一種環(huán)狀的合成多肽d及其抗菌抗病毒應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種環(huán)狀的合成多肽D及其抗菌抗病毒應用。本發(fā)明所涉及的環(huán)狀的合成多肽D具有序列列表中SEQ?ID?No.1所示的氨基酸序列及結(jié)構(gòu)特征；該環(huán)狀的合成多肽D衍生自序列列表中SEQ?ID?No.2所示中國明對蝦抗脂多糖因子FcALF5的LPS結(jié)合結(jié)構(gòu)域；經(jīng)對本發(fā)明涉及的環(huán)狀的合成多肽D進行生物功能體外驗證，證實其對病毒的增殖具有很強的抑制作用，對革蘭氏陽性菌的生長具有較強的抑制作用。
【專利說明】一種環(huán)狀的合成多肽D及其抗菌抗病毒應用
【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種環(huán)狀的合成多肽D及其抗菌抗病毒應用，具體地說是一種合成的衍生自中國明對蝦抗脂多糖因子FcALF5的脂多糖(LPS)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的環(huán)狀多肽及其抗菌抗病毒應用。
【背景技術(shù)】
[0002]對蝦的養(yǎng)殖在我國的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中占有重要地位，近些年來，對蝦養(yǎng)殖過程中的病害問題已經(jīng)嚴重阻礙了其養(yǎng)殖生產(chǎn)的健康發(fā)展，抗生素的濫用與環(huán)境的惡化使海水養(yǎng)殖動物的病害難以從根本上得到控制。
[0003]抗菌肽(蛋白)被認為是魚、蝦、貝等防御細菌、病毒等外源病原感染的重要效應分子，在動物的先天免疫過程中發(fā)揮重要作用。目前從甲殼動物中發(fā)現(xiàn)的抗菌肽種類繁多，抗脂多糖因子(ant1-lipopolysaccharide factor, ALF)就是其中一種重要的抗菌肽。1982年，Tanaka 等首次從中國當(Tachypleus tridentatus)和北美當(Limulus polyphemus)的血細胞中分離得到ALF，并發(fā)現(xiàn)其能抑制LPS介導的凝血反應的激活。1985年，Morita等發(fā)現(xiàn)ALF還具有很強的抗革蘭氏陰性菌活性。之后，人們相繼在斑節(jié)對蝦(Penaeusmonodon)、中國明對蟲下(Fenneropenaeus chinensis)、臼本囊對蟲下(Marsupenaeusjaponicus)、凡納濱對蟲下(Litopenaeus vannamei)> 桃紅對蟲下(Farfantepenaeusduorarum)等多種甲殼動物中發(fā)現(xiàn)ALF基因的存在,并證實ALF的重組蛋白具有廣泛的抗革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌生長的活性。另外，研究還發(fā)現(xiàn)對蝦白斑綜合征病毒(WSSV)預先與重組表達的ALF蛋白一起孵育后再注射入蝦體中，能抑制蝦體中WSSV的復制。
[0004]與傳統(tǒng)抗生素的作用機理不同，ALF直接中和細菌細胞壁的脂多糖，溶解細菌，因此不易產(chǎn)生細菌的耐藥性。ALF對病毒的作用機理目前仍不清楚。隨著抗生素的應用，許多病原菌對現(xiàn)有抗生素逐步產(chǎn)生耐藥性，而新型抗生素的發(fā)現(xiàn)又極其困難，因此，ALF的研究為開發(fā)新型抗菌藥物開辟了廣闊的前景。
[0005]研究發(fā)現(xiàn)，ALF氨基酸序列中的兩個保守半胱氨酸之間形成二硫鍵，并與之間的氨基酸序列共同形成一段陰離子多肽，具有與LPS結(jié)合的能力，這段保守的結(jié)構(gòu)命名為LPS結(jié)合結(jié)構(gòu)域，被認為是ALF降解革蘭氏陰性菌細胞壁脂多糖的功能域。2011年，Sachin Sharma等研究了根據(jù)鋸緣青蟹(Scylla serrata) ALF的LPS結(jié)合結(jié)構(gòu)域合成的具24個氨基酸殘基的多肽在抗菌免疫過程中作用，發(fā)現(xiàn)合成多肽SsALF24具有結(jié)合LPS的活性并且對大腸桿菌都具有明顯的抑制作用，其最小抑制濃度為16.16~32.32uM (Sharma S, Yedery RD, Patgaonkar MS, Selvaakumar C，Reddy KV.Antibacterialactivity of a synthetic peptide that mimics the LPS binding domain of Indianmud crab, Scylla serrata ant1-lipopoIysaccharide factor (SsALF)also involved inthe modulation of vaginal immune functions through NF_kB signaling.Microbialpathogenesis2011;50:179-191.)。
