Vii型新城疫病毒l基因突變的減毒疫苗株及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種應用反向遺傳操作技術生產(chǎn)的Ⅶ型新城疫病毒L基因突變的減毒疫苗株及其制備方法，屬于生物制品和生物【技術領域】，VII型新城疫病毒L基因突變的減毒疫苗株毒力均明顯減弱，同時在雞胚上具有高滴度、遺傳性能穩(wěn)定、與流行病毒的抗原匹配性高，適合于疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)，可用于制造疫苗，與常規(guī)疫苗（基因Ⅰ和基因Ⅱ型）相比，Ⅶ型新城疫病毒L基因突變的減毒疫苗株將在控制新城疫的發(fā)病和流行方面顯示出廣闊的應用前景。
【專利說明】Vl I型新城疫病毒L基因突變的減毒疫苗株及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種應用反向遺傳操作技術生產(chǎn)的VII型新城疫病毒L基因突變的減毒疫苗株及其制備方法，屬于生物制品和生物【技術領域】。
【背景技術】
[0002]新城疫是由新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)引起,侵害雞和火雞,亦可感染其他禽類、鳥類的一種急性、高度傳染性疾病，是世界公認的最重要的兩大禽類傳染病之一(另一個是高致病性禽流感)。NDV屬于副粘病毒科腮腺炎病毒屬，具有囊膜結構，基因組為單股負鏈不分節(jié)段的RNA病毒，由6種結構蛋白組成，分別為NP、P、M、F、HN和L蛋白:M、F和HN蛋白與病毒囊膜的形成相關；NP蛋白為核衣殼蛋白，P蛋白是病毒RNA合成的必需因子山蛋白為病毒最大的蛋白，它在NDV 6種結構蛋白中最為保守，具有RNA聚合酶、轉(zhuǎn)錄后修飾等生物學活性，可與NP和P蛋白共同構成病毒復制復合體，該復合體參與病毒基因組的轉(zhuǎn)錄和復制，L蛋白除了參與病毒基因組的復制外，還具有5’端加帽、帽依賴的甲基化轉(zhuǎn)移酶活性及3’端添加多聚腺苷酸尾巴等功能。
[0003]不同NDV分離株之間的毒力差異很大，根據(jù)對雞和雞胚的致病性及毒力不同，可將NDV分成三類:即強毒型(速發(fā)型)、中等毒力型(中發(fā)型)和弱毒型(緩發(fā)型)。
[0004]以往研究認為NDV的感染性和毒力是由F基因決定，強毒株F蛋白裂解位點為RRQKRF,而弱毒株LaSota的F蛋白裂解位點為GRQGRL。但隨著反向遺傳學技術的不斷發(fā)展及在NDV研究中的深入應用，NDV的致病機制又有了新的研究進展。PeeteriDe Leeuw和Panda等將弱毒株的F基因裂解位點突變?yōu)榕c強毒株一致的裂解位點后拯救出了新的重組病毒，實驗表明雖然其毒力明顯提高，但卻并沒有達到與強毒株毒力一致的水平，這就表明在NDV基因組中除了 F基因的裂解位點外，還可能存在其它能影響病毒毒力的基因。最近有研究指出，L、HN和V蛋白也與病毒的毒力和致病性有關，L蛋白可通過提高病毒的復制水平而增強NDV毒力。Rout等將NDV BC株的L基因替換為LaSota的L基因，病毒獲救后毒力反而增強。另外，我們成功救獲3株基因VI1-97 NDV L突變株(K1756A、K1917A和E1954Q位氨基酸突變)和I株基因VI1-97 NDV F與L共突變株(E1954Q+F)，通過病毒毒力指標測定發(fā)現(xiàn)，這4株VII型新城疫病毒L基因突變的減毒疫苗株能夠使病毒毒力減弱，我們有理由推斷NDV L蛋白對病毒的毒力起著至關重要的作用。這些實驗充分說明L蛋白與病毒的毒力存在聯(lián)系。
