端粒結(jié)合蛋白daxx在制備腫瘤細胞調(diào)控劑中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了端粒結(jié)合蛋白DAXX在制備腫瘤細胞調(diào)控劑中的應(yīng)用。所述端粒相關(guān)蛋白DAXX包含有ATRX結(jié)合結(jié)構(gòu)域、組蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域、端粒酶結(jié)合結(jié)構(gòu)域、卡哈爾小體結(jié)合結(jié)構(gòu)域和端粒結(jié)合結(jié)構(gòu)域。DAXX能夠定位在端粒酶陽性的腫瘤細胞端粒上，通過調(diào)控端粒酶的組裝和運輸以維持端粒長度，從而調(diào)控腫瘤細胞的生長與繁殖。另外，DAXX也能夠定位到不依賴端粒酶端粒延長機制（ALT）腫瘤細胞的端粒上，通過影響ALT機制來調(diào)控端粒的長度。因此DAXX在端粒酶陽性以及存在ALT機制的腫瘤細胞中都有重要的端粒調(diào)控功能，可以針對DAXX對腫瘤細胞的調(diào)控機制開發(fā)有效的腫瘤細胞調(diào)控劑。
【專利說明】端粒結(jié)合蛋白DAXX在制備腫瘤細胞調(diào)控劑中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及腫瘤細胞調(diào)控領(lǐng)域。更具體地，涉及端粒結(jié)合蛋白DAXX在制備腫瘤細胞調(diào)控劑中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]端粒是真核生物染色體末端由高度重復(fù)DNA序列(TTAGGG)和一些結(jié)合蛋白組成的特殊結(jié)構(gòu)。它能保護染色體末端免于降解和相互融合以保證染色體的完整性。正常細胞每分裂一次，端粒就逐漸變短一些，當端?？s短到一定界限時，細胞無法繼續(xù)分裂，便開始衰老和死亡。然而，腫瘤細胞存在端粒延長機制，使得其可以逃避端?？s短造成的衰老和死亡以維持永生化狀態(tài)。大約85%的癌癥通過激活端粒酶的方式延長端粒，另外15%的癌癥則通過稱為ALT (alternative lengthening of telomeres)的不依賴端粒酶的端粒延長機制延長端粒，ALT機制是依賴同源重組實現(xiàn)端粒延長的。目前，可以通過TRAP技術(shù)檢測端粒酶活性的有無，CO-FISH技術(shù)檢測端粒處是否有同源重組的發(fā)生，就可以很方便的檢測出一種腫瘤細胞中存在哪種端粒延長機制。
[0003]端粒結(jié)構(gòu)和功能的維持受到以核心蛋白TRFl，TRF2，TIN2, TPPl，POTl和RAPl組成的shelterin復(fù)合物以及其他端粒相關(guān)蛋白共同形成的端粒蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的精確調(diào)控。因此，對端粒調(diào)控蛋白網(wǎng)絡(luò)的解析有助于闡明不同端粒延伸方式的腫瘤發(fā)生的機制，為尋找更多的有效的腫瘤藥物治療靶標提供理論依據(jù)。
[0004]端粒結(jié)合蛋白DAXX全稱為Death-domain associated protein,其氛基酸序列全長740個氨基酸，在NCBI上的登錄號為:Q9UER7。DAXX包含有ATRX結(jié)合結(jié)構(gòu)域、組蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域、端粒酶結(jié)合 結(jié)構(gòu)域、卡哈爾小體結(jié)合結(jié)構(gòu)域和端粒結(jié)合結(jié)構(gòu)域。DAXX蛋白首先被發(fā)現(xiàn)是結(jié)合跨膜死亡受體FAS的死亡結(jié)構(gòu)域，并提高FAS誘導(dǎo)的細胞死亡。DAXX是早期老鼠發(fā)育的一個非常關(guān)鍵的基因，敲除DAXX能夠?qū)е录毎蛲霾⒃谂咛ピ杏牡?.5天導(dǎo)致胚胎死亡。除了在凋亡方面發(fā)揮作用外，DAXX蛋白還被發(fā)現(xiàn)是一種轉(zhuǎn)錄共抑制子，能夠抑制一些轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄活性，而且這個抑制作用與其定位到PML小體中是非常相關(guān)的。近年來DAXX被發(fā)現(xiàn)是組蛋白H3.3特異的分子伴侶幫助H3.3定位到異染色質(zhì)(如端粒)上去。
