一種利用豬源生產(chǎn)犬用多聯(lián)高免血清的制備方法
【專利摘要】一種利用豬源生產(chǎn)犬用多聯(lián)高免血清的制備方法。本發(fā)明的技術(shù)方案要點(diǎn)是，一種治療豬脾胃虛寒型腹瀉的獸藥，選擇健康狀況良好的母豬，對(duì)其使用含有黃芪多糖的犬五聯(lián)活疫苗多次強(qiáng)化免疫，接種的方法為皮下或肌肉多點(diǎn)注射，接種的部位為頸部兩側(cè)或臀部兩側(cè)，接種劑量從首次的3-5頭份逐次遞增至15-20頭份，最后一次免疫劑量增加至20頭份，每次免疫間隔2-4周，最后一次免疫后2-4周，然后進(jìn)行心臟采血，分離血清，再將血清滅活除菌，然后檢測(cè)抗體效價(jià)，其中犬瘟熱及狂犬病病毒中和抗體效價(jià)得到1:256以上，其余病毒血凝抑制抗體效價(jià)達(dá)到1:256以上為適用。本發(fā)明所述的制備方法簡(jiǎn)單易行，成本低廉，經(jīng)濟(jì)實(shí)用，可廣泛用于犬主要疫病的緊急預(yù)防和治療。
【專利說明】一種利用豬源生產(chǎn)犬用多聯(lián)高免血清的制備方法
[0001]【技術(shù)領(lǐng)域】:
本發(fā)明涉及犬用多聯(lián)高免血清的制備，特別是一種利用豬源生產(chǎn)犬用多聯(lián)高免血清的制備方法。
[0002]【背景技術(shù)】:
隨著人民生活水平的提高，人們飼養(yǎng)犬的數(shù)量與日俱增，相應(yīng)的犬病大量增加，如犬瘟熱、犬細(xì)小病毒病、犬傳染性肝炎、犬傳染性喉氣管炎、犬流感、犬副流感等嚴(yán)重影響犬的健康，一些人獸共患的疾病如狂犬病直接威脅人類健康。
[0003]目前，國內(nèi)外已有多種抗病毒血清、抗細(xì)菌毒素或免疫球蛋白制劑應(yīng)用于臨診實(shí)踐，用于疾病的緊急預(yù)防與治療，如抗狂犬病血清、破傷風(fēng)抗毒素血清等，這些抗血清多數(shù)是使用馬屬動(dòng)物或犬制備的，這些生物制品一方面工藝復(fù)雜，成本很高，另一方面用犬生產(chǎn)的抗血清由于來自于本種動(dòng)物，不可避免會(huì)導(dǎo)致垂直傳播或水平傳播某種傳染病的可能。 [0004]
【發(fā)明內(nèi)容】
:
本發(fā)明的是設(shè)計(jì)一種生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、產(chǎn)品效果好的利用豬源生產(chǎn)犬用多聯(lián)高免血清的制備方法。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案是，一種利用豬源生產(chǎn)犬用多聯(lián)高免血清的制備方法，其特征在于:選擇健康狀況良好的母豬，對(duì)其使用含有黃芪多糖的犬五聯(lián)活疫苗多次強(qiáng)化免疫，接種的方法為皮下或肌肉多點(diǎn)注射，接種的部位為頸部兩側(cè)或臀部兩側(cè)，接種劑量從首次的
3-5頭份逐次遞增至15-20頭份，最后一次免疫劑量增加至20頭份，每次免疫間隔2-4周，最后一次免疫后2-4周，然后進(jìn)行心臟采血，分離血清，再將血清滅活除菌，然后檢測(cè)抗體效價(jià)，其中犬瘟熱及狂犬病病毒中和抗體效價(jià)得到1:256以上，其余病毒血凝抑制抗體效價(jià)達(dá)到1:256以上為適用。所述的血清滅活除菌步驟為:收集的血清混合均勻，加入終濃度為 0.3%-0.5% 的 TNBP (磷酸三丁脂)和 1%-3% 的吐溫-80 或 l%-3%Triton-100, 24°C 6_8h ；再經(jīng)6tlCo-Y射線輻照滅菌，輻照溫度為20°C，輻照劑量率為14.0Gy/min，輻照吸收劑量為12kGy。所述的含有黃芪多糖的犬五聯(lián)活疫苗，其黃芪多糖含量為80-320ug/ml。
