一種視網(wǎng)膜高趨化性的大鼠視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞系的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬微生物動(dòng)物細(xì)胞系領(lǐng)域,涉及一種視網(wǎng)膜高趨化性的大鼠視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞系及其建立方法。本細(xì)胞系為鼠源性細(xì)胞,與原代培養(yǎng)的視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞有不到1%的基因差異且均不涉及主要功能蛋白;能自我增殖,連續(xù)傳代;能表達(dá)單核-巨噬細(xì)胞表面抗原CD11b(OX42),ED1(OX6)、具有吞噬能力并且在LPS的刺激下能分泌TNF-а、IL-1β與iNOS等致炎因子;經(jīng)體內(nèi)移植后能被高效定向募集到視網(wǎng)膜損傷部位并存活,進(jìn)一步促進(jìn)光感受器存活。本發(fā)明細(xì)胞系可用于視網(wǎng)膜光感受器變性疾病的防治研究,并可作為從外周-中樞(視網(wǎng)膜)的藥物載體。CGMCC No815820130903
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種視網(wǎng)膜高趨化性的大鼠視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞系
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬微生物動(dòng)物細(xì)胞系領(lǐng)域,涉及大鼠視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞系,具體涉及一種視網(wǎng)膜高趨化性的大鼠視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞系,尤其是一種能被高效募集到視網(wǎng)膜的大鼠視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞系及其建立方法。
【背景技術(shù)】
[0002]研究報(bào)道,視網(wǎng)膜退行性疾病是一大類(lèi)嚴(yán)重的致盲性眼病,其中以視網(wǎng)膜色素變性(RP)、年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)最為常見(jiàn)。隨著角膜病、白內(nèi)障等可預(yù)防性和可治療性盲的減少,這一類(lèi)疾病已成為世界范圍內(nèi)致盲的主要眼病。雖然近年來(lái)對(duì)其發(fā)病機(jī)制及病理生理過(guò)程的研究使得人們對(duì)這一類(lèi)疾病形成了更為深刻的認(rèn)知,并視網(wǎng)膜及干細(xì)胞移植等方面都取得了一定的進(jìn)展,然而醫(yī)療實(shí)踐中依然無(wú)法從根本上實(shí)現(xiàn)“對(duì)因治療”。在致傷因素不能去除的情況下,如何延緩光感受器進(jìn)行性變性、衰退的過(guò)程,依然是當(dāng)今視網(wǎng)膜變性疾病防治研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn)。
[0003]近年來(lái),作為CNS病理事件“傳感器”的小膠質(zhì)細(xì)胞(MG)的功能調(diào)控日益成為各國(guó)研究者關(guān)注的焦點(diǎn)。研究顯示,在病理模型如腦缺血模型中,駐留型MG能夠分泌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-beta (TGF-beta)和膠質(zhì)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(⑶NF),從而減輕神經(jīng)元的缺血性損傷,給予外源性MG也能夠增加缺血海馬回部位⑶NF和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)的表達(dá),對(duì)受損神經(jīng)元產(chǎn)生營(yíng)養(yǎng)因子依賴(lài)性的保護(hù)作用;尤其值得一提的是,作為CNS游走巨噬細(xì)胞,MG在病理狀態(tài)下受到損傷信號(hào)的趨化能迅速聚集到受損的神經(jīng)元周?chē)踔量梢詮耐庵芡緩酱┰窖琳线M(jìn)入CNS。在本申請(qǐng)已公開(kāi)的前期工作中,發(fā)現(xiàn)強(qiáng)光照射引起光感受器凋亡,凋亡信號(hào)誘導(dǎo)視網(wǎng)膜MG向光感受器層聚集,那么是否可以利用MG這一天然的行為特征將其作為活的生物學(xué)工具,從而為視網(wǎng)膜光感受器變性疾病創(chuàng)建一個(gè)新穎卻又安全可靠的從外周——中樞的功能細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)體系?
