一種新型抗癌藥物羥乙基淀粉-多西紫杉醇偶聯(lián)物制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種羥乙基淀粉-多西紫杉醇偶聯(lián)物的制備方法。該方法以羥乙基淀粉為基本骨架，丁二酸酐為偶聯(lián)劑，將羥乙基淀粉和多西紫杉醇以酯鍵形式偶聯(lián)起來，得到一種具有良好生物相容性的羥乙基淀粉-多西紫杉醇偶聯(lián)物。與多西紫杉醇原料藥相比，該偶聯(lián)物顯著提高了多西紫杉醇在水中的溶解度(約1000～3000倍)。同時(shí)偶聯(lián)物中的羥乙基淀粉還明顯改善了多西紫杉醇的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，具有體內(nèi)長循環(huán)特征。在小鼠荷瘤乳腺癌EMT-6模型實(shí)驗(yàn)中，相比多西紫杉醇原料藥，該偶聯(lián)物明顯增強(qiáng)了對(duì)皮下移植腫瘤的抑制作用。
【專利說明】ー種新型抗癌藥物羥乙基淀粉-多西紫杉醇偶聯(lián)物制備方
法
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001]本發(fā)明涉及生物相容和生物降解類新型藥物載體，具體涉及ー種以羥乙基淀粉為基本骨架，以丁二酸為連接臂，制備羥乙基淀粉-多西紫杉醇偶聯(lián)物的方法和應(yīng)用。
[0002]發(fā)明背景:
[0003]多西紫杉醇(Docetaxel，DTX)是繼紫杉醇后又ー種新型的抗癌藥物。該藥物的作用機(jī)制是提高加強(qiáng)微管蛋白聚合作用和抑制微管解聚作用，阻滯細(xì)胞于G和M期，從而抑制癌細(xì)胞的有絲分裂和增通(F.V.Fossella et al., Phase II study of docetaxel foradvanced or metastatic platinum-refractory non-small—cell lung cancer.Journalof Clinical Oncology, 1995,13,645-651)。與紫杉醇相比，在體外抗瘤活性實(shí)驗(yàn)中，已證實(shí)多西紫杉醇的活性是紫杉醇的1.3~12倍(S.Noguchi, Predictive factors forresponse to aocetaxel in numan breast cancers?しancer bcience,200d,97,813-820)。目前已獲得FDA批準(zhǔn)用于臨床上治療乳腺癌、卵巣癌、非小細(xì)胞肺癌和前列腺癌等。由于多西紫杉醇在水中的溶解性較差( 小于I U g/ml)，極大的影響了藥效的發(fā)揮，目前上市的劑型多利用非離子型表面活性劑吐溫-80增溶，經(jīng)13%的こ醇稀釋后注射使用。但是吐溫-80具有溶血性且粘度較大，在臨床應(yīng)用中，以發(fā)現(xiàn)該制劑具有外周神經(jīng)毒性和肌肉骨骼毒性，以及中性粒細(xì)胞減少等一系列過敏反應(yīng)(J.Baker, et al., Docetaxel-relatedside effects and their management.European Journal of Oncology Nursing,2009,13,49-59)。另外，由于小分子抗癌藥物在體內(nèi)分布廣泛，尤其是在正常器官和組織中有較多的分布，不僅給患者帶來了痛苦，更影響了藥物利用度。因此解決多西紫杉醇的水溶性問題，控制該藥物釋放速率和靶向性，對(duì)于提高多西紫杉醇抗癌藥效具有重要意義。
[0004]天然多糖類聚合物具有良好的生物相容性和生物降解性，作為藥物載體，可有效避免和降低載體本身帶來的毒副作用。然而，普通天然多糖同樣具有水溶性較差的問題，例如殼聚糖只能在酸性條件下溶解，而纖維素在水溶液和一般溶液下都不能溶解。作為藥物載體，天然多糖不僅在負(fù)載水溶性藥物，而且在負(fù)載脂溶性藥物方面均存在一定的局限性。為此，通常采用聚乙二醇(PEG)對(duì)天然多糖類藥物載體進(jìn)行表面親水修飾。需要指出的是，這種PEG親水修飾作用往往也帶來細(xì)胞攝取的減少和胞內(nèi)釋放的降低，即所謂“PEG兩難困境，，(PEG-dilemma)現(xiàn)象(H.Hatakeyama et al., A multifunctional envelopetype nano device(MEND)for gene delivery to tumours based on the EPR eftect:astrategy for overcoming the PEG dilemma.Advanced Drug Delivery Reviews,2011,63,152-160)。另外，PEG本身不能被降解，且連續(xù)使用容易產(chǎn)生副作用(R.Webster et al.，PEb ana PEb conjugates toxicity:towards an understanding of the toxicity of PEband its relevance to PEGylated biological.PEGylated Protein Drugs:Basic Scienceand Clinical Applications, Series !Milestones in Drug Therapy, Birkhauser, , Basel2009，127-146)。