[0005]但是，通過外顯子測序，多個研究組發(fā)現(xiàn)在胰腺神經(jīng)細胞瘤和一些膠質(zhì)母細胞瘤(GBM)發(fā)現(xiàn)了 DAXX的丟失或者突變，而DAXX的功能喪失會激活不依賴端粒酶的端粒延長機制(ALT)。
[0006]抑制端粒酶活性是目前攻克癌癥的主要手段之一。然而近來有文章報導(dǎo)說具有端粒酶活性的癌癥可以通過激活A(yù)LT以逃避端粒酶抑制的治療手段，從而使得癌細胞存活下來。目前，對于這種不依賴端粒酶延長端粒的方式(ALT)的具體機制研究還十分有限，尤其是它是否與端粒酶激活的延長機制有關(guān)更是不清楚。而在大量ALT腫瘤病人中發(fā)現(xiàn)DAXX的功能缺失，揭示了 DAXX必然參與了端粒相關(guān)功能的調(diào)控，很有可能在參與端粒酶轉(zhuǎn)換到ALT機制中扮演重要的角色，這將對以后發(fā)現(xiàn)癌癥治療的真正靶標、攻克癌癥具有重要作用。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有腫瘤細胞調(diào)控存在的問題和技術(shù)不足，提供了端粒結(jié)合蛋白DAXX在制備腫瘤細胞調(diào)控劑上的應(yīng)用。所述端粒結(jié)合蛋白DAXX在端粒酶陽性的腫瘤細胞以及存在ALT機制的腫瘤細胞中都有重要的端粒調(diào)控功能。[0008]本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn): 本發(fā)明解析了 DAXX在調(diào)控腫瘤細胞端粒長度中的功能。DAXX能夠定位在端粒酶陽性的腫瘤細胞端粒上，通過調(diào)控端粒酶的組裝和運輸以維持端粒長度，從而調(diào)控腫瘤細胞的生長與繁殖，其蛋白表達水平與端粒長度成正相關(guān)。[0009]具體地，DAXX能夠與端粒酶相互作用，且這種相互作用是依賴其N端結(jié)構(gòu)域的，DAXX與端粒酶結(jié)合以后，調(diào)控端粒酶的組裝和運輸，使得端粒能夠持續(xù)延長，從而引發(fā)腫瘤細胞的不斷生長與繁殖。發(fā)生在N端的DAXX疾病突變體能夠減弱與端粒酶的相互作用，過表達這些突變體能夠使得端粒長度變短。[0010]DAXX與端粒酶相互作用是通過與端粒酶核心組分DKCl和hTERT相互作用，并且與DKCl的相互作用是直接的。[0011]DAXX也可定位在卡哈爾小體(端粒酶組裝部位)上，并且這種定位是周期依賴的，主要集中在S期早期。[0012]另外，DAXX也能夠定位到不依賴端粒酶端粒延長機制(ALT)腫瘤細胞的端粒上，通過影響ALT機制來調(diào)控端粒的長度。[0013]因此DAXX在端粒酶陽性的腫瘤細胞以及存在ALT機制的腫瘤細胞中都有重要的端粒調(diào)控功能，可以針對其調(diào)控機制制備有效的腫瘤細胞調(diào)控劑。[0014]本發(fā)明提供了端粒結(jié)合蛋白DAXX在制備端粒酶機制腫瘤細胞調(diào)控劑方面的應(yīng)用。[0015]優(yōu)選地，所述應(yīng)用是端粒結(jié)合蛋白DAXX在制備端粒酶機制腫瘤細胞中端粒酶組裝和運輸?shù)恼{(diào)控劑方面的應(yīng)用。[0016]優(yōu)選地，本發(fā)明提供了端粒結(jié)合蛋白DAXX的抑制劑及其表達抑制劑在制備抗端粒酶機制腫瘤細胞藥物方面的應(yīng)用。[0017]本發(fā)明還提供了端粒結(jié)合蛋白DAXX在制備不依賴端粒酶端粒延長機制腫瘤細胞調(diào)控劑方面的應(yīng)用。