[0005]當前世界上防控NDV主要疫苗株是LaSota和BI兩種毒株，LaSota和BI兩弱毒株都屬于基因II型。但是國內(nèi)的學者嚴維巍等在2000年首次報道了基因VII型NDV在中國大陸的存在；2001年，劉華雷等對1994年以來選取的國內(nèi)不同地區(qū)的代表株進行遺傳分析證實，所分離的8株毒株在裂解位點的氨基酸序列均與NDV的強毒株相似。通過遺傳進化樹分析表明，8株分離株中有7株為基因VII型NDV，這些數(shù)據(jù)充分表明我國當前主要流行基因VII型新城疫病毒。LaSota和BI兩種弱毒疫苗作為疫苗毒株已經(jīng)應用了幾十年，疫苗盡管能提供一定的免疫保護，但不能阻止家禽的排毒和抑制病毒的傳播能力，因此，新城疫依然是威脅養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的最主要的疫病之一，中國每年由此造成巨大的經(jīng)濟損失。而且當前中國流行的毒株主要是基因vn型，隨著病毒的不斷變異，針對基因vn型的同基因型疫苗的研發(fā)成為當前的主要任務，我國VD型的新城疫疫苗研制已經(jīng)取得良好進展，一旦產(chǎn)業(yè)化后，必將成為規(guī)模化養(yǎng)殖場免疫程序中必要的一環(huán)。本發(fā)明為開展NDV減毒疫苗的研制和NDV相關基礎研究奠定了堅實的基礎。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的不足而發(fā)明的VII型新城疫病毒L基因突變的減毒疫苗株及其制備方法，從而解決當前我國市場上所用的NDV疫苗株(基因I和基因II型)與目前NDV流行株(基因VII型)的基因型不一致而導致的保護效率不完全，不能有效阻止病毒傳播的實際問題。
[0007]本發(fā)明是通過如下技術方案予以實現(xiàn)的:
一種VII型新城疫病毒L基因突變的減毒疫苗株，其特征在于:VII型新城疫病毒L基因突變的減毒疫苗株毒力均明顯減弱，同時在雞胚上具有高滴度、遺傳性能穩(wěn)定、與流行病毒的抗原匹配性高，適合于疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)，可用于制造疫苗，該VII型新城疫病毒L基因突變的減毒疫苗株的抗原核苷酸序列為SEQ ID NO:1至SEQ ID N0:4所示。
[0008]一種所述的VII型新城疫病毒L基因突變的減毒疫苗株的制備方法，其特征在于:
構建覆蓋整個基因組的五個cDNA克隆片段，利用各片段間重疊部分的酶切位點，在轉(zhuǎn)錄載體質(zhì)粒PBR322連接組裝獲得了 15192nt的完整cDNA克隆。在全長cDNA片段的5’末端前綴I7RNA聚合酶啟動子，在cDNA片段后加入具有自我催化功能的丁肝病毒核酶(RiB)和17轉(zhuǎn)錄終止信號，構建好的質(zhì)粒命名為prNDV-97 ;通過PCR基因組將基因組cDNA中的L蛋白編碼區(qū)第14056位堿基由A同義突變?yōu)镚，消除14056bp處的Hind III酶切位點，并作為拯救病毒的分子標記，構建完成的質(zhì)粒命名為pmNDV-97 ;在!7聚合酶啟動子于基因組cDNA的5’末端引入兩個多余的G，有助于副粘病毒反向遺傳操作的病毒拯救。
[0009]設計5對引物用于擴增NDV W -97株基因組SEQ ID NO: 5，引物序列如下:
Fl:5’ ATGCGGCCGCTAATACGACTCACTATAGGGACCAAACAGAGAATCTG
TGAGGTACGATAA3，
Rl:5’ TAGGTACCCTTGCAGTGGCAGACTTAATCAATTCAGAG3’
F2:5’ GGGTGAAATGACGCTCAATAAACTCTCACA3’
R2:5’ ATGGTACCCTCCCTGTTGCAGATGTCCGAAGCACACCA3’
F3:5’ TGCAGAGATCACTCACACTCACATCAATAC3’
R3:5’ ACGGTACCAGGTGACCAGCTTCTGTTTCGGGCATAATC3’
F4:5’ ATTAGTTTCTTCCAATATGTGCTCGCTGAC3’
R4:5’ GTAGTAATGATACAGACCTGTAGGGTACCA3’
F5:5’ GGAGAGAGAATGCAGAAGAAAGTGACCTGACCTCAGATAAAGCAG3’
