阻止腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)t細(xì)胞老化并逆轉(zhuǎn)其免疫抑制能力的方法及其在抗腫瘤免疫治療中的用途
【專利摘要】本發(fā)明提供阻止腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)T細(xì)胞老化并逆轉(zhuǎn)其免疫抑制能力的方法，向細(xì)胞提供TOLL樣受體8的配體，激活腫瘤細(xì)胞中TLR8信號(hào)通路，阻斷腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)T細(xì)胞老化，從而提高抗腫瘤免疫。TOLL樣受體8的配體，其特征在于是一種寡核苷酸，包含腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤和連接鳥(niǎo)嘌呤與相鄰核酸堿基的核酸酶抗性殘基間主鏈連接鍵組成（優(yōu)選化學(xué)鍵為硫代磷酸酯），其核酸合成序列為：5’-AGG…GA-3’，G代表鳥(niǎo)嘌呤，A代表腺嘌呤，G與G之間為硫代磷酯鍵修飾，G的數(shù)目可以3-10不等；常用配體Poly-G3的酸合成序列為5’-AGGGA-3’，腫瘤內(nèi)注射TLR8配體Poly-G3能顯著增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞的抑瘤作用。
【專利說(shuō)明】阻止腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)T細(xì)胞老化并逆轉(zhuǎn)其免疫抑制能力的方法及其在抗腫瘤免疫治療中的用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]激活TOLL樣受體8 (TLR8)信號(hào)作為新型的和有效的腫瘤免疫治療藥物和/或腫瘤疫苗佐劑。
【背景技術(shù)】
[0002]越來(lái)越多的證據(jù)顯示有效的、功能性的⑶4+和⑶8+T細(xì)胞在腫瘤的免疫監(jiān)視和抗腫瘤免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用。因而如何調(diào)控免疫細(xì)胞使其高效地識(shí)別和清除腫瘤細(xì)胞已成為治療侵襲性和轉(zhuǎn)移性腫瘤的新策略。目前許多免疫治療方法，如細(xì)胞因子、腫瘤活疫苗和過(guò)繼性免疫治療等，在臨床前期試驗(yàn)中顯示一定的效果，但是這些免疫治療的總體臨床效果欠佳[Rosen berg, S.A., Yang, J.C.&Rsetifo, N.P.Cancerimmunotherapy:moving beyond current vaccine.Nat.MedlO, 909-15(2004)]。 目前研究證明腫瘤通過(guò)各種策略形成的抑制性微環(huán)境是調(diào)動(dòng)體內(nèi)免疫功能及取得有效抗腫瘤免疫療效的主要障礙。招募和擴(kuò)增抑制性腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞是腫瘤誘導(dǎo)的免疫抑制的主要機(jī)制之一。腫瘤細(xì)胞能擴(kuò)增和招募不同類型的腫瘤浸潤(rùn)性免疫抑制細(xì)胞，包括調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)，致耐受樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)，腫瘤來(lái)源的巨噬細(xì)胞和骨髓移植細(xì)胞(MSCs) [Roncarolo, M.G.，et al.1nterleukin-10-secreting typelregulatory Tcells in rodents and hum ans.1mmunological reviews212, 28-50(2006);Peng G., etal.Tumor-1nfiltrating gammadelta T cells suppress T and dendritic cell functionvia mechanisms controlled by unique toll-like receptor signaling pathway.1mmunity27，334-8 (2007)]。另外，腫瘤細(xì)胞能分泌抑制因子(IL-10，TGF-β和ID0)，表達(dá)抑制性分子(FasL和I3D-Ll )，直接抑制腫瘤特異性T細(xì)胞的擴(kuò)增并誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡。因此，如何更好地理解腫瘤誘導(dǎo)的免疫抑制微環(huán)境怎樣建立及維持的分子機(jī)制能為開(kāi)發(fā)新的腫瘤疫苗和免疫治療策略提供理論依據(jù)。同時(shí)加強(qiáng)開(kāi)發(fā)逆轉(zhuǎn)免疫抑制的治療新策略是進(jìn)行成功的臨床免疫治療所面臨的主要挑戰(zhàn)。