[0005]輕乙基淀粉(Hydroxyethyl starch,以下簡記為HES)是ー種天然多糖(高分支支鏈淀粉)經(jīng)酸水解、并與環(huán)氧乙烷反應(yīng)(羥乙基化)的產(chǎn)物。與一般天然多糖不同，HES不僅具有良好的水溶性，還具有良好的生物降解性。！ES本身就是ー種血漿擴(kuò)容劑，進(jìn)入體內(nèi)后能夠迅速擴(kuò)張血漿容量，并能夠在血管內(nèi)停留足夠長的時(shí)間維持血壓，是目前治療低血容量和休克的首選藥物。另外，HES還具有良好的局部和系統(tǒng)耐受性(J.Waitzinger et al.，Hydroxyethyl starch (HES)[130/0.4], a new HES specification.Drugs in R &D,2003,4，149-158)。人體內(nèi)每天使用的最大劑量可達(dá)1.2g/kg，且沒有副作用。在進(jìn)入血液之后，HES被血漿a -淀粉酶逐漸水解，平均分子量不斷的下降，最后被腎小球?yàn)V過通過尿液排出體外(し.Jungheinrich et al., Pharmacokinetics of hydroxyethyl starch.しlinica丄Pharmacokinetics, 2005，44，681-699)。目前關(guān)于HES作為藥物載體的研究甚少，尤其是作為負(fù)載脂溶性藥物的載體尚未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供ー種新型抗癌藥物羥乙基淀粉-多西紫杉醇偶聯(lián)物的制備方法。
[0007]實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案是:
[0008]本發(fā)明提供的羥乙基淀粉-多西紫杉醇偶聯(lián)物的制備方法，包括以下步驟:
[0009]步驟ー:令多西紫杉醇與丁二酸酐反應(yīng)生成多西紫杉醇_2’ 丁二酸酯；
[0010]步驟二:令對(duì)甲苯磺酸與4-二甲氨基吡啶反應(yīng)生成二甲氨基吡啶對(duì)甲苯磺酸鹽；
[0011]步驟三:以羥乙基淀粉為基本骨架，在二甲氨基吡啶對(duì)甲苯磺酸鹽和1-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)-碳化二亞胺的催化下，令羥乙基淀粉和紫杉醇-2’ 丁二酸酯發(fā)生酷化反應(yīng)生成羥乙基淀粉-多西紫杉醇偶聯(lián)物。
[0012]上述步驟一所述的令多西紫杉醇與丁二酸酐反應(yīng)生成紫杉醇_2’ 丁二酸酯的具體方法是:將多西紫杉醇，丁二酸酐和4`-二甲氨基吡啶加入到反應(yīng)容器中，封ロ后抽真空2h，多西紫杉醇、丁二酸酐和4-二甲氨基吡啶的用量摩爾比為2.5: 3: I;然后將吡啶混合在二氯甲烷中注入反應(yīng)容器，室溫反應(yīng)3h后加入甲醇終止反應(yīng)得反應(yīng)混合液，其中多西紫杉醇與吡啶的用量摩爾體積比為1: 2(單位為mol: L)，吡唆、二氯甲烷和甲醇的里量體積比為2.5: 5: I ;將得到的反應(yīng)混合液用濃度為2mol/L的HCl水溶液和飽和食鹽水依次萃取一次，得到有機(jī)相I和水相I ;有機(jī)相I再用配制好的HCl水溶液和飽和食鹽水分別重復(fù)萃取2次，將各次所得水相合并得到水相II ;水相II再用二氯甲烷萃取I次，得到有機(jī)相II，將有機(jī)相I和有機(jī)相II合并后，用無水硫酸鈉干燥，蒸去有機(jī)溶剤，以甲醇/ 二氯甲烷(I: 10，v/v)為流動(dòng)相，通過硅膠柱層析分離，得到白色固體狀多西紫杉醇_2’ 丁二酸酷。所述的HCl水溶液的配制方法是:取濃鹽酸15ml，用一次水稀釋至100ml，得到2mol/L的HCl水溶液；所述的飽和食鹽水的配制方法是:取氯化鈉36g溶解在100ml —次水中，攪拌均勻得到飽和食鹽水。
[0013]上述步驟二所述的令對(duì)甲苯磺酸與4-二甲氨基吡啶反應(yīng)生成二甲氨基吡啶對(duì)甲苯磺酸鹽的具體方法是:將對(duì)甲苯磺酸和4-二甲氨基吡啶溶解在四氫呋喃中，于40~60°C下反應(yīng)2h，其中對(duì)甲苯磺酸和4-二甲氨基吡啶的用量摩爾比為1: 1，對(duì)甲苯磺酸和四氫呋喃的用量摩爾體積比為1: 3(單位為mol: L)，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，過濾得到白色沉淀物，該白色沉淀物經(jīng)二氯甲烷中重結(jié)晶，再于40°C真空干燥，得到針狀固態(tài)的二甲氨基吡啶對(duì)甲苯磺酸鹽。