R5:5’ AGCCGGCGCCAGCGAGGAGGCTGGGACCATGCCGGCCACCAAACAG
AGATTTGGTGAATGACATC3’
設計2對用于突變14056bp也Hind III酶切位點引物，消除此酶切位點，引物序列如下:
【權利要求】
1.一種VII型新城疫病毒L基因突變的減毒疫苗株，其特征在于:該VII型新城疫病毒L基因突變的減毒疫苗株毒力明顯減弱，同時在雞胚上具有高滴度、遺傳性能穩(wěn)定、與流行病毒的抗原匹配性高，適合于疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)，可用于制造疫苗，該VII型新城疫病毒L基因突變的減毒疫苗株的抗原核苷酸序列為SEQ ID NO:1至SEQ ID N0:4所示。
2.—種VII型新城疫病毒L基因突變的減毒疫苗株的制備方法，其特征在于:構建了覆蓋整個基因組的五個cDNA克隆片段，利用各片段間重疊部分的酶切位點，在轉(zhuǎn)錄載體質(zhì)粒pBR322連接組裝獲得了 15192nt的完整cDNA克?。辉谌LcDNA片段的5’末端前綴I7RNA聚合酶啟動子，在cDNA片段后加入具有自我催化功能的丁肝病毒核酶(RiB)和T7轉(zhuǎn)錄終止信號，構建好的質(zhì)粒命名為prNDV-97 ;通過PCR基因組將基因組cDNA中的L蛋白編碼區(qū)第14056位堿基由A同義突變?yōu)镚，消除14056bp處的Hind III酶切位點，并作為拯救病毒的分子標記，構建完成的質(zhì)粒命名為pmNDV-97 ;同時在17聚合酶啟動子于基因組cDNA的5’末端引入兩個多余的G，有助于副粘病毒反向遺傳操作的病毒拯救； 設計5對引物用于擴增NDV VI1-97株基因組SEQ ID NO:5，引物序列如下:
3.如權利要求2所述的VII型新城疫病毒L基因突變的減毒疫苗株的制備方法，其特征在于: 以分離株NDV W-97的基因組L基因進行定點突變，對L蛋白結構域VI內(nèi)進行單點氨基酸突變，得到高度致弱的NDV W-97 L減毒株K1756A、K1917A和E1954Q ;在E1954Q的基礎上，對F蛋白裂解位點進 行突變，將強毒株的F蛋白裂解位點(RRQKRF)突變?yōu)長aSota弱毒株的F蛋白裂解位點(GRQGRL)，所獲得的減毒株為E1954Q+F ； 用于突變F蛋白裂解位點的引物如下:
4.根據(jù)權利要求3所述VII型新城疫病毒L基因突變的減毒疫苗株的制備方法，其特征在于: 1)NDV W -97株基因組全長cDNA的構建； 2)NDV W -97 L蛋白結構域VI內(nèi)氨基酸定點突變和突變體全長cDNA的連接； 3)在E1954Q突變的基礎上，NDVW -97 F蛋白裂解位點的突變和突變體全長cDNA的連接； 4)VII型新城疫病毒L基因突變的減毒疫苗株K1756A、K1917A、E1954Q 和E1954Q +F的拯救； 將質(zhì)粒 PK1756A、pK1917A、pE1954Q 和 pE1954Q+F 分別與 pBSK-NP、pBSK-P 和 pBSK_L三個真核表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BHK-21細胞，轉(zhuǎn)染72h后將細胞上清接種9-11日齡SPF雞胚，每份樣品接種3枚，0.2mL/枚，成功救獲NDV W -97 L基因突變減毒株K1756A、K1917A和E1954Q及F蛋白與L蛋白共突變減毒疫苗株E1954Q +F。
【文檔編號】A61P31/14GK103525777SQ201310456112
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年9月30日 優(yōu)先權日:2013年7月1日
【發(fā)明者】朱啟運, 吉艷紅, 付鈺廣 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所