[0003]細(xì)胞老化最初是用來(lái)描述人成纖維細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中出現(xiàn)的有限的傳代增殖能力。近期的研究提示老化也發(fā)生在人免疫細(xì)胞，從而導(dǎo)致與正常老化相關(guān)的免疫系統(tǒng)的功能異常。研究發(fā)現(xiàn)，老化的CD8+T細(xì)胞的增多存在于慢性病毒感染的病人以及某些腫瘤病人如肺癌、乳腺癌和頭頸部腫瘤等。老化T細(xì)胞常有顯著的表型變化，如共刺激分子CD28表達(dá)的永久丟失、細(xì)胞周期停滯以及細(xì)胞周期相關(guān)基因p53、p21和pl6的上調(diào)。更重要的是老化T細(xì)胞發(fā)生功能改變，包括殺傷能力缺失、具有潛在的負(fù)調(diào)控功能[Vallejo，V.N.CD28extinction in human T cells:altered functions and the program of T—cellsenescence.1mmunol Rev205, 158-69(2005)]。因此，更好地了解腫瘤微環(huán)境中老化T細(xì)胞產(chǎn)生的分子機(jī)制以及研究如何恢復(fù)老化的腫瘤特異性免疫細(xì)胞的效應(yīng)功能對(duì)抗腫瘤免疫及治療具有關(guān)鍵的意義。
[0004]TLR激活劑用作疫苗佐劑或防治腫瘤和感染性疾病的藥物已成為一個(gè)活躍的研究令頁(yè)域° [Wang, R.F.，et al.Toll-like receptors and immune regulation:1mplicationsfor cancer therapy.0ncogene, 27，181-9 (2008)]。多種 TLR 配體，包括咪喹莫特(TLR7)和CpG(TLR9)配體對(duì)腫瘤的治療有顯著作用。這些TLR配體能直接誘導(dǎo)表達(dá)相應(yīng)TLR的腫瘤細(xì)胞凋亡，或增強(qiáng)腫瘤浸潤(rùn)固有免疫和腫瘤特異性T細(xì)胞功能。相反，許多研究證實(shí)一些TLR信號(hào)通路，如LPS和羅唑利賓(Loxoribine)能促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。這些矛盾的結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明TLR信號(hào)通路在腫瘤和免疫細(xì)胞的調(diào)控是復(fù)雜的，并因不同腫瘤和不同TLR配體而異。因此，更好地理解腫瘤細(xì)胞和腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞中TLR信號(hào)通路的調(diào)控不僅能進(jìn)一步有助于識(shí)別腫瘤免疫病理的分子機(jī)制也將為開(kāi)發(fā)有效的腫瘤治療方法提供新策略。TLRs也對(duì)調(diào)控Treg的功能起重要作用。我們的研究證實(shí)，人TLR8的配體，包括人工合成的Poly-G寡核苷酸和天然配體(SSRNA40)能直接逆轉(zhuǎn)自然發(fā)生CD4+CD25+Treg細(xì)胞以及腫瘤來(lái)源的CD4+、CD8+以及、δ Treg細(xì)胞的抑制功能[Peng，G.，etal.Toll-like receptor8_mediated reversal of CD4+regulatory T cell function.Science309,1380-4(2005).Peng G.,et al.Tumor-1nfiltrating gammadelta T cellssuppress T and dendritic cell function via mechanisms controlled by uniquetoll-like receptor signaling pathway.1mmunity27, 334-8(2007)]。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]發(fā)明目的:恢復(fù)老化的腫瘤特異性免疫細(xì)胞的效應(yīng)功能。
[0006]技術(shù)方案:我們的最近研究揭示人腫瘤細(xì)胞能誘導(dǎo)幼稚和腫瘤效應(yīng)T細(xì)胞老化。腫瘤來(lái)源的內(nèi)源性環(huán)化單磷酸腺苷(cAMP)是誘導(dǎo)T細(xì)胞老化的主要介質(zhì)。我們的研究進(jìn)一步證實(shí)，TLR8激活劑Poly-G3和ssRNA40顯著逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)T細(xì)胞老化的能力。Poly-G3能有效調(diào)控腫瘤細(xì)胞的TLR8信號(hào)通路并阻斷腫瘤來(lái)源cAMP的作用。我們通過(guò)小鼠腫瘤模型及免疫治療模型發(fā)現(xiàn)，通過(guò)Poly_G3活化腫瘤細(xì)胞TLR8信號(hào)通路能有效地預(yù)防并逆轉(zhuǎn)腫瘤所引起的幼稚T細(xì)胞和腫瘤特異性T細(xì)胞老化，并且能逆轉(zhuǎn)其抑制功能，從而顯著增強(qiáng)抗腫瘤免疫治療效應(yīng)。我們的研究清楚地顯示人TLR8信號(hào)通路能逆轉(zhuǎn)腫瘤微環(huán)境介導(dǎo)的抑制效應(yīng)并能將其切換為效應(yīng)微環(huán)境。我們的研究為利用TLR8配體作為新型的和有效的腫瘤免疫治療藥物和/或腫瘤疫苗佐劑提供強(qiáng)有力的依據(jù)。
