用于治療組織炎癥和癌變的鳥苷酸環(huán)化酶受體激動劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于治療組織炎癥和癌變的鳥苷酸環(huán)化酶受體激動劑。本發(fā)明公開在哺乳動物中治療組織發(fā)炎，癌變前或癌變的方法。該治療涉及施用至少一種鳥苷酸環(huán)化酶的肽激動劑和/或其他增強細胞內(nèi)cGMP產(chǎn)量的小分子的組合物。該鳥苷酸環(huán)化酶的肽激動劑可以單獨施用或同抑制依賴cGMP的磷酸二酯酶的抑制劑聯(lián)合施用。抑制劑可為小分子、肽、蛋白質(zhì)或其他抑制cGMP降解的其他化合物。不需要特定作用機制，該治療可以重建受治療者上皮細胞群中增殖和凋亡的平衡，并抑制癌變。因此，該方法可用于治療包括胃腸道炎癥、普通器官發(fā)炎和哮喘的炎癥和肺、胃腸道、膀胱、睪丸、前列腺和胰腺的癌變或息肉。
【專利說明】用于治療組織炎癥和癌變的鳥苷酸環(huán)化酶受體激動劑
[0001]相關(guān)申請的交叉引用
[0002]本發(fā)明要求以下美國臨時申請的權(quán)益:2001年3月29日提交的60/279,438 ；2001年3月29日提交的60/279，437 ；2001年6月27日提交的60/300，850 ；2001年7月10日提交的60/303，806 ；2001年7月25日提交的60/307，358 ；2002年1月17日提交的60/348，646.發(fā)明領(lǐng)域
[0003]本發(fā)明涉及鳥苷酸環(huán)化酶受體激動劑作為提高細胞內(nèi)cGMP產(chǎn)量的方法，在治療上的用途。該激動劑可以單獨使用或者與cGMP-特異的磷酸二酯酶的抑制劑聯(lián)合使用，以預防或治療癌變的、癌變前的以及轉(zhuǎn)移性的腫瘤生長，尤其是在胃腸道及肺部。除此以外，該激動劑還可以用于治療炎癥，如潰瘍性結(jié)腸炎和哮喘。
[0004]發(fā)明背景
[0005]尿鳥苷蛋白、鳥苷蛋白和細菌ST肽是在結(jié)構(gòu)上相關(guān)的肽，它們與鳥苷酸環(huán)化酶受體結(jié)合并刺激細胞內(nèi)產(chǎn)生環(huán)化鳥嘌呤核苷單磷酸(cGMP)(l-6)。這導致了囊性纖維化跨膜傳導調(diào)節(jié)蛋白(CFTR)的激活，CFTR是一個頂端膜通道，用于氯從沿腸道排列的腸細胞外排(1-6)。CFTR的激活以及隨后的氯的跨上皮分泌的增加導致激發(fā)鈉和水向腸腔內(nèi)的分泌。因此，cGMP受體激動劑通過作為CFTR的旁分泌調(diào)控因子，可以調(diào)控胃腸道內(nèi)液體和電解質(zhì)的運輸(1-6，美國專利5，489，670)。
[0006]上皮的更新過程包括胃腸道細胞在胃腸腔內(nèi)的增殖、遷移、分化、衰老以及最終的喪失(7，8)。根據(jù)上皮細胞的增殖指數(shù)，胃腸粘膜可以分為三個明顯的區(qū)帶。其中的一個區(qū)帶——增殖區(qū)帶，由未分化的干細胞組成，這些干細胞提供新生細胞的持續(xù)來源。干細胞向腸腔方向遷移，并被擠壓進入腸腔。在遷移時，細胞失去其分裂的能力，并分化為執(zhí)行胃腸粘膜特異功能的細胞(9)。胃腸粘膜的更新非常迅速，其在24到48小時以內(nèi)完全更新一次(9)。在這一過程中，突變的和不需要的細胞被新的細胞補充。因此，胃腸粘膜的穩(wěn)態(tài)由增殖速率和細胞凋亡速率之間的平衡的連`續(xù)維來調(diào)控(8)。