[0006]中國明對蝦中的FcALF5已被發(fā)現(xiàn)，研究表明其在對蝦體內(nèi)響應病毒的感染(LiSH，Zhang XJ，Sun Z，Li FH，Xiang JH.Transcriptome analysis on Chinese shrimpFenneropenaeus chinensis during WSSV acute infection.PLoS ONE，8(3):e58627.)?；谝延械难芯拷Y(jié)果，本發(fā)明依據(jù)中國明對蝦FcALF5的氨基酸序列，利用化學合成的方法獲得了其LPS結(jié)合結(jié)構(gòu)域的環(huán)形多肽D，該環(huán)狀多肽具有明顯的抗菌抗病毒生物學活性，具有重要的應用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明旨在提供一種來源于對蝦的環(huán)狀的合成多肽D，具有明顯的抗菌和抗病毒活性。
[0008]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0009]利用化學合成的方法獲得了環(huán)狀的合成多肽D，具有SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列，其序列特征為:
[0010]SEQ ID N0.1:Ac-Yc(C LLSRSPYLKKLEVHYRAELKC)P-NH2
[0011]所述的環(huán)狀的合成多肽D序列具有二硫鍵結(jié)構(gòu)。其結(jié)構(gòu)特征在于:合成多肽D序列氨基端第二個半胱氨酸(C)和羧基端第二個半胱氨酸(C)之間具有二硫鍵結(jié)構(gòu)；多肽的氨基端Y的氨基被乙?；?Ac-)，羧基端P的羧基被酰胺化(-NH2)。
[0012]所述的環(huán)狀的合成多肽D來自中國明對蝦抗脂多糖因子FcALF5的LPS結(jié)合結(jié)構(gòu)域。FcALF5的特征在于:具有序列列表中SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列。
[0013]所述的環(huán)狀的合成多肽D具有明顯的抗菌抗病毒活性。具體為:對病毒的增殖具有很強的抑制作用，對革蘭氏陽性菌的生長具有較強的抑制作用。
[0014]所述環(huán)狀的合成多肽D可作為抗菌和/或抗病毒的活性成份，用于制備抗菌和/或抗病毒的藥物或制劑中。
[0015]本發(fā)明有如下優(yōu)點:
[0016]1、本發(fā)明確定了一種衍生自中國明對蝦抗脂多糖因子FcALF5的抗菌抗病毒多肽D及其結(jié)構(gòu)特征。
[0017]2、通過本發(fā)明可開發(fā)有效的對蝦細菌類和病毒類疾病的防治藥物。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1合成多肽D的骨架結(jié)構(gòu)圖；
[0019]圖2合成多肽D的空間結(jié)構(gòu)圖；
[0020]圖3合成多肽D的HPLC純度檢測圖；
[0021]圖4合成多肽D的MS質(zhì)譜鑒定圖。
【具體實施方式】
[0022]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。
[0023]一種化學合成的具有明顯抗菌和抗病毒活性的對蝦環(huán)狀多肽D，其序列及來源序列信息如下:
[0024](I) SEQ ID N0.1 的信息
[0025](a)序列特征[0026]*長度:24氨基酸
[0027]*類型:氨基酸
[0028]*鏈型:單鏈[0029]*拓撲結(jié)構(gòu):環(huán)形，兩個半胱氨酸之間形成二硫鍵
[0030]*空間結(jié)構(gòu):具有I)圖1所示骨架結(jié)構(gòu):兩個半胱氨酸之間通過二硫鍵相連接，形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，其中二硫鍵用加深黑色表示，C骨架及其它原子用灰色表示；和2)圖2所示空間結(jié)構(gòu):多肽序列形成兩個相連的β折疊結(jié)構(gòu)。
[0031](b)分子類型:蛋白
[0032]序列描述:SEQID N0.1
[0033]Ac-Yc(CLLSRSPYLKKLEVHYRAELKC)P-NH2
[0034]其中括號內(nèi)的氨基酸為成環(huán)的氨基酸，括號外左側(cè)的小寫c表示括號內(nèi)的氨基酸為形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)氨基酸；Ac-表示氨基酸Y的氨基被乙?；?NH2表示氨基酸P的羧基被乙?；?br> [0035](2) SEQ ID N0.2 的信息
