一種含有明膠的蛋白復(fù)合支架及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種含有明膠的蛋白復(fù)合支架，所述蛋白復(fù)合支架的組成材料包括絲素蛋白、角蛋白和明膠。所述絲素蛋白和角蛋白的質(zhì)量比優(yōu)選為（1-10）:（1-10），所述明膠和角蛋白與絲素蛋白總量的質(zhì)量比優(yōu)選為（0.1-5）:10。本發(fā)明提供的含有明膠的蛋白復(fù)合支架復(fù)合了角蛋白、絲素蛋白、明膠，物理強(qiáng)度要優(yōu)于利用單純絲素蛋白溶液和單純蛋白組合溶液所構(gòu)建的膜結(jié)構(gòu)材料，更適合于實(shí)際手術(shù)操作的需要，最終提高尿道修復(fù)重建的成功率。
【專利說明】一種含有明膠的蛋白復(fù)合支架及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001〕 本發(fā)明涉及一種一種蛋白復(fù)合支架，尤其涉及一種可以用于尿道修復(fù)重建的含有明膠的蛋白復(fù)合支架及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002]由于各種原因所導(dǎo)致的復(fù)雜性尿道疾病歷來是泌尿外科臨床治療中的一個難題。雖然多種自體組織作為替代材料已經(jīng)在尿道修復(fù)重建中獲得理想的效果，但相比而言組織工程技術(shù)沒有前者“犧牲正常組織為代價，以手術(shù)創(chuàng)傷修復(fù)組織缺損”的固有缺陷，因而更可作為未來尿道重建發(fā)展的主要方向?，F(xiàn)有國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道中對于各種組織工程材料或者材料-種子細(xì)胞復(fù)合體在尿道修復(fù)重建中的研究已逐漸從實(shí)驗(yàn)室向臨床拓展。其中不乏有小范圍實(shí)際尿道疾病臨床治療的案例，并且獲得另人滿意的初步療效。
[0003]但是相對于種子細(xì)胞研究的日趨完善，在尿道組織工程修復(fù)重建中選擇何種支架材料最為理想?yún)s始終未能達(dá)成共識。目前在尿道的組織工程研究中主要采用兩大類支架:天然脫細(xì)胞膠原基質(zhì)8八16、脫細(xì)胞真皮基質(zhì)等)和人工合成材料(聚乙醇酸、聚乳酸丨聚乙醇酸共聚物前者雖然制備方便，適合商品化的生產(chǎn)，但由于多取材于異種乃至異體生物組織，因而在生物安全性方面一直受到部分學(xué)者質(zhì)疑，很難被所有患者所接受。同時其在空間結(jié)構(gòu)，生物力學(xué)特性以及促進(jìn)微血管和細(xì)胞滲透方面也同時存在著固有缺陷。后者雖然將生物安全性方面的風(fēng)險(xiǎn)降到了最低，但支架在降解過程中的代謝產(chǎn)物對周圍的細(xì)胞以及微環(huán)境會造成不可避免的負(fù)面影響，另外人工合成類支架因缺乏相應(yīng)的生長因子，在促進(jìn)種子細(xì)胞黏附，增殖方面也有著先天的不足。
[0004]基于上述背景，目前在該研究領(lǐng)域，利用蛋白質(zhì)進(jìn)行相關(guān)生物支架材料的構(gòu)建正受到越來越多的研究者的關(guān)注?，F(xiàn)有報(bào)道中，利用絲素蛋白、人發(fā)角蛋白進(jìn)行生物蛋白支架構(gòu)建的報(bào)道已經(jīng)有成功的案例。但現(xiàn)有方法所構(gòu)建出的單純蛋白支架材料的力學(xué)特性仍無法與上述天然脫細(xì)胞膠原基質(zhì)以及人工合成的支架材料相比擬。如果要將上述蛋白質(zhì)材料的力學(xué)性能進(jìn)行進(jìn)一步強(qiáng)化，目前多采用靜電紡絲的方法來進(jìn)行操作。這種操作技術(shù)對設(shè)備要求較高，同時涉及到蛋白質(zhì)溶液的高度濃縮，其操作亦較繁瑣。