[0014]上述步驟三所述的以羥乙基淀粉為基本骨架，在二甲氨基吡啶對(duì)甲苯磺酸鹽和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺的催化下，令羥乙基淀粉和紫杉醇-2’ 丁二酸酷發(fā)生酯化反應(yīng)生成羥乙基淀粉-多西紫杉醇偶聯(lián)物的具體方法是:按等摩爾量取多西紫杉醇_2’丁二酸酷、二甲氨基吡啶對(duì)甲苯磺酸鹽和1-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)-碳化二亞胺，加入到二甲基亞砜中，使多西紫杉醇-2’丁二酸酯與二甲基亞砜的用量摩爾體積比為I: 100 (單位為mol: L)，室溫下反應(yīng)4~6h，再加入羥乙基淀粉，以羥乙基淀粉単元糖環(huán)的摩爾數(shù)計(jì)算羥乙基淀粉的用量為:使羥乙基淀粉単元糖環(huán)與多西紫杉醇_2’ - 丁二酸酯的摩爾比為10: I~50: 1，室溫下繼續(xù)反應(yīng)3~5天，反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)溶液在雙蒸水中透析48~72h，透析期間每7h換一次雙蒸水，透析結(jié)束后經(jīng)冷凍干燥，得到白色固體狀羥乙基淀粉-多西紫杉醇偶聯(lián)物(HES-DTX)。
[0015]本發(fā)明利用羥乙基淀粉的親水性，通過化學(xué)偶聯(lián)反應(yīng)合成了一種羥乙基淀粉-多西紫杉醇偶聯(lián)物(簡記為ffiS-DTX)。本發(fā)明不僅可解決多西紫杉醇的水溶性問題，改善藥物的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，同時(shí)還提供了ー種非PEG化親水修飾藥物載體的新途徑。
[0016]本發(fā)明制備羥乙基淀粉-多西紫杉醇偶聯(lián)物的基本思路是通過丁二酸酐的偶聯(lián)作用，使羥乙基淀粉與多西紫杉醇發(fā)生化學(xué)偶聯(lián)反應(yīng)(見附圖1)。本發(fā)明所述羥乙基淀粉原料購買于武漢華科大生命科技有限公司，所購羥乙基淀粉的分子量為130Kd，取代度為
0.4。多西紫杉醇原料購買于武漢威盛達(dá)有限公司，純度為99%。
[0017]本發(fā)明利用大鼠模型考察了本發(fā)明實(shí)施例1制備的本發(fā)明羥乙基淀粉-多西紫杉醇偶聯(lián)物的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，具體步驟如下:
[0018]實(shí)驗(yàn)藥物的配制:將羥乙基淀粉-多西紫杉醇偶聯(lián)物溶解在水中配制成25.5mg/ml 的水溶液；參照文獻(xiàn)的方法(M.J.Ernsting et al., Preclinical pharmacokinetic,biodistribution, and ant1-cancer efficacy studies oi a docetaxelcarboxymethyl—cellulose nanoparticle in mouse models.Biomaterials,2012，33，1445-1454.)配制2.5mg/ml的多西紫杉醇溶液。
[0019]隨機(jī)將大鼠分為2組，每組5只。將多西紫杉醇原料藥和羥乙基淀粉-多西紫杉醇偶聯(lián)物以多西紫杉醇10mg/kg的給藥量，Iml的劑量通過尾靜脈注射入每只大鼠。不同時(shí)間點(diǎn)下從大鼠眼眶靜脈叢取血0.4ml,4000rpm轉(zhuǎn)速下離心IOmin,取血衆(zhòng)0.2ml,高效液相色譜檢測血漿中多西紫杉醇的濃度(見附圖4)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，羥乙基淀粉-多西紫杉醇偶聯(lián)物顯著改善了多西紫杉醇的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，具有體內(nèi)長循環(huán)效果，使藥物易于在腫瘤部位富集。
[0020]另外，按文獻(xiàn)方法(M.J.Ernsting et al.，Tumor—targeted drug delivery usingMR—contrasted docetaxel—CarDoxymethyIcelluiose nanoparticIes.Biomaterials,2012，33，3931-3941)建立小鼠乳腺癌EMT-6細(xì)胞荷瘤小鼠模型，考察了羥乙基淀粉-多西紫杉醇偶聯(lián)物體內(nèi)抗腫瘤活性。具體步驟如下:
[0021]實(shí)驗(yàn)藥物的配制:將本發(fā)明實(shí)施例1制備的羥乙基淀粉-多西紫杉醇偶聯(lián)物溶解在水中配制成13.7mg/ml的水溶液；配制多西紫杉醇溶液的濃度為1.4mg/ml。
[0022]隨機(jī)將小鼠分為3組，每組6只。將多西紫杉醇組，羥乙基淀粉-多西紫杉醇偶聯(lián)物水溶液組以多西紫杉醇10mg/kg的給藥量，200 u I的劑量于第0天、第4天、第8天尾靜脈注射入每只小鼠，并設(shè)置空白對(duì)照組生理鹽水組(saline)，測量腫瘤體積大小(見附圖5)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的羥乙基淀粉-多西紫杉醇偶聯(lián)物能夠顯著增強(qiáng)多西紫杉醇對(duì)腫瘤的抑制作用。[0023]本發(fā)明提供的羥乙基淀粉-多西紫杉醇偶聯(lián)物的優(yōu)點(diǎn)在于:多西紫杉醇的水溶性提高了 1000~3000倍，解決了多西紫杉醇原料藥水溶性低藥效差的難題；延長了多西紫杉醇的血液循環(huán)時(shí)間，使其易于在腫瘤部位富集；顯著增強(qiáng)多西紫杉醇對(duì)腫瘤的抑制作用。[0024]本發(fā)明提供了一種羥乙基淀粉-多西紫杉醇偶聯(lián)物的制備方法。該方法以羥乙基淀粉為基本骨架，丁二酸酐為偶聯(lián)劑，將羥乙基淀粉和多西紫杉醇以酯鍵形式偶聯(lián)起來，得到ー種具有良好生物相容性的羥乙基淀粉-多西紫杉醇偶聯(lián)物。與多西紫杉醇原料藥相比，該偶聯(lián)物顯著提高了多西紫杉醇在水中的溶解度(約1000~3000倍)。同時(shí)偶聯(lián)物中的羥乙基淀粉還明顯改善了多西紫杉醇的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，具有體內(nèi)長循環(huán)特征。在小鼠荷瘤乳腺癌EMT-6模型實(shí)驗(yàn)中，相比多西紫杉醇原料藥，該偶聯(lián)物明顯增強(qiáng)了對(duì)皮下移植腫瘤的抑制作用。
【專利附圖】

【附圖說明】[0025]圖1為羥乙基淀粉-多西紫杉醇偶聯(lián)物的合成路線圖。[0026]圖2本發(fā)明實(shí)施例1制備的羥乙基淀粉-多西紫杉醇偶聯(lián)物的紅外光譜(FT-1R)圖。從附圖2的羥乙基淀粉紅外光譜可知，3400cm—1，2926cm—1，1649cm—1的吸收峰分別為OH的伸縮振動(dòng)峰，C-H的震動(dòng)吸收峰和分子內(nèi)氫鍵。對(duì)比羥乙基淀粉的紅外光譜，羥乙基淀粉-多西紫杉醇偶聯(lián)物在1720cm—1處出現(xiàn)了ー個(gè)新吸收峰，歸屬于酯鍵C = O振動(dòng)峰。同時(shí)在1540cm \ 1453cm 1和713cm 1還出現(xiàn)了三個(gè)新吸收峰，其中1540cm S 1453cm 1歸屬于苯環(huán)C = C骨架振動(dòng)峰，713cm-1歸屬于苯環(huán)C-H彎曲振動(dòng)峰。這些新吸收峰證明多西紫杉醇已經(jīng)成功偶聯(lián)到HES上面。[0027]圖3為本發(fā)明實(shí)施例1制備的羥乙基淀粉-多西紫杉醇偶聯(lián)物的核磁共振波譜(1H-NMR)圖。其中譜圖A為多西紫杉醇原料藥。譜圖B為多西紫杉醇-2’丁二酸酷。譜圖C為羥乙基淀粉。譜圖D為本發(fā)明實(shí)施例1制備的羥乙基淀粉-多西紫杉醇偶聯(lián)物。從附圖3的氫核磁共振波譜可知，對(duì)比多西紫杉醇的核磁共振波譜，多西紫杉醇_2’ - 丁二酸酯(DTX-Suc)的2’號(hào)H對(duì)應(yīng)的核磁共振峰從4.64ppm(s, 1H)處消失，并遷移到5.5ppm處，這表明酯鍵的生成。并且2.5~2.7ppm處增加的多重峰對(duì)應(yīng)的是丁二酸的0C0CH2CH2C00H部分，證明多西紫杉醇_2’丁二酸酯成功合成。另外，從羥乙基淀粉-多西紫杉醇的氫核磁共振波譜的7.0~8.0ppm之間還出現(xiàn)了較多的峰，這是多西紫杉醇苯環(huán)上的氫振動(dòng)峰。根據(jù)氫核磁共振波譜確證羥乙基淀粉-多西紫杉醇偶聯(lián)物的結(jié)構(gòu)正確。[0028]圖4為大鼠體內(nèi)注射多西紫杉醇和本發(fā)明實(shí)施例2制備的羥乙基淀粉-多西紫杉醇偶聯(lián)物后不同時(shí)間點(diǎn)的血藥濃度曲線。從附圖4的血藥濃度曲線可知，多西紫杉醇給藥組的藥物消除速率很快，給藥Ih后血藥濃度就從16.01 u g/ml迅速下降到1.26 u g/ml,到8h幾乎完全消除(僅為0.11 y g/ml)。24h后已經(jīng)檢測不到多西紫杉醇的色譜峰。羥乙基淀粉-多西紫杉醇給藥組在給藥后的前2h內(nèi)也存在ー個(gè)快速消除的過程，但是藥物的消除速率明顯低于多西紫杉醇給藥組。