毛蓮菜提取物在制備治療艾滋病藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種毛蓮菜提取物的新用途，該新用途是毛蓮菜提取物在制備治療艾滋病藥物中的應(yīng)用。所述毛蓮菜提取物是按如下方法制備的：以毛蓮菜為原料，用50%-90%乙醇提取，通過高速逆流色譜、聚酰胺色譜等純化得到。本發(fā)明所提供的毛蓮菜提取物對制備治療艾滋病藥物具有重要意義。
【專利說明】毛蓮菜提取物在制備治療艾滋病藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種中藥材提取物在制備治療艾滋病藥物中的應(yīng)用，具體是涉及毛蓮菜提取物在制備治療艾滋病藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]艾滋病是1981年發(fā)現(xiàn)的新病毒性傳染病，中醫(yī)過去對其未有記載。中醫(yī)對艾滋病辨證，認(rèn)為艾滋病屬于疫病范疇。病因?yàn)橐叨緹嵝扒忠u，正氣虛弱而致。病機(jī)主要為衛(wèi)外不固，陽氣損傷，臟腑受累，引起肺虛脾虛腎虛，繼發(fā)感染。熱傷脈絡(luò)，氣血凝滯，形成癥積腫塊腫瘤。 [0003]中醫(yī)辨“證”:主要辨別邪正消長和虛證實(shí)證。艾滋病病毒為邪毒，邪毒入里而傳變，與機(jī)體正氣的邪正抗?fàn)幍膭討B(tài)變化，為疾病的發(fā)展過程。感染早期以邪實(shí)為主，中期“因?qū)嵵绿摗?，晚期“因虛致?shí)”。艾滋病病情復(fù)制多變，艾滋病及其繼發(fā)感染都可形成“病”，且有不同“型”和“期”。中醫(yī)對艾滋病有辨證辨病，分型分期等不同診治方案。
[0004]艾滋病的中醫(yī)藥治療目前仍屬于研究階段，目前國內(nèi)外尚未有公認(rèn)療效肯定被批準(zhǔn)生產(chǎn)的抗艾滋病病毒中藥或中藥單體化合物?？拱滩〔《局参锼幒椭兴幯芯恐饕?種途徑，煙具獲得的抗艾滋病病毒中藥植物藥及其成分，有些已在臨床試用。
[0005]自艾滋病病毒發(fā)現(xiàn)以來，國際上用艾滋病病毒細(xì)胞培養(yǎng)和逆轉(zhuǎn)錄酶,蛋白酶和整合酶等體外實(shí)驗(yàn)方法，廣泛篩選化合物的同時，也大量篩選植物和中草藥提取物及其成分，也研究了一些中藥復(fù)方制劑，發(fā)現(xiàn)在體外抑制艾滋病毒的有效藥物，有的可抑制猴免疫缺陷病毒(SIV)感染猴的病毒血癥。有些已在臨床試用，尚未明確效果。
[0006]我國自1987年派中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)療隊去非洲治療艾滋病病人。國內(nèi)在2002年以前，缺乏特效抗艾滋病病毒藥物，中西醫(yī)在臨床根據(jù)中醫(yī)理論，對艾滋病病人辨病與辨證相結(jié)合，以清熱解毒，扶正固本，或涼血補(bǔ)腎，活血化瘀等治則，按中藥性能，選擇中藥，處方治療。通過臨床實(shí)踐，認(rèn)為有些中藥復(fù)方治療艾滋病可改善癥狀，緩解病情。近年來對實(shí)驗(yàn)診斷確診的艾滋病病人，采用中藥治療，設(shè)對照組，在治療期間，定期檢測血液病毒載量(HIV-RNA)和CD4細(xì)胞水平，評價效果。有報道可改善癥狀，提高免疫力，大多仍在臨床驗(yàn)證中。進(jìn)入臨床的抗HIV單味中藥或植物藥及中藥復(fù)方如下:
甘草甜素:甘草甜素(glycyrrhizin,GL)是中藥甘草(Glycyrrhiza glabra L)提取的甘草皂苷，有廣譜抗病毒作用，體外抑制HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶，在細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)抑制HIV細(xì)胞融合，也抗流感病毒和SARS病毒，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明可保護(hù)流感病毒感染小鼠引起的肺炎死亡和肺病變；保護(hù)小鼠的CCl4中毒性肝損傷；誘生Y-干擾素；有類激素作用。日本常用其靜脈點(diǎn)滴治療慢性乙型肝炎，也曾試用治療艾滋病病人，可抑制血清HIV-1-P24抗原，升高CD4細(xì)胞。呂維柏教授1988-1992年在非洲坦桑尼亞應(yīng)用甘草甜素口服制劑克艾可治療艾滋病病人可改善癥狀，CD4細(xì)胞略有上升。其效果尚未被驗(yàn)證。
