一種海藻酸－透明質(zhì)酸原位組織工程細胞支架及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種海藻酸－透明質(zhì)酸原位組織工程細胞支架及其制備方法。所述制備方法包括：用生理鹽水或生理緩沖液分別將海藻酸或其衍生物和透明質(zhì)酸或其衍生物配成溶液，將上述兩種溶液中的任意一種與所需載負的細胞混合后，再與剩下的另外一種溶液混合，室溫平衡一段時間后即得海藻酸－透明質(zhì)酸原位組織工程細胞支架。本發(fā)明制備的海藻酸－透明質(zhì)酸原位組織工程細胞支架有效延長了海藻酸和透明質(zhì)酸在體內(nèi)的降解時間，通過適度的分子交聯(lián)大大提高了支架的力學(xué)性能、組織填充/支撐性能，具有良好的安全性、有效性。本發(fā)明提供的海藻酸－透明質(zhì)酸原位組織工程細胞支架的制備方法不涉及有機試劑，反應(yīng)體系簡單溫和，臨床應(yīng)用安全性好。
【專利說明】一種海藻酸一透明質(zhì)酸原位組織工程細胞支架及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料領(lǐng)域，具體涉及一種原位組織工程細胞支架及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著組織工程和再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展，細胞移植或細胞治療已逐漸成為臨床治療的研究熱點。將自體或異體細胞植入病變組織以替代或部分恢復(fù)肌體功能，但對正常細胞或組織無任何副作用，是細胞移植區(qū)別于常規(guī)治療方法的優(yōu)勢。已有許多研究對于細胞移植進行了廣泛探討，而且胰島細胞移植術(shù)治療糖尿病業(yè)已在臨床取得了很好效果，也有報道認為干細胞移植對于腫瘤、神經(jīng)疾病等傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)難以解決的臨床難題具有突破性進展。迄今，細胞移植或細胞治療已經(jīng)作為最有潛力的臨床新技術(shù)，探討用于解決多種臨床難題。
[0003]業(yè)已證實，單純將細胞移植到所需部位后，細胞在位性不強，易分散到其他部位而大大減少在標(biāo)靶部位的有效數(shù)量，不僅造成了種子細胞的浪費而且減弱了治療效果，可控性較差。此外，注入機體內(nèi)的外源性移植細胞由于難以獲得良好的微環(huán)境，活性大大降低同時死亡率提高，也減弱了細胞治療的效果。將細胞負載到支架材料上再植入目標(biāo)部位，則可以提高細胞的在位性并為細胞提供生長支架增加其存活率。將細胞與支架復(fù)合物用于細胞移植主要包括兩種方法:(I)體外組織工程法，即將細胞在體外接種到支架材料上，生長一段時間后用于體內(nèi)移植。該方法的缺點是周期較長，而且支架材料多為片狀、膜狀、海綿狀或其他固態(tài)立體形態(tài)，因此植入手術(shù)窗較大，在一定程度上增加了手術(shù)創(chuàng)傷。(2)體內(nèi)原位組織工程法，即將細胞與支架材料直接復(fù)合或混合，植入目標(biāo)部位后，可在體內(nèi)原位形成細胞-支架復(fù)合物，該方法所用的支架材料多為可注射的水凝膠，屬于微創(chuàng)手術(shù)，創(chuàng)面小，而且可與手術(shù)導(dǎo)航系統(tǒng)聯(lián)用用于介入手術(shù)治療。目前，用于體內(nèi)原位組織工程支架的材料已有許多研究報道，如透明質(zhì)酸、膠原蛋白、纖維蛋白膠、殼聚糖、海藻酸、PLGA、羥基磷灰石、硫酸鈣等，雖然可顯著改善移植細胞`的在位性和存活率，但也存在尚需改進的不足，如天然材料的組織支撐性不足和降解過快、高分子材料和無機材料的組織相容性欠佳等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種可注射型的原位組織工程支架，該支架可用于載負細胞植入特定組織部位進行原位再生修復(fù)，尤其適用于軟組織的再生修復(fù)。