[0005]相比而言國外的相關(guān)研究中也已提出將多種蛋白進(jìn)行混合，可利用不同蛋白質(zhì)因空間結(jié)構(gòu)的不同而導(dǎo)致力學(xué)性質(zhì)不同的特點(diǎn)來進(jìn)行最終制備材料的力學(xué)強(qiáng)化。雖然現(xiàn)有報(bào)道中已有利用人發(fā)還原型角蛋白與絲素蛋白結(jié)合構(gòu)建支架材料的報(bào)道，但其合適的濃度配比仍沒有進(jìn)行深入探究。同時兩種混合蛋白所制得的材料雖然在力學(xué)性能上較單一蛋白支架有所改進(jìn)，但仍與天然脫細(xì)胞基質(zhì)支架存在一定的差距。
[0006]針對上述問題，以往曾采用化學(xué)交聯(lián)劑如吉尼平，或者光交聯(lián)方法對支架材料進(jìn)行進(jìn)一步的力學(xué)改性。但化學(xué)交聯(lián)法所涉及的交聯(lián)劑可能對材料后續(xù)的體內(nèi)植入以及其表面的細(xì)胞種植帶來一定的負(fù)面影響。而光交聯(lián)法較長的處理時間又可能對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性帶來一定的影響。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于克服上述不足，提供一種含有明膠的蛋白復(fù)合支架，其物理特性較現(xiàn)有單純蛋白質(zhì)支架材料更為優(yōu)異，從而適合于實(shí)際手術(shù)操作的需要，最終提高尿道修復(fù)重建的成功率。
[0008]本發(fā)明的第一個方面是提供一種可以用于尿道修復(fù)重建的含有明膠的蛋白復(fù)合支架，所述蛋白復(fù)合支架的組成材料包括絲素蛋白、角蛋白和明膠。
[0009]優(yōu)選地，所述絲素蛋白和角蛋白的質(zhì)量比為(1-10): (1-10),^^^^(1.5-9):(1.5-9),更優(yōu)選為(2-8): (2-8),更優(yōu)選為(3-7): (3-7),例如 3:7、4:6、5:5、6:4 或 7:3。
[0010]優(yōu)選地，所述明膠和角蛋白與絲素蛋白總量的質(zhì)量比為(0.1-5):10，更優(yōu)選為(0.5-4): 10，更優(yōu)選為(0.8-3.5):10，例如 1.5:10,2:10,2.5:10 ^2.8:10。
[0011]其中，所述角蛋白優(yōu)選為還原型人發(fā)角蛋白。
[0012]本發(fā)明的第二個方面是提供一種上述含有明膠的蛋白復(fù)合支架的制備方法，包括以下步驟:
[0013]步驟1，將角蛋白溶液與絲素蛋白溶液混合得到蛋白混合液，控制絲素蛋白和角蛋白的質(zhì)量比為(1-10): (1-10),且蛋白混合液中角蛋白與絲素蛋白的總濃度為0.05-0.2^/1111,；
[0014]步驟2，將明膠加入到蛋白混合液中，待明膠完全溶解后，將混合溶液液密封靜置，直至凝膠化，敞口自蒸發(fā)，得到蛋白復(fù)合支架，其中，所述明膠和角蛋白與絲素蛋白總量的質(zhì)量比為(0.1-5):10。
[0015]步驟1中，所述絲素蛋白和角蛋白的質(zhì)量比優(yōu)選為(1.5-9): (1.5-9),更優(yōu)選為(2-8): (2-8),^^^^(3-7): (3-7),^^3:7,4:6,5:5,6:4^7:30
[0016]步驟1中，蛋白混合液中角蛋白與絲素蛋白的總濃度優(yōu)選為0.06-0.匕更優(yōu)選為0.07-0.158/?[，更優(yōu)選為0.08-0.[，更優(yōu)選為0.09-0.[，例如0.匕/此或
0.105^/1111。
[0017]步驟2中，所述明膠和角蛋白與絲素蛋白總量的質(zhì)量比優(yōu)選為(0.5-4):10，更優(yōu)選為(0.8-3.5):10,^^^^(1-3):10，例如 1.5:10,2:10,2.5:10 或 2.8:10
[0018]步驟1中，所述角蛋白優(yōu)選為還原型人發(fā)角蛋白，制備方法如下:將人頭發(fā)置于提取液中，50-1501 (優(yōu)選為70-1301，更優(yōu)選為80-1201，更優(yōu)選為100-1100下浸泡10-60111111 (優(yōu)選為15-50111111，更優(yōu)選為25-35111111)，過濾，將濾液透析，濃縮，得到還原型人發(fā)角蛋白，其中，人頭發(fā)的質(zhì)量與提取液的體積的比為(0.5-?): (5-201111).