[0007]天花粉蛋白:天花粉蛋白(Trichosanthin, TCS, GLQ223, Q物質(zhì))為中藥括樓(Trichosanthes kiri1wii)屬葫蘆科(Cucurbitaceae),我國民間用于流產(chǎn)的中藥復(fù)方的主要中藥成分為栝樓，我國科學(xué)家分離鑒定器抗早孕和引產(chǎn)的有效成分為天花粉蛋白，分子量為27kD，其一、二級結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)已完全弄清，為抑制蛋白合成的植物毒蛋白，是單鏈的核糖體失活蛋白(Ribosome Inactivating Protein, RIP)。美國在篩選抗HIV-1藥物時，發(fā)現(xiàn)其在淋巴細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)抑制HIV-1細(xì)胞融合，其后發(fā)現(xiàn)在單核巨噬細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)HIV-1的P24抗原和RNA，在3只猴艾滋病病毒(SIV)感染猴靜脈注射可抑制血漿HIV-1。美國在林場使用靜脈點(diǎn)滴治療艾滋病病人，可抑制外周血HIV-1感染的T淋巴細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞內(nèi)HIV-1-P24抗原，使⑶4/⑶8比例略有升高。由于可引起過敏性反應(yīng)死亡，神經(jīng)毒性的精神失常和腎毒性反應(yīng)，臨床實(shí)驗(yàn)已中止。近年來從天花粉中分離出其他蛋白TAP29，分子量在29 kD，也有抑制HIV-1的作用，但毒性較小，未在臨床試用。此外苦瓜(MOmordicacharantia)的苦瓜蛋白和商陸(Phytolacca americana)的商陸蛋白(Pokeweed protein)等都有抑制HIV的作用。
[0008]金絲桃素:植物貫葉金絲桃(St.John Wort, Hypericum perforatum)民間傳統(tǒng)用其提取物治療抑郁癥，從花提出的活性成分是金絲桃素(hypericin)，是芳香族多環(huán)二聚蒽醌類化合物，為抗抑郁癥藥物，已全合成。金絲桃素具有多種抗病毒活性，在細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)抑制HIV，其作用機(jī)制為阻斷病毒的脫衣，裝配和釋放，有殺病毒作用，可通過血腦屏障。在細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)可抑制鼠白血病病毒繁殖。在體內(nèi)可抑制鼠白血病病毒感染小鼠引起的脾腫大，也可抑制鴨乙型肝炎病毒感染鴨血請病毒DNA，并有廣譜抗細(xì)菌活性。曾在臨床I/II期試用治療艾滋病患者，因有光敏感作用已停止試驗(yàn)。
[0009]右旋胡同素A:右旋胡同素A (+Calanolide A)是1992年報道從馬來西亞熱帶雨林植物Calophyllum Ianigerum中分離的天然化合物，鼠香豆素類化合物，抑制HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶，但對HIV-2無效。屬于非核苷類HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，在細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)多對多住臨床分離的AZT敏感和耐藥HIV-1有效，并與AZT，NVP有協(xié)同作用。在HIV空纖維管小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?HIV hollow fiber mouse model)中證明有抗艾滋病病毒作用，與AZT聯(lián)合應(yīng)用可增強(qiáng)藥效。已全合成，進(jìn)行了 1-1I其臨床試驗(yàn)證明有抑制HIV-1感染的治療效果，毒性小，副作用輕，有頭痛和食欲不振等，與AZT聯(lián)合用藥有效。是目前唯一進(jìn)入II期臨床實(shí)驗(yàn)的單一植物成分，正在觀察驗(yàn)·證療效中，尚未批準(zhǔn)生產(chǎn)。
[0010]小柴胡湯:小柴胡湯(柴胡，人參，半夏，黃芩，甘草，生姜，大棗)