[0005]本發(fā)明的一個目的是提供一種海藻酸一透明質(zhì)酸原位組織工程細胞支架的制備方法，包括以下步驟:
[0006]用生理鹽水或生理緩沖液分別將海藻酸或其衍生物和透明質(zhì)酸或其衍生物配成溶液，得到含海藻酸或其衍生物的溶液和含透明質(zhì)酸或其衍生物的溶液，將上述兩種溶液與所需載負的細胞混合后，室溫平衡一段時間后即得海藻酸一透明質(zhì)酸原位組織工程細胞支架。[0007]所述生理鹽水或生理緩沖液為無菌無熱原的生理鹽水或生理緩沖液。
[0008]所述所需載負的細胞包括生物體所有組織的細胞；優(yōu)選軟組織細胞；
[0009]所述混合的具體過程為:將上述兩種溶液中的任意一種與所需載負的細胞，灌裝入注射器中；將剩下的另外一種溶液灌裝入另外一只注射器中；將上述兩種溶液通過三通注射器混合。
[0010]所述注射器為無菌注射器。 [0011]所述含海藻酸或其衍生物的溶液中，海藻酸或其衍生物的質(zhì)量體積百分濃度為0.5-5.0% ;優(yōu)選的，質(zhì)量體積百分濃度為1.5 — 5.0% ;再優(yōu)選的，質(zhì)量體積百分濃度為
3.0- 5.0% ;最優(yōu)選的，質(zhì)量體積百分濃度為3.0%、4.0%或5.0% ；
[0012]所述含透明質(zhì)酸或其衍生物的溶液中，透明質(zhì)酸或其衍生物的質(zhì)量體積百分濃度為0.5 — 5.0% ;優(yōu)選的，質(zhì)量體積百分濃度為1.5 — 3.5% ;再優(yōu)選的，質(zhì)量體積百分濃度為2 — 3.5% ;最優(yōu)選的，質(zhì)量體積百分濃度為3.5%、2.5%或2.0% ；
[0013]所述質(zhì)量以克單位計算，所述體積以毫升單位計算。
[0014]所述含海藻酸或其衍生物的溶液與所述含透明質(zhì)酸或其衍生物的溶液的體積比為1:4一4:I ;優(yōu)選的，體積比為1:3—3:I ;再優(yōu)選的，體積比為1:3—2:I ;最優(yōu)選的，體積比為 1:3、1:2 或 2:1。
[0015]所述室溫平衡的時間為I 一 50min ;優(yōu)選的，室溫平衡的時間為l_20min ;再優(yōu)選的，室溫平衡的時間為3-5min ;最優(yōu)選的,室溫平衡的時間為3min、4min或5min。
[0016]所述室溫具體為20°C -25°C。
[0017]所述海藻酸或其衍生物重均分子量為5 — 25萬Da ;優(yōu)選的，重均分子量為12 —15萬Da ;最優(yōu)選的，重均分子量為15KD或12KD ;
[0018]所述透明質(zhì)酸或其衍生物重均分子量為100 - 300萬Da ;優(yōu)選的，重均分子量為150 - 250萬Da ;最優(yōu)選的，重均分子量為200萬Da。
[0019]所述海藻酸或其衍生物的Μ/G比例為0.65、醛基化度為0.5 ;所述透明質(zhì)酸或其衍生物醛基化度為0.5。
[0020]所述海藻酸或其衍生物包括海藻酸鈉、海藻酸鉀、海藻酸銨、海藻酸鈣或氧化醛基化海藻酸鈉中的任意一種物質(zhì)或兩種以上物質(zhì)的任意組合；
[0021]所述透明質(zhì)酸或其衍生物包括透明質(zhì)酸鈉、氧化醛基化透明質(zhì)酸鈉或硫化透明質(zhì)酸鈉中的任意一種物質(zhì)或兩種以上物質(zhì)的任意組合。
[0022]本發(fā)明的另一個目的是提供上述任一所述方法制備得到的海藻酸一透明質(zhì)酸原位組織工程細胞支架。
[0023]本發(fā)明的還一個目的是提供海藻酸或其衍生物，和透明質(zhì)酸或其衍生物在制備原位組織工程細胞支架中的應(yīng)用；
[0024]海藻酸或其衍生物，和透明質(zhì)酸或其衍生物作為支架材料在制備原位組織工程中細胞支架中的應(yīng)用。
