一種茯苓皮有效成分的提取方法及其提取物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種茯苓皮有效成分的提取方法，包括：將茯苓皮用鹽酸沖洗，水洗至中性，晾干；將茯苓皮用乙醇回流提取，提取液回收乙醇至干；將干物質(zhì)用水溶解，加入正丁醇和乙酸乙酯的混合物萃取，有機相回收溶劑至干，得粗品；粗品用乙醇溶解，配成溶液，所得溶液上中性氧化鋁層析柱，然后用乙醇和乙酸乙酯的混合物進行洗脫，收集洗脫液；向洗脫液中加入活性炭，過濾，濾液濃縮、靜置、過濾、干燥，得有效成分。本發(fā)明提取方法穩(wěn)定、提取效率高，大大提高了提取物的收率和有效成分的含量，所得提取物中3β-羥基-羊毛甾7,9（11），24-三烯-21-酸和去氫依布里酸含量較大，提取物具有降血糖、降血脂的作用，具有較好的應用前景。
【專利說明】一種茯苓皮有效成分的提取方法及其提取物
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種茯苓皮中有效成分的提取方法及所得提取物，具體涉及一種3 β -羥基-羊毛留7，9( 11 )，24-三烯-21-酸和去氫依布里酸含量較大的茯苓皮有效成分的提取方法及所得提取物，屬于中藥提取【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]獲茶為多孔菌科真菌Poria cocos ( Schw.) Wolf的干燥菌核的外皮,異名“茶皮”(《四川中藥志》)，性味“甘淡，平”，功用“利水，消腫”，主治“水腫、腹脹”。茯苓皮主要化學成分有茯苓多糖、三萜、樹膠、蛋白質(zhì)、留醇和脂肪酸等，現(xiàn)代研究結(jié)果表明茯苓中三萜類化學成分具有抗腫瘤、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等活性。
[0003]目前，國內(nèi)外對茯苓中有效成分的提取有一定研究，已從中提取了三萜類化合物、總皂苷、茯苓多糖、黃酮類化合物等有效成分。相對的，從茯苓皮中提取有效成分的研究較少，茯苓皮中含有比較豐富的三萜類化合物，專利201210168614.1公開了一種茯苓皮提取物及其在制備利尿作用藥物中的應用，方案是:茯苓皮用乙醇滲漉、然后用乙酸乙酯萃取、然后上硅膠柱用石油醚-乙酸乙酯洗脫、濃縮得提取物。所得提取物具有保鈉排鉀的作用，可用于利尿。專利201210235819.7公開了一種茯苓皮提取物及其在治療慢性腎衰竭藥物中的應用，方案為:將茯苓皮用乙醇提取、然后用乙酸乙酯萃取，得提取物。提取物對慢性腎衰竭有一定療效。
[0004]因茯苓皮中含有多種有效成份，因此采用不同的方法所得的有效成分及其含量不盡相同，所表現(xiàn)出來的治療作用也不盡相同。

【發(fā)明內(nèi)容】

`[0005]本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，提供了一種茯苓皮有效成分的提取方法，該方法所得有效成分中3 β -羥基-羊毛留7，9 (11)，24-三烯-21-酸和去氫依布里酸含量較大，收率較高。
[0006]本發(fā)明還提供了采用上述方法所得的茯苓皮提取物。
[0007]本發(fā)明技術(shù)方案如下:
一種茯苓皮有效成分的提取方法，其特征是，包括以下步驟:
(1)將茯苓皮用1.0-2.0wt%的鹽酸沖洗,然后用水沖洗至中性，晾干；
(2)將步驟(1)處理過的茯苓皮用70-95體積％的乙醇溶液回流提取2次，合并提取液，提取液回收乙醇至干；
(3)將步驟(2)的干物質(zhì)用水溶解，加入正丁醇和乙酸乙酯的混合物萃取，有機相回收溶劑至干，得粗品；
(4)粗品用乙醇溶解，配成溶液，所得溶液上中性氧化鋁層析柱，然后用乙醇和乙酸乙酯的混合物進行洗脫，收集洗脫液；
(5)向洗脫液中加入活性炭，加熱至沸騰并保持30min，趁熱過濾，用乙醇洗滌活性炭，合并濾液及洗液，濃縮至原體積的1/3，靜置沉淀、過濾、干燥，得有效成分。
[0008]上述步驟(2)中，茯苓皮與乙醇溶液的用量關(guān)系為1:5-20 (g/ml)。
[0009]上述步驟(2)中，每次提取時間為0.5-3.5h。
[0010]上述步驟(2)中，優(yōu)選用70體積％的乙醇提取茯苓皮，茯苓皮與乙醇溶液的用量關(guān)系為1:10 (g/ml),每次提取時間為0.5 ho
