一種基于毛囊干細(xì)胞和硅凝膠敷料的皮膚重建方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種皮膚重建的方法，所述方法以毛囊干細(xì)胞為種子細(xì)胞，以硅凝膠敷料作為新的細(xì)胞移植載體進(jìn)行皮膚重建，包括以下步驟：1）培養(yǎng)擴(kuò)增毛囊干細(xì)胞；2）培養(yǎng)真皮細(xì)胞；3）將步驟1）培養(yǎng)擴(kuò)增的毛囊干細(xì)胞與步驟2）培養(yǎng)的真皮細(xì)胞混合；4）將步驟3）的混合細(xì)胞滴加于硅凝膠敷料上孵育；5）將步驟4）的細(xì)胞和硅凝膠敷料移植到需要皮膚重建的部位。本發(fā)明提供的方法不僅可以在大面積皮膚損傷的治療中重建功能性皮膚，也可以在科研活動(dòng)中為毛囊干細(xì)胞的多潛能性檢測(cè)提供一種簡(jiǎn)便的驗(yàn)證方法。
【專利說(shuō)明】一種基于毛囊干細(xì)胞和硅凝膠敷料的皮膚重建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種基于毛囊干細(xì)胞和硅凝膠敷料的新型皮膚重建方法。
【背景技術(shù)】
[0002]皮膚是哺乳動(dòng)物最大的器官，不僅可以起到隔絕外界病原等有害因素保護(hù)機(jī)體的屏障作用，同時(shí)皮膚中含有豐富的神經(jīng)末梢可以迅速感知環(huán)境變化，此外，在體溫調(diào)節(jié)和水分保持等方面皮膚也同樣發(fā)揮著不可替代的作用。然而，現(xiàn)在面對(duì)諸如燒傷或傳染性疾病導(dǎo)致的皮膚損傷等問(wèn)題時(shí)，皮膚的修復(fù)和再生一直是困擾人類的一大難題。
[0003]毛囊作為皮膚的一個(gè)重要組成部分，在保護(hù)體表、感覺(jué)傳導(dǎo)、毛色膚色決定、表皮再生等多方面也同樣發(fā)揮著重要作用。因此，研究毛囊的結(jié)構(gòu)及功能在皮膚的再生醫(yī)學(xué)、美容、以及疾病治療等方面有著不可忽視的意義。自1990年Cotsarelis等人發(fā)現(xiàn)毛囊干細(xì)胞位于毛囊隆突部以來(lái)，經(jīng)過(guò)二十幾年的深入研究，科研人員發(fā)現(xiàn)分離的單個(gè)毛囊干細(xì)胞就可以體外大量增殖，并分化形成皮膚表皮的各種細(xì)胞類群，說(shuō)明位于毛囊隆突部的毛囊干細(xì)胞在構(gòu)建毛囊的過(guò)程中起到了至關(guān)重要的作用。此外，多個(gè)研究組也已證明毛囊干細(xì)胞直接參與了創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程，能夠形成新的表皮組織。綜合這些結(jié)果不難看出，毛囊干細(xì)胞為皮膚再生研究提供了一個(gè)新的思考方向。
[0004]鑒于皮膚及毛囊重建有著重要的醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景，目前已有多種方法來(lái)進(jìn)行體外的毛囊重建及異種毛囊重建實(shí)驗(yàn)。例如，1993年首次報(bào)道的在毛囊重建實(shí)驗(yàn)中使用最為廣泛的硅膠小室(Chamber)法,還有隨后發(fā)展出來(lái)的皮下注射(Patch)法、夾層(Flap)法、以及新近報(bào)道的支架(Scaffold)方法等。雖然毛囊重建實(shí)驗(yàn)已有多種方法，但是這些方法或多或少存在硬件要求高、操作時(shí)間長(zhǎng)、難度較高、毛囊再生效率低、可重復(fù)性差等缺點(diǎn)，比如硅膠小室(Chamber)法所用移植材料成`本高，手術(shù)操作難度高,重建面積較小,傷口暴露時(shí)間長(zhǎng)；皮下注射(Patch)法由于是皮下注射實(shí)現(xiàn)重建，因此，手術(shù)操作難度高，重建面積有限，效率低，重復(fù)性差；夾層(Flap)法由于是皮膚的分層操作，所以手術(shù)操作難度大，時(shí)間長(zhǎng)，再生效率低，重復(fù)性差；支架(Scaffold)方法所用移植材料成本高、手術(shù)縫合操作時(shí)間較長(zhǎng)，上述這些方法的缺點(diǎn)禁錮了毛囊干細(xì)胞在皮膚再生方面的研究和應(yīng)用。