[0018]優(yōu)選地，所述應(yīng)用是端粒結(jié)合蛋白DAXX在制備不依賴端粒酶端粒延長機制的腫瘤細胞端粒長度的調(diào)控劑方面的應(yīng)用。[0019]優(yōu)選地，本發(fā)明提供了端粒結(jié)合蛋白DAXX的激活劑及其表達調(diào)控劑在制備抗不依賴端粒酶端粒延長機制腫瘤細胞藥物方面的應(yīng)用。[0020]另外，本發(fā)明還提供了一種抗端粒酶機制腫瘤細胞的藥物制劑或一種抗不依賴端粒酶端粒延長機制腫瘤細胞的藥物制劑，包括有效量的端粒結(jié)合蛋白DAXX和藥學上可接受的輔料。[0021]優(yōu)選地，所述藥物制劑為注射制劑或口服制劑。[0022]優(yōu)選地，所述注射制劑為凍干粉針劑。[0023]優(yōu)選地，所述口服制劑為散片劑、膠囊劑或顆粒劑。[0024]本發(fā)明為了研究端粒結(jié)合蛋白DAXX對腫瘤細胞的調(diào)控功能，具體實驗設(shè)計如下:
51.免疫熒光實驗，檢測內(nèi)源DAXX蛋白在端粒上的定位情況；
52.串聯(lián)親和純化(TAP)結(jié)合液相色譜質(zhì)譜實驗，對端粒酶陽性的293T細胞中的DAXX進行質(zhì)譜檢測，研究DAXX與端粒酶的相互作用；
53.雙分子突光互補技術(shù)(Bimolecularfluorescence complementation, BiFC)實驗以及免疫熒光實驗，研究DAXX與端粒酶相互作用的機制。進一步地，通過體內(nèi)和體外的免疫共沉淀實驗驗證DAXX與端粒酶的作用；
54.免疫沉淀相結(jié)合的端粒酶活性實驗，研究DAXX與端粒酶的相互作用以及相互作用的部位；
55.敲低HTC75細胞中DAXX表達水平或者過表達DAXX疾病突變體，研究DAXX與端粒長度變化的關(guān)系；
56.敲低U20S細胞中DAXX表達水平，研究DAXX與ALT機制的活性的關(guān)系。
[0025]本發(fā)明具有以下有益效果:
本發(fā)明克服了現(xiàn)有腫瘤細胞調(diào)控存在的問題和技術(shù)不足，提供了端粒結(jié)合蛋白DAXX在制備腫瘤細胞調(diào)控劑上的應(yīng)用。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)在端粒酶陽性的細胞中端粒結(jié)合蛋白DAXX能夠幫助端粒酶定位到端粒上去，調(diào)控端粒酶的組裝和運輸，從而延伸端粒。同時在ALT機制腫瘤細胞中DAXX功能喪失可以促進ALT機制的活性，來延伸端粒以維持端粒長度。因此，根據(jù)DAXX的這種功能 ，開發(fā)應(yīng)用抗端粒酶機制腫瘤細胞藥物以及抗不依賴端粒酶端粒延長機制腫瘤細胞藥物，對癌癥的攻克具有舉足輕重的意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1為內(nèi)源DAXX蛋白在不同細胞中與端粒的共定位情況。紅色顯示DAXX蛋白信號，綠色顯示端粒探針信號。
[0027]圖2為DAXX與卡哈爾小體在細胞周期非同步化及同步化情況下的共定位情況，PI染色顯示細胞周期同步化處理效果。紅色顯示DAXX蛋白信號，綠色顯示卡哈爾小體的marker蛋白coilin的信號,藍色顯示DAPI染色的細胞核。
[0028]圖3為細胞周期同步化下DAXX與卡哈爾小體的共定位實驗的統(tǒng)計數(shù)據(jù)。
[0029]圖4為DAXX疾病突變體與卡哈爾小體的共定位情況。紅色顯示DAXX突變體蛋白信號，綠色顯示卡哈爾小體的marker蛋白coilin的信號,藍色顯示DAPI染色的細胞核。
[0030]圖5為DAXX疾病突變體與卡哈爾小體的共定位實驗統(tǒng)計數(shù)據(jù)。
[0031 ] 圖6顯示在對照組和敲低DAXX的ALT機制的細胞U20S中，ALT機制的標記ALT相關(guān)的PML小體的數(shù)量變化情況。
[0032]圖7為DAXX蛋白在293T細胞中的質(zhì)譜數(shù)據(jù)。