[0036](a)序列特征
[0037]*長度:123氨基酸
[0038]*類型:氨基酸
[0039]*鏈型:單鏈
[0040]*拓撲結(jié)構(gòu):線性
[0041](b)分子類型:蛋白
[0042]序列描述:SEQID N0.2
[0043]MTSSTSRASVFPLVCFLLIASASARPQL⑶ILGSLVTTFVENAVKTTETTILDNYCLLSRSPYLKKLEVHYRAELK CPGWTTIVGKGRDHTNPTNSELDAIKDFIRQALEKGLVTDEEAAQYL
[0044]所述抗菌抗病毒多肽D的合成、環(huán)化、純化、鑒定及生物活性分析:
[0045]通過人工化學合成途徑，利用固相合成方法獲得粗品多肽，經(jīng)固相環(huán)化、質(zhì)譜鑒定和液相色譜純化獲得含有二硫鍵的合成多肽D。具體為:
[0046]I)多肽合成
[0047]采用9-荷甲氧羰基(Fmoc)合成策略，從C端向N端方向合成。用IOmgRink-Amide-Resin樹脂(AAPPTec，貨號RRZOOI)作為載體，依靠載體本身的活性基團與5mg被Fmoc進行氨基保護的第一個氨基酸(Fmoc-Pro-NH2)的羧基相連(詳細方法參考文獻:Panagiotis Stathopoulos, Serafim Papas, Vassilios Tsikaris.C-terminalN-alkylated peptide amides resulting from the linker decomposition of the Rinkamide resin.A new cleavage mixture prevents their formation.Journal of PeptideScience2006;12:227-232.)。
[0048]用N-甲基毗咯皖酣(NMP)沖洗樹脂除去多余保護氨基酸，向反應器(固相合成器)中加入20%哌啶/NMP溶液(體積分數(shù))脫除Fmoc基團，反應20min，排空反應器，用5mLNMP振蕩沖洗樹脂，重復3次，脫除第一個氨基酸殘基的Fmoc保護；裸露出的活性氨基基團與下一個被Fmoc進行氨基保護的氨基酸(5mg)的羧基相連,形成第一個肽鍵(Pro-Cys)。此段的以上步驟循環(huán)進行(不同之處在于:只是每次需采用對應的被Fmoc進行氨基保護的氨基酸)直至多肽序列Ac-YC LLSRSPYLKKLEVHYRAELKCP-NH2合成完畢，得約20mg線性多肽。
[0049]2)多肽環(huán)化
[0050]20mg線性多肽偶聯(lián)完最后一個氨基酸后，配置0.lmol/L的I2溶液(I2溶于體積比1:1的甲醇:DMF混合溶液中)，加入IOmL至固相合成器中，氮氣吹拂反應，約6小時。
[0051]3)多肽純化和鑒定
[0052]用50mL切肽試劑三氟乙酸:苯甲硫醚:苯酚:乙二硫醇:雙蒸水(體積比82.5:5:5:2.5:5)將20mg環(huán)化后的多肽從載體樹脂上裂解下來，2小時后，加入4°C預冷的乙醚100ml使多肽沉淀，離心收集沉淀物，并用乙醚洗滌3遍，真空抽干，得到的多肽粗品經(jīng)反向液相色譜純化，純化后的多肽凍干后進行HPLC純度檢測(圖3)和質(zhì)譜鑒定(圖4)。檢測 HPLC 色譜柱為 250*4.6mm, Kromasi1-C18-5 μ m ;流動相 A:0.1%TFA/ 乙腈,流動相 B:0.1%TFA/H20 ;線性洗脫梯度:15%A-100%A ;流速為lml/min，檢測波長為220nm ;—次進樣量為10 μ I。HPLC和MS檢測結(jié)果顯示，合成多肽D的純度為97.90%，分子量為2951.49，與預測分子量(2949.56)基本一致。
[0053]4)抑菌試驗
[0054]合成多肽D用50mmol/L pH7.4的PBS溶解至濃度為640 μ mo I/L的溶液，同時以50mmol/L pH7.4的PBS為陰性對照。采用最低抑菌濃度(MIC)方法檢測合成多肽對革蘭氏陰性菌包括大腸桿菌(Escherichia coli)、鰻弧菌(Vibrio anguillarum)和革蘭氏陽性菌包括藤黃微球菌(Micrococcus luteus)、溶壁微球菌(Micrococcus Iysodeikticus)的抑菌活性。即:將待測大腸桿菌、藤黃微球菌和溶壁微球菌分別在37°C，200r/min培養(yǎng)條件下于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至lX108cellS/mL，鰻弧菌培養(yǎng)溫度為28°C，其它條件同上不變；培養(yǎng)的細菌分別加入到48孔培養(yǎng)板中，用新鮮的LB培養(yǎng)基將待測菌液稀釋稀釋至終濃度I X IO6ceIlsAiL ;向48孔培養(yǎng)板中分別加入梯度稀釋的多肽D溶液至終體積為200 μ 1，多妝 D 終濃度依次為 64 μ mol/L、32 μ mol/L、16 μ mol/L、8 μ mol/L、4 μ mol/L、2 μ mol/L 和I μ mol/L ;用PBS作為陰性對照，終濃度58 μ mol/L的氨芐青霉素(大腸桿菌、藤黃微球菌、溶壁微球菌)或88 μ mol/L的卡那霉素(鰻弧菌)分別作為陽性對照；在37°C或28°C條件下培養(yǎng)3h后，分別加入300 μ I新鮮LB培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)18h，測定每孔中細菌的0D600吸光值，計算細菌濃度。