雖然國(guó)內(nèi)外已有商業(yè)出售的人工表皮，但是這種人工皮膚由于缺乏皮脂腺汗腺等附屬結(jié)構(gòu)，移植到患處后缺乏彈性，而且并不能發(fā)揮正常皮膚的完整功能。由此可見(jiàn)，建立一種有效而簡(jiǎn)單的皮膚重建方法是十分必要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]因此，本發(fā)明的目的是提供一種皮膚重建的方法。
[0006]本發(fā)明的目的是采用以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明提供了一種皮膚重建的方法，以毛囊干細(xì)胞為種子細(xì)胞，以硅凝膠敷料作為新的細(xì)胞移植載體進(jìn)行皮膚重建，具體包括以下步驟:1)培養(yǎng)擴(kuò)增毛囊干細(xì)胞；2)培養(yǎng)真皮細(xì)胞；3)將步驟I)培養(yǎng)擴(kuò)增的毛囊干細(xì)胞與步驟2)培養(yǎng)的真皮細(xì)胞混合；4)將步驟3)的混合細(xì)胞滴加于硅凝膠敷料上孵育；5)將步驟4)的細(xì)胞和硅凝膠敷料移植到需要皮膚重建的部位。
[0007]優(yōu)選地，其中所述步驟I)中的毛囊干細(xì)胞來(lái)源于哺乳動(dòng)物毛囊隆突部，優(yōu)選為大鼠觸須。
[0008]優(yōu)選地，所述步驟I)中的毛囊干細(xì)胞和成纖維細(xì)胞按2: 1-1: 2的比例接種到培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。其中，發(fā)揮滋養(yǎng)作用的成纖維細(xì)胞過(guò)多或過(guò)少均會(huì)影響毛囊干細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，因此，毛囊干細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的比例優(yōu)選2: 1-1: 2之間。
[0009]更優(yōu)選地，所述步驟I)中的毛囊干細(xì)胞和成纖維細(xì)胞按1:1的比例接種到培養(yǎng)
皿中培養(yǎng)。
[0010]優(yōu)選地，所述毛囊干細(xì)胞是利用器官培養(yǎng)的方法，采用William’s E完全培養(yǎng)基對(duì)毛囊進(jìn)行培養(yǎng)并分離純化而制備的。
[0011]優(yōu)選地，其中所述步驟2)中的真皮細(xì)胞來(lái)源于新生大鼠，優(yōu)選出生后24小時(shí)內(nèi)的大鼠。
[0012]優(yōu)選地，步驟3)還包括在混合前，將毛囊干細(xì)胞和真皮細(xì)胞分別使用DMEM/F12重懸的步驟；
[0013]其中，所述DMEM/F12培養(yǎng)基是實(shí)驗(yàn)室常用的培養(yǎng)基，為DMEM培養(yǎng)基和F12培養(yǎng)基按1:1的比例結(jié)合，稱為DMEM/F12培養(yǎng)基。在本申請(qǐng)的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，所述DMEM/F12培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司。
[0014]優(yōu)選地,步驟3)還包括混勻后,加入基質(zhì)膠(Matrigel)的步驟；優(yōu)選地,所述基質(zhì)膠在冰上溶解；優(yōu)選地，將所述基質(zhì)膠與細(xì)胞混合液按體積比1: 2-1: 4混合；更優(yōu)選地，所述基質(zhì)膠與細(xì)胞混合液的體積之比為1: 3。其中，根據(jù)基質(zhì)膠本身的性質(zhì)，基質(zhì)膠濃度越大凝結(jié)越明顯，不利于細(xì)胞的均勻混合，濃度過(guò)低則不能有效輔助制成膠凍狀，因此，基質(zhì)膠與細(xì)胞混合液適宜體積比在1: 2-1: 4之間。