是張仲景傷寒論方。日本用其治療乙型肝炎，發(fā)現(xiàn)其在細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)抑制HIV。美國在臨床用于治療數(shù)例艾滋病病人，可降低血清P24抗原。我們證明其有抑制HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶和在細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)抑制HIV-1的作用。分別研究其7種成分中藥的效果，發(fā)現(xiàn)僅黃芩水提物及其成分黃芩苷(baicalin)有抑制HIV-1作用，在體外無細(xì)胞系統(tǒng)中抑制HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶，在人T細(xì)胞和外周血單核細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)抑制HIV-1細(xì)胞病變，病毒熒光抗原和P24抗原，體內(nèi)鼠白血病病毒感染小鼠口服可抑制脾腫大和血白細(xì)胞升高。日本Ono報道黃芩苷元(baicalien)抑制HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶。
[0011]中研I號:中研I號(主藥有紫花地丁，天花粉等組成)商品名為:艾
克沖劑，以清熱解毒為治則，由我國中藥研究院組方1992-1993年在非洲坦桑尼亞對早中期艾滋病臨床應(yīng)用，認(rèn)為有一定改善癥狀，提高免疫力的效果。實(shí)驗(yàn)室證明該藥體外抑制HIV逆轉(zhuǎn)錄酶活性，體內(nèi)對猴艾滋病毒感染猴實(shí)驗(yàn)治療結(jié)果表明，能降低血漿病毒滴度，并且能提高⑶4細(xì)胞數(shù)目及⑶4/⑶8比值和T，B淋巴細(xì)胞數(shù)值，誘生干擾素和產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)功能。曾在非洲和我國臨床試用，尚未批準(zhǔn)臨床驗(yàn)證。[0012]中研2號:中研2號(黃芪，人參，當(dāng)歸，枸杞和甘草等)是我國中醫(yī) 研究院醫(yī)療隊組方。1992年在非洲坦桑尼亞治療艾滋病病人。1998-1999年在非洲?？崎T診對29例艾滋病病人治療，2/16例HIV病毒載量下降，CD4 8/29例CD4升高。2001-2002年在北京佑安醫(yī)院治療15例艾滋病病人，3/15例病毒載量下降，⑶4 1/15例CD4升高。有改善癥狀的效果。實(shí)驗(yàn)證明該藥在人體內(nèi)對猴艾滋病毒感染猴實(shí)驗(yàn)治療表明，用藥4-12周能降低血漿病毒滴度，P27抗原，并且能提高CD4細(xì)胞數(shù)目，對感染猴淋巴細(xì)胞有激活作用。[0013]毛蓮菜:為菊科植物毛蓮菜(Picris japonica Thunb.)的干燥地上部分。夏、秋二季花開時采收，除去雜質(zhì)，曬干。收載于1998年《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)蒙藥分冊》。性涼、糙，味苦。殺“粘”，止痛，清熱，消腫，解毒。用于瘟疫，結(jié)喉，乳腺炎，胸刺痛，腮腺炎，陣刺痛。為我國藏蒙等少數(shù)民族地區(qū)的常用藥物。但有關(guān)毛蓮菜的基礎(chǔ)研究尚十分有限，使該藥材的后續(xù)推廣和應(yīng)用受到限制?，F(xiàn)代研究表明，毛蓮菜含有毛連菜苷(picriside) A、B、C，山萵苣素(lactucin)，11 P-13-二氫山萵苣素(113 -13-dihydrolactucin),假還陽參式(caepidiaside) A 及苦荬菜內(nèi)酯(ixerin) F 等，還含有多糖和黃酮類化合物，其他化學(xué)成分不詳；藥理作用研究表明，毛蓮菜水提取，過DlOl大孔樹脂，水洗脫部分具有降血糖，調(diào)節(jié)血脂作用。詳見文獻(xiàn):席嘯虎，葛睿，高建平。日本毛連菜水洗部位降血糖、調(diào)血脂作用研究，中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2011，8 (13):34-36。其他藥理作用未見報道。[0014]國內(nèi)專利檢索結(jié)果，未見毛蓮菜相關(guān)專利。[0015]上述文獻(xiàn)及專利等，尚未見毛蓮菜或毛蓮菜提取物用于制備治療艾滋病藥物的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0016]本發(fā)明的目的在于提供毛蓮菜提取物的在制備治療艾滋病藥物中的應(yīng)用。