[0007]本發(fā)明提供一種阻止腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)T細(xì)胞老化并逆轉(zhuǎn)其抑制能力的方法，向細(xì)胞提供TOLL樣受體8的配體，激活腫瘤細(xì)胞中TLR8信號(hào)通路，阻斷腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)T細(xì)胞老化。TLR8配體通過(guò)激活腫瘤細(xì)胞中TLR8信號(hào)通路下游的ERK1/2和P38，阻斷腫瘤來(lái)源內(nèi)源性環(huán)化單磷酸腺苷即cAMP的產(chǎn)生。TOLL樣受體8的配體，是一種寡核苷酸，包含腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤和連接鳥(niǎo)嘌呤與相鄰核酸堿基的核酸酶抗性殘基間主鏈連接化學(xué)鍵組成，其核酸合成序列為:5’ -AGG…GA-3’ ；G代表鳥(niǎo)嘌呤，A代表腺嘌呤，G與G之間為化學(xué)鍵修飾，化學(xué)鍵為硫代磷酸酯。G的數(shù)目可以3-10不等，優(yōu)選配體Poly_G3的酸合成序列為5’ -AGGGA-3’。
[0008]腫瘤細(xì)胞包括小鼠腫瘤細(xì)胞及人腫瘤細(xì)胞。
[0009]人腫瘤細(xì)胞包括乳腺癌、黑色素瘤、前列腺癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌，肺癌，肝癌和頭頸部腫瘤及其他實(shí)體性腫瘤。
[0010]TOLL樣受體8的配體用于腫瘤免疫治療藥物或腫瘤疫苗佐劑；并可用注射的方式為腫瘤內(nèi)，皮下，或全身靜脈注射。[0011]有益效果:
[0012]1、發(fā)現(xiàn)了一個(gè)腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)免疫抑制的新機(jī)制，即將幼稚/效應(yīng)T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有抑制功能的老化T細(xì)胞。
[0013]2、證實(shí)腫瘤細(xì)胞來(lái)源的內(nèi)源性cAMP與T細(xì)胞老化的誘導(dǎo)有關(guān)。
[0014]3、進(jìn)一步證實(shí)激活腫瘤細(xì)胞內(nèi)的TLR8信號(hào)通路能阻斷腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)幼稚T細(xì)胞和腫瘤特異性效應(yīng)T細(xì)胞老化并逆轉(zhuǎn)其抑制功能，從而提高抗腫瘤免疫。
[0015]4、進(jìn)一步闡明了 TLR8在腫瘤細(xì)胞的具體調(diào)控信號(hào)通路。這些研究為研發(fā)阻斷腫瘤誘導(dǎo)的免疫抑制策略提供新思路和手段。
[0016]4、TLR8配體通過(guò)激活腫瘤細(xì)胞中TLR8信號(hào)通路(包括MyD88、IRAK4、ERKI/2和P38)阻斷腫瘤來(lái)源cAMP的產(chǎn)生，進(jìn)而阻斷腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)T細(xì)胞老化。
[0017]5、我們利用黑色素瘤586mel荷瘤Ragl+小鼠模型證明，腫瘤內(nèi)注射TLR8配體Poly-G3能顯著阻斷轉(zhuǎn)入荷瘤小鼠的幼稚⑶4+T細(xì)胞老化并且逆轉(zhuǎn)其抑制功能。
[0018]6、我們利用黑色素瘤586mel荷瘤N0D_scid IL_2Rgammanu11小鼠模型證明，腫瘤內(nèi)注射TLR8配體Poly-G3能顯著阻斷轉(zhuǎn)入荷瘤小鼠的腫瘤特異性效應(yīng)T細(xì)胞⑶8+TIL586的老化誘導(dǎo)并逆轉(zhuǎn)其抑制能力。
[0019]7、我們通過(guò)小鼠腫瘤免疫治療模型發(fā)現(xiàn)，腫瘤內(nèi)注射TLR8配體Poly_G3能顯著增強(qiáng)⑶8+TIL586細(xì)胞的抑瘤作用。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0020]圖1顯示了腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(TILs)中老化細(xì)胞比例升高；
[0021]圖2顯示了腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(TILs)中老化細(xì)胞比例升；
[0022]圖3顯示了腫瘤誘導(dǎo)的老化細(xì)胞具有很強(qiáng)的抑制功能；
[0023]圖4顯示了腫瘤來(lái)源的內(nèi)源性cAMP是誘導(dǎo)T細(xì)胞老化的關(guān)鍵介質(zhì)；
[0024]圖5顯示了 cAMP抑制劑能顯著抑制腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的T細(xì)胞老化；
[0025]圖6顯示了 TLR8配體顯著逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)幼稚⑶4+T細(xì)胞老化；
[0026]圖7顯示了 TLR8配體逆轉(zhuǎn)腫瘤誘導(dǎo)的T細(xì)胞老化所涉及TLR8信號(hào)通路，包括MyD88、IRAK4、ERKI/2 和 P38 ；