[0015]其中，所述基質(zhì)膠購(gòu)自BD Biosciences公司。
[0016]優(yōu)選地，所述步驟3)中毛囊干細(xì)胞和真皮細(xì)胞的混合比例為1: 1-1: 10，優(yōu)選1:4-1: 6，更優(yōu)選 1: 5。
[0017]優(yōu)選地，將所述步驟5)中的重懸液吹成膠凍狀，優(yōu)選地，在超凈工作臺(tái)中以
0.2-0.5m/s的低風(fēng)速將所述重懸液吹15-25分鐘至形成膠凍狀即可，優(yōu)選地，在超凈工作臺(tái)中以0.3m/s的低風(fēng)速將所述重懸液吹15-25分鐘至形成膠凍狀即可。
[0018]優(yōu)選地，所述硅凝膠敷料為醫(yī)用自粘性硅凝膠敷料，所述醫(yī)用自粘性硅凝膠敷料優(yōu)選為醫(yī)用自粘性硅凝膠膜或醫(yī)用自粘性硅凝膠貼。
[0019]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中優(yōu)選使用購(gòu)自美國(guó)Biodermis公司的硅膠貼。
[0020]優(yōu)選地，步驟5)中使用醫(yī)用粘合劑將硅凝膠敷料與需要皮膚重建的部位粘合；優(yōu)選地，所述粘合劑為軟組織醫(yī)用粘合劑，優(yōu)選地，所述醫(yī)用粘合劑為α -氰基丙烯酸正丁酯。
[0021]優(yōu)選地，所述方法還包括用綠色熒光蛋白標(biāo)記毛囊干細(xì)胞的步驟；
[0022]優(yōu)選地，所述綠色熒光蛋白標(biāo)記毛囊干細(xì)胞是通過(guò)慢病毒感染法。[0023]此外，本發(fā)明提供了上述方法在皮膚損傷治療中用于重建皮膚的用途；優(yōu)選地，所述皮膚損傷包括燒傷或燙傷。[0024]本發(fā)明還提供了上述方法重建的皮膚類產(chǎn)品，例如表皮。
[0025]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，涉及的主要技術(shù)路線包括:
[0026](I)大鼠隆突部毛囊干細(xì)胞復(fù)蘇擴(kuò)增及綠色熒光標(biāo)記細(xì)胞
[0027](2)新生大鼠真皮細(xì)胞的制備
[0028]( 3 )硅凝膠敷料和待移植細(xì)胞準(zhǔn)備
[0029](4)皮膚重建手術(shù)
[0030](5)形態(tài)學(xué)觀察
[0031]本發(fā)明具有以下的有益效果:
[0032]1.硅凝膠敷料的使用簡(jiǎn)化了手術(shù)操作并大大縮短傷口暴露時(shí)間，避免感染；
[0033]2.用含基質(zhì)膠的-DMEM/12培養(yǎng)液作為移植細(xì)胞的支持環(huán)境，細(xì)胞移植后易存活，提高了皮膚重建的成功率；
[0034]3.本方法成本低，成功率高，硅凝膠敷料和醫(yī)用粘合劑價(jià)廉易得，大大提高了操作的可重復(fù)性、可操作性；
[0035]4.利用毛囊干細(xì)胞和真皮細(xì)胞的移植，實(shí)現(xiàn)了裸鼠背部全皮缺失后的皮膚重建；
[0036]5.將毛囊干細(xì)胞用綠色熒光蛋白標(biāo)記，便于對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行跟蹤定位；
[0037]6.手術(shù)中利用醫(yī)用粘`合劑取代針線縫合固定硅凝膠敷料，將小鼠創(chuàng)傷降到最低，并排除縫合造成的傷口修復(fù)對(duì)毛囊重建過(guò)程的影響以及避免拆除縫合線的過(guò)程，進(jìn)一步簡(jiǎn)化了手術(shù)操作。