[0006]本發(fā)明所述的制備方法簡(jiǎn)單易行，成本低廉，經(jīng)濟(jì)實(shí)用，可廣泛用于犬主要疫病的緊急預(yù)防和治療。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案由如下過程組成:
1.免疫原:市售的犬五聯(lián)活疫苗；①美國輝瑞生產(chǎn)，預(yù)防犬瘟熱、犬腺病毒I型引起的傳染性肝炎、犬腺病毒2型引起的呼吸道病、犬副流感和犬細(xì)小病毒腸炎；②吉林五星藥廠生產(chǎn)，用于預(yù)防狂犬病、犬瘟熱、犬副流感、腺病毒感染及犬細(xì)小病毒感染。
[0008]2.動(dòng)物免疫:
選擇體格較大，健康狀況良好，產(chǎn)仔6胎以上，繁殖力下降，無種用價(jià)值的淘汰母豬。在衛(wèi)生狀況良好，專人管理的條件下飼養(yǎng)，對(duì)其使用上述添加黃芪多糖重量份數(shù)為80-320ug/ml的疫苗進(jìn)行多次強(qiáng)化免疫。接種的方法為皮下或肌肉多點(diǎn)注射，接種的部位為頸部兩側(cè)或臀部兩側(cè)。
[0009]接種劑量從首次的3-5頭份逐次遞增至15-20頭份，最后一次免疫劑量增加至20頭份。每次免疫間隔2-4周，最后一次免疫后2-4周，檢測(cè)抗體效價(jià)。依據(jù)抗體效價(jià)確定強(qiáng)化免疫時(shí)間及采血時(shí)間。
[0010]3.血液采集及血清分離:
強(qiáng)化免疫后14-30d之間檢測(cè)抗體效價(jià)，達(dá)到規(guī)定的效價(jià)水平要求后即可采血。采血最好在上午空腹時(shí)進(jìn)行，禁食時(shí)間在6h以上，可避免血中乳糜的發(fā)生從而獲得澄清的血清。將待采血母豬用清水沖洗干凈后固定在“X”型的保定架上，使豬仰臥，將豬尾部墊高，將位于胸前口左側(cè)的被毛刮除干凈，并用3%碘酒消毒，后用75%酒精脫碘，將事先消毒完好的空心銅管(一端尖、一端平，長40cm、直徑約Icm)平頭一端套上消毒完好的硅橡膠管，經(jīng)消毒的胸前口捅入豬的心臟(不宜深入太長防止完全穿透心臟)，將膠管游離端插入預(yù)先裝有少量滅菌生理鹽水的離心管中收集血液，室溫放置，待血塊收縮完全后置4°C過夜，4000rpm離心20min收集血清。
[0011]4.血清滅活除菌
將上述收集的血清混合均勻，加入終濃度為0.3%-0.5%的TNBP (磷酸三丁脂)和1%_3%的吐溫-80或l%-3%Triton-100，24°C 6_8h ;再經(jīng)60Co- Y射線輻照滅菌，輻照溫度為20°C，輻照劑量率為14.0Gy/min，輻照吸收劑量為12kGy。
[0012]5.效價(jià)測(cè)定
犬瘟熱及狂犬病病毒抗體通過微量中和試驗(yàn)測(cè)定，犬副流感、腺病毒I型和2型及犬細(xì)小病毒病毒抗體均通過微量血凝抑制病毒試驗(yàn)測(cè)定，犬瘟熱及狂犬病病毒中和抗體效價(jià)得到1:256以上，其余病毒血凝抑制抗體效價(jià)達(dá)到1:256以上為合格。
[0013]6.無菌檢查
血清通過接種瓊脂平板，37°C培養(yǎng)48-72h看是否有菌落生長。
[0014]7.安全試驗(yàn)
將上述無細(xì)菌生長的血清注射犬約10頭(5日齡-10日齡)(腹腔注射)5-10ml/頭，觀察一周(每日量體溫，觀察是否發(fā)病)，一切正常者為合格。
[0015]其它項(xiàng)按照中華人民共和國獸用生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(2001年版)中抗血清成品有關(guān)規(guī)定進(jìn)行。
