N-(3,5-二氯苯基)-3,4-二氯-順丁烯二酰亞胺在抗真菌感染中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種N-(3,5-二氯苯基)-3,4-二氯-順丁烯二酰亞胺在抗真菌感染中的應(yīng)用；N-(3,5-二氯苯基)-3,4-二氯-順丁烯二酰亞胺可有效抑制白色念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、隱球酵母菌、須癬毛癬菌、紅色毛癬菌或煙曲霉，為其提供了抗真菌感染方面的新應(yīng)用；N-(3,5-二氯苯基)-3,4-二氯-順丁烯二酰亞胺的Vero、PK11和Hepg2細胞毒性低，都>10μg/mL。
【專利說明】N- (3, 5- 二氯苯基)-3, 4- 二氯-順丁烯二酰亞胺在抗真菌感染中的應(yīng)用
(-)【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及順丁烯二酰亞胺化合物的應(yīng)用，特別涉及一種N-(3，5-二氯苯基)-3，4- 二氯-順丁烯二酰亞胺在抗真菌感染中的應(yīng)用。
(二)【背景技術(shù)】
[0002]含順丁烯二酸酐或順丁烯二酰亞胺結(jié)構(gòu)的天然化合物均具有良好的生物活性，尤其是抗真菌活性。在上世紀60年代末 ，原上海農(nóng)藥所中國工程院院士沈寅初課題組在篩選抗油菜菌核病(Sclerotinia sclerotiorum)抗生素時發(fā)現(xiàn)的含順丁烯二酸酐結(jié)構(gòu)的天然化合物(圖1) 一變構(gòu)霉素和變構(gòu)菌素，兩者對真菌都有良好的活性。含馬來酸酐的Zopfiellin被日本尼桑公司開發(fā)為新一代防治灰霉病生物農(nóng)藥，它對菌核病菌的MIC為
1.56 u g/mLo Scytalidin、Viburspiran、Heveadride 和 Dihydroepiheveadride 都具有很廣的抗真菌譜，后兩個化合物已被列為抗真菌候選藥物。而含順丁烯二酰亞胺結(jié)構(gòu)的天然化合物-焦土霉素、Aqabamycins以及Arcyruarubins對許多細菌、真菌均具有較好的抗菌效果，其中焦土霉素作為抗菌藥已在臨床上使用數(shù)十年之久。以順丁烯二酸酐或順丁烯二酰亞胺為核心結(jié)構(gòu)衍生得到的該類化合物對油菜菌核病菌和灰霉病菌同樣具有較好的抑菌效果，而且毒性低。更重要的是，Sortino等人報道了順丁烯二酰亞胺類化合物對人體易感染真菌有很好的抑制作用，他們聲稱該類化合物是有潛力的抗真菌感染候選藥物。但只描述了部分化合物。
[0003]真菌感染包括淺部真菌病和深部真菌病，凡具有殺滅或抑制真菌生長或繁殖的藥物稱為抗真菌藥(antifungal agents),其研究已有近百年的歷史。第一代以灰黃霉素為代表，20世紀30年代末從微生物發(fā)酵代謝產(chǎn)物中分離得到的，第一個應(yīng)用于臨床，對皮膚癬菌有較強的抑制作用，但對深部真菌無效，現(xiàn)已停止生產(chǎn)和使用；另外還包括制霉菌素及兩性霉素B，均屬多烯大環(huán)內(nèi)酯類，主要用于深部真菌的治療。第二代為咪唑類，主要有酮康唑、克霉唑、咪康唑、益康唑等。第三代為三唑類，包括伊曲康唑、氟康唑以及丙烯胺類的特比萘芬等。目前，抗真菌感染藥物具有品種少、毒性大等的特點。尋找新的抗真菌感染藥物是永恒的課題。
[0004]新化合物N-(3，5- 二氯苯基)-3，4- 二氯-順丁烯二酰亞胺的合成制備我們已在國家發(fā)明專利201310047509.7中加以描述。但有關(guān)該化合物的抗真菌感染中應(yīng)用研究還未見報道。
(三)
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明目的是提供N-(3，5- 二氯苯基)-3，4- 二氯-順丁烯二酰亞胺在抗真菌感染方面的應(yīng)用，為新抗真菌感染藥物篩選提供依據(jù)。
[0006]本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
[0007]本發(fā)明提供N-(3，5- 二氯苯基)-3，4- 二氯-順丁烯二酰亞胺在抗真菌感染中的應(yīng)用。
[0008]進一步,所述真菌為白色念珠菌(Canidia albicans)、光滑念珠菌(C.glabrata)、克柔念珠菌(C.krusei)、隱球酵母菌(Cryptococcus neoformans)、須癖毛癖菌(Trichophyton mentagrophytes)、紅色毛癖菌(T.rubrum)或煙曲霉(Aspergillusfumigatus),優(yōu)選所述真菌為克柔念珠菌(C.krusei)或隱球酵母菌(Cryptococcusneoformans)。
[0009]進一步，所述N-(3，5- 二氯苯基)-3，4- 二氯-順丁烯二酰亞胺的最小抑菌濃度(MIC)為0.3~5.0 ii g/mL,通常所述N- (3，5- 二氯苯基)_3，4- 二氯-順丁烯二酰亞胺的MIC都在5.0 ii g/mL以下，特別是對隱球酵母菌的MIC為0.3 y g/mL。
[0010]本發(fā)明所述N-(3，5- 二氯苯基)-3，4- 二氯-順丁烯二酰亞胺在抗真菌感染中的應(yīng)用方法為:在96孔板中加入ro培養(yǎng)基和測試藥物，在特定的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)真菌，檢測其OD值,并與對照相比計算抑制率及MIC等,具體操作見文獻Li, et al.Potent in vitroantifungal activities of naturally occurring acetylenic acids.ANTIMICROBIALAGENTS AND CHEMOTHERAPY, 2008，52:2442-2448。