[0027]圖8顯示了 TLR8信號(hào)通過(guò)下調(diào)腫瘤細(xì)胞內(nèi)的cAMP逆轉(zhuǎn)腫瘤誘導(dǎo)的T細(xì)胞老化；
[0028]圖9顯示了敲除MCF7細(xì)胞中ERK1/2或p38信號(hào)分子，或敲除PC3細(xì)胞中ERK1/2信號(hào)分子能顯著阻斷Poly_G3導(dǎo)致的腫瘤細(xì)胞內(nèi)cAMP水平降低；
[0029]圖10顯示了 TLR8信號(hào)通路能逆轉(zhuǎn)人黑色素瘤細(xì)胞小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的幼稚⑶4+T細(xì)胞老化；
[0030]圖11顯示了激活腫瘤中TLR8信號(hào)能阻斷腫瘤誘導(dǎo)的腫瘤特異性效應(yīng)T細(xì)胞老化；
[0031]圖12顯不了腫瘤內(nèi)注射TLR8配體Poly_G3能顯著增強(qiáng)NOD-scid IL_2Rgammanu11小鼠的T細(xì)胞抗腫瘤免疫。
【具體實(shí)施方式】
[0032]實(shí)驗(yàn)方法如下:[0033]1.人標(biāo)本和細(xì)胞株[0034]黑色素瘤、乳腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌標(biāo)本和配對(duì)正常組織來(lái)自于圣路易斯大學(xué)外科住院手術(shù)病人。正常人血白細(xì)胞層來(lái)(Buffy Coat)自于美國(guó)休斯頓海灣地區(qū)血液中心。這些研究已獲得學(xué)校研究審查委員會(huì)批準(zhǔn)。Ficoll-Paque分離獲得外周血單核細(xì)胞(PBMC)。人幼稚⑶4+和Q38+T細(xì)胞用EasySep富集試劑盒(StemCell Technologies)分離獲得。不同種類的腫瘤細(xì)胞株(黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、結(jié)腸癌和鱗癌)和正常乳腺組織來(lái)源細(xì)胞(BN)，購(gòu)自于美國(guó)組織庫(kù)(ATCC)或本實(shí)驗(yàn)室建立。乳腺癌(BC)、結(jié)腸癌(CC)細(xì)胞株培養(yǎng)于角化細(xì)胞培養(yǎng)液(含25mg/ml牛腦垂體提取物、5ng/ml表皮生長(zhǎng)因子、2mML-glutamineUOmM HEPES緩沖液、2%熱滅活胎牛血清(FCS)和親鏈霉素)。其他腫瘤細(xì)胞株培養(yǎng)于含10%FCS的RPMI1640。
[0035]2.腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的獲得
[0036]腫瘤和正常組織浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞來(lái)自于不同的腫瘤和正常組織，方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[Peng, G., et al.Toll-like receptor8_mediated reversal of CD4+regulatory T cellfunction.Science309, 1380-4(2005).Peng G., et al.Tumor-1nfiltrating gammadeltaT cells suppress T and dendritic cell function via mechanisms controlled byunique toll-like receptor signaling pathway.1mmunity27, 334-8 (2007)]。主要步驟如下:組織切碎后以膠原酶IV、透明質(zhì)酸酶和脫氧核酸酶消化；消化后的細(xì)胞經(jīng)RPMI1640洗滌后，培養(yǎng)于含10%人血清、左旋谷酰胺、2-巰基乙醇和50U/ml的IL-2的RPMI1640中。
[0037]3.TLR8配體的合成
[0038](A)人工合成的TLR8配體Poly_G3，AG*G*GA.A代表腺嘌呤，G代表鳥(niǎo)嘌呤。*代表硫代磷脂鍵修飾。由Invitrogen公司合成。
[0039](B)天然 TLR8 配體 ssRNA40/LyoVec,由 Invivogen 公司合成。
[0040](C)陰性對(duì)照配體，Poly-TIO，T*TTTT*T*T*T*T*T。T代表腺腺嘧啶。*代表硫代磷脂鍵修飾。由Invitrogen公司合成。
[0041]4.老化相關(guān)β -半乳糖苷酶(SA- β -Gal)染色
[0042]老化T細(xì)胞內(nèi)SA- β -Gal活性的檢測(cè)參考以前文獻(xiàn)(Ye J.，et al.Humanregulatory T cells induce T lymphocyte senescence.Blood, 2012，120:2021-2031)。主要步驟如下:抗-⑶3激活的幼稚⑶4+或⑶8+T細(xì)胞以1:1的比例與腫瘤細(xì)胞或正常組織來(lái)源細(xì)胞共培養(yǎng)I天后，分離并繼續(xù)培養(yǎng)3或5天。處理的細(xì)胞PBS洗滌后，固定于3%甲醛，以新鮮配制的 SA- β -Gal 顯色液(lmg/ml X-gal, 5mM K3Fe [CN]6, 5mM K4Fe [CN]6, 2mM MgCl2于PBS中，Ph6.0.)37°C，孵育過(guò)夜。染色后的細(xì)胞經(jīng)水輕輕洗滌后，置于顯微鏡下觀察。