[0007]消化道上皮細胞的細胞增殖速率和凋亡速率可以由于多種不同的情況被增加或降低，例如對于生理刺激如衰老、炎癥信號、激素、肽、生長因子、化學物質(zhì)和飲食習慣的反應。除此以外，提高的增殖速率常常與全更新時間的減少和增殖區(qū)帶的擴張有關(guān)(10)。據(jù)觀察，增殖指數(shù)在潰瘍性結(jié)腸炎和其他胃腸疾病的病理情況下要高很多(11)。因此，腸增生是胃腸炎癥和癌癥發(fā)生的主要促進原因。
[0008]尿鳥苷蛋白和鳥苷蛋白除了具有對腸內(nèi)液體和離子分泌的調(diào)節(jié)作用以外，這些肽還可能參與胃腸道粘膜的持續(xù)更新。以前在WOOl/25266中公開的數(shù)據(jù)提示，具有尿鳥苷蛋白活性結(jié)構(gòu)域的肽可能具有結(jié)腸息肉生長抑制劑的功能，并可能成為結(jié)腸癌的一種治療方法。但是，該功能出現(xiàn)所依據(jù)的機制還不能確定，因為WOOl/25266中教導尿鳥苷蛋白拮抗肽與稱為GC-C的鳥苷酸環(huán)化酶受體特異結(jié)合，該鳥苷酸環(huán)化酶受體最早被描述為大腸桿菌(E.coli)中熱穩(wěn)定的腸毒素(ST)受體(4)。缺失這個鳥苷酸環(huán)化酶受體的基因敲除小鼠在腸內(nèi)對ST表現(xiàn)出抗性，但在腎臟體內(nèi)實驗中，尿鳥苷蛋白和ST的作用沒有受到影響
(3)。這些結(jié)果受到下面事實的進一步支持:鳥苷蛋白引起的膜的去極化被酪氨酸激酶抑制劑——染料木黃酮(5，7，4'-三羥基異黃酮)阻斷，而尿鳥苷蛋白引起的膜的超極化不受影響(12，13)。這些數(shù)據(jù)一起，提示尿鳥苷蛋白也與一個目前還不清楚的、與GC-C不同的受體結(jié)合。
[0009]另外一些文章也報道了在癌變早期的結(jié)腸息肉和腫瘤組織中，尿鳥苷蛋白和鳥苷蛋白的產(chǎn)量顯著降低(14-17)。除此以外，還發(fā)現(xiàn)編碼尿鳥苷蛋白和鳥苷蛋白的基因定位在常常與人結(jié)腸腫瘤中雜合性的喪失有關(guān)的基因組區(qū)域內(nèi)(18-20)。這些發(fā)現(xiàn)一起表明尿鳥苷蛋白、鳥苷蛋白以及其他有相似活性的肽可以用于結(jié)腸異常性生長的預防和治療。這個提議得到了最近一項研究的支持，該研究證明了鳥苷蛋白的口服給藥抑制了小鼠中息肉的形成(15，16)。
[0010]尿鳥苷蛋白和鳥苷蛋白肽看起來也通過控制細胞的離子流而促進細胞凋亡。細胞凋亡的改變與腫瘤發(fā)展為轉(zhuǎn)移性表型有關(guān)。原發(fā)性的胃腸癌只限于小腸、結(jié)腸和直腸，但癌變可以轉(zhuǎn)移并擴張至骨、淋巴結(jié)、肝臟、肺、腹膜、卵巢、大腦等部位。通過提高鉀離子的外流和鈣離子的內(nèi)流，尿鳥苷蛋白和相關(guān)肽可以促進轉(zhuǎn)化細胞的死亡，從而抑制癌變轉(zhuǎn)移。
[0011]降低的CFTR活性的一項臨床表現(xiàn)是呼吸道的炎癥(21)。這一結(jié)果可能歸因于CTFR調(diào)控NF-kB、趨化因子和細胞因子的表達(22-25)。最近的報道也提示CFTR通道與還原型谷胱甘肽的運輸和維持有關(guān)。還原型谷胱甘肽是抗氧化劑，在防止因氧化脅迫而產(chǎn)生的炎癥方面起著重要作用(39)。通過激活鳥苷酸環(huán)化酶或抑制cGMP特異的磷酸二酯酶這兩條途徑而產(chǎn)生的細胞 內(nèi)cGMP水平的提高，可預計對這些炎癥刺激有減量調(diào)節(jié)的作用。因此，尿鳥苷蛋白型的激動劑應該在肺(如哮喘)、腸[如潰瘍性結(jié)腸炎和節(jié)段性回腸炎(克羅恩氏病)]、胰腺和其他器官炎癥的預防和治療中有用。
[0012]總之可以得出結(jié)論，鳥苷酸環(huán)化酶受體的激動劑如尿鳥苷蛋白，在多種炎癥、癌癥(特別是結(jié)腸癌)的治療中以及作為抗轉(zhuǎn)移藥物，都具有潛在的治療價值。因此，新型激動劑的開發(fā)在臨床上具有實質(zhì)的重要性。