[0019]進(jìn)一步優(yōu)選地，人頭發(fā)的質(zhì)量與提取液的體積的比為(1-30: (8-154),更優(yōu)選為(1.5-20: (10-121111)0
[0020]優(yōu)選地，所述提取液為尿素、十二烷基硫酸鈉、^！23205的混合水溶液。
[0021]進(jìn)一步優(yōu)選地，所述提取液中，每100111[水中，含有30-708(優(yōu)選為35-608，更優(yōu)選為45-500尿素、40-808 (優(yōu)選為45-708，更優(yōu)選為50-600十二烷基硫酸鈉、80-1208 (優(yōu)選為 88-1108，更優(yōu)選為 92-1008)^123205。
[0022]步驟1中，所述絲素蛋白的制備方法如下:將脫膠蠶絲溶于IX溶液中，過濾，將濾液透析，濃縮，得到純化的絲素蛋白，其中，I為堿金屬(例如[1、版1、尺等),X為鹵素(例如？、01、8『、I等兄
[0023]優(yōu)選地，步驟2中，凝膠化后，敞口自蒸發(fā)8-1611(優(yōu)選為10-1處，更優(yōu)選為11-1210后，倒入無水酒精0.5-21！(優(yōu)選為0.8-1.51！，更優(yōu)選為1-1.210后取出得到蛋白復(fù)合支架。
[0024]本發(fā)明提供的含有明膠的蛋白復(fù)合支架復(fù)合了角蛋白、絲素蛋白、明膠，物理強(qiáng)度要優(yōu)于利用單純絲素蛋白溶液和單純蛋白組合溶液所構(gòu)建的膜結(jié)構(gòu)材料，更適合于實(shí)際手術(shù)操作的需要，最終提高尿道修復(fù)重建的成功率。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1為本發(fā)明提供的含有明膠的蛋白復(fù)合支架的冊染色圖。

【具體實(shí)施方式】
[0026]下面參照附圖，結(jié)合具體的實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的描述，以更好地理解本發(fā)明。
[0027]實(shí)施例1
[0028]1、自理發(fā)店中獲取無染色的正常黑發(fā)，常規(guī)洗發(fā)精清洗1-2次，置放于常規(guī)室溫中進(jìn)行干燥。
[0029]2、將干燥處理后的頭發(fā)浸泡于乙酸乙酯與甲醇的混合溶液中24小時，其中乙酸乙酯與甲醇的體積比為3:1。
[0030]3、頭發(fā)再次干燥后，充分剪碎，將其按1.58/101111比例加入提取液(每100(^1水中，溶解480.48尿素、57.6768十二烷基硫酸鈉30^95.045^--^^)中，浸沒后在100【油浴加熱30111111。
[0031]4、真空抽濾，將黑色提取液置于透析袋中，透析5(1，透析袋周圍水溶液中含有0.1^1:% 的他23205。
[0032]5、完成透析后將透析帶置于20被%？2以分子量10000)水溶液中，濃縮6小時，調(diào)節(jié)還原型人發(fā)角蛋白的的濃度為0.18/11^后，行303蛋白電泳檢測提示蛋白電泳帶在45-601^0左右，說明得到還原型人發(fā)角蛋白。
[0033]6、將得到的還原型人發(fā)角蛋白溶液在41環(huán)境下予以保存。
[0034]7、將1008溴化鋰溶于601111水中，配制成溴化鋰水溶液，攪拌溶液同時加熱至60。。。
[0035]8、將自市場上購置的脫膠蠶絲108溶液溴化鋰水溶液中，5卜后，多層紗布過濾，過濾后溶液置于透析袋中。
[0036]9、透析5(1，透析袋周圍水溶液中含有0.1被％的似23205，每天換水一次。
[0037]10、完成透析后將透析帶置于20被%？% (分子量20000)水溶液中，濃縮6卜，調(diào)節(jié)至絲素蛋白的濃度為0.4/111匕行303蛋白電泳檢測提示蛋白電泳帶在25-301^0左右，說明得到絲素蛋白。
[0038]11、將得到的絲素蛋白溶液在41環(huán)境下予以保存。
[0039]12、將得到的還原型人發(fā)角蛋白溶液和絲素蛋白溶液按體積比5:5進(jìn)行混合。