[0033]圖8為BiFC技術(shù)原理示意圖以及DAXX與端粒酶組分DKCl的BiFC實驗流式結(jié)果。TCABl是已知與DKCl相互作用的蛋白作為陽性對照，PDKl為陰性對照。
[0034]圖9為DAXX與DKCl和hTERT的體內(nèi)免疫共沉淀實驗結(jié)果(左)以及DAXX與DKCl體外免疫共沉淀實驗結(jié)果(右)。
[0035]圖10為DAXX疾病突變體與ATRX、H3.3以及端粒酶組分DKCl的相互作用結(jié)果。
[0036]圖11為DAXX蛋白序列以及截短(truncate)突變體和疾病突變體示意圖。[0037]圖12為DAXX truncate突變體的免疫沉淀相結(jié)合的端粒酶活性實驗結(jié)果。
[0038]圖13為DAXX疾病突變體的免疫沉淀相結(jié)合的端粒酶活性實驗結(jié)果。
[0039]圖14為DAXX敲低細胞系中端粒長度的變化圖(左)，右側(cè)為western blot檢測DAXX敲低效率以及長度變化統(tǒng)計數(shù)據(jù)。
[0040]圖15為穩(wěn)定表達DAXX疾病突變體的細胞系端粒長度的變化。
[0041]圖16為穩(wěn)定表達DAXX疾病突變體的細胞系western blot結(jié)果以及端粒長度變化統(tǒng)計數(shù)據(jù)。
[0042]圖17顯示在對照組和敲低DAXX細胞系中表達端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶TERT，ChromatinFraction實驗檢測TERT在胞質(zhì)和染色質(zhì)的分布情況。
【具體實施方式】
[0043]以下結(jié)合附圖和具體實施例來進一步說明本發(fā)明，但實施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、設(shè)備為本【技術(shù)領(lǐng)域】常規(guī)試劑和設(shè)備；未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或制造廠商所建議條件實施。
[0044]以下實施例所使用的蛋白DAXX，是通過從哈佛醫(yī)學院ORFeome數(shù)據(jù)庫購買包含其序列的入門載體PD0NR223，然后連接到含有不同標簽(如SFB，HA, GST)的表達載體中，再通過大腸桿菌原核表達或者真核細胞中表達得到。
[0045]腫瘤細胞(Hela，HTC75)、腫瘤細胞(U20S)、293T細胞(人腎上皮細胞)，均購買于上海中國科學院細胞庫。
[0046]實施例1免疫熒光實·驗 1、實驗材料
試劑:本實驗所用兔多抗DAXX內(nèi)源抗體(購于Santa Cruz公司，產(chǎn)品貨號sc_7152)，使用時用3%牛血清蛋白(BSA)按1:200稀釋；coilin抗體(購于Abcam公司，產(chǎn)品貨號ab11822)，使用時用3% BSA按1:2000稀釋；PML抗體(購于Santa Cruz公司，產(chǎn)品貨號sc-966)，使用時用3% BSA按1:100稀釋；HA抗體(購于sigma公司，產(chǎn)品貨號H3663)，使用時用3% BSA按1:500稀釋；二抗(羊抗鼠，F(xiàn)ITC標記，購于Invitrogen公司，產(chǎn)品貨號A11017，羊抗兔，TXRED標記，購于聯(lián)科生物公司，產(chǎn)品貨號LK-GAR5492)，使用時用3% BSA按1:2000稀釋；PNA端粒探針(購于Panagene公司，產(chǎn)品貨號F1009-5)，工作濃度為10nM。
[0047]2、實驗方法
S1.細胞準備:按照常規(guī)腫瘤細胞培養(yǎng)方法進行培養(yǎng)，將培養(yǎng)的腫瘤細胞放入24孔板(用前在24孔板中放入蓋玻片)，讓細胞在蓋玻片上貼壁生長，待細胞生長至細胞匯合度為85%~95%時，吸走培養(yǎng)基，用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗兩次；
所述培養(yǎng)基的組成為=DMEM培養(yǎng)基、10%FBS。