[0025]所述應(yīng)用中，所述海藻酸一透明質(zhì)酸原位組織工程細胞支架為一次性使用的無菌
女口
廣叩ο
[0026]所述應(yīng)用中，所述海藻酸或其衍生物重均分子量為5 — 25萬Da ;優(yōu)選的，重均分子量為12 — 15萬Da ;最優(yōu)選的，重均分子量為15KD或12KD ；[0027]所述應(yīng)用中，所述透明質(zhì)酸或其衍生物重均分子量為100 - 300萬Da ;優(yōu)選的，重均分子量為150 - 250萬Da ;最優(yōu)選的，重均分子量為200萬Da。
[0028]所述應(yīng)用中，所述海藻酸或其衍生物的Μ/G比例為0.65、醛基化度為0.5 ;所述透明質(zhì)酸或其衍生物醛基化度為0.5。
[0029]所述應(yīng)用中，所述海藻酸或其衍生物包括海藻酸鈉、海藻酸鉀、海藻酸銨、海藻酸鈣或氧化醛基化海藻酸鈉中的任意一種物質(zhì)或兩種以上物質(zhì)的任意組合；
[0030]所述透明質(zhì)酸或其衍生物包括透明質(zhì)酸鈉、氧化醛基化透明質(zhì)酸鈉或硫化透明質(zhì)酸中的任意一種物質(zhì)或兩種以上物質(zhì)的任意組合。
[0031]本發(fā)明的再一個目的是提供用于制備原位組織工程中細胞支架的材料，包含海藻酸或其衍生物，和透明質(zhì)酸或其衍生物。
[0032]所述含海藻酸或其衍生物的溶液中，海藻酸或其衍生物的質(zhì)量體積百分濃度為0.5-5.0% ;優(yōu)選的，質(zhì)量體積百分濃度為1.5 — 5.0% ;再優(yōu)選的，質(zhì)量體積百分濃度為
3.0- 5.0% ;最優(yōu)選的，質(zhì)量體積百分濃度為3.0%、4.0%或5.0% ；
[0033]所述含透明質(zhì)酸或其衍生物的溶液中，透明質(zhì)酸或其衍生物的質(zhì)量體積百分濃度為0.5 — 5.0% ;優(yōu)選的，質(zhì)量體積百分濃度為1.5 — 3.5% ;再優(yōu)選的，質(zhì)量體積百分濃度為2 — 3.5% ;最優(yōu)選的，質(zhì)量體積百分濃度為3.5%、2.5%或2.0% ；
[0034]所述質(zhì)量以克單位計算，所述體積以毫升單位計算。
[0035]所述溶液的溶劑為生理鹽水或生理緩沖液；所述生理鹽水或生理緩沖液為無菌無熱原的生理鹽水或生理緩沖液。
[0036]所述材料中，所述海藻`酸或其衍生物重均分子量為5 — 25萬Da ;優(yōu)選的，重均分子量為12 — 15萬Da ;最優(yōu)選的，重均分子量為15KD或12KD ；
[0037]所述材料中，所述透明質(zhì)酸或其衍生物重均分子量為100 - 300萬Da ;優(yōu)選的，重均分子量為150 - 250萬Da ;最優(yōu)選的，重均分子量為200萬Da。
[0038]所述材料中，所述海藻酸或其衍生物的Μ/G比例為0.65、醛基化度為0.5 ;所述透明質(zhì)酸或其衍生物醛基化度為0.5。
[0039]所述材料中，所述海藻酸或其衍生物包括海藻酸鈉、海藻酸鉀、海藻酸銨、海藻酸鈣或氧化醛基化海藻酸鈉中的任意一種物質(zhì)或兩種以上物質(zhì)的任意組合；
[0040]所述材料中，所述透明質(zhì)酸或其衍生物包括透明質(zhì)酸鈉、氧化醛基化透明質(zhì)酸鈉或硫化透明質(zhì)酸中的任意一種物質(zhì)或兩種以上物質(zhì)的任意組合。
[0041 ] 所述材料還包括說明書，所述說明書中記載有如下內(nèi)容:
[0042]使用前，用生理鹽水或生理緩沖液分別將海藻酸或其衍生物和透明質(zhì)酸或其衍生物配成溶液，得到含海藻酸或其衍生物的溶液和含透明質(zhì)酸或其衍生物的溶液，將上述兩種溶液與所需載負的細胞混合后，室溫平衡一段時間后即得海藻酸一透明質(zhì)酸原位組織工程細胞支架；