[0038]此外，由于整個(gè)移植手術(shù)過(guò)程操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)少，再加上毛囊干細(xì)胞在體外增殖能力強(qiáng)，以及真皮細(xì)胞容易獲取等特點(diǎn)，因而，本發(fā)明具有較強(qiáng)的實(shí)際應(yīng)用前景和科研價(jià)值，不僅可以在皮膚損傷的治療中功能性皮膚的重建方面發(fā)揮作用，也可以在科學(xué)基礎(chǔ)研究中為毛囊干細(xì)胞的多潛能性驗(yàn)證方面提供更簡(jiǎn)便易行的方法。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0039]以下，結(jié)合附圖來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方案，其中:
[0040]圖1是本發(fā)明中毛囊重建過(guò)程示意圖，即綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記的毛囊干細(xì)胞與新生大鼠真皮細(xì)胞混合后滴加于硅膠貼上，然后移植到裸鼠的背部創(chuàng)口處。
[0041]圖2是手術(shù)后4周裸鼠背部明顯長(zhǎng)出的新毛；B圖是A圖所示裸鼠背部的俯拍圖，可見(jiàn)綠色虛線框所示的創(chuàng)傷愈合區(qū)域中已長(zhǎng)出不同于裸鼠自身畸形毛發(fā)的新毛；C圖為A圖的局部放大圖。
[0042]圖3是手術(shù)后4周在熒光體視鏡下拍到的裸鼠背部創(chuàng)傷愈合區(qū)域的局部放大圖，可見(jiàn)圖2B中長(zhǎng)毛區(qū)域相較于外周的非創(chuàng)傷皮膚呈現(xiàn)明顯綠色，說(shuō)明這一區(qū)域正是由毛囊干細(xì)胞參與重建的皮膚組織圖為A圖中白色虛線框的局部放大圖，可見(jiàn)毛干基部有綠色亮斑，說(shuō)明此毛囊是由移植的綠色熒光蛋白標(biāo)記的毛囊干細(xì)胞重建而來(lái)。
[0043]圖4是手術(shù)后4周裸鼠背部創(chuàng)口及附近皮膚冰凍切片后，在熒光顯微鏡下觀察到的由綠色熒光蛋白標(biāo)記的毛囊干細(xì)胞分化形成的表皮、毛囊、和皮脂腺結(jié)構(gòu)。
【具體實(shí)施方式】
[0044]以下參照具體的實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，其不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0045]在以下的實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過(guò)程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。所用試劑的來(lái)源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時(shí)標(biāo)明，其后所用相同試劑如無(wú)特殊說(shuō)明，均以首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。
[0046]以下實(shí)施例中，新生大鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，是出生后24小時(shí)內(nèi)的，不區(qū)分雌雄；裸鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，是大于7周齡的雌鼠。
[0047]實(shí)施例1大鼠隆突部毛囊干細(xì)胞制備
[0048]皮膚重建所需要的毛囊干細(xì)胞的來(lái)源有多種途徑，例如根據(jù)毛囊干細(xì)胞標(biāo)記分子以流式細(xì)胞分選的手段獲得，或通過(guò)組織器官培養(yǎng)的方法獲得。