[0048]S2.固定:加4%多聚甲醛，冰上固定細胞lOmin，再用PBS洗兩次，置于水平搖床，室溫震蕩2min。
[0049]S3.細胞通透處理:每孔加入 ImL 透化液(5% Triton-X, 20mM HEPES,50mM NaCl,3mM MgCl2, 300mM Sucrose),室溫靜置30分鐘后，加入適量的體積比濃度5%的羊血清(用PBS配制)洗三次，每次5分鐘，置于水平搖床。
[0050]S4.封閉:用體積比濃度5%的羊血清(用PBS配制)做封閉液，封閉至少I小時，濾干玻片。
[0051]S5.—抗結(jié)合:孵一抗，倒扣，4°C過夜(12小時)，置于濕盒中，用吐溫含量為0.1%的磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)清洗三次，每次15分鐘。
[0052]S6.二抗結(jié)合(該步驟需避光):濾干玻片，孵二抗，置于室溫I小時后PBST洗三次，每次15分鐘；加入適量固定液(4%多聚甲醛)，冰上固定15分鐘，之后用PBS洗兩次，每次15分鐘，依次用體積比濃度為70%、90%、100%的無水乙醇脫水，風干。
[0053]S7.加 PNA探針:加PNA端粒探針，倒扣在載玻片上，85°C熱變性，濕盒中孵育2小時；wash I (IOmM Tris-HCL (ΡΗ7.4)，70% 甲酰胺，0.1%BSA)洗兩次，wash II (Tris-HCL緩沖鹽溶液，0.l%Tween 20)洗三次，依次用體積比濃度為70%、90%、100%的無水乙醇脫水。
[0054]S8.封片及檢測:自然風干，加封片液(DAPI)染核，涂指甲油封片，熒光顯微鏡檢測。[0055]3、實驗結(jié)果
(I)實驗結(jié)果如附圖1所示，DAXX能夠定位到端粒酶陽性的腫瘤細胞(Hela，HTC75)的端粒上，并且也能夠定位到ALT機制腫瘤細胞(U20S)的端粒上，而且偏向于長度較長的端粒上。
[0056](2)進一步地，免疫熒光實驗檢測到DAXX與端粒酶組裝部位卡哈爾小體(Cajalbody)共定位并且這種定位是周期依賴的，主要集中在S期早期，與端粒酶組裝時期符合(如附圖2、附圖3所示)。
[0057](3)實驗結(jié)果還顯示了，某些DAXX的疾病突變體不能夠去到卡哈爾小體(Cajalbody)中(如附圖4、附圖5所示)，說明DAXX的疾病突變體能夠影響端粒酶的組裝或組裝后的運輸。
[0058](4)敲低U20S細胞中DAXX表達水平，結(jié)合免疫熒光實驗結(jié)果顯示，敲低U20S細胞中DAXX表達水平，能夠增加ALT機制細胞的標記ALT相關(guān)的PML小體的數(shù)量。說明DAXX的失活能夠增強ALT的活性(如附圖6所示)。表明在ALT機制腫瘤細胞中的蛋白表達水平與ALT機制的標記ALT相關(guān)的PML小體(APB)的數(shù)量呈負相關(guān)。
[0059]實施例2串聯(lián)親和純化(TAP)結(jié)合液相色譜質(zhì)譜實驗 1、實驗方法
首先利用Invitrogen公司Gateway技術(shù)，將從哈佛醫(yī)學院購買的入門載體DAXXpDonor223通過LR反應(yīng)連接到目的載體pBabe-CMV-SFB-puro (美國貝勒醫(yī)學院生化與分子生物學實驗室惠贈，SFB同時含有鏈霉親和素結(jié)合的標簽(B標簽)，核糖核酸酶A蛋白水解剪切后的一段肽段S標簽，F(xiàn)lag標簽)中，制備得到pBabe-CMV-SFB-DAXX-puro病毒載體(反應(yīng)條件參照Invitrogen公司產(chǎn)品LR CL0NASE II ENZYME MIX產(chǎn)品說明書，貨號11791020)，通過包裝表達DAXX-SFB的逆轉(zhuǎn)錄病毒，感染293T細胞，48小時用嘌呤霉素篩選，挑選能穩(wěn)定表達DAXX-SFB的293T單克隆細胞系，經(jīng)大規(guī)模培養(yǎng)后，裂解細胞提取蛋白，然后將蛋白經(jīng)過鏈霉親和素瓊脂糖珠(從Amersham Biosciences購買,貨號17_5113_01)和S蛋白瓊脂糖珠(從Novagen公司購買，貨號69704-4) 2步純化，獲得含有DAXX-SFB的與DAXX互相作用的蛋白，將該蛋白跑SDS-PAGE膠分離，切下特異膠帶，送去哈佛醫(yī)學院進行質(zhì)譜結(jié)果分析。
