒光素酶的活性，每組三個(gè)重復(fù)孔，以PRL-TK表達(dá)的熒光素作為內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)化pMir-Report的活性。重復(fù)三次。
[0053]結(jié)論:將插入3’UTR序列的突變或者野生型pMir-reporter載體，miR-493minics,以及 pRL-TK(pRL-TK Renilla luciferase Vector,海腎突光素酶)在Iipofectamine 2000的介導(dǎo)下共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞miR-493能抑制報(bào)告基因的表達(dá)(圖4)，提示miR-493對E2F1表達(dá)具有直接抑制作用。
【權(quán)利要求】
1.miR-493基因或含有該基因的表達(dá)載體在制備抑制癌細(xì)胞藥物中的用途。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述的藥物為抑制癌細(xì)胞增殖的藥物。
3.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述的癌細(xì)胞的增殖機(jī)制與E2F1相關(guān)。
4.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述的癌為肺癌、卵巢癌、頭頸部腫瘤等。
5.如權(quán)利要求4所述用途，其特征在于所述的癌細(xì)胞為非小細(xì)胞肺癌。
6.如權(quán)利要求4所述用途，其特征在于所述的癌細(xì)胞為95D。
7.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述的miR-493基因序列如SEQID NO:1或SEQ ID NO:2 所示。
8.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述的藥物的制劑形式為液體制劑、顆粒劑、片劑或膠丸。
9.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述的藥物還包括要學(xué)上可接受的載體。
10.miR-493基因或`含有該基因的表達(dá)載體在制備E2F1抑制劑中的用途。
【文檔編號(hào)】A61K48/00GK103656678SQ201310438244
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年9月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月24日
【發(fā)明者】賀智敏, 谷依學(xué), 程燁, 張志杰, 王成昆 申請人:廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院