[0040]13.取步驟12得到的混合液15“，將其融合攪拌并加熱至371，加入明膠，控制混合液中明膠的濃度為0.018/1^。高速攪拌308后置入方型模具中。
[0041]14.混合溶液在方型模具中，模具加蓋，室溫下放置121！小時，帶凝膠化后，開蓋，自然蒸發(fā)12匕倒入酒精111后取出，得到蛋白復(fù)合支架。
[0042]最終獲取材料大體外觀為褐色半透明膜狀材料，其冊染色提示該材料一伊紅染色陽性膜狀物(圖1所示
[0043]經(jīng)力學(xué)拉伸檢測，該材料的最大伸長率45.49%，彈性模量0.11%。
[0044]實(shí)施例2
[0045]1、自理發(fā)店中獲取無染色的正常黑發(fā)，常規(guī)洗發(fā)精清洗1-2次，置放于常規(guī)室溫中進(jìn)行干燥。
[0046]2、將干燥處理后的頭發(fā)浸泡于乙酸乙酯與甲醇的混合溶液中24小時，其中乙酸乙酯與甲醇的體積比為3:1。
[0047]3、頭發(fā)再次干燥后，充分剪碎，將其按1.58/101111比例加入提取液(每100(^1水中，溶解480.48尿素、57.6768十二烷基硫酸鈉30^95.045^--^^)中，浸沒后在100【油浴加熱30111111。
[0048]4、真空抽濾，將黑色提取液置于透析袋中，透析5(1，透析袋周圍水溶液中含有0.1^1:% 的他23205。
[0049]5、完成透析后將透析帶置于20被%？2以分子量10000)水溶液中，濃縮6小時，調(diào)節(jié)還原型人發(fā)角蛋白的的濃度為0.18/11^后，行303蛋白電泳檢測提示蛋白電泳帶在45-601^0左右，說明得到還原型人發(fā)角蛋白。
[0050]6、將得到的還原型人發(fā)角蛋白溶液在41環(huán)境下予以保存。
[0051]7、將1008溴化鋰溶于601111水中，配制成溴化鋰水溶液，攪拌溶液同時加熱至60。。。
[0052]8、將自市場上購置的脫膠蠶絲108溶液溴化鋰水溶液中，5卜后，多層紗布過濾，過濾后溶液置于透析袋中。
[0053]9、透析5(1，透析袋周圍水溶液中含有0.1被％的似23205，每天換水一次。
[0054]10、完成透析后將透析帶置于20被%？% (分子量20000)水溶液中，濃縮6卜，調(diào)節(jié)至絲素蛋白的濃度為0.4/111匕行303蛋白電泳檢測提示蛋白電泳帶在25-301^0左右，說明得到絲素蛋白。
[0055]11、將得到的絲素蛋白溶液在41環(huán)境下予以保存。
[0056]12、將得到的還原型人發(fā)角蛋白溶液和絲素蛋白溶液按體積比5:5進(jìn)行混合。
[0057]13.取步驟12得到的混合液15“，將其融合攪拌并加熱至371，加入明膠，控制混合液中明膠的濃度為0.028/1^。高速攪拌308后置入方型模具中。
[0058]14.混合溶液在方型模具中，模具加蓋，室溫下放置121！小時，帶凝膠化后，開蓋，自然蒸發(fā)12匕倒入酒精111后取出，得到蛋白復(fù)合支架。
[0059]最終獲取材料大體外觀為褐色半透明膜狀材料，其冊染色提示該材料一伊紅染色陽性膜狀物。
[0060]經(jīng)力學(xué)拉伸檢測，該材料的最大伸長率55.29%，彈性模量0.1171%。
[0061]實(shí)施例3
[0062]1、自理發(fā)店中獲取無染色的正常黑發(fā)，常規(guī)洗發(fā)精清洗1-2次，置放于常規(guī)室溫中進(jìn)行干燥。
[0063]2、將干燥處理后的頭發(fā)浸泡于乙酸乙酯與甲醇的混合溶液中24小時，其中乙酸乙酯與甲醇的體積比為3:1。
[0064]3、頭發(fā)再次干燥后，充分剪碎，將其按1.58/1001比例加入提取液(每100001水中，溶解480.48尿素、57.6768十二烷基硫酸鈉30^95.045^--^^)中，浸沒后在100【油浴加熱30111111。
[0065]4、真空抽濾，將黑色提取液置于透析袋中，透析5(1，透析袋周圍水溶液中含有0.1^1:% 的他23205。