[0060]2、實驗結(jié)果實驗結(jié)果如附圖7所示，在端粒酶陽性的293T細胞中的質(zhì)譜結(jié)果顯示，DAXX除了能夠拉下已知相互作用的蛋白ATRX和組蛋白外,還能拉下端粒酶復(fù)合物(DKC1, coilin, GARl,NAFl等)，說明DAXX能與端粒酶相互作用。
[0061]實施例3 雙分子突光互補實驗(Bimolecular fluorescence complementation,BiFC)
1、實驗方法
首先利用Invitrogen公司Gateway技術(shù)，將從哈佛醫(yī)學院購買的入門載體DKClpDonor223通過LR反應(yīng)連接到目的載體pBabe-CMV-YFPn_neo (美國貝勒醫(yī)學院生化與分子生物學實驗室惠贈)中，制備得到pBabe-CMV-YFPn-DKCl-neo病毒載體，以該病毒感染HTC75細胞并用抗生素G418篩選出穩(wěn)定表達DKCl-YFPn的誘餌(Bait)細胞。然后用同樣的方法利用Invitrogen公司Gateway技術(shù),將從哈佛醫(yī)學院購買的入門載體DAXX pDonor223通過LR反應(yīng)連接到目的載體pBabe-CMV-YFPc-puro (貝勒醫(yī)學院生化與分子生物學實驗室惠贈)中，制備得到pBabe-CMV- YFPc-DAXX-puro病毒載體，以該病毒感染篩選出的穩(wěn)定細胞系(Prey細胞),再通過嘌呤霉素(puro)篩選,最后使用流式細胞儀技術(shù)分析兩者是否具有相互作用。
[0062]2、實驗結(jié)果
實驗結(jié)果如附圖8所示，雙分子熒光互補技術(shù)實驗中，分別表達連有YFP部分結(jié)構(gòu)的DAXX和DKCl，兩半YFP蛋白重新結(jié)合成會發(fā)熒光的完整的YFP蛋白，從而證實了 DAXX可以與蛋白DKCl相互作用。
[0063]實施例4免疫共沉淀實驗
1、實驗使用的抗體有FLAG抗體(購于sigma公司，產(chǎn)品貨號F7425)，使用時用3%牛血清蛋白(BSA)按1:5000稀釋；GST抗體(購于Abmart公司，產(chǎn)品貨號M20007)，使用時用3%牛血清蛋白(BSA)按1:5000稀釋；DKC1抗體(購于Santa cruz公司，產(chǎn)品貨號sc-48794)，使用時用3%牛血清蛋白(BSA)按1:500稀釋；ATRX抗體(購于Santa cruz公司，產(chǎn)品貨號sc-15408)，使用時用3%牛血清蛋白(BSA)按1:500稀釋；H3抗體(購于Cell signalingtechnology公司，產(chǎn)品貨號9701S)，使用時用3%牛血清蛋白(BSA)按1:1000稀釋。
[0064]2、體內(nèi)免疫共沉淀實驗
在293T細胞中共轉(zhuǎn)染待驗證相互作用的蛋白(DAXX和DKCl，DAXX和TERT )。所述DKCl的cDNA全長是通過PCR方法從Hela細胞中獲得并連接到InvitrogenpEnter-D-TOPO入門載體，得到DKCl pENTER載體，然后再利用Gateway技術(shù)進行LR反應(yīng)連接到pCL-CMV-2XFlag-puro目的載體(美國貝勒醫(yī)學院生化與分子生物學實驗室惠贈)；所述TERT的cDNA全長是通過PCR方法從Hela細胞中獲得并連接到InvitrogenpEnter-D-TOPO入門載體，得到記為TERT pENTER載體，然后再利用Gateway技術(shù)進行LR反應(yīng)連接到pBabe-CMV-SFB-puro目的載體(美國貝勒醫(yī)學院生化與分子生物學實驗室惠贈)，得到TERT-SFB載體質(zhì)粒。通過GST pull down,然后western blot (使用FLAG抗體、GST抗體)檢測拉下來的蛋白，或者單獨轉(zhuǎn)染DAXX突變體，通過Flag IP (FlagImmunoprecipitation),然后 western blot (使用 FLAG 抗體、DKCl 抗體、ATRX 抗體、和 H3抗體)檢測與ATRX，DKCl, H3的相互作用。