[0043]對(duì)有些實(shí)驗(yàn)，共培養(yǎng)體系含有下列TLR配體或抑制劑。TLR配體包括:Pam3CSK4 (TLR2 配體，200ng/ml)，Poly(1:C) (TLR3 配體，25 μ g/ml)，LPS (TLR4 配體，100ng/ml), Flagellin (TLR5 配體 10 μ g/ml)，Loxoribine (TLR7 配體,500 μ Μ)，ssRNA40/LyoVec (TLR8 配體 3 μ g/ml) (Invivogen, San Diego, CA)和寡聚核昔酸 CpG-B (3 μ g/ml)，Poly-T3 (3 μ g/ml)和 PoIy-G3 (3 μ g/ml) (Invitrogen 合成);cAMP 抑制劑包括:2，，5’ -雙脫氧腺苷(7ddA, 320 μ Μ)和雙氫氯化物(Η89, 20 μ M) (Calbiochemistry, San Diego, CA)。MAPK和NF-κ B阻斷實(shí)驗(yàn):腫瘤細(xì)胞經(jīng)MAPK抑制劑U0126(10yM), SB203580 (10 μ Μ)，和SP600125(10yM)或NF-κ B抑制劑APDC (10 μ Μ)處理3天，第三天加入Poly_G3。處理后的T細(xì)胞分離后繼續(xù)培養(yǎng)3天，然后檢測(cè)SA-β -Gal活性。
[0044]5.流式細(xì)胞儀分析
[0045]⑶4+Τ細(xì)胞經(jīng)PE或FITC標(biāo)記的抗人特殊抗體細(xì)胞表面或胞內(nèi)染色后，F(xiàn)ACS檢測(cè)⑶4+Τ細(xì)胞標(biāo)志表達(dá)。所用到的人抗體包括:抗-⑶4、抗-⑶8、抗-⑶28和抗磷酸化ATM，均購(gòu)自BD Biosceinces0所有染色細(xì)胞用FACSCalibur流式細(xì)胞儀分析，所得數(shù)據(jù)用FLOWJ0軟件分析(Tree Star)。
[0046]6.免疫印跡實(shí)驗(yàn)
[0047]抗-⑶3激活的⑶4+T細(xì)胞與MCF7或PC3共培養(yǎng)O、1、3或5天。共培養(yǎng)的⑶4+T細(xì)胞分離后以裂解液[50mM Tris-HCl (Ph8.0), 1%NP40, 250mM NaCl, 50mM NaF, ImM Na3VO4, ImM蛋白抑制劑(PMSF，抑酶肽，亮肽素)和ImM DDT]處理。細(xì)胞裂解液經(jīng)蛋白定量后，SDS-PAGE分離，隨后轉(zhuǎn)至HWF膜。PVDF膜經(jīng)一抗及辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗孵育后化學(xué)發(fā)光底物處理顯影。實(shí)驗(yàn)中所用抗體包括:抗-磷酸化LCK，抗-LCK，抗磷酸化-PKA，抗-PKA，抗磷酸化CREB,抗-CREB,抗 _actin(Cell Signaling Technology, Danvers, MA) ? 有些實(shí)驗(yàn)中，培養(yǎng)液中加入Poly-G3，處理后的幼稚⑶4+T細(xì)胞用來(lái)進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)。
[0048]7.功能性增殖實(shí)驗(yàn)
[0049]增殖實(shí)驗(yàn)如前所述[Peng,G.，et al.Toll-like receptor8_mediated reversalof CD4+regulatory T cell function.Science309, 1380-4(2005).Peng G., etal.Tumor-1nfiltrating gammadelta T cells suppress T and dendritic cell functionvia mechanisms controlled by unique toll-like receptor signaling pathway.1mmunity27，334-8 (2007)]。主要步驟:在抗_CD3 (2 μ g/ml)包被的96孔培養(yǎng)板中，IXlO5從健康人新鮮分離的幼稚⑶4+T細(xì)胞與腫瘤或正常組織細(xì)胞處理的T細(xì)胞以不同比M(l:10, 1:0.5, 1:0.2, 1:0.1,0:1)共培養(yǎng)于含2%人AB血清培養(yǎng)液。培養(yǎng)56小時(shí)后，以IyCi/孔的終濃度加入[3H]-胸腺嘧啶，繼續(xù)培養(yǎng)16小時(shí)。以液閃計(jì)數(shù)器測(cè)定[3H]-胸腺嘧啶的摻入。
[0050]8.Calcein AM轉(zhuǎn)移及細(xì)胞間連接通訊阻斷
[0051]MCF7、M628 及 PC3 腫瘤細(xì)胞孵育于含 Calcein AM (5 μ Μ, Invitrogen, Inc.)的 PBS中40分鐘(37°C，5%C02)。細(xì)胞用含5%FBS的PBS洗滌2次，以1:1的比例與抗-CD3激活的CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)1-3天，同時(shí)在培養(yǎng)液內(nèi)加或不加300 μ M GAP27 (Tocris Bioscience)。FACS檢測(cè)轉(zhuǎn)移入T細(xì)胞的Calcein AM。細(xì)胞間連接通訊阻斷實(shí)驗(yàn)，MCF7、M628或PC3腫瘤細(xì)胞與抗-CD3激活的CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)I天，培養(yǎng)液內(nèi)加或不加GAP27。處理后的細(xì)胞分離后繼續(xù)培養(yǎng)3天，然后檢測(cè)SA- β -Gal表達(dá)及cAMP濃度。