單核吞噬細(xì)胞包括MG的定向遷移能力受歸巢受體的調(diào)控,其中又以CC-趨化因子受體
2(CCR2)的作用最為重要。有研究在小鼠的多發(fā)性硬化的模型中發(fā)現(xiàn),CCR2與單核巨噬細(xì)胞向腦內(nèi)的浸潤(rùn)有關(guān);CCR2對(duì)于巨噬細(xì)胞向海馬回軸突損傷部位的募集是必需的;CCR2基因靜默將阻礙MG的趨化聚集從而加速Alzheimer’ s病的進(jìn)展。在已公開(kāi)的體外研究中,成功構(gòu)建了 Lent1-CCR2載體并將其轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的大鼠視網(wǎng)膜MG,被轉(zhuǎn)染的MG能大量表達(dá)CCR2蛋白并在體外趨化實(shí)驗(yàn)中顯示出對(duì)CCL2的高趨化性。而在視網(wǎng)膜中,光感受器是CCL2的主要來(lái)源,損傷狀態(tài)下其表達(dá)明顯上升,成為吸引外源性MG進(jìn)入損傷部位發(fā)揮生物學(xué)作用的關(guān)鍵因子。盡管有研究表明在從外周途徑進(jìn)入CNS的過(guò)程中,成熟的MG較巨噬細(xì)胞而言對(duì)神經(jīng)組織具有更高的親和力,然而從可行性方面考慮,從患者自身的視網(wǎng)膜分離獲取MG再進(jìn)行外周移植是不現(xiàn)實(shí)的,因此需要尋找其他替代細(xì)胞來(lái)源。由于小膠質(zhì)細(xì)胞在體外培養(yǎng)環(huán)境中無(wú)法自我增殖,建立功能細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)體系的另一個(gè)瓶頸就是缺乏足夠的細(xì)胞數(shù)量,現(xiàn)有技術(shù)已公開(kāi)的小膠質(zhì)細(xì)胞系有BV2、N9等,但其來(lái)源均為大腦組織,因此建立可靠的視網(wǎng)膜來(lái)源的能自我增殖并向視網(wǎng)膜高趨化的小膠質(zhì)細(xì)胞系是當(dāng)務(wù)之急。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]本發(fā)明的目的是提供一種能被高效募集到視網(wǎng)膜的鼠視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞系一T-MG。本發(fā)明的視網(wǎng)膜高趨化性的小膠質(zhì)細(xì)胞系能用于視網(wǎng)膜光感受器變性疾病的防治研究。
[0005]本發(fā)明通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染的方法構(gòu)建能自我增殖并向視網(wǎng)膜高趨化的小膠質(zhì)細(xì)胞系(T-MG)。本發(fā)明基于成功構(gòu)建了 Lent1-SV40-eGFP慢病毒載體的基礎(chǔ)上,將病毒進(jìn)行包裝后轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞(T-MG),成功轉(zhuǎn)染后采用基因芯片的方法比較轉(zhuǎn)染前后的細(xì)胞其基因表達(dá)譜的變化,結(jié)果顯示僅有1%為差異基因,其生長(zhǎng)性、吞噬性、主要生物學(xué)功能(分泌致炎因子、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子等)與親本細(xì)胞保持一致并能自我增殖。進(jìn)一步對(duì)T-MG的趨化能力進(jìn)行測(cè)定,將T-MG細(xì)胞置于趨化小室的上端,下端放置不同濃度的CCL2,結(jié)果顯示T-MG細(xì)胞能被CCL2趨化進(jìn)入下室其趨化效應(yīng)呈一定的時(shí)間依賴(lài)性和濃度依賴(lài)性,并且與原代培養(yǎng)的MG相比其趨化性明顯增強(qiáng)。在以上實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,本發(fā)明將16的T-MG細(xì)胞通過(guò)尾靜脈注射和玻璃體腔注射的方式移植入光損傷大鼠模型,結(jié)果顯示光照后3d,視網(wǎng)膜上可發(fā)現(xiàn)少量GFP (+)細(xì)胞,其數(shù)量逐漸增多于14d時(shí)達(dá)到高峰,28d時(shí)仍可見(jiàn)較多,T-MG移植組視網(wǎng)膜外核層厚度較對(duì)照組增厚,顯示出初步的神經(jīng)保護(hù)作用。