[0013]發(fā)明概述
[0014]本發(fā)明基于新型鳥苷酸環(huán)化酶受體激動劑的開發(fā)和天然存在的激動劑的新用途。這些激動劑是尿鳥苷蛋白的類似物，其中許多具有很優(yōu)良的性質(zhì)，在低pH下具有提高的受體激活能力、穩(wěn)定性、活性或者降低的副作用。這些肽可以用于治療任何對細胞內(nèi)提高的cGMP水平反應的情況。提高細胞內(nèi)cGMP的產(chǎn)量和/或通過cGMP特異的磷酸二酯酶抑制cGMP的降解都可以提高細胞內(nèi)的cGMP水平。在能夠被預防或治療的具體情況中有炎癥、癌癥、息肉和癌轉(zhuǎn)移。
[0015]首先，本發(fā)明針對基本由SEQ ID NO:2-21中任意一個氨基酸序列組成的肽以及含有這些肽的治療用組合物。術(shù)語“基本由…組成”包括肽，其序列與上面列舉的帶有標識序號的序列相同以及在結(jié)構(gòu)或功能上與這些序列沒有根本區(qū)別的其他序列。對于本申請的目的，如果一個肽在結(jié)構(gòu)上相對于SEQ ID NO:2-21中的肽有三個以上氨基酸的變化，或者其激活細胞內(nèi)cGMP產(chǎn)生的能力有50%的增加或減少，則該肽有根本的區(qū)別。優(yōu)選，基本相似的肽不應該有兩個以上氨基酸的差異，并且在激活cGMP產(chǎn)生方面的差異不應該大于25%。最優(yōu)選的肽是具有SEQ ID NO:20序列的雙環(huán)肽。[0016]這些肽可以與一或多種賦形劑一起，以單位劑量形式出現(xiàn)在藥物組合物中。術(shù)語“單位劑量形式”指一個單一給藥實體，如片劑、膠囊、溶液或吸入制劑。加入的肽量應該為在給患者用藥時，足以產(chǎn)生有效的治療作用(一般在100微克與3克之間)。“有效的治療作用”的建立取決于被治療的特定情況，而且包括本領(lǐng)域技術(shù)人員容易識別的狀況的任何顯著改善。例如，有效的治療作用可以包括炎癥的減少、息肉或腫瘤的縮小、轉(zhuǎn)移性損害的減少等等。
[0017]本發(fā)明還包含了聯(lián)合療法，使用鳥苷酸環(huán)化酶受體激動劑單獨給藥或與cGMP依賴的磷酸二酯酶的抑制劑、抗炎癥藥劑或抗癌藥劑一起給藥。這些藥劑的量應當是本領(lǐng)域內(nèi)已知的給患者服用后有治療效果的量。抗腫瘤藥劑可以包括烷基化試劑、表鬼白毒素、亞硝基脲、抗代謝物、長春花生物堿、蒽環(huán)類抗生素、氮芥試劑以及類似的物質(zhì)。具體的抗腫瘤藥劑可以包括三苯氧胺(它莫西芬)、紫杉醇、表鬼白毒素吡喃葡糖苷和5-氟尿嘧啶。在設計適合于患者具體需要的治療方案時，抗病毒和單克隆抗體療法可以與包括至少一種鳥苷酸環(huán)化酶受體激動劑的化療組合物聯(lián)合使用。
[0018]另一方面，本發(fā)明針對通過給患者服用含有效量鳥苷酸環(huán)化酶受體激動劑——優(yōu)選合成的鳥苷酸環(huán)化酶受體激動劑的組合物來預防、治療或減緩受治療者的癌癥，特別是上皮細胞癌癥或息肉發(fā)作的方法。術(shù)語“有效量”是指能夠可測量地提高細胞內(nèi)cGMP水平的足量的激動劑。術(shù)語“合成的”是指制造的與鳥苷酸環(huán)化酶受體結(jié)合的肽，但該肽含有某些在已知的內(nèi)源鳥苷酸環(huán)化酶激動劑——如尿鳥苷蛋白中不存在的氨基酸序列替換。該激動劑應當選自由SEQ ID NO:2-21限定的，并且列在表2和表3中的肽。本發(fā)明還包括了通過給患者服用有效劑量的選自尿鳥苷蛋白、鳥苷蛋白和大腸桿菌ST肽的肽來治療原發(fā)性癌癥而非原發(fā)性結(jié)腸癌的方法。盡管優(yōu)選使用人類的肽，但是任何已知形式的尿鳥苷蛋白或鳥苷蛋白都可以用于此目的。