[0049]本實(shí)施例以成年大鼠觸須毛囊干細(xì)胞為例，詳細(xì)說(shuō)明制備作為本發(fā)明毛囊重建的種子細(xì)胞的方法，具體如下。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)和使用按照中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所動(dòng)物與醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的規(guī)定執(zhí)行。
[0050]1.大鼠觸須毛囊的顯微剝離:取一小塊成年Wistar大鼠(中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所)觸須部皮膚，用75%酒精消毒3-5分鐘；在體視鏡下，用鑷子夾住觸須毛囊靠近表皮的峽部，向真皮方向用力撕出毛囊；用29G針頭固定住毛囊，用解剖刀小心劃破真皮鞘，并將毛囊剝離出來(lái)，切斷真皮乳頭和真皮鞘間的連接。
[0051]2.用William’s E完全培養(yǎng)基培養(yǎng)毛囊:(I)配制William’s E完全培養(yǎng)基。向William’ s E基本培養(yǎng)基(購(gòu)自Gibco公司)中添加以下因子,各種因子的最終濃度為:10納克/毫升的表皮生長(zhǎng)因子，5微克/毫升的胰島素，I微克/毫升的氫化可的松，5.8毫摩爾/升的L-谷氨酰胺，0.115微克/毫 升的維生素A，I微克/毫升的維生素D2，I微克/毫升的轉(zhuǎn)鐵蛋白，100納克/毫升的亞油酸，20微克/毫升的牛血清白蛋白，200單位/毫升的青霉素鈉，200單位/毫升的硫酸鏈霉素。向添加因子后的William’ s E培養(yǎng)基中加體積百分含量為15%的胎牛血清，即為William’ s E完全培養(yǎng)基。(2)將毛囊轉(zhuǎn)入6孔培養(yǎng)板，加William’s E完全培養(yǎng)基，37°C、5%C02、100%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。毛囊一般在第3-7天貼壁，然后毛囊干細(xì)胞會(huì)從隆突部爬出，細(xì)胞邊緣明亮，緊密排列，為典型角質(zhì)細(xì)胞特征。
[0052]3.毛囊干細(xì)胞的純化:毛囊干細(xì)胞具有貼壁緊的特點(diǎn)，利用這一特點(diǎn)，在室溫25°C左右，用消化液(含有質(zhì)量百分含量為0.1%的胰蛋白酶和0.008%的EDTA的磷酸鹽緩沖液)消化時(shí)，成纖維細(xì)胞會(huì)被消化下來(lái)，而干細(xì)胞克隆仍貼在培養(yǎng)板上。用磷酸鹽緩沖液小心將消化下來(lái)的成纖維細(xì)胞收集起來(lái)，離心后可以傳代或凍存，以備用于與毛囊干細(xì)胞的共培養(yǎng)，為干細(xì)胞提供與體內(nèi)相似的模擬環(huán)境，有利于干細(xì)胞的生長(zhǎng)。再向培養(yǎng)板中加消化液，轉(zhuǎn)到37°C培養(yǎng)箱繼續(xù)消化3-5分鐘，用磷酸鹽緩沖液收集消化下來(lái)的毛囊干細(xì)胞，離心后可以傳代或凍存。
[0053]4.毛囊干細(xì)胞的傳代和增殖:將單根毛囊生長(zhǎng)出的毛囊干細(xì)胞和成纖維細(xì)胞按照I: I的比例接種到IOcm培養(yǎng)皿中，加William’ S E完全培養(yǎng)基，37°C、5%C02、100%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2-3天更換培養(yǎng)液,大約2周后細(xì)胞長(zhǎng)滿,可繼續(xù)傳代或在液氮中凍存?zhèn)溆谩?br> [0054]實(shí)施例2干細(xì)胞熒光標(biāo)記[0055]1.