[0006]更具體的,本發(fā)明采用原代培養(yǎng)的SD大鼠視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞,通過(guò)構(gòu)建Lent1-SV40-eGFP慢病毒載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染并用有限稀釋法挑取單克隆、體外擴(kuò)增和傳代等策略,分離得到了具有自我增殖能力并向視網(wǎng)膜高趨化的大鼠視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞系(T-MG),已于2013年9月3日保藏,保藏單位:中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC),北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào),中國(guó)科學(xué)院微生物研究所,100101,保藏編號(hào):CGMCC N0.8158,分類(lèi)命名:大鼠視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞株Retinal microglia cell。
[0007]本細(xì)胞系具有以下生物學(xué)特性:經(jīng)基因芯片檢測(cè)(20,001 probes),僅有不到200個(gè)基因(1%)與原代培養(yǎng)的視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞有差異且均不涉及主要功能蛋白;T-MG能表達(dá)單核-巨噬細(xì)胞表面抗原⑶Ilb (0X42),EDl (0X6)、具有吞噬能力并且在LPS的刺激下能分泌TNF-a、IL-1 β與iNOS等致炎因子,這些小膠質(zhì)細(xì)胞的主要功能并未受慢病毒轉(zhuǎn)染的影響。最為關(guān)鍵的是T-MG能自我增殖,連續(xù)傳代(驗(yàn)證了 10代)并未影響細(xì)胞性狀;體外趨化實(shí)驗(yàn)顯示T-MG能被CCL2趨化,并且其趨化能力較原代小膠質(zhì)細(xì)胞明顯增強(qiáng);體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)(尾靜脈注射途徑和玻璃體腔注射途徑)證實(shí)T-MG能夠進(jìn)入視網(wǎng)膜并存活下來(lái),并且視網(wǎng)膜切片的HE染色顯示,光照后14d,T-MG移植組視網(wǎng)膜外核層厚度較對(duì)照組(Sham移植組)為厚,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,顯示能自我增殖并向視網(wǎng)膜高趨化的小膠質(zhì)細(xì)胞系(T-MG)的體內(nèi)移植能延緩視網(wǎng)膜光感受器的變性過(guò)程。
[0008]本發(fā)明的細(xì)胞系具有以下特點(diǎn):
1)遺傳背景清楚,生物學(xué)特性穩(wěn)定,
該細(xì)胞系來(lái)自于廣泛使用的鼠視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞,其生長(zhǎng)、吞噬能力、分泌致炎因子等基本生物學(xué)特性與原代細(xì)胞一致,經(jīng)多次傳代及修飾后仍保持穩(wěn)定;
2)應(yīng)用面寬,適用于多種視網(wǎng)膜光感受器變性模型,
該細(xì)胞系可用于延緩強(qiáng)光照射引起的光感受器變性實(shí)驗(yàn),也可用于研究視網(wǎng)膜神經(jīng)元損傷后趨化因子及其受體系統(tǒng)在調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞趨化中的作用; 3)該細(xì)胞系培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單,趨化能力強(qiáng),實(shí)驗(yàn)周期短,
該細(xì)胞系移植入光損傷大鼠模型后能夠進(jìn)入損傷部位存活,并表現(xiàn)出一定的神經(jīng)保護(hù)作用。
[0009]本發(fā)明細(xì)胞系為視網(wǎng)膜光感受器變性疾病提供了一個(gè)新穎且安全可靠的從外周-中樞的功能細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)體系,可以方便的用于視網(wǎng)膜光感受器變性疾病的防治研究,并可作為從外周-中樞(視網(wǎng)膜)的藥物載體。
【專(zhuān)利附圖】
【附圖說(shuō)明】
[0010]圖1:顯示了 Lent1-SV40-eGFP轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞后7d,所得的細(xì)胞(T-MG)能自我增殖并傳代,免疫熒光染色結(jié)果顯示T-MG能表達(dá)小膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物CDllb (0X42), EDl (0X6), Ibal。
[0011]圖2:顯示了免疫熒光染色顯示光照后14d,視網(wǎng)膜上存在GFP(+)細(xì)胞(綠色)并表達(dá)了 MG標(biāo)記物EDl (紅色),從垂直分布來(lái)看,GFP(+)細(xì)胞逐漸向光感受器層即損傷部位遷移,To-to-3復(fù)染。
【具體實(shí)施方式】
[0012]實(shí)施例1視網(wǎng)膜高趨化性的小膠質(zhì)細(xì)胞的建系