[0017]本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的: 本發(fā)明所用毛蓮菜為菊科植物毛蓮菜(Picris japonica Thunb.)的干燥地上部分。[0018]本發(fā)明毛蓮菜提取物是按如下方法制備得到: (1)毛蓮菜，用濃度50%-90%乙醇作為溶劑，在10°C_35°C溫浸提取，提取次數(shù)為3-8次，每次提取時間為12~48小時，每次溶劑用量為毛蓮菜重量的21-25倍；濾過，合并提取液，回收乙醇，濃縮，干燥，得毛蓮菜提取物A ; (2)將步驟(1)得到的毛蓮菜提取物A加10-20倍量水溶解，濾過，得藥液A和沉淀A;將沉淀A，采用高速逆流色譜法，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(2:2:1:1)為溶劑系統(tǒng)，進(jìn)行分離純化，回收溶劑，濃縮干燥，得到毛蓮菜提取物B ； (3)將步驟(2)得到的藥液A，通過聚酰胺柱柱，用水洗脫，再用濃度10%-70%的乙醇溶液進(jìn)行梯度洗脫，收集不同濃度乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮干燥，即得毛蓮菜提取物C ； (4)上述毛蓮菜提取物B、毛蓮菜提取物C，其中一種或兩種按一定比例混勻，即得本發(fā)明的毛蓮菜提取物。[0019]毛蓮菜提取物的制備方法為:(1)毛蓮菜，用濃度55%乙醇作為溶劑，在25°C溫浸提取，提取次數(shù)為5次，每次提取時間為24小時，每次溶劑用量為藥材重量的23倍；濾過，合并提取液，回收乙醇,濃縮,干燥，得毛蓮菜提取物A ；
(2)將步驟(1)得到的提取物A加15倍量水溶解，濾過，得藥液A和沉淀A。將沉淀A，采用高速逆流色譜法，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(2:3:1:1)為溶劑系統(tǒng)，進(jìn)行分離純化，回收溶劑，濃縮干燥，即得到毛蓮菜提取物B ；
(3)將步驟(2)得到的藥液A，通過聚酰胺柱柱，用水洗脫，再用濃度60%的乙醇溶液進(jìn)行梯度洗脫，收集60%濃度乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮干燥，即得毛蓮菜提取物C ；
(4)上述毛蓮菜提取物B和毛蓮菜提取物C混勻，即得本發(fā)明的毛蓮菜提取物。
[0020]本發(fā)明的毛蓮菜提取物主要含有:中美菊素C (Zaluzanin C) ;9 a -輕基-11 3，13- 二氫中美菊素 C 3-0- P -吡喃別苷(9 a -Hydroxy-11 P , 13-dihydrozaluzanin C 3-0-0-allopyranoside);木犀草素-7-0-0-D-葡萄糖苷；金絲桃素(hypericin);共4主要成分。
[0021]本發(fā)明的毛蓮菜提取物，可以通過加入藥劑學(xué)允許的各種輔料，制成藥劑學(xué)上的各種口服劑型。
[0022]本發(fā)明首次探索研究以菊科植物毛蓮菜(Picris japonica Thunb.)的干燥地上部分為原料提取制備治療艾滋病提取物。本實(shí)驗(yàn)研究表明，本發(fā)明的毛蓮菜提取物可用于制備治療艾滋病藥物，在MAGI細(xì)胞中對HIV-1 IIIB毒株有明顯抑制作用，濃度為50 ii g/ml時，抑制率90%以上；在階4細(xì)胞中對HIV-1 IIIB毒株有明顯的抑制作用，濃度為IOOii g/ml時，抑制率95%以上。
[0023]本發(fā)明的毛蓮菜提取·物與化學(xué)藥或中藥或天然藥物組成治療艾滋病藥物。
【具體實(shí)施方式】
[0024]下面通過具體實(shí)驗(yàn)例和實(shí)施例對毛蓮菜提取物在制備治療艾滋病藥物中的應(yīng)用做進(jìn)一步說明，但不限于本發(fā)明。
[0025]實(shí)施例1:毛蓮菜提取物及單體化合物制備
(1)毛蓮菜10kg，用濃度55%乙醇作為溶劑，在25°C溫浸提取，提取次數(shù)為5次，每次提取時間為24小時，每次溶劑用量為藥材重量的23倍；濾過，合并提取液，回收乙醇，濃縮干燥，得毛蓮菜提取物A ;
(2)將步驟(1)得到的毛蓮菜提取物A加15倍量水溶解，濾過，得藥液A和沉淀A;將沉淀A，采用高速逆流色譜法(HSCCC)，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇-7JC (2:3:1:1)為溶劑系統(tǒng)，進(jìn)行分離純化，回收溶劑，濃縮干燥，即得到毛蓮菜提取物B ；