[0066]5、完成透析后將透析帶置于20被%？2以分子量10000)水溶液中，濃縮6小時，調(diào)節(jié)還原型人發(fā)角蛋白的的濃度為0.18/11^后，行303蛋白電泳檢測提示蛋白電泳帶在45-601^0左右，說明得到還原型人發(fā)角蛋白。
[0067]6、將得到的還原型人發(fā)角蛋白溶液在41環(huán)境下予以保存。
[0068]7、將1008溴化鋰溶于601111水中，配制成溴化鋰水溶液，攪拌溶液同時加熱至60。。。
[0069]8、將自市場上購置的脫膠蠶絲108溶液溴化鋰水溶液中，5卜后，多層紗布過濾，過濾后溶液置于透析袋中。
[0070]9、透析5(1，透析袋周圍水溶液中含有0.1被％的似23205，每天換水一次。
[0071]10、完成透析后將透析帶置于20被%？% (分子量20000)水溶液中，濃縮6卜，調(diào)節(jié)至絲素蛋白的濃度為0.4/111匕行303蛋白電泳檢測提示蛋白電泳帶在25-301^0左右，說明得到絲素蛋白。
[0072]11、將得到的絲素蛋白溶液在41環(huán)境下予以保存。
[0073]12、將得到的還原型人發(fā)角蛋白溶液和絲素蛋白溶液按體積比5:5進(jìn)行混合。
[0074]13.取步驟12得到的混合液15“，將其融合攪拌并加熱至371，加入明膠，控制混合液中明膠的濃度為0.038/11^。高速攪拌308后置入方型模具中。
[0075]14.混合溶液在方型模具中，模具加蓋，室溫下放置12卜小時，帶凝膠化后，開蓋，自然蒸發(fā)12匕倒入酒精111后取出，得到蛋白復(fù)合支架。
[0076]最終獲取材料大體外觀為褐色半透明膜狀材料，其冊染色提示該材料一伊紅染色陽性膜狀物。
[0077]經(jīng)力學(xué)拉伸檢測，該材料的最大伸長率11.27%，彈性模量0.051%。
[0078]實(shí)施例4
[0079]1、自理發(fā)店中獲取無染色的正常黑發(fā)，常規(guī)洗發(fā)精清洗1-2次，置放于常規(guī)室溫中進(jìn)行干燥。
[0080]2、將干燥處理后的頭發(fā)浸泡于乙酸乙酯與甲醇的混合溶液中24小時，其中乙酸乙酯與甲醇的體積比為3:1。
[0081]3、頭發(fā)再次干燥后，充分剪碎，將其按1.58/101111比例加入提取液(每100(^1水中，溶解480.48尿素、57.6768十二烷基硫酸鈉30^95.045^--^^)中，浸沒后在100【油浴加熱30111111。
[0082]4、真空抽濾，將黑色提取液置于透析袋中，透析5(1，透析袋周圍水溶液中含有0.1^1:% 的他23205。
[0083]5、完成透析后將透析帶置于20被%？2以分子量10000)水溶液中，濃縮6小時，調(diào)節(jié)還原型人發(fā)角蛋白的的濃度為0.18/11^后，行303蛋白電泳檢測提示蛋白電泳帶在45-601^0左右，說明得到還原型人發(fā)角蛋白。
[0084]6、將得到的還原型人發(fā)角蛋白溶液在41環(huán)境下予以保存。
[0085]7、將1008溴化鋰溶于601111水中，配制成溴化鋰水溶液，攪拌溶液同時加熱至60。。。
[0086]8、將自市場上購置的脫膠蠶絲108溶液溴化鋰水溶液中，5卜后，多層紗布過濾，過濾后溶液置于透析袋中。
[0087]9、透析5(1，透析袋周圍水溶液中含有0.1被％的似23205，每天換水一次。
[0088]10、完成透析后將透析帶置于20被%？% (分子量20000)水溶液中，濃縮6卜，調(diào)節(jié)至絲素蛋白的濃度為0.4/111匕行303蛋白電泳檢測提示蛋白電泳帶在25-301^0左右，說明得到絲素蛋白。
[0089]11、將得到的絲素蛋白溶液在41環(huán)境下予以保存。
[0090]12、將得到的還原型人發(fā)角蛋白溶液和絲素蛋白溶液按體積比3:7進(jìn)行混合。
[0091〕 13.取步驟12得到的混合液15“，將其融合攪拌并加熱至371，加入明膠，控制混合液中明膠的濃度為0.028/1^。高速攪拌308后置入方型模具中。