[0011]上述步驟(3)中，正丁醇:乙酸乙酯的體積比為5-10:1.5，優(yōu)選7:1.5。
[0012]上述步驟(3)中，水:正丁醇和乙酸乙酯的混合物的體積比為1:1.5-2。
[0013]上述步驟(4)中，粗品用其100-120質(zhì)量倍的乙醇溶解，配成溶液。
[0014]上述步驟(4)中，中性氧化鋁的質(zhì)量為粗品的15-20倍。
[0015]上述步驟(4)中，乙醇和乙酸乙酯的體積比為2:3-7，優(yōu)選為2:5。
[0016]上述步驟(4)中，乙醇和乙酸乙酯的混合物的用量為氧化鋁的1.5-3倍，優(yōu)選為2倍。
[0017]上述步驟(5)中，活性炭用量為粗品質(zhì)量的2-3%。
[0018]采用上述方法獲得的茯苓皮提取物也應受到保護，提取物中有效成分主要為3 β -羥基-羊毛留7,9 (11)，24-三烯-21-酸和去氫依布里酸，兩者含量在50%以上。
[0019]本發(fā)明提取方法穩(wěn)定、提取效率聞，大大提聞了提取物的收率和有效成分的含量，所得提取物中3 β -羥基-羊毛留7，9 (11`)，24-三烯-21-酸和去氫依布里酸含量較大，提取物具有降血糖、降血脂的作用，具有較好的應用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1為實施例1茯苓皮提取物的色譜圖。
[0021]圖2為3β-羥基-羊毛甾7，9 (11)，24-三烯-21-酸的色譜圖。
[0022]圖3為去氫依布里酸的色譜圖。
【具體實施方式】
[0023]下面對本發(fā)明進行進一步的闡述。
[0024]實施例1
茯苓皮提取方法如下:
1、取5kg茯苓皮，用1.5wt%的鹽酸沖洗一次，然后用水將酸沖洗干凈，至中性后晾干；
2、將晾干后的5kg茯苓皮用70體積％的乙醇溶液回流提取2次，乙醇溶液的用量為50L，每次提取時間為0.5 h，合并提取液，減壓回收乙醇至干，得干物質(zhì)；
3、將步驟2的干物質(zhì)用500ml的水溶散，然后加入750ml正丁醇和乙酸乙酯的混合物(正丁醇:乙酸乙酯體積比=7:1.5)進行萃取，取有機相，回收溶劑至干，得粗品203g ；
4、粗品用20.5L乙醇溶解，配成溶液，取粗品18質(zhì)量倍的中性氧化鋁，裝層析柱，將上述粗品溶液加入層析柱中，使溶液通過層析柱，然后用兩體積倍氧化鋁的乙醇和乙酸乙酯(乙醇:乙酸乙酯體積比=2:5)的混合物進行洗脫，收集洗脫液；
5、向洗脫液中加入6.1g的活性炭，加熱至沸騰，保持微沸30分鐘，趁熱過濾，用乙醇洗滌活性炭，合并濾液及洗液，濃縮至原體積的1/3，靜置沉淀、過濾、60°C干燥，得茯苓皮提取物150g。計算提取物收率=提取物質(zhì)量/茯苓皮質(zhì)量=150/5000=3%。[0025]對提取物中羥基-羊毛留7，9 (11)，24-三烯-21-酸和去氫依布里酸的含量進行測定，方法如下:
1、儀器及試藥=Waters高效液相色譜系統(tǒng)，Water600泵，996 二極管陣列檢測器，M32色譜工作站，Lichrospher-C18柱,200 X 4.6mm, 5 μ (江蘇漢邦科技有限公司產(chǎn)品)。
[0026]2、藥物:乙腈(色譜純級)，3β-羥基-羊毛甾7，9 (11 )，24-三烯_21_酸和去氫依布里酸(山東省中藥新型制劑中心制備，含量均達98.0%以上)。
[0027]3、檢測條件:流動相:乙腈:0.5%乙酸水(80:20)，檢測波長242nm。
[0028]4、對照品溶液的制備
精密稱取3 β -羥基-7，9 (11 )，24-三烯-21-酸對照品，置10 mL容量瓶中，甲醇稀釋至刻度，制成228 μ g -mr1的對照品溶液；精密稱取去氫依布里酸對照品，置10 mL容量瓶中，甲醇稀釋至刻度，制成130 μ g.mL—1的對照品溶液。
[0029]5、供試品溶液的制備
取茯苓皮提取物約40 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μ m的微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。
[0030]6、測定方法
精密吸取上述對照品溶液及供試品溶液各10 μ L，分別注入液相色譜儀中，得到提取物和對照品的色譜圖1-3。