[0052]9.cAMP 的檢測(cè)
[0053]腫瘤細(xì)胞或T細(xì)胞以預(yù)冷PBS洗滌三次，然后凍融三次。以cAMP特異性的ELISA測(cè)定胞漿cAMP的濃度(具體方法見(jiàn)R&D Systems)。
[0054]10.Lentivirus-shRNA的產(chǎn)生及腫瘤細(xì)胞基因的敲除
[0055]TLR8、IRAK4、MyD88、ERKl、ERK2、P38a、JNKl、IKKa 或隨機(jī) lent1-shRNAs 的設(shè)計(jì)和構(gòu)建方法，以及攜帶GFP的重組Ientivirus和shRNA的產(chǎn)生見(jiàn)前[Peng, G., etal.Toll-like receptor8_mediated reversal of CD4+regulatory T cell function.Science309,1380-4(2005).Peng G.,et al.Tumor-1nfiltrating gammadelta T cellssuppress T and dendritic cell function via mechanisms controlled by uniquetoll-like receptor signaling pathway.1mmunity27，334—8 (2007) ] ?腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)于24孔培養(yǎng)板，加入濃縮的Ientivirus上清(5-10M0I/0.5ml培養(yǎng)液)及8μ g/ml聚凝胺(Sigma),室溫1000g離心I小時(shí)。轉(zhuǎn)染3_4天后，F(xiàn)ACS分離GFP+和GFP_腫瘤細(xì)胞。進(jìn)一步測(cè)定分離的腫瘤細(xì)胞(GFP+和GFP_)誘導(dǎo)老化及產(chǎn)生cAMP的能力。TLR8siRNA，5’GGTGGTGCTTCAATTAATA;IRAK4siRNA, 5’GCAGCAATGGTTGACATTA;MyD88siRNA, 5’GGCACCTGTGTCTGGTCTA0
[0056]11.逆轉(zhuǎn)錄 PCR
[0057]用Trizol (Invitrogen)提取總 RNA,用 SuperScript II RT 試劑盒提取 cDNA,參照廠商的說(shuō)明操作。逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)TLRl至TLR9mRNA的表達(dá)。每一樣本mRNA表達(dá)水平以GAI3DH矯正。
[0058]12.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
[0059]Ragl+ 小鼠和 NOD-scid IL2Rgammanu11 小鼠(缺失 T 和 B 細(xì)胞)購(gòu)自于 Jackson 實(shí)驗(yàn)室。所有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已獲得Saint Louis University動(dòng)物管理委員會(huì)的批準(zhǔn)。Ragl+小鼠和NOD-scid IL2Rgammanu11小鼠皮下注射含人黑色素瘤586mel腫瘤細(xì)胞(5X IO6)的100 μ I PBS緩沖液.⑶3抗體(2 μ g/ml)預(yù)激活的⑶4+T細(xì)胞(5X IO6/鼠)或腫瘤特異的⑶8+TIL586細(xì)胞(5 X IO6/鼠)(能特異性地識(shí)別和殺死586mel細(xì)胞)經(jīng)尾靜脈注射入對(duì)照組小鼠及荷瘤小鼠(腫瘤大小約為10X 10mm)。在平行實(shí)驗(yàn)中，分別于注入⑶4+T細(xì)胞后 1、4、7 和 10 天后，瘤內(nèi)注射 PBS (100 μ I/鼠)、LPS (10、20、50 μ g/100 μ I PBS/鼠)或Poly-G3(50yg/100y I PBS/鼠)。每組5_10只小鼠。T細(xì)胞注射12天后，收集血、淋巴結(jié)(LN)、脾臟(SP)和腫瘤；Ficoll分離單核細(xì)胞。注入的人⑶4+T細(xì)胞以抗體包被的磁珠分選法(M icrobeads, Miltenvi Biotec)分離、回收，并作表型和功能分析。SA-β-Gal染色和3Η-胸腺嘧啶摻入試驗(yàn)同前。至于腫瘤生長(zhǎng)和抗腫瘤免疫實(shí)驗(yàn)，人黑色素瘤586mel腫瘤細(xì)胞(5X106)于100μ I PBS皮下注入NOD-scid IL2Rgammanu11小鼠。第三天，尾靜脈注射腫瘤特異CD8+TIL586細(xì)胞，同時(shí)給予或不給Poly_G3 (4次,3天間隔)。腫瘤大小每四天測(cè)量一次，并計(jì)算腫瘤體積。
[0060]實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