[0092]14.混合溶液在方型模具中，模具加蓋，室溫下放置121！小時，帶凝膠化后，開蓋，自然蒸發(fā)12匕倒入酒精111后取出，得到蛋白復(fù)合支架。
[0093]最終獲取材料大體外觀為褐色半透明膜狀材料，其冊染色提示該材料一伊紅染色陽性膜狀物。
[0094]經(jīng)力學(xué)拉伸檢測，該材料的最大伸長率42.06%，彈性模量0.091%。
[0095]實(shí)施例5
[0096]1、自理發(fā)店中獲取無染色的正常黑發(fā)，常規(guī)洗發(fā)精清洗1-2次，置放于常規(guī)室溫中進(jìn)行干燥。
[0097]2、將干燥處理后的頭發(fā)浸泡于乙酸乙酯與甲醇的混合溶液中24小時，其中乙酸乙酯與甲醇的體積比為3:1。
[0098]3、頭發(fā)再次干燥后，充分剪碎，將其按1.58/101111比例加入提取液(每100(^1水中，溶解480.48尿素、57.6768十二烷基硫酸鈉30^95.045^--^^)中，浸沒后在100【油浴加熱30111111。
[0099]4、真空抽濾，將黑色提取液置于透析袋中，透析5(1，透析袋周圍水溶液中含有0.1^1:% 的他23205。
[0100]5、完成透析后將透析帶置于20被%？2以分子量10000)水溶液中，濃縮6小時，調(diào)節(jié)還原型人發(fā)角蛋白的的濃度為0.18/11^后，行303蛋白電泳檢測提示蛋白電泳帶在45-601^0左右，說明得到還原型人發(fā)角蛋白。
[0101]6、將得到的還原型人發(fā)角蛋白溶液在41環(huán)境下予以保存。
[0102]7、將1008溴化鋰溶于6(^1水中，配制成溴化鋰水溶液，攪拌溶液同時加熱至60。。。
[0103]8、將自市場上購置的脫膠蠶絲108溶液溴化鋰水溶液中，5卜后，多層紗布過濾，過濾后溶液置于透析袋中。
[0104]9、透析5(1，透析袋周圍水溶液中含有0.1被％的似23205，每天換水一次。
[0105]10、完成透析后將透析帶置于20被%？% (分子量20000)水溶液中，濃縮6卜，調(diào)節(jié)至絲素蛋白的濃度為0.4/111匕行303蛋白電泳檢測提示蛋白電泳帶在25-301^0左右，說明得到絲素蛋白。
[0106]11、將得到的絲素蛋白溶液在41環(huán)境下予以保存。
[0107]12、將得到的還原型人發(fā)角蛋白溶液和絲素蛋白溶液按體積比4:6進(jìn)行混合。
[0108]13.取步驟12得到的混合液15“，將其融合攪拌并加熱至371，加入明膠，控制混合液中明膠的濃度為0.028/1^。高速攪拌308后置入方型模具中。
[0109]14.混合溶液在方型模具中，模具加蓋，室溫下放置121！小時，帶凝膠化后，開蓋，自然蒸發(fā)12匕倒入酒精111后取出，得到蛋白復(fù)合支架。
[0110]最終獲取材料大體外觀為褐色半透明膜狀材料，其冊染色提示該材料一伊紅染色陽性膜狀物。
[0111]經(jīng)力學(xué)拉伸檢測，該材料的最大伸長率39.31%，彈性模量0.1461%。
[0112]實(shí)施例6
[0113]1、自理發(fā)店中獲取無染色的正常黑發(fā)，常規(guī)洗發(fā)精清洗1-2次，置放于常規(guī)室溫中進(jìn)行干燥。
[0114]2、將干燥處理后的頭發(fā)浸泡于乙酸乙酯與甲醇的混合溶液中24小時，其中乙酸乙酯與甲醇的體積比為3:1。
[0115]3、頭發(fā)再次干燥后，充分剪碎，將其按1.58/101111比例加入提取液(每100(^1水中，溶解480.48尿素、57.6768十二烷基硫酸鈉30^95.045^--^^)中，浸沒后在100【油浴加熱30111111。
[0116]4、真空抽濾，將黑色提取液置于透析袋中，透析5(1，透析袋周圍水溶液中含有
0.1^1:% 的他23205。
[0117]5、完成透析后將透析帶置于20被%？2以分子量10000)水溶液中，濃縮6小時，調(diào)節(jié)還原型人發(fā)角蛋白的的濃度為0.18/11^后，行303蛋白電泳檢測提示蛋白電泳帶在45-601^0左右，說明得到還原型人發(fā)角蛋白。