[0031]根據(jù)峰面積計算`，3β-羥基-羊毛甾7，9 (11)，24-三烯-21-酸含量為30.61%，去氫依布里酸含量為32.52%，兩種物質(zhì)共計63.23%。
[0032]實施例2 茯苓皮提取方法如下:
1、取5kg茯苓皮，用1.0wt%的鹽酸沖洗一次，然后用水將酸沖洗干凈，至中性后晾干；
2、將晾干后的5kg茯苓皮用80體積％的乙醇溶液回流提取2次，乙醇溶液的用量為75L，每次提取時間為2h，合并提取液，減壓回收乙醇至干，得干物質(zhì)；
3、將步驟2的干物質(zhì)用500ml的水溶散，然后加入1000ml正丁醇和乙酸乙酯的混合物(正丁醇:乙酸乙酯體積比=5:1.5)進行萃取，取有機相，回收溶劑至干，得粗品186g;
4、粗品用19L乙醇溶解，配成溶液，取粗品15質(zhì)量倍的中性氧化鋁，裝層析柱，將上述粗品溶液加入層析柱中，使溶液通過層析柱，然后用1.5體積倍氧化鋁的乙醇和乙酸乙酯(乙醇:乙酸乙酯體積比=2:3)的混合物進行洗脫，收集洗脫液；
5、向洗脫液中加入3.Sg的活性炭，加熱至沸騰，保持微沸30分鐘，趁熱過濾，用乙醇洗滌活性炭，合并濾液及洗液，濃縮至原體積的1/3，靜置沉淀、過濾、60°C干燥，得茯苓皮提取物 123g。
[0033]采用高效液相色譜法測得提取物中3 β -羥基-羊毛甾7，9(11)和24-三烯-21-酸含量共計55.24%。
[0034]實施例3 茯苓皮提取方法如下:
1、取5kg茯苓皮，用2.0wt%的鹽酸沖洗一次，然后用水將酸沖洗干凈，至中性后晾干；
2、將晾干后的5kg茯苓皮用95體積％的乙醇溶液回流提取2次，乙醇溶液的用量為25L，每次提取時間為3h，合并提取液，減壓回收乙醇至干，得干物質(zhì)；3、將步驟2的干物質(zhì)用500ml的水溶散，然后加入800ml正丁醇和乙酸乙酯的混合物(正丁醇:乙酸乙酯體積比=10:1.5)進行萃取，取有機相，回收溶劑至干，得粗品183g ；
4、粗品用22L乙醇溶解，配成溶液，取粗品20質(zhì)量倍的中性氧化鋁，裝層析柱，將上述粗品溶液加入層析柱中，使溶液通過層析柱，然后用3體積倍氧化鋁的乙醇和乙酸乙酯(乙醇:乙酸乙酯體積比=7:5)的混合物進行洗脫，收集洗脫液；
5、向洗脫液中加入5.5g的活性炭，加熱至沸騰，保持微沸30分鐘，趁熱過濾，用乙醇洗滌活性炭，合并濾液及洗液，濃縮至原體積的1/3，靜置沉淀、過濾、60°C干燥，得茯苓皮提取物 122g。
[0035]采用高效液相色譜法測得提取物中3 β -羥基-羊毛甾7，9(11)和24-三烯-21-酸含量共計53.57%。
[0036]下面以實施例1所得提取物為例，對提取物降血糖、降血脂作用進行研究。
[0037]、實驗動物
健康雄性昆明種小鼠,體重24~26g ;清潔級Wistar大鼠，體重180~220g。
[0038]、儀器與試劑
總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)試劑盒:北京北化精細化學有限責任公司臨床試劑分廠生產(chǎn)。
[0039]四氧嘧啶:香港FARCO公司生產(chǎn)。
[0040]血糖測定儀:英國寶靈曼公司生產(chǎn)。
[0041]半自動生化分析儀:上海第三分析儀器廠生產(chǎn)
3、實驗方法
3.1對糖尿病小鼠血糖的影響
3.1.1糖尿病模型小鼠:采用尾靜脈注射四氧嘧啶(動物禁食24h后給藥，劑量為45mg / kgbw)的方法建立糖尿病動物模型。將尾靜脈注射四氧嘧啶7d后空腹(禁食3h)血糖值大于IOmmol / L的小鼠作為本試驗的糖尿病模型小鼠。
[0042]3.1.2試驗劑量與動物分組:根據(jù)糖尿病模型小鼠的血糖值將其隨機分為四組，其中I個模型對照組，3個提取物劑量組(劑量分別為1.5,2.5,3.5g / kgbw)。每組均12只小鼠。
[0043]3.1.3空腹血糖的測定:上述各劑量組動物連續(xù)給予提取物30d (模型對照組給蒸餾水)后，眼內(nèi)眥取血測全血空腹血糖值(禁食3h)。
[0044]對實驗性高血脂大鼠血脂的影響
3.2.1采用大鼠脂代謝紊亂模型法進行試驗。以基礎(chǔ)飼料喂飼大鼠觀察5d后，空腹取尾血，酶法測定血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)，根據(jù)TC水平將動物隨機分為4組:高脂對照組，三個提取物組(劑量分別為1.5,2.5,3.5g /kgbw)。提取物用蒸餾水按所需濃度配制。自正式試驗開始，各組動物換用高脂飼料，提取物組灌胃給予不同劑量的提取物，高脂對照組灌胃給予同體積的蒸餾水，灌胃量按1.0ml / 100gbw計算，每日一次，連續(xù)40d后，空腹取尾血測定上述各項血脂指標。