[0043]所述含海藻酸或其衍生物的溶液中，海藻酸或其衍生物的質(zhì)量體積百分濃度為0.5-5.0% ;優(yōu)選的，質(zhì)量體積百分濃度為1.5 — 5.0% ;再優(yōu)選的，質(zhì)量體積百分濃度為
3.0- 5.0% ;最優(yōu)選的，質(zhì)量體積百分濃度為3.0%、4.0%或5.0% ；
[0044]所述含透明質(zhì)酸或其衍生物的溶液中，透明質(zhì)酸或其衍生物的質(zhì)量體積百分濃度為0.5 — 5.0% ;優(yōu)選的，質(zhì)量體積百分濃度為1.5 — 3.5% ;再優(yōu)選的，質(zhì)量體積百分濃度為2 — 3.5% ;最優(yōu)選的，質(zhì)量體積百分濃度為3.5%、2.5%或2.0% ；
[0045]所述質(zhì)量以克單位計算，所述體積以毫升單位計算；
[0046]所述生理鹽水或生理緩沖液為無菌無熱原的生理鹽水或生理緩沖液； [0047]所述所需載負的細胞包括生物體所有組織的細胞；優(yōu)選軟組織細胞；再優(yōu)選軟骨組織的細胞；最優(yōu)選成骨細胞MC3T3-E1或心肌細胞H9C2 ；
[0048]所述混合的具體過程為:將上述兩種溶液中的任意一種與所需載負的細胞，灌裝入注射器中；將剩下的另外一種溶液灌裝入另外一只注射器中；將上述兩種溶液通過三通注射器混合；
[0049]所述注射器為無菌注射器；
[0050]所述含海藻酸或其衍生物的溶液與所述含透明質(zhì)酸或其衍生物的溶液的體積比為1:4一4:I ;優(yōu)選的，體積比為1:3—3:I ;再優(yōu)選的，體積比為1:3—2:I ;最優(yōu)選的，體積比為 1:3、1:2 或 2:1 ；
[0051]所述室溫平衡的時間為I — 50min ;優(yōu)選的，室溫平衡的時間為l_20min ;再優(yōu)選的，室溫平衡的時間為3-5min ;最優(yōu)選的,室溫平衡的時間為3min、4min或5min ；
[0052]所述室溫具體為20°C -25°C。
[0053]本發(fā)明采用海藻酸基生物材料和透明質(zhì)酸基生物材料制備一種可注射型的原位組織工程細胞支架。海藻酸和透明質(zhì)酸已作為生物醫(yī)用材料廣泛用于多個臨床科室，具有良好的安全性和有效性。本發(fā)明制備的支架不僅兼具上述兩種材料的良好生物學(xué)性能，與多種細胞、組織具有良好相容性，而且通過適度的交聯(lián)大大提高了支架的力學(xué)性能、組織填充/支撐性能，延長了其在體內(nèi)的降解時間。
[0054]將本發(fā)明制備的原位組織工程細胞支架注入標(biāo)靶部位，可原位形成具有良好力學(xué)性能和空間結(jié)構(gòu)的凝膠支架，該支架載負細胞到所需部位，原位形成細胞-支架復(fù)合物對組織進行再生修復(fù)，不僅可實現(xiàn)微創(chuàng)方式的細胞移植，而且可有效改善移植細胞的在位性，維持細胞活性，有效支撐或填充組織，促進組織修復(fù)；該支架可載負多種細胞用于不同組織尤其是軟組織包括軟骨的修復(fù)。
[0055]本發(fā)明提供的一種海藻酸一透明質(zhì)酸原位組織工程細胞支架的制備方法不涉及有機試劑或有機化學(xué)反應(yīng)，反應(yīng)體系溫和，條件可控，僅通過海藻酸和透明質(zhì)酸衍生化產(chǎn)生的交聯(lián)基團進行相互作用，避免了交聯(lián)劑毒性風(fēng)險，不存在毒性交聯(lián)劑或助劑等殘留問題，大大提高了臨床應(yīng)用的安全性。
[0056]本發(fā)明提供的一種海藻酸一透明質(zhì)酸原位組織工程細胞支架的制備工藝簡單可控，大幅度降低了制備過程中風(fēng)險管理的難度，工藝重復(fù)性好，具有良好的產(chǎn)品轉(zhuǎn)化可行性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0057]圖1為實施例1制備的海藻酸一透明質(zhì)酸原位組織工程支架與成骨細胞MC3T3-E1的相容性實驗結(jié)果。