[0065]3、體外免疫共沉淀實驗首先以含有DAXX的pD0NR223為模板，通過PCR方法拿到DAXX核苷酸序列全長的161-240位，以DKCl pENTER載體為模板，通過PCR方法拿到DKC核苷酸序列全長的1-250位這段序列，然后將該PCR產(chǎn)物和Invitrogen pEnter-D-TOPO入門載體空載進行過雙酶切CAscI和艙(/，從Thermo公司購買)，通過T4連接酶進行連接，得到含有目的片段的入門載體，再通過Gateway技術(shù)進行LR反應(yīng)連接到原核表達目的載體H)EST15 (GST標簽，市購于Invitrogen公司)或FOESTU (His標簽,市購于Invitrogen公司)中，獲得能夠在BL21大腸桿菌(市購)中進行表達的目的載體。將獲得的目的載體在BL21大腸桿菌(市購)中經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)表達，并用GST瓊脂糖珠(beads，購自GE公司)及鎳柱進行體外純化得到重組蛋白DAXX 161-240-GST和DKCll-250-His，將2種蛋白4°C孵育過夜，然后4°C與GST瓊脂糖珠孵育2小時，NETN洗3遍，然后跑SDS-PAGE膠，考馬斯亮藍檢測結(jié)果。
[0066]4、實驗結(jié)果
實驗結(jié)果顯示，體內(nèi)和體外的免疫共沉淀實驗證實了 DAXX與DKCl的相互作用是直接的，DAXX能夠與端粒酶核心組分逆轉(zhuǎn)錄酶hTERT相互作用(如附圖9所示)，說明DAXX的確能夠與端粒酶組分相互作用。
[0067]實驗結(jié)果還顯示了 DAXX疾病突變體能夠影響與ATRX、組蛋白H3.3或端粒酶組分DKCl相互作用(如附圖10所示)。
[0068]實施例5免疫沉淀相結(jié)合的端粒酶活性實驗 1、實驗方法
在293T細胞中瞬時轉(zhuǎn)染帶Flag標簽的DAXX核苷酸序列全長及truncate突變體和疾病突變體的質(zhì)粒，48小時后收集蛋白，經(jīng)過Flag IP后，用3XFlag P印tide洗脫beads上的蛋白。將洗脫下來的蛋白與體外端粒酶延伸的底物(底物是一段序列為AATCCGTCGAGCAGAGTT的引物)孵育，然后通過實時熒光定量PCR技術(shù)檢測拉下來的端粒酶活性。
[0069]2、實驗結(jié)果
實驗結(jié)果顯示，DAXX的N端能夠拉下極強的端粒酶活性，C端不能，說明DAXX N端是與端粒酶相互作用的部位(如附圖11、附圖12所示)。另外，某些DAXX的疾病突變體能夠減弱與端粒酶的相互作用(如附圖13所示)。
[0070]實施例6通過shRNA蛋白敲低的方法研究DAXX對腫瘤細胞的作用機制
1、本實施例中的穩(wěn)定表達shRNA (shDAXX)的細胞系的篩選方法
首先合成含有shRNA正反序列的oligo引物，通過梯度降溫的方式將2條引物退火，將退火好的含有shRNA正反序列的雙鏈RNA連接于pcl-MU6載體中，制備逆轉(zhuǎn)錄病毒。以病毒感染HTC75細胞或者U20S細胞，并用嘌呤霉素篩選出穩(wěn)定表達shRNA的細胞系。
[0071]2、Southern blot 實驗 (1）實驗方法
首先構(gòu)建穩(wěn)定表達shDAXX和DAXX疾病突變體的HTC75細胞系，通過western檢測shRNA的敲低效率，取不同代次的細胞，提取基因組DNA，使用限制性內(nèi)切酶fca/和HinfI將其切碎到只剩下端粒區(qū)，跑0.7%瓊脂糖凝膠電泳分離，然后轉(zhuǎn)移到尼龍膜(購自GE公司)上，紫外交聯(lián)，然后變性、中和，與同位素P32標記的端粒探針雜交，然后用Typhoon掃描儀進行信號檢測。[0072](2)實驗結(jié)果