[0061]1.腫瘤細(xì)胞能誘導(dǎo)T細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂幸种乒δ艿睦匣疶細(xì)胞。
[0062]1.1腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(TILs)中老化細(xì)胞比例升高。
[0063]為研究誘導(dǎo)T細(xì)胞老化是否為腫瘤免疫逃避的機(jī)制之一，我們獲取不同腫瘤和正常組織浸潤(rùn)淋性巴細(xì)胞，并分析老化細(xì)胞的比例。我們首先檢測(cè)了 SA-P-Gal (人老化細(xì)胞標(biāo)志)陽(yáng)性細(xì)胞比例。與配對(duì)的正常組織來(lái)源的淋巴細(xì)胞相比，乳腺癌、黑色素瘤、頭頸部腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞(TILs)包含高比例的SA-β-Gal陽(yáng)性細(xì)胞(圖1A)。⑶28表達(dá)的丟失或降低是老化T細(xì)胞的另一個(gè)重要標(biāo)志。因而我們進(jìn)一步檢測(cè)了 TILs(分別為來(lái)源于乳腺癌、黑色素瘤、頭頸部腫瘤)或正常乳腺組織來(lái)源的淋巴細(xì)胞CD28表達(dá)狀況。結(jié)果顯示，正常組織來(lái)源的淋巴細(xì)胞高表達(dá)⑶28，而TILs中⑶28顯著下降(圖1B)。BNT:正常乳腺組織來(lái)源T細(xì)胞；BTIL，MTIL和HNTIL:分別為來(lái)源于乳腺癌、黑色素瘤、頭頸部腫瘤的TILs。
[0064]1.2腫瘤細(xì)胞株和幼稚T細(xì)胞共培養(yǎng)顯著誘導(dǎo)幼稚T細(xì)胞老化。
[0065]我們進(jìn)一步探討腫瘤細(xì)胞是否直接誘導(dǎo)T細(xì)胞老化。幼稚CD4+T細(xì)胞分離自健康志愿者，以抗-CD3抗體激活后與不同種類腫瘤細(xì)胞株(乳腺癌MCF7、黑色素瘤M586和M628、結(jié)直腸癌SW480和CC2、卵巢癌0C155、前列腺癌DU145和PC3、鱗癌SSC25和CAL27)或正常乳腺細(xì)胞株BN2和BN5共培養(yǎng)。共培養(yǎng)I天后，分離出⑶4+T細(xì)胞，并繼續(xù)培養(yǎng)3天，然后檢測(cè)老化相關(guān)表型及功能。結(jié)果顯示，幼稚CD4+T細(xì)胞與正常乳腺細(xì)胞株共培養(yǎng)后只出現(xiàn)少量SA-β -Gal陽(yáng)性細(xì)胞；而與不同種類的腫瘤細(xì)胞株共培養(yǎng)后SA-β -Gal陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著升高(圖2Α)。進(jìn)一步分析CD28表達(dá)發(fā)現(xiàn)，幼稚T細(xì)胞與不同種類的腫瘤細(xì)胞(而不是正常組織細(xì)胞)共培養(yǎng)能顯著降低其CD28的表達(dá)(圖2Β)。
[0066]1.3腫瘤誘導(dǎo)老化細(xì)胞具有抑制功能。
[0067]我們進(jìn)一步研究了腫瘤誘導(dǎo)的老化細(xì)胞的功能改變。[3H]-胸腺嘧啶摻入實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同種類腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的老化CD4+T細(xì)胞對(duì)反應(yīng)性CD4+T細(xì)胞有很強(qiáng)的增殖抑制作用(圖3)。
[0068]2.腫瘤來(lái)源的內(nèi)源性cAMP是誘導(dǎo)T細(xì)胞老化的關(guān)鍵介質(zhì)。
[0069]2.1腫瘤細(xì)胞內(nèi)大量cAMP能傳遞給共培養(yǎng)的T細(xì)胞。
[0070]已有研究證實(shí)，腫瘤細(xì)胞能建立一個(gè)缺氧環(huán)境，從而導(dǎo)致腫瘤部位腺苷和cAMP的升高。這些缺氧所致的代謝產(chǎn)物能保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受腫瘤特異性CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫。cAMP作為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tr eg )發(fā)揮抑制功能的機(jī)制之一，能抑制IL-2的產(chǎn)生和⑶4+T細(xì)胞增殖[Bopp, T.et al.Cyclic adenosinemonophosphate is a key component of regulatory T cell-mediated suppression.J Exp Med204，1303-10(2007)]。這些研究促使我們?nèi)プC實(shí)腫瘤來(lái)源的cAMP是否也與誘導(dǎo)T細(xì)胞老化有關(guān)。結(jié)果顯示 ，cAMP在腫瘤細(xì)胞M628，PC3和MCF7中的水平顯著高于正常乳腺細(xì)胞(圖4A)。與腫瘤細(xì) 胞M628，PC3和MCF7共培養(yǎng)一天后，cAMP在⑶4+T細(xì)胞的水平顯著升高(圖4B)。