(3)將步驟(2)得到的藥液A，通過聚酰胺柱柱，用水洗脫，再用濃度60%的乙醇溶液進(jìn)行梯度洗脫，收集60%濃度乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮干燥，即得毛蓮菜提取物C ；
(4)上述毛蓮菜提取物B和毛蓮菜提取物C混勻，即得本發(fā)明的毛蓮菜提取物。
[0026]如上所述方法制備毛蓮菜提取物B，再經(jīng)200-300目硅膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫(10:0.5-5:1)，薄層跟蹤檢測，合并相同流份，靜置析晶，抽濾，丙酮-乙烷(1:2)重結(jié)晶，分別得到中美菊素C (Zaluzanin C);9 a -羥基-11 0，13-二氫中美菊素C3-0-0 -批喃別苷(9 a-Hydroxy-11 P，13-dihydrozaluzanin C 3-0-^ -allopyranoside)等成分，以上各化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)均經(jīng)質(zhì)譜和核磁共振等波譜手段確證，純度經(jīng)高效液相色譜檢測均大于98.5%。
[0027]如上所述方法制備毛蓮菜提取物C，再經(jīng)200-300目硅膠柱層析，以三氯甲烷_甲醇梯度洗脫(100:1-2.5:1)，薄層跟蹤檢測，合并相同流份，靜置析晶，抽濾，甲醇重結(jié)晶，分別得到木犀草素-7-0-0 -D-葡萄糖苷,金絲桃素(hypericin)等成分，以上各化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)均經(jīng)質(zhì)譜和核磁共振等波譜手段確證，純度經(jīng)高效液相色譜檢測均大于98%。
[0028]實(shí)施例2:毛蓮菜提取物及單體化合物制備
(1)毛蓮菜5kg，用濃度50%乙醇作為溶劑，在35°C溫浸提取，提取次數(shù)為3次，每次提取時間為12小時，每次溶劑用量為毛蓮菜重量的21倍；濾過，合并提取液，回收乙醇，濃縮，干燥，得毛蓮菜提取物A ; (2)將步驟(1)得到的提取物A加10倍量水溶解，濾過，得藥液A和沉淀A;將沉淀A，采用高速逆流色譜法(HSCCC)，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(2:2:1:1)為溶劑系統(tǒng)，進(jìn)行分離純化，回收溶劑，濃縮干燥，即得到毛蓮菜提取物B ；
(3)將步驟(2)得到的藥液A，通過聚酰胺柱柱，用水洗脫，再用濃度10%的乙醇溶液進(jìn)行梯度洗脫，收集10%濃度乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮干燥，即得毛蓮菜提取物C ；
(4)上述毛蓮菜提取物B、毛蓮菜提取物C，其中一種或兩種按一定比例混勻，即得本發(fā)明的毛蓮菜提取物。
[0029]如上所述方法制備毛蓮菜提取物B，再經(jīng)200-300目硅膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫(10:0.5-5:1)，薄層跟蹤檢測，合并相同流份，靜置析晶，抽濾，丙酮-乙烷(1:2)重結(jié)晶，分別得到中美菊素C (Zaluzanin C);9 a -羥基-11 0，13-二氫中美菊素C3-0-0 -批喃別苷(9 a-Hydroxy-11 P，13-dihydrozaluzanin C 3-0-^ -allopyranoside)等成分，以上各化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)均經(jīng)質(zhì)譜和核磁共振等波譜手段確證，純度經(jīng)高效液相色譜檢測均大于98.5%。
[0030]如上所述方法制備毛蓮菜提取物C，再經(jīng)200-300目硅膠柱層析，以三氯甲烷_甲醇梯度洗脫(100:1-2.5:1)，薄層跟蹤檢測，合并相同流份，靜置析晶，抽濾，甲醇重結(jié)晶，分別得到木犀草素-7-0-0 -D-葡萄糖苷,金絲桃素(hypericin)等成分，以上各化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)均經(jīng)質(zhì)譜和核磁共振等波譜手段確證，純度經(jīng)高效液相色譜檢測均大于98%。
[0031]實(shí)施例3:毛蓮菜提取物及單體化合物制備