[0019]本發(fā)明還包括預防或治療來源于原發(fā)性腫瘤塊的腫瘤轉(zhuǎn)移。依據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的肽可以靶向具有鳥苷酸環(huán)化酶受體的轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞。在優(yōu)選的實施方案中，在胃腸癌細胞上和源自這些癌的轉(zhuǎn)移細胞上，會發(fā)現(xiàn)被靶向的受體。這種受體一般是跨膜蛋白，具有細胞外配基結(jié)合結(jié)構(gòu)域，跨膜結(jié)構(gòu)域和具有鳥苷酸環(huán)化酶活性的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。盡管本發(fā)明沒有任何特殊作用機制的限制，但是一般認為這些肽通過與這些細胞受體相結(jié)合并引發(fā)細胞凋亡而發(fā)生作用。轉(zhuǎn)移性的腫瘤也可以通過給藥任意已知形式的尿鳥苷蛋白或鳥苷蛋白(優(yōu)選人源的)或給藥大腸桿菌ST肽進行治療。
[0020]肽可以單獨給藥或者與一或多種cGMP依賴的磷酸二酯酶的抑制劑一起給藥。cGMP依賴的磷酸二酯酶的抑制劑的例子有suldinac砜,苯氮嘌呤酮和motapizone?？梢灾委煹陌┌Y形式包括乳腺癌、直腸癌，肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、腎癌和睪丸癌?？梢允┯酶鶕?jù)本發(fā)明的組合物通過抑制癌變早期直腸息肉的發(fā)育而預防結(jié)腸癌的發(fā)生。可以認為這些肽對治療結(jié)腸癌和預防結(jié)腸腫瘤轉(zhuǎn)移應該非常有效。
[0021]第三 方面，本發(fā)明針對通過施用含有可以提高細胞內(nèi)cGMP產(chǎn)量的鳥苷酸環(huán)化酶受體激動劑的組合物來治療、防治或延緩受治療者器官炎癥(如與胃腸道、哮喘、腎炎、肝炎、胰腺炎、支氣管炎或囊腫性纖維化有關(guān)的炎癥)發(fā)作的方法。優(yōu)選的肽激動劑選自表2和表3所示的SEQ ID NO:2-21定義的肽，或者是尿鳥苷蛋白、鳥苷蛋白或大腸桿菌ST肽。這些肽可選與一或多種cGMP依賴的磷酸二酯酶的抑制劑，如suldinac砜,苯氮嘌呤酮或motapizone 一起給患者服用。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明針對治療哺乳動物的胃腸道炎癥的方法。炎癥可以歸為發(fā)炎性腸部疾病，更為具體地可以是節(jié)段性回腸炎(克羅恩氏病)或潰瘍性結(jié)腸炎。給藥方式可以是腸溶性的，并使用適于靶向腸細胞的制劑。
[0022]從更廣義的意義上講，本發(fā)明包括通過給患者施用有效量的具有SEQ ID NO:2-21中任一序列的肽，或者尿鳥苷蛋白、鳥苷蛋白或大腸桿菌ST肽來誘導細胞凋亡的方法。在這一意義上，“有效量”的肽所指足以在目標組織中提高細胞凋亡的量。例如，在腫瘤生長中可以給予足量的肽以誘導提高速率的細胞死亡。
[0023]最優(yōu)選用于上述方法的肽是SEQ ID NO:20所限定的肽。其序列如下(也請參見表3):
[0024]Asn1 Asp2 Glu3 Cys4 Glu5 Leu6 Cys7 Val8 Asn9 Val10 Ala11 Cys12 Thr13 Gly14 Cys15 Leu16
[0025]******