血藥濃度也遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于多西紫杉醇給藥組，給藥Ih后血藥濃度仍然有6.65 u g/ml,并在隨后的時(shí)間內(nèi)保持一個(gè)緩慢的藥物消除過程，48h后仍然能夠檢測到血藥濃度為0.157 u g/ml。將多西紫杉醇和羥乙基淀粉-多西紫杉醇偶聯(lián)物兩個(gè)給藥組的血藥濃度輸入藥代動(dòng)力學(xué)軟件DAS2.0進(jìn)行擬合，多西紫杉醇給藥組和羥乙基淀粉-多西紫杉醇偶聯(lián)物給藥組均符合三室藥代動(dòng)力學(xué)模型，其中羥乙基淀粉-多西紫杉醇偶聯(lián)物的藥物清除率遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于多西紫杉醇，經(jīng)靜脈給藥后其藥代動(dòng)力學(xué)曲線下面積AUC(0—是多西紫杉醇溶液的4倍，即相對(duì)生物利用度提高到原有的4倍，消除半衰期t1/2e是多西紫杉醇溶液的4.1倍。這表明，通過靜脈給藥方式，羥乙基淀粉-多西紫杉醇偶聯(lián)物具有顯著的長循環(huán)特征。
[0029]圖5為荷瘤小鼠注射多西紫杉醇和本發(fā)明實(shí)施例2制備的羥乙基淀粉-多西紫杉醇偶聯(lián)物的腫瘤生長曲線。其中:曲線a為生理鹽水對(duì)照組；曲線b為多西紫杉醇給藥組；曲線c為羥乙基淀粉-多西紫杉醇偶聯(lián)物給藥組；圖B是實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將各組小鼠腫瘤剝離出來后拍攝的照片。從附圖5的腫瘤生長曲線可以看出，與生理鹽水組相比，多西紫杉醇組和羥乙基淀粉-多西紫杉醇偶聯(lián)物給藥組的腫瘤體積顯著性降低(P < 0.05)，抑制腫瘤生長作用明顯。相比多西紫杉醇組，羥乙基淀粉-多西紫杉醇偶聯(lián)物給藥組的腫瘤體積在第4天開始減小，到第12天時(shí)顯著降低(p<0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后各組小鼠剝離腫瘤的照片也顯示羥乙基淀粉-多西紫杉醇偶聯(lián)物給藥組的腫瘤體積顯著減小。說明在本發(fā)明實(shí)施例5的給藥方案下羥乙基淀粉-多西紫杉醇偶聯(lián)物對(duì)于小鼠乳腺癌EMT-6皮下移植腫瘤的抑制作用明顯高于純多西紫杉醇。
【具體實(shí)施方式】
[0030]以下結(jié)合實(shí)施例和附圖將明做進(jìn)ー步的說明，而不是限制本發(fā)明范圍。
[0031]實(shí)施例1:
[0032]實(shí)驗(yàn)藥品的配制:取濃鹽酸15ml，用一次水稀釋至100ml，得到2mol/L的HCl水溶液；取氯化鈉36g溶解在100ml —次水中，攪拌均勻得到飽和食鹽水。
[0033]步驟一、將多西紫杉醇2g，`丁二酸酐0.3g和4- 二甲氨基吡啶61mg加入到兩ロ燒瓶中，封ロ后抽真空2h。然后將5ml吡啶混合在IOml 二氯甲烷中，注入瓶中，室溫反應(yīng)3h后加入2ml甲醇終止反應(yīng)。
[0034]步驟二、將步驟一得到的反應(yīng)混合液用IOml濃度為2mol/L的HCl水溶液和IOml飽和食鹽水依次萃取I次，得到有機(jī)相I和水相I，有機(jī)相I再用配制好的HCl水溶液和飽和食鹽水分別重復(fù)萃取2次，將各次所得水相合并得到水相II。水相II再用IOml 二氯甲烷萃取I次得到有機(jī)相II。將有機(jī)相I和有機(jī)相II合并后，用無水硫酸鈉干燥，蒸去有機(jī)溶剤，以甲醇/ 二氯甲烷(I: 10，v/v)為流動(dòng)相，通過硅膠柱層析分離得到白色固體狀多西紫杉醇-2’ 丁二酸酷。
[0035]步驟三、將5g對(duì)甲苯磺酸和3.55g4_ 二甲氨基吡啶溶于100ml四氫呋喃中，于60°C下反應(yīng)2h。反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，過濾得到白色沉淀物，該白色沉淀物在30ml 二氯甲烷中重結(jié)晶，再于40°C真空干燥，得到針狀固態(tài)的二甲氨基吡啶對(duì)甲苯磺酸鹽。