(1)毛蓮菜10kg，用濃度90%乙醇作為溶劑，在10°C溫浸提取，提取次數(shù)為8次，每次提取時間為48小時，每次溶劑用量為毛蓮菜重量的25倍；濾過，合并提取液，回收乙醇，濃縮，干燥，得毛蓮菜提取物A ;
(2)將步驟(1)得到的提取物A加20倍量水溶解，濾過，得藥液A和沉淀A;將沉淀A，采用高速逆流色譜法(HSCCC)，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(2:2:1:1)為溶劑系統(tǒng)，進(jìn)行分離純化，回收溶劑，濃縮干燥，即得到毛蓮菜提取物B ；
(3)將步驟(2)得到的藥液A，通過聚酰胺柱柱，用水洗脫，再用濃度70%的乙醇溶液進(jìn)行梯度洗脫，收集70%濃度乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮干燥，即得毛蓮菜提取物C ；
(4)上述毛蓮菜提取物B、毛蓮菜提取物C混勻，即得本發(fā)明的毛蓮菜提取物。
[0032]如上所述方法制備毛蓮菜提取物B，再經(jīng)200-300目硅膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫(10:0.5-5:1)，薄層跟蹤檢測，合并相同流份，靜置析晶，抽濾，丙酮-乙烷(1:2)重結(jié)晶，分別得到中美菊素C (Zaluzanin C);9 a -羥基-11 0，13-二氫中美菊素C3-0-0 -批喃別苷(9 a-Hydroxy-11 P，13-dihydrozaluzanin C 3-0-^ -allopyranoside)等成分，以上各化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)均經(jīng)質(zhì)譜和核磁共振等波譜手段確證，純度經(jīng)高效液相色譜檢測均大于98.5%。
[0033]如上所述方法制備毛蓮菜提取物C，再經(jīng)200-300目硅膠柱層析，以三氯甲烷_甲醇梯度洗脫(100:1-2.5:1)，薄層跟蹤檢測，合并相同流份，靜置析晶，抽濾，甲醇重結(jié)晶，分別得到木犀草素-7-0-0 -D-葡萄糖苷,金絲桃素(hypericin)等成分，以上各化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)均經(jīng)質(zhì)譜和核磁共振等波譜手段確證，純度經(jīng)高效液相色譜檢測均大于98%。
[0034]實(shí)驗(yàn)例1:毛蓮菜提取物抗HIV-1活性試驗(yàn)。
[0035]1.材料
細(xì)胞:MT_4 細(xì)胞、MAGI test (Multinuclear Activation of GalactosidaseIndicator)又稱 Single Life Cycle,所用細(xì)胞為 Hela-QM-LTR-0-gal。北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院培養(yǎng)保存。
[0036]毒株:HIV_1HI B北京工
業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院培養(yǎng)保存。
[0037]藥物:本發(fā)明實(shí)施例1、實(shí)施例2、實(shí)施例3所得毛蓮菜提取物，編號為:毛蓮菜提取物1、毛蓮菜提取物2、毛蓮菜提取物3。
[0038]2.毛蓮菜提取物在MT4細(xì)胞中抗HIV_1 HI B活性試驗(yàn)
離心收集500萬MT-4細(xì)胞，加入Iml含10000 TCID50 HIV-1 IIIB的RPMI 1640培養(yǎng)液，37°C、5% CO2孵箱中孵育2小時。1500rpm離心后，RPMI 1640培養(yǎng)液洗滌一次，離心，加入10ml RPMI 1640培養(yǎng)液重懸，96孔板每孔加入100 ul細(xì)胞病毒懸液(含5X IO4細(xì)胞/孔)。選用藥物最高濃度為50iig/ml，5倍比稀釋4個濃度，每個濃度4個復(fù)孔，每孔IOOul (藥物終濃度減半)。同時設(shè)立病毒對照組(只加病毒，不加藥物)、細(xì)胞對照組(不加病毒，不加藥物)。于37°C、5% CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)5天，期間，第3天更換藥液。逐日觀察細(xì)胞生長與形態(tài)變化。細(xì)胞對照組細(xì)胞生長狀態(tài)良好，病毒對照組于培養(yǎng)后第3-4天出現(xiàn)合胞體。培養(yǎng)第5天，收獲培養(yǎng)上清，以測定p24抗原的方法，檢測培養(yǎng)上清p24抗原含量，以示病毒的增殖情況。將給藥組與病毒對照組進(jìn)行比較，以下列公式計算藥物的抑制率:
抑制率=(病毒對照組p24含量一給藥組p24含量)+病毒對照組p24含量以P24抗原檢測法測定藥物對HIV-1 IIIB毒株的抑制作用，結(jié)果見表1。以藥物濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，以對病毒的抑制率為縱坐標(biāo)繪制曲線，利用直線回歸方法計算回歸任線，計算各樣品對HIV-1 IIIB毒株的50%抑制病毒濃度(IC5tl)。
[0039]表1毛蓮菜提取物在MT4細(xì)胞中對HIV-1 IIIB毒株的抑制作用。
【權(quán)利要求】
1.毛蓮菜提取物在制備治療艾滋病藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述毛蓮菜提取物是按如下方法制備得到: (1)毛蓮菜，用濃度50%-90%乙醇作為溶劑，在10°C_35°C溫浸提取，提取次數(shù)為3-8次，每次提取時間為12~48小時，每次溶劑用量為毛蓮菜重量的21-25倍；濾過，合并提取液，回收乙醇，濃縮，干燥，得毛蓮菜提取物A ; (2)將步驟(1)得到的毛蓮菜提取物A加10-20倍量水溶解，濾過，得藥液A和沉淀A;將沉淀A，采用高速逆流色譜法，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(2:2:1:1)為溶劑系統(tǒng)，進(jìn)行分離純化，回收溶劑，濃縮干燥，得到毛蓮菜提取物B ； (3)將步驟(2)得到的藥液A，通過聚酰胺柱柱，用水洗脫，再用濃度10%-70%的乙醇溶液進(jìn)行梯度洗脫，收集不同濃度乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮干燥，即得毛蓮菜提取物C ； (4)上述毛蓮菜提取物B、毛蓮菜提取物C，其中一種或兩種按一定比例混勻，即得本發(fā)明的毛蓮菜提取物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述毛蓮菜提取物是按如下方法制備得到: (1)毛蓮菜，用濃度55%乙醇作為溶劑，在25°C溫浸提取，提取次數(shù)為5次，每次提取時間為24小時，每次溶劑用量為毛蓮菜重量的23倍；濾過，合并提取液，回收乙醇,濃縮,干燥，得毛蓮菜提取物A ; (2)將步驟(1)得到的提取物A加15倍量水溶解，濾過，得藥液A和沉淀A;將沉淀A，采用高速逆流色譜法，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(2:3:1:1)為溶劑系統(tǒng)，進(jìn)行分離純化，回收溶劑，濃縮干燥，即得到毛蓮菜提取物B ； (3)將步驟(2)得到的藥液A，通過聚酰胺柱柱，用水洗脫，再用濃度60%的乙醇溶液進(jìn)行梯度洗脫，收集60%濃度乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮干燥，即得毛蓮菜提取物C ； (4)上述毛蓮菜提取物B和毛蓮菜提取物C混勻，即得本發(fā)明的毛蓮菜提取物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、權(quán)利要求2、權(quán)利要求3所述毛蓮菜提取物，其特征在于:所述的毛蓮菜提取物主要含有:中美菊素C (Zaluzanin C) ;9 a -羥基-11 0，13-二氫中美菊素 C 3-0- ^ -吡喃別苷(9 a-Hydroxy-11 0，13-dihydrozaluzanin C3-0- ^ -allopyranoside);木犀草素-7-0- ^ -D-葡萄糖苷；金絲桃素(hypericin)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的毛蓮菜提取物與化學(xué)藥或中藥或天然藥物組成的治療艾滋病藥物。
【文檔編號】A61K36/28GK103585223SQ201310525437
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年10月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月31日
【發(fā)明者】孔倩倩 申請人:濟(jì)南星懿醫(yī)藥技術(shù)有限公司