[0058]圖2為實施例1制備的海藻酸一透明質(zhì)酸原位組織工程支架與心肌細胞H9C2的相容性實驗結(jié)果?！揪唧w實施方式】
[0059]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0060]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0061]下述實施例中的固體液體百分比為質(zhì)量體積百分比，其中，質(zhì)量單位以克(g)計，體積單位以毫升(ml)計；下述實施例中的液體與液體的比值為體積比。
[0062]下述實施例中的成骨細胞MC3T3-E1和心肌細胞H9C2購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。
[0063]實施例1、一種海藻酸一透明質(zhì)酸原位組織工程細胞支架的制備
[0064]采用海藻酸鈉和氧化醛基化透明質(zhì)酸為原料，制備步驟如下:
[0065]I)溶液的配制
[0066]溶液I的配制:稱取海藻酸鈉粉末適量，以生理鹽水配制成4% (w/v)的溶液；所述的海藻酸鈉重均分子量約為15萬Da，Μ/G比例約為0.65。
[0067]溶液2的配制:稱取氧化醛基化透明質(zhì)酸粉末適量，以生理鹽水配制成3.5% (w/v)的溶液；所述的氧化醛基化透明質(zhì)酸重均分子量約為200萬Da，醛基化度約為0.5。
[0068]2)使用前的配制
[0069]將所需載負的細胞共IO6個與0.5ml上述溶液I混合，灌裝入無菌注射器中；將上述溶液2灌裝入另外一只注射器中。
[0070]將上述溶液I和溶液2以體積比2:1比例通過三通注射器混合，室溫平衡3min，可形成所需的海藻酸一透明質(zhì)酸原位組織工程細胞支架與待載負的細胞的混合液。
[0071]實施例2、一種海藻酸一透明質(zhì)酸原位組織工程細胞支架的制備
[0072]采用氧化醛基化海藻酸鈉和透明質(zhì)酸鈉為原料，制備步驟如下:
[0073]I)溶液的配制
[0074]溶液I的配制:稱取氧化醛基化海藻酸鈉粉末適量，以生理鹽水配制成4% (w/v)的溶液；所述的海藻酸鈉重均分子量約為15萬Da，Μ/G比例約為0.65，醛基化度約為0.5。
[0075]溶液2的配制:稱取透明質(zhì)酸鈉粉末適量，以生理鹽水配制成3.5% (w/v)的溶液；所述的透明質(zhì)酸鈉重均分子量約為200萬Da。
[0076]2)使用前的配制
[0077]將所需載負的細胞與上述溶液I混合，灌裝入無菌注射器中；將上述溶液2灌裝入另外一只注射器中。
[0078]將上述溶液I和溶液2以體積比1:3比例通過三通注射器混合，室溫平衡5min，可形成所需的海藻酸一透明質(zhì)酸原位組織工程細胞支架與待載負的細胞的混合液。
[0079]實施例3、一種海藻酸一透明質(zhì)酸原位組織工程細胞支架的制備
[0080]采用氧化醛基化海藻酸鈉和透明質(zhì)酸鈉為原料(原料的重均分子量與實施例2相同)，制備步驟同實施例2，不同的是:
[0081]溶液I的濃度為3.0% (w/v);溶液2的濃度為2.5% (w/v)；
[0082]將溶液I和溶液2以體積比1:2比例通過三通注射器混合，室溫平衡4min，可形成所需的海藻酸一透明質(zhì)酸原位組織工程細胞支架與待載負的細胞的混合液。
[0083]實施例4、一種海藻酸一透明質(zhì)酸原位組織工程細胞支架的制備
[0084]采用海藻酸鈉和氧化醛基化透明質(zhì)酸為原料，制備步驟如下:[0085]I)溶液的配制
[0086]溶液I的配制:稱取海藻酸鈉粉末適量，以生理鹽水配制成5% (w/v)的溶液；所述的海藻酸鈉重均分子量約為12萬Da，M/G比例約為0.65。
[0087]溶液2的配制:稱取氧化醛基化透明質(zhì)酸粉末適量，以生理鹽水配制成2.0% (w/ v)的溶液；所述的氧化醛基化透明質(zhì)酸重均分子量約為200萬Da，醛基化度約為0.5。