已有研究顯示，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞間連接通訊向效應(yīng)T細(xì)胞傳遞 cAMP[Bopp, T.et al.Cyclic adenosine monophosphate is a key component ofregulatory T cell-mediated suppression.J Exp Med204, 1303-10 (2007)]。我們推測(cè)腫瘤細(xì)胞可能利用相似的機(jī)制，向靶T細(xì)胞傳遞cAMP，從而誘導(dǎo)T細(xì)胞老化。在共培養(yǎng)系統(tǒng)中加入細(xì)胞間隙連接抑制性多肽GAP27后，能顯著降低cAMP水平(圖4B)。而且，GAP27能顯著降低腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的T細(xì)胞老化(圖4C)。*p〈0.05, **p<0.01，與對(duì)照組比較。
[0071](B)
[0072]
【權(quán)利要求】
1.一種阻止腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)T細(xì)胞老化并逆轉(zhuǎn)其免疫抑制能力的方法，其特征在于，向細(xì)胞提供TOLL樣受體8的配體，激活腫瘤細(xì)胞中TLR8信號(hào)通路，阻斷腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)T細(xì)胞老化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的阻止腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)T細(xì)胞老化并逆轉(zhuǎn)其抑制能力的方法，其特征在于，TOLL樣受體8的配體，是一種寡核苷酸，包含腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤和連接鳥(niǎo)嘌呤與相鄰核酸堿基的核酸酶抗性殘基間主鏈連接化學(xué)鍵組成，其核酸合成序列為:5’ -AGG…GA-3’ ；G代表鳥(niǎo)嘌呤，A代表腺嘌呤，G與G之間為化學(xué)鍵修飾，G的數(shù)目可以3_10不等。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的阻止腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)T細(xì)胞老化并逆轉(zhuǎn)其抑制能力的方法，其特征在于，TOLL樣受體8的配體，配體Poly-G3的酸合成序列為5’ -AGGGA-3’。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的阻止腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)T細(xì)胞老化并逆轉(zhuǎn)其抑制能力的方法，其特征在于，TOLL樣受體8的配體，化學(xué)鍵為硫代磷酸酯。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的阻止腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)T細(xì)胞老化并逆轉(zhuǎn)其抑制能力的方法，其特征在于，TLR8配體通過(guò)激活腫瘤細(xì)胞中TLR8信號(hào)通路，是下游的ERK1/2和P38，阻斷腫瘤來(lái)源內(nèi)源性環(huán)化單磷酸腺苷即cAMP的產(chǎn)生。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的阻止腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)T細(xì)胞老化并逆轉(zhuǎn)其抑制能力的方法，其特征在于，腫瘤細(xì)胞包括小鼠腫瘤細(xì)胞及人腫瘤細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的阻止腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)T細(xì)胞老化并逆轉(zhuǎn)其抑制能力的方法，其特征在于，人腫瘤細(xì)胞包 括乳腺癌、黑色素瘤、前列腺癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌，肺癌，肝癌和頭頸部腫瘤及其他實(shí)體性腫瘤。
8.一種用于人逆轉(zhuǎn)腫瘤免疫抑制的疫苗，其特征在于，將權(quán)利要求2或3或4所述的TOLL樣受體8的配體用于腫瘤免疫治療藥物或腫瘤疫苗佐劑。
9.TOLL樣受體8的配體注射方式，其特征在于，將權(quán)利要求2或3或4中的TOLL樣受體8的配體注射腫瘤內(nèi)，皮下，或全身靜脈注射。
【文檔編號(hào)】A61K39/39GK103520198SQ201310439868
【公開(kāi)日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2013年9月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月24日
【發(fā)明者】彭光勇, 葉健 申請(qǐng)人:彭光勇