[0026]且其中在第4位的半胱氨酸和第12位的半胱氨酸之間有一個二硫鍵；第二個二硫鍵位于第7位的半胱氨酸和第15位的半胱氨酸之間(SEQ ID NO:20)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)由于該肽對于鳥苷酸環(huán)化酶受體提高的結(jié)合常數(shù)，作為cGMP產(chǎn)生的激動劑，它具有增強的生物活性。在溫度和蛋白酶穩(wěn)定性方面以及在大腸中生理適宜pH值(pH6-7)時的生物活性方面，該肽優(yōu)于尿鳥苷蛋白。
[0027]上述方法中使用的鳥苷酸環(huán)化酶受體激動劑可以口服、全身或局部方式給藥。劑量形式包括吸入或注射的制劑、溶液、懸浮液、乳劑、片劑、膠囊、局部軟膏和洗劑、透皮組合物，其他已知的肽劑型和pegylated肽類似物。組合物的有效劑量一般在約1微克到約10毫克每千克體重之間，優(yōu)選在約10微克到5毫克每千克體重之間。使用本領(lǐng)域的常規(guī)方法并依據(jù)具體的組合物和臨床的考慮調(diào)整劑量。激動劑可以以單一活性藥劑的形式給藥，或者與其他藥物如cGMP依賴的磷酸二酯酶的抑制劑一起給藥。在所有情況下，其他藥物的給藥劑量應當以本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)為指導的治療有效劑量?？梢砸詥我唤M合物或逐一給藥的方式給藥。
[0028]發(fā)明詳述
[0029]本發(fā)明建立在多種原理上。首先是依賴cGMP的機制，其調(diào)控細胞增殖和細胞凋亡之間的平衡，并且由于尿鳥苷蛋白/鳥苷蛋白的缺乏和/或cGMP特異的磷酸二酯酶的激活而導致的cGMP水平的降低，這是腫瘤轉(zhuǎn)化中早期且至關(guān)重要的一步。第二個原理是花生四烯酸從膜磷脂上的釋放將導致在發(fā)炎過程中cPLA2、C0X-2及可能還有5-脂氧合酶的激活，該釋放受到依賴cGMP機制的負調(diào)控，這會導致前列腺素和白三烯水平的降低，并且提高胞內(nèi)的cGMP水平因此可以產(chǎn)生抗炎癥反應。除此以外，依賴cGMP的機制被認為參與促炎過程的調(diào)控。因此，升高胞內(nèi)cGMP水平可以用作治療和控制腸部發(fā)炎性疾病如潰瘍性結(jié)腸炎和節(jié)段性回腸炎(克羅恩氏病)及其他器官炎癥(例如與哮喘、腎炎、肝炎、胰腺炎、支氣管炎、囊腫性纖維化有關(guān)的炎癥)的一種方法。
[0030]并非局限于任何理論，預想離子跨細胞膜的運輸可以被證明是細胞增殖和凋亡之間平衡的重要調(diào)控因子，這個平衡會受到能夠改變cGMP濃度的組合物的影響。已有證據(jù)顯示尿苷蛋白刺激胃腸道中鉀離子外流，鈣離子內(nèi)流以及水的運輸(3)。此外，已發(fā)現(xiàn)心房肽(ANP)，一個也可以與特異的鳥苷酸環(huán)化酶受體結(jié)合的肽，誘導大鼠血管系膜細胞的凋亡，并通過依賴cGMP的機制誘導心肌細胞的凋亡(26-29)。可以認為本發(fā)明的激動劑與鳥苷酸環(huán)化酶受體的結(jié)合刺激cGMP的產(chǎn)生。這種配基-受體相互作用，通過激活依賴cGMP的蛋白激酶和CFTR的級聯(lián)作用，預期會誘導目標細胞的凋亡。因此，施用如表2和表3中所示的SEQ ID NO:2-21所限定的新型肽，或者尿鳥苷蛋白、或鳥苷蛋白或大腸桿菌ST肽，預期會消除，或至少延緩，胃腸道炎癥的發(fā)作和普通器官發(fā)炎(如哮喘、腎炎、肝炎、胰腺炎、支氣管炎和囊腫性纖維化)。