[0088]2)使用前的配制
[0089]將所需載負的細胞與上述溶液I混合，灌裝入無菌注射器中；將上述溶液2灌裝入另外一只注射器中。
[0090]將上述溶液I和溶液2以體積比2:1比例通過三通注射器混合，室溫平衡5min， 可形成所需的海藻酸一透明質(zhì)酸原位組織工程細胞支架與待載負的細胞的混合液。
[0091]實施例5、實施例1制備的海藻酸一透明質(zhì)酸原位組織工程細胞支架的細胞相容性和細胞增殖實驗
[0092]按照實施例1所述的使用前的配制方法，將成骨細胞MC3T3-E1、心肌細胞H9C2分別海藻酸一透明質(zhì)酸原位組織工程細胞支架混合。根據(jù)GB/T16886.5-2003規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)方法檢測細胞增殖率，評價該支架對成骨細胞活性的影響，結(jié)果見圖1和圖2。圖1和圖2中， 實驗組使用的細胞支架是按照實施例1所述的使用前的配制方法配制的海藻酸一透明質(zhì)酸原位組織工程細胞支架；對照組采用常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)。
[0093]圖1-2結(jié)果顯示，實驗組與對照組相比，OD值不小于對照組的80%，說明實施例1 制備的支架與成骨細胞、心肌細胞有良好的相容性，并能在一定程度上促進細胞增殖，證實該支架作為原位組織工程支架具有良好的細胞相容性，無細胞毒性，安全性良好。`
【權(quán)利要求】
1.一種海藻酸一透明質(zhì)酸原位組織工程細胞支架的制備方法，包括以下步驟: 用生理鹽水或生理緩沖液分別將海藻酸或其衍生物和透明質(zhì)酸或其衍生物配成溶液，得到含海藻酸或其衍生物的溶液和含透明質(zhì)酸或其衍生物的溶液，將上述兩種溶液與所需載負的細胞混合后，室溫平衡一段時間后即得海藻酸一透明質(zhì)酸原位組織工程細胞支架。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于: 所述含海藻酸或其衍生物的溶液中，海藻酸或其衍生物的質(zhì)量體積百分濃度為0.5 -5.0% ;優(yōu)選的，質(zhì)量體積百分濃度為1.5 — 5.0% ;再優(yōu)選的，質(zhì)量體積百分濃度為3.0 —5.0% ;最優(yōu)選的，質(zhì)量體積百分濃度為3.0^^4.0%或5.0% ； 所述含透明質(zhì)酸或其衍生物的溶液中，透明質(zhì)酸或其衍生物的質(zhì)量體積百分濃度為0.5 - 5.0% ;優(yōu)選的，質(zhì)量體積百分濃度為1.5 — 3.5% ;再優(yōu)選的，質(zhì)量體積百分濃度為2-3.5% ;最優(yōu)選的，質(zhì)量體積百分濃度為3.5%、2.5%或2.0%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述含海藻酸或其衍生物的溶液與所述含透明質(zhì)酸或其衍生物的溶液的體積比為1:4一4:1 ;優(yōu)選的，體積比為1:3—3:1 ;再優(yōu)選的，體積比為1:3 — 2:1 ;最優(yōu)選的，體積比為1:3、1:2或2:1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的方法，其特征在于: 所述海藻酸或其衍生物重均分子量為5 — 25萬Da ;優(yōu)選的，重均分子量為12 — 15萬Da ;最優(yōu)選的，重均分子量為15KD或12KD ； 所述透明質(zhì)酸或其衍生物重均分子量為100 - 300萬Da ;優(yōu)選的，重均分子量為150 —250萬Da ;最優(yōu)選的，重均分子量為200萬Da。`