[0118]6、將得到的還原型人發(fā)角蛋白溶液在41環(huán)境下予以保存。
[0119]7、將1008溴化鋰溶于6(^1水中，配制成溴化鋰水溶液，攪拌溶液同時加熱至60。。。
[0120]8、將自市場上購置的脫膠蠶絲108溶液溴化鋰水溶液中，5卜后，多層紗布過濾，過濾后溶液置于透析袋中。
[0121]9、透析5(1，透析袋周圍水溶液中含有0.1被％的似23205，每天換水一次。
[0122]10、完成透析后將透析帶置于20被%？% (分子量20000)水溶液中，濃縮6卜，調(diào)節(jié)至絲素蛋白的濃度為0.4/111匕行303蛋白電泳檢測提示蛋白電泳帶在25-301^0左右，說明得到絲素蛋白。
[0123]11、將得到的絲素蛋白溶液在41環(huán)境下予以保存。
[0124]12、將得到的還原型人發(fā)角蛋白溶液和絲素蛋白溶液按體積比6:4進(jìn)行混合。
[0125]13.取步驟12得到的混合液15“，將其融合攪拌并加熱至371，加入明膠，控制混合液中明膠的濃度為0.028/1^。高速攪拌308后置入方型模具中。
[0126]14.混合溶液在方型模具中，模具加蓋，室溫下放置121！小時，帶凝膠化后，開蓋，自然蒸發(fā)12h，倒入酒精I(xiàn)h后取出，得到蛋白復(fù)合支架。
[0127]最終獲取材料大體外觀為褐色半透明膜狀材料，其HE染色提示該材料一伊紅染色陽性膜狀物(圖1所示)。
[0128]經(jīng)力學(xué)拉伸檢測，該材料的最大伸長率52.43%，彈性模量0.202Mpa。
[0129]實(shí)施例7
[0130]1、自理發(fā)店中獲取無染色的正常黑發(fā)，常規(guī)洗發(fā)精清洗1-2次，置放于常規(guī)室溫中進(jìn)行干燥。
[0131]2、將干燥處理后的頭發(fā)浸泡于乙酸乙酯與甲醇的混合溶液中24小時，其中乙酸乙酯與甲醇的體積比為3:1。
[0132]3、頭發(fā)再次干燥后，充分剪碎，將其按1.5g/10ml比例加入提取液(每100ml水中，溶解480.4g尿素、57.676g十二烷基硫酸鈉SDS、95.045gNa2S205)中，浸沒后在100°C油浴加熱30min。
[0133]4、真空抽濾，將黑色提取液置于透析袋中，透析5d，透析袋周圍水溶液中含有0.lwt% 的 Na2S2O5。
[0134]5、完成透析后將透析帶置于20wt%PEG(分子量10000)水溶液中，濃縮6小時，調(diào)節(jié)還原型人發(fā)角蛋白的的濃度為0.lg/mL后，行SDS蛋白電泳檢測提示蛋白電泳帶在45-60kD左右，說明得到還原型人發(fā)角蛋白。
[0135]6、將得到的還原型人發(fā)角蛋白溶液在4°C環(huán)境下予以保存。
[0136]7、將10g溴化鋰溶于60ml水中，配制成溴化鋰水溶液，攪拌溶液同時加熱至60。。。
[0137]8、將自市場上購置的脫膠蠶絲1g溶液溴化鋰水溶液中，5h后，多層紗布過濾，過濾后溶液置于透析袋中。
[0138]9、透析5d，透析袋周圍水溶液中含有0.lwt%的Na2S2O5，每天換水一次。
[0139]10、完成透析后將透析帶置于20wt%PEG (分子量20000)水溶液中，濃縮6h，調(diào)節(jié)至絲素蛋白的濃度為0.lg/mL，行SDS蛋白電泳檢測提示蛋白電泳帶在25-30kD左右，說明得到絲素蛋白。
[0140]11、將得到的絲素蛋白溶液在4°C環(huán)境下予以保存。
[0141]12、將得到的還原型人發(fā)角蛋白溶液和絲素蛋白溶液按體積比7:3進(jìn)行混合。
[0142]13.取步驟12得到的混合液15ml，將其融合攪拌并加熱至37°C，加入明膠，控制混合液中明膠的濃度為0.02g/mL。高速攪拌30s后置入方型模具中。
[0143]14.混合溶液在方型模具中，模具加蓋，室溫下放置12h小時，帶凝膠化后，開蓋，自然蒸發(fā)12h，倒入酒精I(xiàn)h后取出，得到蛋白復(fù)合支架。
[0144]最終獲取材料大體外觀為褐色半透明膜狀材料，其HE染色提示該材料一伊紅染色陽性膜狀物。