[0036]步驟四、偶聯(lián)反應(yīng):取0.30g上述步驟二得到的多西紫杉醇_2’ 丁二酸酷、上述步驟三得到的二甲氨基吡啶對(duì)甲苯磺酸鹽0.092g和1-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)-碳化二亞胺0.064g,加入到30ml 二甲基亞砜中，室溫下反應(yīng)4~6h。再加入輕乙基淀粉，以輕乙基淀粉単元糖環(huán)的摩爾數(shù)計(jì)算羥乙基淀粉的用量為:使羥乙基淀粉単元糖環(huán)與多西紫杉醇-2’ 丁二酸酯的摩爾比為50: 1，室溫下繼續(xù)反應(yīng)3天。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)溶液在雙蒸水中透析48~72h，透析期間每7h換一次透析液。透析結(jié)束后經(jīng)冷凍干燥，得到白色固體狀羥乙基淀粉-多西紫杉醇偶聯(lián)物01ES-DTX)，該偶聯(lián)物稱重測得質(zhì)量為I。采用紫外檢測法測得羥乙基淀粉-多西紫杉醇偶聯(lián)物中多西紫杉醇的質(zhì)量為W2，載藥量采用公式Wt%=VW1X 100%計(jì)算為 4.5%o
[0037]采用紅外光譜和氫核磁共振波譜確認(rèn)本實(shí)施例合成的HES-DTX的化學(xué)結(jié)構(gòu)，見圖2和圖3，圖2本發(fā)明實(shí)施例1制備的羥乙基淀粉-多西紫杉醇偶聯(lián)物的紅外光譜(FT-1R)圖。圖3為本發(fā)明實(shí)施例1制備的羥乙基淀粉-多西紫杉醇偶聯(lián)物的核磁共振波譜(1H-NMR)圖。從附圖2的羥乙基淀粉紅外光譜可知，3400cm—1，2926cm—1，1649cm—1的吸收峰分別為OH的伸縮振動(dòng)峰，C-H的震動(dòng)吸收峰和分子內(nèi)氫鍵。對(duì)比羥乙基淀粉的紅外光譜，羥乙基淀粉-多西紫杉醇偶聯(lián)物在1720cm—1處出現(xiàn)了ー個(gè)新吸收峰，歸屬于酯鍵C = O振動(dòng)峰。同時(shí)在1540cm \ 1453cm 1和713cm 1還出現(xiàn)了三個(gè)新吸收峰，其中1540cm S 1453cm 1歸屬于苯環(huán)C = C骨架振動(dòng)峰，713cm-1歸屬于苯環(huán)C-H彎曲振動(dòng)峰。這些新吸收峰證明多西紫杉醇已經(jīng)成功偶聯(lián)到HES上面。附圖3為羥乙基淀粉-多西紫杉醇偶聯(lián)物的核磁共振波譜(1H-NMR)圖。其中譜圖A為多西紫杉醇原料藥。譜圖B為多西紫杉醇-2’丁二酸酷。譜圖C為羥乙基淀粉。譜圖D為本發(fā)明實(shí)施例1制備的羥乙基淀粉-多西紫杉醇偶聯(lián)物。從附圖3的氫核磁共振波譜可知，對(duì)比多西紫杉醇的核磁共振波譜，多西紫杉醇_2’ - 丁二酸酯(DTX-Suc)的2’號(hào)H對(duì)應(yīng)的核磁共振峰從4.64ppm(s, 1H)處消失，并遷移到5.5ppm處，這表明酯鍵的生成。并且2.5~2.7ppm處增加的多重峰對(duì)應(yīng)的是丁二酸的0C0CH2CH2C00H部分，證明多西紫杉醇_2’丁二酸酯成功合成。另外，從羥乙基淀粉-多西紫杉醇的氫核磁共振波譜的7.0~8.0ppm之間還出現(xiàn)了較多的峰，這是多西紫杉醇苯環(huán)上的氫振動(dòng)峰。根據(jù)氫核磁共振波譜確證羥乙基淀粉-多西紫杉醇偶聯(lián)物的結(jié)構(gòu)正確。
[0038]實(shí)施例2:
[0039]除羥乙基淀粉単元糖環(huán)與多西紫杉醇_2’_ 丁二酸酯的摩爾比為20: I外，其它條件同實(shí)施例1。采用紫外檢測法測得實(shí)施例2制備的羥乙基淀粉-多西紫杉醇偶聯(lián)物的載藥量為9.8%。
[0040]實(shí)施例3:
[0041]除改變羥乙基淀粉単元糖環(huán)與多西紫杉醇-2’ - 丁二酸酯的摩爾比為10: I外，其它條件同實(shí)施例1。采用紫外檢測法測得實(shí)施例3制備的羥乙基淀粉-多西紫杉醇偶聯(lián)物的載藥量為10.6%。
[0042]實(shí)施例4:
[0043]大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn):隨機(jī)將大鼠分為2組，每組5只，體重在250~260g。給藥組分別為多西紫杉醇組和本發(fā)明實(shí)施例2制備的羥乙基淀粉-多西紫杉醇偶聯(lián)物組。兩組的給藥量均為10mg/kg，每只大鼠的注射量為1ml，給藥方式均為尾靜脈注射。
[0044]給藥后分別于5min、15min、0.5h、lh、2h、4h、8h、12h、24h、48h,從大鼠眼眶靜脈叢取血0.4ml置于事先用肝素鈉濕潤的離心管中，在離心機(jī)中離心IOmin(4000rpm)后，取血漿0.2ml。采用高效液相色譜分別測定了不同時(shí)間點(diǎn)血漿樣品中多西紫杉醇的濃度。