本發(fā)明所涉及的細(xì)胞均培養(yǎng)于含10%胎牛血清(FCS)的Leibovitz’s L_15細(xì)胞培養(yǎng)基中。培養(yǎng)溫度為37° C,氣體環(huán)境為5% C02/95%空氣,濕度為飽和濕度。傳代時(shí),用0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞,按1:3的比例傳代。
[0013]1.原代視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng):
取出生3d的SD乳鼠,無(wú)菌條件下取出眼球,置于盛有預(yù)冷的D-Hank’ s液體的平皿中,在組織顯微鏡下取出視網(wǎng)膜,小心剝除視網(wǎng)膜血管,加入適量0.25%胰蛋白酶,37°C孵育消化15 mir1加入等體積預(yù)冷的含血清培養(yǎng)液終止消化,I 000 r/min離心10 min,棄去上清液,沉淀物用適量含10% (體積分?jǐn)?shù))胎牛血清的培養(yǎng)液重新混懸,調(diào)整細(xì)胞密度至IXlO6 /mL,將10 mL細(xì)胞懸液接種到多聚賴(lài)氨酸(12.5 mg/L)包被過(guò)的T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,置37°C,5% (體積分?jǐn)?shù))CO2孵箱中培養(yǎng),靜置2d后首次換液,以后每4d換液I次。細(xì)胞培養(yǎng)到14d時(shí),將T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于恒溫?fù)u床上,100 r/min的速度振搖I h,將上清液轉(zhuǎn)移到50 mL離心管中,1500 r/min離心10 min,沉淀用含血清的培養(yǎng)液重新混懸,即可得到純化的原代視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞。
[0014]2.按現(xiàn)有技術(shù)構(gòu)建Lent1-SV40_eGFP慢病毒載體;
3.病毒感染原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞
病毒感染前24小時(shí)將細(xì)胞置于6孔板,每孔細(xì)胞量約為5X 105。加入2 ml適當(dāng)?shù)耐耆囵B(yǎng)基(含有血清和抗生素)孵育過(guò)夜。在轉(zhuǎn)染當(dāng)天細(xì)胞應(yīng)該達(dá)到約50 — 70%平鋪;在室溫下溶化慢病毒顆粒,使用前輕輕混勻,準(zhǔn)備完全培養(yǎng)基和Polybrene混合物,Polybrene終濃度為:8 Pg/ml。胰酶消化每孔細(xì)胞,收集細(xì)胞后用1.5ml培養(yǎng)基混合物溶于每孔中,加入病毒液(梯度為10,20,50ul/孔)感染細(xì)胞,輕輕振動(dòng)培養(yǎng)板使其混勻并孵育過(guò)夜,待細(xì)胞貼壁。
[0015]4.挑選克隆在顯微鏡下確定克隆的位置后用marker筆在培養(yǎng)器皿的外部底面劃圈,先PBS洗漆一次后,再加入37度預(yù)熱的5% tripsin-PBS溶液(即Iml標(biāo)準(zhǔn)trypsin-EDTA溶液與19mlPBS混合而成),后用200ul滅菌黃槍頭直接在標(biāo)記的克隆位置反復(fù)洗吹使細(xì)胞完全消化后轉(zhuǎn)移至事先已加入培養(yǎng)液的24孔板內(nèi),將所得到的細(xì)胞進(jìn)行傳代,體外長(zhǎng)期培養(yǎng)逾10代,成為連續(xù)傳代的細(xì)胞系,命名為T(mén)-MG。
[0016]本發(fā)明通過(guò)構(gòu)建慢病毒載體轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞并通過(guò)克隆挑選策略,分離得到了能自我增殖并向視網(wǎng)膜高趨化的小膠質(zhì)細(xì)胞系(T-MG),該細(xì)胞系體外培養(yǎng)生長(zhǎng)良好,每4天傳代一次。
[0017]T-MG經(jīng)基因芯片檢測(cè)(20,001 probes),僅有不到200個(gè)基因(1%)與原代培養(yǎng)的視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞有差異且均不涉及主要功能蛋白,T-MG能自我增殖,在體外連續(xù)傳代及培養(yǎng)過(guò)程中具有遺傳穩(wěn)定性。
[0018]本發(fā)明采用ELISA、吞卩遼實(shí)驗(yàn)、Real-time PCR、Western_blot等分子生物學(xué)檢測(cè)方法證實(shí)T-MG能表達(dá)單核-巨噬細(xì)胞表面抗原⑶IIb (0X42),EDl (0X6)、具有吞噬能力并且在LPS的刺激下能分泌TNF- a、IL_1 β與iNOS等致炎因子;體外趨化實(shí)驗(yàn)顯示T-MG能被CCL2趨化,并且其趨化能力較原代小膠質(zhì)細(xì)胞明顯增強(qiáng)。