毛囊干細(xì)胞的準(zhǔn)備:復(fù)蘇實(shí)施例1中制備并凍存的成年大鼠觸須毛囊干細(xì)胞，按照建立的毛囊干細(xì)胞培養(yǎng)體系，接種少量成纖維細(xì)胞做滋養(yǎng)層細(xì)胞，用William’s E完全培養(yǎng)基在37°C、5%C02、100%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0056]2.毛囊干細(xì)胞用綠色熒光蛋白標(biāo)記:恢復(fù)性生長(zhǎng)24小時(shí)后，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好；加入帶有綠色熒光蛋白基因的慢病毒儲(chǔ)存液(購(gòu)自Invitrogen公司)，感染24小時(shí)后，換為新鮮William’ s E完全培養(yǎng)基，48小時(shí)可以觀察到綠色細(xì)胞。
[0057]3.綠色熒光蛋白標(biāo)記的毛囊干細(xì)胞的純化和擴(kuò)增:首先利用毛囊干細(xì)胞貼壁緊的特點(diǎn)，用消化液(質(zhì)量百分含量為0.1%的胰蛋白酶+0.008%的EDTA的磷酸鹽緩沖液)在室溫下消化，顯微鏡下觀察，待成纖維細(xì)胞脫落后，用磷酸鹽緩沖液(pH為7.3左右)將成纖維細(xì)胞洗掉，剩余仍然貼壁的都是毛囊干細(xì)胞；然后加消化液在37°C繼續(xù)消化，收集毛囊干細(xì)胞；用適量磷酸鹽緩沖液重懸，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分選，只保留綠色熒光較強(qiáng)的細(xì)胞；將分選出的高表達(dá)綠色熒光蛋白的毛囊干細(xì)胞接種到IOcm細(xì)胞培養(yǎng)皿中擴(kuò)增，加少量成纖維細(xì)胞做共培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為William’ s E完全培養(yǎng)基在37°C、5%C02、100%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2-3天更換一次培養(yǎng)液，將綠色熒光蛋白標(biāo)記的毛囊干細(xì)胞增殖到需要的細(xì)胞量備用。
[0058]實(shí)施例3新生大鼠真皮細(xì)胞的制備
[0059]將出生后24小時(shí)之內(nèi)的大鼠冰中處死后，用75%酒精浸泡消毒3_5分鐘，隨后在超凈工作臺(tái)中操作，先用無(wú)菌生理鹽水洗2遍，使用消毒后的剪刀和鑷子將整個(gè)背部的皮膚剪下，用生理鹽水洗一遍，然后用解剖刀輕刮去皮下脂肪，隨后用生理鹽水洗7遍。將皮膚表皮朝上鋪于培養(yǎng)皿內(nèi)，小心加入消化液(0.25%的胰酶和Dispase酶(Gibco公司)體積比1: 1)，使皮膚漂于液面，4°C消化過(guò)夜。第二天揭去表皮，將真皮部分置于四型膠原酶中37°C消化45min。用400目的篩布過(guò)濾消化后的真皮細(xì)胞懸液，收集濾過(guò)的單細(xì)胞懸液，1000rpm, IOmin離心收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)，用DMEM/F12重懸后備用。
[0060]實(shí)施例4硅凝膠料和待移植細(xì)胞準(zhǔn)備
`[0061]1.預(yù)先購(gòu)買(mǎi)硅凝膠敷料(美國(guó)Biodermis公司所生產(chǎn)的硅膠貼產(chǎn)品)，撕去包裝后，裁剪成直徑3.5cm左右的圓片，浸泡于75%的酒精中待用；使用前取出，于超凈臺(tái)中吹干，再用DMEM/F12培養(yǎng)液浸泡涮洗，最后放置于IOcm的培養(yǎng)皿中備用。
[0062]2.將培養(yǎng)的綠色熒光標(biāo)記的成年大鼠觸須毛囊干細(xì)胞用0.1%的胰酶在室溫下消化，用磷酸緩沖液洗掉滋養(yǎng)層成纖維細(xì)胞；加0.25%的胰酶在37°C繼續(xù)消化，收集毛囊干細(xì)胞，計(jì)數(shù)后用DMEM/F12重懸后備用。
[0063]3.將毛囊干細(xì)胞與真皮細(xì)胞以1: 5的比例混合，3.5X106個(gè)毛囊干細(xì)胞和