[0011]本發(fā)明的創(chuàng)新性主要體現(xiàn)在:(l)N-(3，5-二氯苯基)-3，4-二氯-順丁烯二酰亞胺可有效抑制白色念珠菌(Canidia albicans)、光滑念珠菌(C.glabrata)、克柔念珠菌 C.krusei)、隱球酵母菌(Cryptococcus neoformans)> 須癖毛癖菌(Trichophytonmentagrophytes)、紅色毛癖菌(T.rubrum)或煙曲霉(Aspergillus fumigatus),為其提供了抗真菌感染方面的新應(yīng)用；(2 )N- (3，5- 二氯苯基)-3，4- 二氯-順丁烯二酰亞胺的Vero、PKll和Hepg2細胞毒性低，都>10 ii g/mL。
(四)【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1為含順丁烯二酸 酐或順丁烯二酰亞胺結(jié)構(gòu)的化合物。
(五)【具體實施方式】
[0013]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此:
[0014]實施例1:N-(3，5- 二氯苯基)-3，4- 二氯-順丁烯二酰亞胺的制備
[0015]稱取2，3-二氯順丁烯二酸酐2.505g (0.015mol)，量取4_甲苯苯胺2.415g(0.015mol)，直接加入到裝有磁力攪拌子的干燥三口燒瓶中，再加入25mL冰醋酸作溶劑；加熱120°C回流反應(yīng)3h，待反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，減壓蒸餾除去溶劑，得到晶體粗產(chǎn)物，再用丙酮作溶劑加熱105°C進行重結(jié)晶，過濾，濾餅干燥，得到黃色固體產(chǎn)物3.92g，產(chǎn)率84.5%。所得產(chǎn)物經(jīng)1H NMR, MS光譜分析，確證為N- (4-甲苯基)-3，4- 二氯基順丁烯二酰亞胺。
[0016]1H MMR(500MHz，CDCl3)S7.43(t，J=1.8Hz，lH)，7.36(d，J=1.8Hz，2H).EIMS m/z (%): 309.0 (100) [M]+, 229.9 (27)，186.9 (14)，124.0 (28)，87.0 (34)。
[0017]實施例2
[0018]分別精確稱取實施例1方法制備的N-(3，5- 二氯苯基)-3，4- 二氯-順丁烯二酰亞胺2.0mg、兩性霉素B (購自Sigma)2.0mg、特比萘芬(購自Sigma)2.0mg及化合物B-J各2.0mg，分別用ImL DMSO溶解，然后分別用20%DMS0的生理鹽水(V/V)稀釋至0.1-20 u g/mL不同梯度濃度，制成藥物兩性霉素B、藥物特比萘芬及藥物A-J。
[0019]菌株:白色念珠菌(Candidaalbicans) ATCC90028、光滑念珠菌(Candidaglabrata)ATCC90030、克柔念珠菌(Candida krusei)ATCC6258、隱球酵母菌(Cryptococcusneoformans) ATCC90113、煙曲霉(Aspergillus fumigatus) ATCC90906、須癖毛癖菌(Trichophyton mentagrophytes)ATCC9953、須癖毛癖菌(Trichophyton mentagrophytes)ATCC4439、紅色毛癖菌(Trichophyton rubrum) ATCC10218 和紅色毛癖菌(Trichophytonrubrum) ATCC4438均購自美國ATCC菌種保藏中心。細胞VER0、PKll和HEPG2均由美國密西西比大學藥學院實驗室保藏。
[0020]培養(yǎng)基都用土豆培養(yǎng)基(PD)。分別將上述菌株在96孔板中接種培養(yǎng)，培養(yǎng)基中分別添加藥物兩性霉素B、藥物特比萘芬及藥物A-J，以不加藥物的空白作對照，并用分光光度計讀數(shù)檢測其菌體濃度，與對照相比計算MIC、MFC和ICki (具體操作見文獻Li，etal.Potent in vitro antifungal activities of naturally occurring acetylenicacids.ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY, 2008，52:2442-2448)。研究結(jié)果如表 I和表2所示。
[0021]所述ro培養(yǎng)基組成為:馬鈴薯200g，葡萄糖20g，加水至1000mL,自然pH。
[0022]表1兩性霉素B、N_ (3，5- 二氯苯基)_3，4_ 二氯-順丁烯二酰亞胺及其類似物的
抗真菌活性及細胞毒性
[0023]
【權(quán)利要求】
1.N-(3, 5- 二氯苯基)-3，4- 二氯-順丁烯二酰亞胺在抗真菌感染中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述N-(3，5- 二氯苯基)-3，4- 二氯-順丁烯二酰亞胺在抗真菌感染中的應(yīng)用，其特征在于所述真菌為白色念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、隱球酵母菌、須癬毛癬菌、紅色毛癬菌或煙曲霉。
3.如權(quán)利要求2所述N-(3，5- 二氯苯基)-3，4- 二氯-順丁烯二酰亞胺在抗真菌感染中的應(yīng)用，其特征在于所述真菌為克柔念珠菌或隱球酵母菌。
4.如權(quán)利要求1所述所述N-(3，5- 二氯苯基)-3，4- 二氯-順丁烯二酰亞胺在抗真菌感染中的應(yīng)用，其特征在于所述N- (3，5- 二氯苯基)-3，4- 二氯-順丁烯二酰亞胺的MIC為·0.3 ~5.0 u g/mL。·
【文檔編號】A61P31/10GK103565802SQ201310462766
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年9月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月30日
【發(fā)明者】陳小龍, 范永仙, 陸躍樂, 李福革, 沈寅初 申請人:浙江工業(yè)大學