實驗結(jié)果顯示，敲低HTC75細胞中DAXX表達水平，導(dǎo)致端粒長度逐漸變短(如附圖14所示)，過表達DAXX疾病突變體也能夠?qū)е露肆ｉL度變短(如附圖15、附圖16所示)，說明DAXX能夠正調(diào)控端粒長度。
[0073]3、核質(zhì)分離(Chromatin Fraction)實驗 (O實驗方法
構(gòu)建穩(wěn)定表達shDAXX的293T細胞系，瞬時轉(zhuǎn)染能夠表達端粒酶核心組分逆轉(zhuǎn)錄酶的載體TERT-SFB(構(gòu)建方法同實施例4中2步驟所述)，48小時后收集細胞，首先用低鹽裂解液(20 mM Tris-HCl, pH 8.0, IOmMNaCl, 1.5mM MgC12, I mM EDTA, 0.5% Nonidet P-40,20mM NaF, ImM Na3V04, I μ g/ml aprotinin, and I μ g/ml pepstatin)提取胞質(zhì)蛋白，將細胞沉淀用PBS洗3遍后，用0.2M HCl提取結(jié)合在染色質(zhì)上的蛋白。跑SDS-PAGE膠，進行western blot檢測(使用FLAG抗體、GAPDH抗體(購于Abmart公司，產(chǎn)品貨號M20006M,使用時用3%牛血清蛋白(BSA)按1:5000稀釋)、H3抗體)。用GAPDH抗體和H3抗體檢測細胞質(zhì)和染色質(zhì)分離效果。
[0074](2)實驗結(jié)果
實驗結(jié)果顯示，敲低293T細胞中DAXX表達水平，能夠影響端粒酶核心組分逆轉(zhuǎn)錄酶hTERT運輸?shù)蕉肆Ｉ先パ由於肆?如附圖17所示)，說明DAXX是通過影響端粒酶的運輸來調(diào)節(jié)端粒長度的。
【權(quán)利要求】
1.端粒結(jié)合蛋白DAXX在制備端粒酶機制腫瘤細胞調(diào)控劑方面的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用是端粒結(jié)合蛋白DAXX在制備端粒酶機制腫瘤細胞中端粒酶組裝和運輸?shù)恼{(diào)控劑中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求1所述端粒結(jié)合蛋白DAXX的抑制劑及其表達抑制劑在制備抗端粒酶機制腫瘤細胞藥物中的應(yīng)用。
4.端粒結(jié)合蛋白DAXX在制備不依賴端粒酶端粒延長機制腫瘤細胞調(diào)控劑中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用是端粒結(jié)合蛋白DAXX在制備不依賴端粒酶端粒延長機制的腫瘤細胞端粒長度的調(diào)控劑中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求4所述端粒結(jié)合蛋白DAXX的激活劑及其表達調(diào)控劑在制備抗不依賴端粒酶端粒延長機制腫瘤細胞藥物中的應(yīng)用。
7.一種抗端粒酶陽性腫瘤細胞的藥物制劑，其特征在于，包括有效量的端粒結(jié)合蛋白DAXX和藥學上可接受的輔料。
8.一種抗不依賴端粒酶端粒延長機制腫瘤細胞的藥物制劑，其特征在于，包括有效量的端粒結(jié)合蛋白DAXX和藥學上可接受的輔料。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的藥物制劑，其特征在于，所述藥物制劑為注射制劑或口服制劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述藥物制劑，其特征在于，所述注射制劑為凍干粉針劑，所述口服制劑為散片劑、膠囊劑或顆 粒劑。
【文檔編號】A61P35/00GK103585618SQ201310527333
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年10月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月31日
【發(fā)明者】松陽洲, 唐夢帆 申請人:中山大學