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的方法,其特征在于: 所述海藻酸或其衍生物包括海藻酸鈉、海藻酸鉀、海藻酸銨、海藻酸鈣或氧化醛基化海藻酸鈉中的任意一種物質(zhì)或兩種以上物質(zhì)的任意組合； 所述透明質(zhì)酸或其衍生物包括透明質(zhì)酸鈉、氧化醛基化透明質(zhì)酸鈉或硫化透明質(zhì)酸鈉中的任意一種物質(zhì)或兩種以上物質(zhì)的任意組合。
6.權(quán)利要求1-6任一所述方法制備得到的海藻酸一透明質(zhì)酸原位組織工程細胞支架。
7.海藻酸或其衍生物，和透明質(zhì)酸或其衍生物在制備原位組織工程細胞支架中的應(yīng)用； 或，海藻酸或其衍生物，和透明質(zhì)酸或其衍生物作為支架材料在制備原位組織工程中細胞支架中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于: 所述海藻酸或其衍生物包括海藻酸鈉、海藻酸鉀、海藻酸銨、海藻酸鈣或氧化醛基化海藻酸鈉中的任意一種物質(zhì)或兩種以上物質(zhì)的任意組合； 所述透明質(zhì)酸或其衍生物包括透明質(zhì)酸鈉、氧化醛基化透明質(zhì)酸鈉或硫化透明質(zhì)酸中的任意一種物質(zhì)或兩種以上物質(zhì)的任意組合。
9.用于制備原位組織工程中細胞支架的材料，包含海藻酸或其衍生物，和透明質(zhì)酸或其衍生物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的材料，其特征在于: 所述材料還包括說明書，所述說明書中記載有如下內(nèi)容: 使用前，用生理鹽水或生理緩沖液分別將海藻酸或其衍生物和透明質(zhì)酸或其衍生物配成溶液，得到含海藻酸或其衍生物的溶液和含透明質(zhì)酸或其衍生物的溶液，將上述兩種溶液與所需載負的細胞混合后，室溫平衡一段時間后即得海藻酸一透明質(zhì)酸原位組織工程細胞支架； 所述含海藻酸或其衍生物的溶液中，海藻酸或其衍生物的質(zhì)量體積百分濃度為0.5 -`5.0% ;優(yōu)選的，質(zhì)量體積百分濃度為1.5 — 5.0% ;再優(yōu)選的，質(zhì)量體積百分濃度為3.0 —`5.0% ;最優(yōu)選的，質(zhì)量體積百分濃度為3.0^^4.0%或5.0% ； 所述含透明質(zhì)酸或其衍生物的溶液中，透明質(zhì)酸或其衍生物的質(zhì)量體積百分濃度為`0.5 - 5.0% ;優(yōu)選的，質(zhì)量體積百分濃度為1.5 — 3.5% ;再優(yōu)選的，質(zhì)量體積百分濃度為2-3.5% ;最優(yōu)選的，質(zhì)量體積百分濃度為3.5%、2.5%或2.0% ； 所述生理鹽水或生理緩沖液為無菌無熱原的生理鹽水或生理緩沖液； 所述所需載負的細胞包括生物體所有組織的細胞；優(yōu)選軟組織細胞；再優(yōu)選軟骨組織的細胞；最優(yōu)選成骨細胞MC3T3-E1或心肌細胞H9C2 ； 所述混合的具體過程為:將上述兩種溶液中的任意一種與所需載負的細胞，灌裝入注射器中；將剩下的另外一種溶液灌裝入另外一只注射器中；將上述兩種溶液通過三通注射器混合； 所述含海藻酸或其衍生物的溶液與所述含透明質(zhì)酸或其衍生物的溶液的體積比為1:4一4:I ;優(yōu)選的，體積比為1:3 —3:I ;再優(yōu)選的，體積比為1:3 —2:I ;最優(yōu)選的，體積比為`1:3、1:2 或 2:1 ； 所述室溫平衡的時間為 I 一 50min ;優(yōu)選的，室溫平衡的時間為l_20min ;再優(yōu)選的，室溫平衡的時間為3-5min ;最優(yōu)選的,室溫平衡的時間為3min、4min或5min。
【文檔編號】A61L27/42GK103550830SQ201310481647
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月15日
【發(fā)明者】位曉娟, 奚廷斐, 顧其勝, 鄭玉峰 申請人:北京大學(xué)