[0045]從附圖4的血藥濃度曲線可知，多西紫杉醇給藥組的藥物消除速率很快，給藥Ih后血藥濃度就從16.01 V- g/ml迅速下降到1.26 V- g/ml,到8h幾乎完全消除(僅為0.1lug/ml)。24h后已經(jīng)檢測不到多西紫杉醇的色譜峰。羥乙基淀粉-多西紫杉醇給藥組在給藥后的前2h內(nèi)也存在ー個(gè)快速消除的過程，但是藥物的消除速率明顯低于多西紫杉醇給藥組。血藥濃度也遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于多西紫杉醇給藥組，給藥Ih后血藥濃度仍然有6.65 u g/ml,并在隨后的時(shí)間內(nèi)保持一個(gè)緩慢的藥物消除過程，48h后仍然能夠檢測到血藥濃度為0.157 Ug/ml。將多西紫杉醇和羥乙基淀粉-多西紫杉醇偶聯(lián)物兩個(gè)給藥組的血藥濃度輸入藥代動(dòng)カ學(xué)軟件DAS2.0進(jìn)行擬合，多西紫杉醇給藥組和羥乙基淀粉-多西紫杉醇偶聯(lián)物給藥組均符合三室藥代動(dòng)力學(xué)模型，其中羥乙基淀粉-多西紫杉醇偶聯(lián)物的藥物清除率遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于多西紫杉醇，經(jīng)靜脈給藥后其藥代動(dòng)力學(xué)曲線下面積AUC(0 —是多西紫杉醇溶液的4倍，即相對(duì)生物利用度提高到原有的4倍，消除半衰期t1/2e是多西紫杉醇溶液的4.1倍。這表明，通過靜脈給藥方式，羥乙基淀粉-多西紫杉醇偶聯(lián)物具有顯著的長循環(huán)特征。
[0046]實(shí)施例5: [0047]通過在每只健康Balb/c小鼠右后肢近腋下皮下接種小鼠乳腺癌EMT-6細(xì)胞懸液4X105cells/100iil，建立小鼠乳腺癌EMT-6細(xì)胞皮下移植荷瘤小鼠模型。
[0048]在飼養(yǎng)過程中，各組小鼠均同等自由飲食。動(dòng)物房內(nèi)溫度保持在20~24°C，相對(duì)濕度當(dāng)皮下瘤體積為50~IOOmm3時(shí)(約7天左右)，開始尾靜脈給藥。將皮下瘤體積在50~IOOmm3范圍內(nèi)，體重在28~30g范圍內(nèi)的荷瘤小鼠隨機(jī)分為3組，每組6只。給藥組分為多西紫杉醇組和本發(fā)明實(shí)施例2制備的羥乙基淀粉-多西紫杉醇偶聯(lián)物組，均以多西紫杉醇給藥量為10mg/kg。并設(shè)置空白対照的生理鹽水組。每只小鼠通過尾靜脈注射200 Ul的劑量。第一次給藥記為第0天，再分別于第4天、第8天繼續(xù)按上述劑量分組給藥。第0天，采用游標(biāo)卡尺測量皮下腫瘤最寬處(W)和最長處大小(L)，計(jì)算腫瘤的體積V = LXW2/2。之后每隔一天測量一次，繪制腫瘤生長曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，處死荷瘤小鼠，將腫瘤剝離并拍照。
[0049]附圖5是為荷瘤小鼠注射多西紫杉醇和本發(fā)明實(shí)施例2制備的羥乙基淀粉-多西紫杉醇偶聯(lián)物的腫瘤生長曲線。其中曲線a為生理鹽水對(duì)照組；曲線b為多西紫杉醇給藥組；曲線c為羥乙基淀粉-多西紫杉醇偶聯(lián)物給藥組；圖B是實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將各組小鼠腫瘤剝離出來后拍攝的照片。從附圖5的腫瘤生長曲線可以看出，與生理鹽水組相比，多西紫杉醇組和羥乙基淀粉-多西紫杉醇偶聯(lián)物給藥組的腫瘤體積顯著性降低(P < 0.05)，抑制腫瘤生長作用明顯。相比多西紫杉醇組，羥乙基淀粉-多西紫杉醇偶聯(lián)物給藥組的腫瘤體積在第4天開始減小，到第12天時(shí)顯著降低(p<0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后各組小鼠剝離腫瘤的照片也顯示羥乙基淀粉-多西紫杉醇偶聯(lián)物給藥組的腫瘤體積顯著減小。說明在本發(fā)明實(shí)施例5的給藥方案下羥乙基淀粉-多西紫杉醇偶聯(lián)物對(duì)于小鼠乳腺癌EMT-6皮下移植腫瘤的抑制作用明顯高于純多西紫杉醇。
【權(quán)利要求】
1.一種羥乙基淀粉-多西紫杉醇偶聯(lián)物的制備方法，包括以下步驟: 步驟ー:令多西紫杉醇與丁二酸酐反應(yīng)生成多西紫杉醇-2’ 丁二酸酯； 步驟二:令對(duì)甲苯磺酸與4- 二甲氨基吡啶反應(yīng)生成二甲氨基吡啶對(duì)甲苯磺酸鹽； 步驟三:以羥乙基淀粉為基本骨架，在二甲氨基吡啶對(duì)甲苯磺酸鹽和1-乙基-3- (3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺的催化下，令羥乙基淀粉和紫杉醇_2’丁二酸酯發(fā)生酯化反應(yīng)生成羥乙基淀粉-多西紫杉醇偶聯(lián)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的羥乙基淀粉-多西紫杉醇偶聯(lián)物的制備方法，其特征在干，步驟一所述的令多西紫杉醇與丁二酸酐反應(yīng)生成紫杉醇-2’ 丁二酸酯的具體方法是:將多西紫杉醇，丁二酸酐和4-二甲氨基吡啶加入到反應(yīng)容器中，封ロ后抽真空2h，多西紫杉醇、丁二酸酐和4-二甲氨基吡啶的用量摩爾比為2.5: 3: I ;然后將吡啶混合在二氯甲烷中注入反應(yīng)容器，室溫反應(yīng)3h后加入甲醇終止反應(yīng)得反應(yīng)混合液，其中多西紫杉醇與吡啶的用量摩爾體積比為1: 2(單位為mol: L)，吡啶、二氯甲烷和甲醇的用暈體積比為2.5: 5:1 ;將得到的反應(yīng)混合液用濃度為2mol/L的HCl水溶液和飽和食鹽水依次萃取一次，得到有機(jī)相I和水相I ;有機(jī)相I再用配制好的HCl水溶液和飽和食鹽水分別重復(fù)萃取2次，將各次所得水相合并得到水相II ;水相II再用二氯甲烷萃取I次，得到有機(jī)相II，將有機(jī)相I和有機(jī)相II合并后，用無水硫酸鈉干燥，蒸去有機(jī)溶剤，以甲醇/ 二氯甲烷(I: 10，v/v)為流動(dòng)相，通過硅膠柱層析分離，得到白色固體狀多西紫杉醇-2’ 丁二酸酷。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的羥乙基淀粉-多西紫杉醇偶聯(lián)物的制備方法，其特征在于，所述的HCl水溶液的配制方法是:取濃鹽酸15ml，用一次水稀釋至100ml，得到2mol/L的HCl水溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的羥乙基淀粉-多西紫杉醇偶聯(lián)物的制備方法，其特征在于，所述的飽和食鹽水的配制方法是:取氯化鈉36g溶解在100ml —次水中，攪拌均勻得到飽和食鹽水。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的羥乙基淀粉-多西紫杉醇偶聯(lián)物的制備方法，其特征在于，步驟二所述的令對(duì)甲苯磺酸與4-二甲氨基吡啶反應(yīng)生成二甲氨基吡啶對(duì)甲苯磺酸鹽的具體方法是:將對(duì)甲苯磺酸和4-二甲氨基吡啶溶解在四氫呋喃中，于40~60°C下反應(yīng)2h，其中對(duì)甲苯磺酸和4-二甲氨基吡啶的用量摩爾比為1: 1，對(duì)甲苯磺酸和四氫呋喃的用量摩爾體積比為1: 3(單位為mol: L)，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，過濾得到白色沉淀物，該白色沉淀物經(jīng)二氯甲烷中重結(jié)晶，再于40°C真空干燥，得到針狀固態(tài)的二甲氨基吡啶對(duì)甲苯磺酸鹽。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的羥乙基淀粉-多西紫杉醇偶聯(lián)物的制備方法，其特征在于，步驟三所述的以羥乙基淀粉為基本骨架，在二甲氨基吡啶對(duì)甲苯磺酸鹽和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺的催化下，令羥乙基淀粉和紫杉醇-2’ 丁二酸酯發(fā)生酯化反應(yīng)生成羥乙基淀粉-多西紫杉醇偶聯(lián)物的具體方法是:按等摩爾量取多西紫杉醇_2’ 丁二酸酷、二甲氨基吡啶對(duì)甲苯磺酸鹽和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺，加入到二甲基亞砜中，使多西紫杉醇-2’ 丁二酸酯與二甲基亞砜的用量摩爾體積比為1: 100(單位為mol: L)，室溫下反應(yīng)4~6h，再加入羥乙基淀粉，以羥乙基淀粉単元糖環(huán)的摩爾數(shù)計(jì)算羥乙基淀粉的用量為:使羥乙基淀粉単元糖環(huán)與多西紫杉醇_2’ - 丁二酸酯的摩爾比為10: I~50: I，室溫下繼續(xù)反應(yīng)3~5天，反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)溶液在雙蒸水中透析48~72h，透析期間每7h換一次雙蒸水，透析結(jié)束后經(jīng)冷凍干燥，得到白色固體狀羥乙基淀粉-多西紫杉醇偶聯(lián)物(HES-DTX)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的羥乙基淀粉-多西紫杉醇偶聯(lián)物的制備方法，其特征在于，所述的多西紫杉醇_2’ 丁二酸酯按權(quán)利要求2所述方法制得。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的羥乙基淀粉-多西紫杉醇偶聯(lián)物的制備方法，其特征在于，所述的二甲氨基吡啶對(duì)甲苯磺酸·鹽按權(quán)利要求5制得。
【文檔編號(hào)】A61K31/337GK103585642SQ201310521645
【公開日】2014年2月19日 申請(qǐng)日期:2013年10月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月29日
【發(fā)明者】楊祥良, 楊亞江, 徐輝碧, 柳輕瑤, 萬江陵 申請(qǐng)人:華中科技大學(xué)