[0019]實(shí)施例2,T-MG細(xì)胞的體內(nèi)移植
1.大鼠視網(wǎng)膜光損傷模型的建立:
所有實(shí)驗(yàn)用大鼠均在12h明(20?50 Lux)以及12h暗(O?10 Lux)的循環(huán)光環(huán)境下適應(yīng)7d,光照組大鼠予縫線(xiàn)開(kāi)瞼,I %阿托品擴(kuò)瞳,經(jīng)24h暗適應(yīng)后,放入光照箱中接受24h2500Lux寬譜藍(lán)光照射,光照結(jié)束后置于黑暗中恢復(fù)24h后送回原正常環(huán)境飼養(yǎng);
2.T-MG細(xì)胞在光損傷大鼠模型中的體內(nèi)移植:
①光照后ld,將SD大鼠麻醉后,通過(guò)尾靜脈注射和玻璃體腔注射兩種方法將16個(gè)T-MG細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)移植,移植后的7d、14d、28d常規(guī)處理大鼠,4%多聚甲醛灌注固定后,制作雙眼眼球切片及視網(wǎng)膜鋪片;由于T-MG細(xì)胞攜帶GFP基因,因此在熒光顯微鏡下可以觀察到綠色的陽(yáng)性細(xì)胞;光照后3d,視網(wǎng)膜上發(fā)現(xiàn)少量GFP (+)細(xì)胞,其數(shù)量逐漸增多于14d時(shí)達(dá)到高峰,28d時(shí)仍可見(jiàn)較多;結(jié)果顯示,從水平空間分布來(lái)看,GFP (+)細(xì)胞主要圍繞血管分布,其密度在各象限之間無(wú)明顯差別;從垂直分布來(lái)看,GFP(+)細(xì)胞逐步向ONL層遷移,能夠進(jìn)入視網(wǎng)膜損傷部位;
②視網(wǎng)膜切片的HE染色顯示,光照后2周,T-MG移植組的視網(wǎng)膜外核層厚度較對(duì)照組明顯增厚,表明T-MG細(xì)胞的體內(nèi)移植能促進(jìn)光感受器的存活。
【權(quán)利要求】
1.一種視網(wǎng)膜高趨化性的大鼠視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞系,其特征在于,所述的細(xì)胞系為能被高效募集到視網(wǎng)膜的大鼠視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞系,其保藏編號(hào)=CGMCC N0.8158,具有以下生物學(xué)特性:為鼠源性細(xì)胞,經(jīng)基因芯片檢測(cè)(20,OOl probes),僅有不到200個(gè)基因(1%)與原代培養(yǎng)的視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞有差異且均不涉及主要功能蛋白;能表達(dá)單核-巨噬細(xì)胞表面抗原⑶I Ib (0X42),EDl (0X6)、具有吞噬能力并且在LPS的刺激下能分泌TNF- a、IL-1 β與iNOS等致炎因子;能自我增殖,連續(xù)傳代;其趨化能力較原代小膠質(zhì)細(xì)胞明顯增強(qiáng);能通過(guò)體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)進(jìn)入視網(wǎng)膜并存活。
2.按權(quán)利要求1所述的視網(wǎng)膜高趨化性的大鼠視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞系,其特征是所述的細(xì)胞系其生物學(xué)特性經(jīng)多次傳代及修飾后保持穩(wěn)定。
3.按權(quán)利要求1所述的視網(wǎng)膜高趨化性的大鼠視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞系,其特征是所述細(xì)胞系在體外趨化實(shí)驗(yàn)中能被CCL2高效趨化。
4.按權(quán)利要求1所述的視網(wǎng)膜高趨化性的大鼠視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞系,其特征是所述細(xì)胞系體內(nèi)移植后能被高效定向募集到視網(wǎng)膜損傷部位并存活,具有促進(jìn)光感受器存活作用。
5.權(quán)利要求1的視網(wǎng)膜高趨化性的大鼠視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞系在制備從外周-中樞(視網(wǎng)膜)的藥物載體中的用途。
【文檔編號(hào)】A61K47/46GK104513808SQ201310459318
【公開(kāi)日】2015年4月15日 申請(qǐng)日期:2013年9月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月30日
【發(fā)明者】倪穎勤, 徐格致, 蔣小爽, 張萌, 江睿, 劉天津 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院