[0145]經(jīng)力學(xué)拉伸檢測，該材料的最大伸長率39.81%，彈性模量0.148Mpa。
[0146]以上對本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實(shí)施例。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對本發(fā)明進(jìn)行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種含有明膠的蛋白復(fù)合支架，其特征在于，組成材料包括絲素蛋白、角蛋白和明膠。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白復(fù)合支架，其特征在于，所述絲素蛋白和角蛋白的質(zhì)量比為(1-10): (1-10)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的蛋白復(fù)合支架，其特征在于，所述絲素蛋白和角蛋白的質(zhì)量比為(3-7): (3-7)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白復(fù)合支架，其特征在于，所述明膠和角蛋白與絲素蛋白總量的質(zhì)量比為(0.1-5):10ο
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的蛋白復(fù)合支架，其特征在于，所述明膠和角蛋白與絲素蛋白總量的質(zhì)量比為(1-3): 10ο
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白復(fù)合支架，其特征在于，所述角蛋白為還原型人發(fā)角蛋白。
7.—種如權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng)所述的含有明膠的蛋白復(fù)合支架的制備方法，其特征在于，包括以下步驟:步驟1，將角蛋白溶液與絲素蛋白溶液混合得到蛋白混合液，控制絲素蛋白和角蛋白的質(zhì)量比為(1-10): (1-10)，且蛋白混合液中角蛋白與絲素蛋白的總濃度為0.05-0.2g/mL; 步驟2，將明膠加入到蛋白混合液中，待明膠完全溶解后，將混合溶液液密封靜置，直至凝膠化，敞口自蒸發(fā)，得到蛋白復(fù)合支架，其中，所述明膠和角蛋白與絲素蛋白總量的質(zhì)量比為(0.1-5):10ο
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述角蛋白為還原型人發(fā)角蛋白，制備方法如下: 將人頭發(fā)置于提取液中，50-150°C下浸泡10-60min，過濾，將濾液透析，濃縮，得到還原型人發(fā)角蛋白，其中，人頭發(fā)的質(zhì)量與提取液的體積的比為(0.5-4g): (5-20mL)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，所述提取液為尿素、十二烷基硫酸鈉、Na2S205的混合水溶液，其中，每lOOmL水中，含有30_70g尿素、40_80g十二烷基硫酸鈉、80-120gNa2S205o
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述絲素蛋白的制備方法如下: 將脫膠蠶絲溶于MX溶液中，過濾，將濾液透析，濃縮，得到純化的絲素蛋白，其中，Μ為堿金屬，X為鹵素。
【文檔編號】A61L27/22GK104307038SQ201310476339
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2013年10月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月12日
【發(fā)明者】馮超, 李喆, 徐月敏, 呂向國 申請人:上海市第六人民醫(yī)院