[0055]結(jié)果表明，對革蘭氏陰性菌的生長無明顯抑制作用；對革蘭氏陽性菌，16-32 μ mol/L的合成多肽D能夠有效抑制溶壁微球菌的生長。說明合成多肽D具有抵抗革蘭氏陽性菌的活性。
[0056]5)病毒中和實驗
[0057]按實施例抑菌試驗步驟用PBS溶解合成多肽D，用終濃度50 μ mol/L的合成多肽在室溫下與WSSV (white spot syndrome virus,白斑綜合癥病毒)孵育2h ;用相同濃度的無關多肽(相同長度的綠色熒光蛋白GFP肽段)作為陰性對照在相同條件下孵育WSSV，孵育后的WSSV分別注射脊尾白奸(Exopalaemon carinicauda),每尾奸的注射量為IO4拷貝WSSV粒子；注射24h后取脊尾白蝦游泳足，采用天根生化科技有限公司的DNA提取試劑盒(貨號:DP324)提取總DNA ;梯度稀釋WSSV作為標準品，利用WSSV拷貝數(shù)檢測引物對VP28rF(5，-AAACCTCCGCATTCCTGTGA-3’ )和 VP28rR (5，-TCCGCATCTTCTTCCTTCAT-3’)，采用實時熒光定量PCR技術(shù)分別擴增標準品和待測對蝦DNA樣品中VP28基因的表達量(詳細檢測方法參考文獻:Yumiao Sun, Fuhua Li, Jianhai Xiang.Analysis on the dynamic changes ofthe amount of WSSV in Chinese shrimp Fenneropenaeus chinensis during infection.Aquaculture2013; 376-379:124-132.)，然后換算成待測對蝦DNA樣品中WSSV的拷貝數(shù)。
[0058]結(jié)果表明，合成多肽D處理組的WSSV拷貝數(shù)為6.99 X 103/ng DNA,而GFP陰性對照組的WSSV拷貝數(shù)為1.67 XioVng DNA,處理組中WSSV的拷貝數(shù)明顯低于對照組，說明合成多肽D具有明顯抗病毒活性。
[0059]該多肽D的發(fā)現(xiàn)及生物活性 鑒定，在新型抗菌抗病毒藥物的開發(fā)上具有重要的應用前景。
【權(quán)利要求】
1.一種環(huán)狀的合成多肽D，其特征在于:具有序列列表中SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列。
2.按照權(quán)利要求1所述的環(huán)狀的合成多肽D，其結(jié)構(gòu)特征為: 所述的環(huán)狀的合成多肽D序列具有二硫鍵結(jié)構(gòu)，多肽D的氨基端第二個半胱氨酸(C)和羧基端第二個半胱氨酸(C)之間具有二硫鍵結(jié)構(gòu)。
3.按照權(quán)利要求1或2所述的環(huán)狀的合成多肽D，其序列特征在于:SEQID N0.1:Ac-Yc (CLLSRSPYLKKLEVHYRAELKC)P-NH2。
4.按照權(quán)利要求1或2所述的環(huán)狀的合成多肽D，其特征在于:所述的環(huán)狀的合成多肽D衍生自中國明對蝦抗脂多糖因子FcALF5的LPS結(jié)合結(jié)構(gòu)域，F(xiàn)cALF5具有序列列表中SEQID N0.2所示的氨基酸序列。
5.一種權(quán)利要求1-4任一所述環(huán)狀的合成多肽D的應用，其特征在于 : 所述環(huán)狀的合成多肽D對病毒的增殖具有很強的抑制作用，對革蘭氏陽性菌的生長具有較強的抑制作用，其可用于抗菌和/或抗病毒的制劑中。
6.按照權(quán)利要求5所述環(huán)狀的合成多肽D的應用，其特征在于: 所述環(huán)狀的合成多肽D可作為抗菌和/或抗病毒的活性成份，用于制備抗菌和/或抗病毒的藥物或制劑中。
【文檔編號】A61P31/20GK103539849SQ201310534958
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年11月1日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月1日
【發(fā)明者】李富花, 李詩豪, 郭書悅, 相建海 申請人:中國科學院海洋研究所