[0031]在第二方面，本發(fā)明針對通過施用含有有效量的鳥苷酸環(huán)化酶受體激動劑的組合物，優(yōu)選合成的鳥苷酸環(huán)化酶受體激動劑，來治療、防治或延緩受治療者的癌癥，特別是上皮細胞癌癥發(fā)作的方法。術(shù)語“有效量”指可以使胞內(nèi)cGMP水平產(chǎn)生可測量增加的足量的激動劑。術(shù)語“合成的”指制造出來與鳥苷酸環(huán)化酶受體結(jié)合的肽，卻含有某些已知的內(nèi)源鳥苷酸環(huán)化酶激動劑——如尿鳥苷蛋白中不存在的氨基酸序列替換。該激動劑應當是選自SEQ ID NO:2-21所限定的，及在表2和表3中列出的肽。本發(fā)明還包括了通過施用有效劑量的選自尿鳥苷蛋白、鳥苷蛋白和大腸桿菌ST肽的肽，來治療除原發(fā)性結(jié)腸癌以外的原發(fā)癌癥的方法。盡管優(yōu)選使用人源的肽，但是任何已知形式的尿鳥苷蛋白或鳥苷蛋白都可以用于此目的。
[0032]調(diào)控轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞中細胞增殖和凋亡之間平衡的依賴cGMP的機制可以作為靶向和治療轉(zhuǎn)移性腫瘤的機制。肝臟是最常見的從原發(fā)性結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的位置。在癌癥的后期，結(jié)直腸的轉(zhuǎn)移性細胞也可以侵襲身體的其他部位。應重點注意的是來源于胃腸道中原發(fā)位點的轉(zhuǎn)移性細胞一般會繼續(xù)表達鳥苷酸環(huán)化酶受體，因此，這些細胞應當對由腸部鳥苷酸環(huán)化酶受體介導的凋亡療法敏感。具有尿鳥苷蛋白活性的肽，在單獨使用或與cGMP-磷酸二酯酶的特異抑制劑一起使用時，也會通過cGMP介導的機制，恢復細胞增殖和凋亡間的健康平衡，而延緩消化道上皮的癌癥發(fā)生。
[0033]這里使用的術(shù)語“鳥苷酸環(huán)化酶受體”指位于任何細胞類型上的鳥苷酸環(huán)化酶受體，在此所述的發(fā)明的激動劑肽或天然激動劑與這些受體結(jié)合。
[0034]這里使用的術(shù)語“鳥苷酸環(huán)化酶受體-激動劑”指與鳥苷酸環(huán)化酶受體結(jié)合并刺激cGMP產(chǎn)生的肽和/或其他化合物。該術(shù)語還包括所有這樣的肽，它們具有與包含SEQ IDNO:1的3-15號氨基酸殘基結(jié)合結(jié)構(gòu)域的至少一部分基本上相同的序列。該術(shù)語還涵蓋了與鳥苷酸環(huán)化酶受體結(jié)合并刺激c`GMP產(chǎn)生的片段和前肽。術(shù)語“基本上相同”指具有與結(jié)合結(jié)構(gòu)域相同氨基酸序列的肽，序列中某些殘基可以被刪除，或被其他氨基酸替代而不影響該肽結(jié)合鳥苷酸環(huán)化酶受體并刺激cGMP產(chǎn)生的能力。
[0035]新型鳥苷酸環(huán)化酶受體激動劑的策略和設計
[0036]尿鳥苷蛋白由杯狀突和其他排列為胃腸粘膜的上皮細胞以功能上無活性的尿鳥苷蛋白原的形式分泌。人類的肽原隨后在腸腔內(nèi)通過內(nèi)源蛋白酶的作用被轉(zhuǎn)變?yōu)楣δ苌嫌谢钚缘?，由SEQ ID N0:1所表示的16氨基酸肽(人尿鳥苷蛋白序列，參見表2)。因為尿鳥苷蛋白是一種耐熱、耐酸和耐蛋白酶水解的肽，在治療方法中可以有效地采用這種肽和/或其他與SEQ ID NO:1的序列相似的功能上有活性的16氨基酸肽的口服或全身性給藥。
[0037]下面討論與尿鳥苷蛋白相似但不同的肽，包括一些具有優(yōu)異的cGMP增強性質(zhì)，和/或其他與以前知道的尿鳥苷蛋白肽相比有利的性質(zhì)。這些肽可以用于抑制胃腸炎癥，以及治療或預防與消化道炎癥有關(guān)的息肉形成。也可以治療易于形成癌細胞的上皮組織。這里描述的鳥苷酸環(huán)化酶受體激動劑具有表2和3中所示的氨基酸序列。激動劑-受體相互作用的“結(jié)合結(jié)構(gòu)域”包含SEQ ID NO:1的3-15號氨基酸殘基。