1.8X IO7個(gè)真皮細(xì)胞用DMEM/F12培養(yǎng)基混合為一份，用于一只裸鼠的移植；混勻兩種細(xì)胞，而后再與冰上溶解的基質(zhì)膠混勻；將以上液體滴加到已吹干及漂洗過(guò)的硅膠貼上，形成直徑1.5厘米的液滴，置于37°C培養(yǎng)箱中孵育2小時(shí)；取出后打開(kāi)培養(yǎng)皿上蓋，在超凈工作臺(tái)中以0.3m/s的低風(fēng)速吹約20分鐘至形成膠凍狀，置于冰上待移植。
[0064]實(shí)施例5皮膚重建手術(shù)
[0065]1.手術(shù)操作臺(tái)提前用紫外線消毒，手術(shù)器械用高壓滅菌消毒；裸鼠腹部皮膚消毒，腹腔注射經(jīng)過(guò)過(guò)濾除菌的麻醉劑；待裸鼠麻醉后，注射適量青霉素-鏈霉素溶液；整個(gè)背部皮膚依次用碘伏和75%酒精擦拭消毒，使用環(huán)形印章沓出外徑1.5厘米的空心圓，用眼科剪沿此圓圈外剪出創(chuàng)口，將皮下結(jié)締組織清除干凈，露出肌肉層；小心地用鑷子夾起已準(zhǔn)備好的附有細(xì)胞的硅膠貼，細(xì)胞面朝向傷口，迅速置于裸鼠背部創(chuàng)傷處；使用醫(yī)用膠水將硅膠貼邊緣與裸鼠背皮粘合，最后用醫(yī)用絲綢膠帶包扎一圈半，以加固硅膠貼；整個(gè)過(guò)程要求無(wú)菌操作。
[0066]2.手術(shù)I周后，裸鼠背上的硅膠貼基本自然脫落，傷口逐漸愈合；定期觀察裸鼠傷口愈合及長(zhǎng)毛情況。
[0067]實(shí)施例6形態(tài)學(xué)觀察
[0068]1.手術(shù)4周后，麻醉裸鼠后，在熒光體視鏡下觀察裸鼠背部；并可以取背部疤痕部位皮膚，立即轉(zhuǎn)移到-80°C保存；用冰凍切片包埋劑(OCT)包埋皮膚組織，冰凍切片，切片厚度40微米。
[0069]2.用4%的中性多聚甲醛溶液于室溫固定10分鐘，磷酸緩沖液洗3遍，用防淬滅劑DABCO封片，-20°C保存；用熒光顯微鏡觀察時(shí)，綠色的組織即為綠色熒光蛋白標(biāo)記的毛囊干細(xì)胞分化形成的組織，可以發(fā)現(xiàn)毛囊干細(xì)胞已經(jīng)成功分化為結(jié)構(gòu)正常的表皮、毛囊和皮脂腺。
[0070]其中，圖2中A圖是手術(shù)后4周裸鼠背部明顯長(zhǎng)出的新毛；B圖是A圖所示裸鼠背部的俯拍圖，可見(jiàn)綠色虛線框所示的創(chuàng)傷愈合區(qū)域中已長(zhǎng)出不同于裸鼠自身畸形毛發(fā)的新毛；C圖為A圖的局部放大圖。圖3中A圖是手術(shù)后4周在熒光體視鏡下拍到的裸鼠背部創(chuàng)傷愈合區(qū)域的局部放大圖，可見(jiàn)圖2B中長(zhǎng)毛區(qū)域相較于外周的非創(chuàng)傷皮膚呈現(xiàn)明顯綠色，說(shuō)明這一區(qū)域正是由毛囊干細(xì)胞參與重建的皮膚組織；B圖為A圖中白色虛線框的局部放大圖，可見(jiàn)毛干基部有綠色亮斑，說(shuō)明此毛囊是由移植的綠色熒光蛋白標(biāo)記的毛囊干細(xì)胞重建而來(lái)。圖4是手術(shù)后 4周裸鼠背部創(chuàng)口及附近皮膚冰凍切片后，在熒光顯微鏡下觀察到的由綠色熒光蛋白標(biāo)記的毛囊干細(xì)胞分化形成的表皮、毛囊、和皮脂腺結(jié)構(gòu)。
【權(quán)利要求】
1.一種皮膚重建的方法，所述方法以毛囊干細(xì)胞為種子細(xì)胞，以硅凝膠敷料作為細(xì)胞移植載體進(jìn)行皮膚重建，包括以下步驟: 1)培養(yǎng)擴(kuò)增毛囊干細(xì)胞； 2)培養(yǎng)真皮細(xì)胞； 3)將步驟I)培養(yǎng)擴(kuò)增的毛囊干細(xì)胞與步驟2)培養(yǎng)的真皮細(xì)胞混合； 4)將步驟3)的混合細(xì)胞滴加于硅凝膠敷料上孵育； 5)將步驟4)的細(xì)胞和硅凝膠敷料移植到需要皮膚重建的部位。