[0045]3.2.2動物飼料
基礎(chǔ)飼料:正常顆粒飼料。
[0046]高脂飼料(wt%):基礎(chǔ)飼料79%，膽固醇1%,豬油10%，新鮮蛋黃液10%。[0047]、數(shù)據(jù)處理
采用t檢驗和方差分析進行統(tǒng)計學處理。
[0048]、結(jié)果與分析
5.1提取物對糖尿病模型小鼠空腹血糖的影響
各組糖尿病模型小鼠在接觸提取物前(即試驗前)的平均空腹血糖值均無明顯差別(p>0.05);而在連續(xù)經(jīng)口給予提取物30d(模型對照組給蒸餾水)后(即試驗后)，其平均空腹血糖值及平均空腹血糖降低值均發(fā)生了一定的變化。結(jié)果見表1。
表1提取種!對糠覺病模型小I空腹血.錆值(mmoW；)的影_
【權(quán)利要求】
1.一種茯苓皮有效成分的提取方法，其特征是，包括以下步驟: (1)將茯苓皮用1.0-2.0wt%的鹽酸沖洗,然后用水沖洗至中性，晾干； (2)將步驟(1)處理過的茯苓皮用70-95體積％的乙醇溶液回流提取2次，合并提取液，提取液回收乙醇至干； (3)將步驟(2)的干物質(zhì)用水溶解，加入正丁醇和乙酸乙酯的混合物萃取，有機相回收溶劑至干，得粗品； (4)粗品用乙醇溶解，配成溶液，所得溶液上中性氧化鋁層析柱，然后用乙醇和乙酸乙酯的混合物進行洗脫，收集洗脫液； (5)向洗脫液中加入活性炭，加熱至沸騰并保持30min，趁熱過濾，用乙醇洗滌活性炭，合并濾液及洗液，濃縮至原體積的1/3，靜置沉淀、過濾、干燥，得有效成分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征是:步驟(2)中，茯苓皮與乙醇溶液的用量關(guān)系為 1:5-20 (g/ml)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征是:步驟(2)中，每次提取時間為0.5-3.5h0
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征是:步驟(2)中，用70體積％的乙醇提取茯苓皮，茯苓皮與乙醇溶液的用量關(guān)系為1:10 (g/ml)，每次提取時間為0.5 h。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征是:步驟(3)中，正丁醇:乙酸乙酯的體積比為5-10:1.5，優(yōu)選7:1.5 ； 7jC:正丁醇和乙酸乙酯的混合物的體積比為1:1.5_2。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征是:步驟(4)中，粗品用其100-120質(zhì)量倍的乙醇溶解，配成溶液；中性氧化鋁的質(zhì)量為粗品的15-20倍。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征是:步驟(4)中，乙醇和乙酸乙酯的體積比為2:3-7，優(yōu)選為2:5 ;乙醇和乙酸乙酯的混合物的用量為氧化鋁的1.5-3倍，優(yōu)選為2倍。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征是:步驟(5)中，活性炭用量為粗品質(zhì)量的2-3% ο
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征是:所得有效成分中主要包括3β-羥基-羊毛甾7,9 (11)，24-三烯-21-酸和去氫依布里酸，兩者含量在50%以上。
10.采用權(quán)利要求1-9中任一項所述的茯苓皮有效成分的提取方法提取所得的茯苓皮提取物。
【文檔編號】A61P3/06GK103550265SQ201310547949
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年11月8日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月8日
【發(fā)明者】閆雪生, 孫丹丹, 于蓓蓓, 趙許杰, 韓媛媛 申請人:山東省中醫(yī)藥研究院