[0038]應用分子模擬設計新型的鳥苷酸環(huán)化酶受體激動劑，具體方法見(30)。分子模擬設計包括對三個已知與鳥苷酸環(huán)化酶受體相互作用的化合物的能量計算，這三個化合物為人尿鳥苷蛋白，雙環(huán)[4，12 ;7，15]
[0039]Asn1-Asp2-Asp3-Cys4-Glu5-Leu6-Cys7-Val8-Asn9-Val10-Ala11-Cys12-Thr13-Gly14-Cys15-Leu16(UG, SEQ ID NO:1)、人鳥苷蛋白，雙環(huán)[4，12 ;7，15]
[0040]Pro1-Gly2-Thr3-Cys4-Glu5-1le6-Cys7-Ala8-Tyr9-Ala10-Ala11-Cys12-Thr13-Gly14-Cys15(⑶,SEQ ID NO:22)、和大腸桿菌小的熱穩(wěn)定腸毒素，三環(huán)[6,10 ;7，15 ill-lSjAsn'-Ser2-Ser3-Asn4-Tyr5-Cys6-Cys7-Glu8-Leu9-Cys10-Cysn-Asn12-Pro13-Ala14-Cys15-Thr16-Gly17-Cys18—Thr19-(ST, SEQ ID NO:23)。對這三個化合物所有可能的低能量構(gòu)象進行幾何比較，以揭示出作為生物活性構(gòu)象(即在與受體相互作用的過程中GU，UG和ST所采用的構(gòu)象)“模板”的共有的3-D結(jié)構(gòu)。分子模型設計允許在以其他低能量構(gòu)象為代價的情況下，通過選擇對于多種氨基酸殘基的單獨替代，設計具有生物活性構(gòu)象顯著增加的構(gòu)象群體的新型類似物。
[0041]利用堆積(build-up)步驟進行能量計算(30)。用平面順式肽鍵(包括ST中的Pro 13的平面順式肽鍵)用剛性化合價幾何結(jié)構(gòu)，使用ECEPP/2勢場(31，32)。Pro13的ω角允許變動。脂肪族和芳香族的氫一般被包括在01?類型的聯(lián)合原子中心中；對α氫原子和酰胺的氫進行明確的描述。
[0042]主要的計算方案涉及許多相連續(xù)的步驟。首先要考慮兩個單環(huán)的模型片段(對于ST是三個片段)，Ac-環(huán)(Cys1-...-CysO-NMe的序列，其中除了 Cys、Gly和Pro以外的所有殘基都由丙氨酸替代；i和j的值與GU、UG和ST的序列對應。在這一步，要考慮每一個氨基酸殘基對肽骨架的局部最小量的所有可能組合，即對Ala殘基，E，F(xiàn)，C，D，A和A*類型[按照(33)中的符號系統(tǒng)]的Ramachandran圖中的最小量；對Gly殘基，E*, F*, C*,D*，A，E，F(xiàn)，C，D，和A*類型的Ramachandran圖中的最小量；對Pro殘基，F(xiàn)，C和A類型的Ramachandran圖中的最小量。對于每一個骨架構(gòu)象，通過檢查D_Cys殘基沿二面角x 1旋轉(zhuǎn)的能量性質(zhì)，找到使用ECEPP/2力場內(nèi)在的拋物線勢能函數(shù)關(guān)閉環(huán)的最適可能性。