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述步驟I)中的毛囊干細(xì)胞來(lái)源于哺乳動(dòng)物毛囊隆突部，優(yōu)選為大鼠觸須。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中將所述步驟I)中的毛囊干細(xì)胞和成纖維細(xì)胞按2: 1-1: 2的比例接種到培養(yǎng)皿中培養(yǎng)； 優(yōu)選地，所述步驟I)中的毛囊干細(xì)胞和成纖維細(xì)胞按1:1的比例接種到培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述毛囊干細(xì)胞是利用器官培養(yǎng)的方法，采用William’ s E完全培養(yǎng)基對(duì)毛囊進(jìn)行培養(yǎng)并分離純化而制備的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述步驟2)中的真皮細(xì)胞來(lái)源于新生大鼠，優(yōu)選24小時(shí)內(nèi)出生的新生大鼠。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟3)還包括在混合前，將毛囊干細(xì)胞和真皮細(xì)胞分別使用DMEM/F12重懸的步驟； 優(yōu)選地，步驟3)還包括混勻后，加入基質(zhì)膠的步驟；優(yōu)選地，所述基質(zhì)膠在冰上溶解；優(yōu)選地，將所述基質(zhì)膠與細(xì)胞混合液按體積比1: 2-1: 4混合；更優(yōu)選地，所述基質(zhì)膠與細(xì)胞混合液的體積之比為1: 3; 優(yōu)選地，所述步驟3)中毛囊干細(xì)胞和真皮細(xì)胞的混合比例為1: 1-1: 10，更優(yōu)選1:4-1: 6，最優(yōu)選 1: 5。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的方法，其中將所述步驟5)中的重懸液吹成膠凍狀；優(yōu)選地，在超凈工作臺(tái)中以0.2-0.5m/s的風(fēng)速將所述重懸液吹15-25分鐘至形成膠凍狀即可，優(yōu)選地，所述風(fēng)速為0.3m/s。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述硅凝膠敷料為醫(yī)用自粘性硅凝膠敷料，所述醫(yī)用自粘性硅凝膠敷料優(yōu)選為醫(yī)用自粘性硅凝膠膜或醫(yī)用自粘性硅凝膠貼； 優(yōu)選地，步驟5)中使用醫(yī)用粘合劑將硅凝膠敷料與需要皮膚重建的部位粘合；優(yōu)選地，所述粘合劑為軟組織醫(yī)用粘合劑，優(yōu)選地，所述醫(yī)用粘合劑為α-氰基丙烯酸正丁酯。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述方法還包括用綠色熒光蛋白標(biāo)記毛囊干細(xì)胞的步驟；優(yōu)選地，所述綠色熒光蛋白標(biāo)記毛囊干細(xì)胞是通過(guò)慢病毒感染法。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的方法重建的皮膚類產(chǎn)品。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的皮膚類產(chǎn)品在制備用于治療皮膚損傷的產(chǎn)品中的用途，優(yōu)選地，所述皮膚損傷包括燒傷或燙傷。
【文檔編號(hào)】A61L27/38GK103550828SQ201310487717
【公開(kāi)日】2014年2月5日 申請(qǐng)日期:2013年10月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月17日
【發(fā)明者】段恩奎, 趙華山, 張會(huì)閃, 張守兵, 喬靜巧 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所