[0043]總計，對每一個環(huán)部分，至少考慮大約180，000個構(gòu)象。然后，滿足E_Emin< ΔΕ=15kcal/mol標準，且在任意骨架二面角的至少一個值上有40°以上差異的構(gòu)象(對不同的模型片段，從約3000到8000個構(gòu)象中)被挑選出來。在下一步，將相配的單環(huán)片段中所選出來的構(gòu)象進行疊加，以產(chǎn)生雙環(huán)模型片段的可能構(gòu)象(對于ST是三環(huán)片段)。這一步一般得到20，000到30，000個構(gòu)象。所有這些構(gòu)象進入新一輪能量計算的循環(huán)，產(chǎn)生出對于ST模型片段滿足E-Emin < ΔΕ = 20kcal/mol標準的191個構(gòu)象和對于⑶/UG模型片段滿足同樣條件的6，965個構(gòu)象。此后，恢復在模型片段中漏掉的側(cè)鏈，再次進行能量計算，在能量最小化之前，利用前述算法(34)，對側(cè)鏈基團的二面角值(除了 Cys殘基的xl角以外)和骨架末端基團的二面角值進行優(yōu)化，以達到這些基團最適宜的空間排列。對于UG4-15片段，632個構(gòu)象滿足Λ E = 20kcal/mol的標準；其中162個滿足更為嚴格的Λ E =12kcal/mol的標準，這符合已接受的lkcal/mol/殘基的標準(30)。接下來由UG4-15片段向3-16片段的延長，以及延長為整個UG分子，以同樣的堆積步驟進行。最終找到滿足ΛΕ=16kcal/mol標準的31個UG的骨架構(gòu)象。[0044]用以下方法對每一個構(gòu)象進行幾何比較。根據(jù)(35)，確定一個構(gòu)象對中原子中心重疊的最適度，以檢查兩個構(gòu)象之間幾何相似性的水平。幾何相似性的標準是rms值，對于一對構(gòu)象A和B, rsm值計算如下:
[0045]rms = (1/Ν) Σ ' = 1 [ (χ'-Α) 2+2+ (ζ'-Α)2]1/2,
[0046]其中Ν是選擇用于重疊的α碳原子對的數(shù)目，x、y和ζ是笛卡爾坐標。根據(jù)rms<2.0羞的幾何相似性標準，剛性構(gòu)象片段UG4-15的低能量構(gòu)象歸入七個構(gòu)象家族。其中的一個家族由與1UYA和1ETN都相似的相同的六個構(gòu)象組成；該家族還包含UG的最低能量構(gòu)象。(1UYA和1ETN由實驗限定為UG和ST分別的3D結(jié)構(gòu)，已知它們具有高生物活性(36，37);從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中可以獲得3D結(jié)構(gòu)。)
[0047]表1在UG的“模板”構(gòu)象中，肽骨架的二面角(用度表示)值
【權(quán)利要求】
1.治療患者中發(fā)炎性腸病的方法，該方法包括向所述的患者施用有效劑量的由SEQIDNO:8組成的肽，其中所述肽是(4，12 ;7，15)雙環(huán)肽，且其中所述肽結(jié)合鳥苷酸環(huán)化酶受體并誘導cGMP產(chǎn)生。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述肽由SEQID NO:20的序列組成。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述的發(fā)炎性腸病選自由潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩氏病組成的組。
4.權(quán)利要求1的方法，其進一步包括與所述的鳥苷酸環(huán)化酶受體激動劑同時或順序地向所述的患者施用有效劑量的依賴cGMP的磷酸二酯酶的抑制劑，其中所述依賴cGMP的磷酸二酯酶的抑 制劑選自由sulindac sulfone、扎普司特和莫他匹酮組成的組。
【文檔編號】A61K9/48GK103638514SQ201310447363
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2002年3月28日 優(yōu)先權(quán)日:2001年3月29日
【發(fā)明者】K·沙魯布海, G·尼克夫維茨, G·S·雅克布 申請人:藥物協(xié)和公司