[0016]將合格的血清制品分裝，5ml/瓶，-18°C以下冷凍保存。
[0017]所述的黃芪多糖為廣西南寧市桃源獸藥廠生產(chǎn)的黃芪多糖注射液，含量為0.2g/10ml。
[0018]【具體實(shí)施方式】:
詳細(xì)描述實(shí)施例，
實(shí)施例1
1.免疫原:由美國輝瑞生產(chǎn)的犬五聯(lián)活疫苗。
[0019]2.動(dòng)物免疫:
選擇體格較大，健康狀況良好，產(chǎn)仔6胎以上，繁殖力下降，無種用價(jià)值的淘汰母豬。在衛(wèi)生狀況良好，專人管理的條件下飼養(yǎng)。對(duì)其使用上述添加黃芪多糖含量為80ug/ml的疫苗進(jìn)行多次強(qiáng)化免疫。接種的方法為肌肉多點(diǎn)注射，接種的部位為頸部兩側(cè)。接種劑量首次5頭份/頭，第二次10頭份/頭，第三次免疫15頭份/頭，每次間隔2周，最后一次免疫劑量增加至20頭份/頭。最后一次免疫后2周，檢測(cè)抗體效價(jià)，犬瘟熱病毒中和抗體效價(jià)得到1:256以上，其余病毒血凝抑制抗體效價(jià)達(dá)到1:256以上為合格。
[0020]3.血液采集及血清分離:
強(qiáng)化免疫后14-30d之間檢測(cè)抗體效價(jià)，達(dá)到規(guī)定的效價(jià)水平要求后即可采血。采血最好在上午空腹時(shí)進(jìn)行，禁食時(shí)間在6h以上，可避免血中乳糜的發(fā)生從而獲得澄清的血清。將待采血母豬用清水沖洗干凈后固定在“X”型的保定架上，使豬仰臥，將豬尾部墊高，將位于胸前口左側(cè)的被毛刮除干凈，并用3%碘酒消毒，后用75%酒精脫碘，將事先消毒完好的空心銅管(一端尖、一端平，長40cm、直徑約Icm)平頭一端套上消毒完好的硅橡膠管，經(jīng)消毒的胸前口捅入豬的心臟(不宜深入太長防止完全穿透心臟)，將膠管游離端插入預(yù)先裝有少量滅菌生理鹽水的離心管中收集血液，室溫放置，待血塊收縮完全后置4°C過夜，4000rpm離心20min收集血清。
[0021]4.血清滅活除菌
將上述收集的血清混合均勻，加入終濃度為0.5%的TNBP和1%的吐溫-80，240C 6h ；再經(jīng)6tlCo-Y射線輻照滅菌，輻照溫度為20°C，輻照劑量率為14.0Gy/min，輻照吸收劑量為12kGy。
[0022]5.效價(jià)測(cè)定
犬瘟熱病毒抗體通過微量中和試驗(yàn)測(cè)定，犬副流感、腺病毒I型和2型及犬細(xì)小病毒病毒抗體均通過微量血凝抑制病毒試驗(yàn)測(cè)定，犬瘟熱病毒中和抗體效價(jià)得到1:256以上，其余病毒血凝抑制抗體效價(jià)達(dá)到1:256以上為合格。
[0023]6.無菌檢查
血清通過接種瓊脂平板,37°C培 養(yǎng)48h無菌落生長為合格。
[0024]7.安全試驗(yàn)
將上述無細(xì)菌生長的血清注射犬約10頭(5日齡-10日齡)(腹腔注射)5-10ml/頭，觀察一周(每日量體溫，觀察是否發(fā)病)，一切正常者為合格。
[0025]其它項(xiàng)按照中華人民共和國獸用生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(2001年版)中抗血清成品有關(guān)規(guī)定進(jìn)行。
[0026]將合格的血清制品分裝，5ml/瓶，-18°C以下冷凍保存。
[0027]所述的黃芪多糖為廣西南寧市桃源獸藥廠生產(chǎn)的黃芪多糖注射液，含量為0.2g/10ml。
[0028]實(shí)施例2
1.免疫原:由吉林五星藥廠生產(chǎn)的犬五聯(lián)活疫苗。
[0029]2.動(dòng)物免疫:
選擇體格較大，健康狀況良好，產(chǎn)仔6胎以上，繁殖力下降，無種用價(jià)值的淘汰母豬。在衛(wèi)生狀況良好，專人管理的條件下飼養(yǎng)。對(duì)其使用上述添加黃芪多糖重量份數(shù)為160ug/ml的疫苗進(jìn)行多次強(qiáng)化免疫。接種的方法為肌肉多點(diǎn)注射，接種的部位為頸部兩側(cè)。接種劑量首次5頭份/頭，第二次10頭份/頭，第三次免疫15頭份/頭，每次間隔2周，最后一次免疫劑量增加至20頭份/頭。最后一次免疫后2周，檢測(cè)抗體效價(jià)，犬瘟熱及狂犬病病毒中和抗體效價(jià)得到1:256以上，其余病毒血凝抑制抗體效價(jià)達(dá)到1:256以上為合格。
[0030]3.血液采集及血清分離:
強(qiáng)化免疫后14-30d之間檢測(cè)抗體效價(jià)，達(dá)到規(guī)定的效價(jià)水平要求后即可采血。采血最好在上午空腹時(shí)進(jìn)行，禁食時(shí)間在6h以上，可避免血中乳糜的發(fā)生從而獲得澄清的血清。將待采血母豬用清水沖洗干凈后固定在“X”型的保定架上，使豬仰臥，將豬尾部墊高，將位于胸前口左側(cè)的被毛刮除干凈，并用3%碘酒消毒，后用75%酒精脫碘，將事先消毒完好的空心銅管(一端尖、一端平，長40cm、直徑約Icm)平頭一端套上消毒完好的硅橡膠管，經(jīng)消毒的胸前口捅入豬的心臟(不宜深入太長防止完全穿透心臟)，將膠管游離端插入預(yù)先裝有少量滅菌生理鹽水的離心管中收集血液，室溫放置，待血塊收縮完全后置4°C過夜，4000rpm離心20min收集血清。
[0031]4.血清滅活除菌
將上述收集的血清混合均勻，加入終濃度為0.4%的TNBP和2%的吐溫-80，24°C 6h ；再經(jīng)6tlCo-Y射線輻照滅菌，輻照溫度為20°C，輻照劑量率為14.0Gy/min，輻照吸收劑量為12kGy。
[0032]5.效價(jià)測(cè)定
犬瘟熱及狂犬病病毒抗體通過微量中和試驗(yàn)測(cè)定，犬副流感、腺病毒I型和2型及犬細(xì)小病毒病毒抗體均通過微量血凝抑制病毒試驗(yàn)測(cè)定，犬瘟熱及狂犬病病毒中和抗體效價(jià)得到1:256以上，其余病毒血凝抑制抗體效價(jià)達(dá)到1:256以上為合格。
[0033]6.無菌檢查
血清通過接種瓊脂平板,37°C培養(yǎng)48h無菌落生長為合格。
[0034]7.安全試驗(yàn)
將上述無細(xì)菌生長的血清注射犬約10頭(5日齡-10日齡)(腹腔注射)5-10ml/頭，觀察一周(每日量體溫，觀察是否發(fā)病)，一切正常者為合格。
[0035]其它項(xiàng)按照中華人民共和國獸用生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(2001年版)中抗血清成品有關(guān)規(guī)定進(jìn)行。
[0036]將合格的血清制品分裝，5ml/瓶，-18°C以下冷凍保存。
[0037]所述的黃芪多糖為廣西南寧市桃源獸藥廠生產(chǎn)的黃芪多糖注射液，含量為0.2g/10ml。
[0038]實(shí)施例3
1.免疫原:由美國輝瑞生產(chǎn)的犬五聯(lián)活疫苗。
[0039]2.動(dòng)物免疫:
選擇體格較大，健康狀況良好，產(chǎn)仔6胎以上，繁殖力下降，無種用價(jià)值的淘汰母豬。在衛(wèi)生狀況良好，專人管理的條件下飼養(yǎng)。對(duì)其使用上述添加黃芪多糖重量份數(shù)為320ug/ml的疫苗進(jìn)行多次強(qiáng)化免疫。接種的方法為肌肉多點(diǎn)注射，接種的部位為頸部兩側(cè)。接種劑量首次5頭份/頭，第二次10頭份/頭，第三次免疫15頭份/頭，每次間隔2周，最后一次免疫劑量增加至20頭份/頭。最后一次免疫后2周，檢測(cè)抗體效價(jià)，犬瘟熱病毒中和抗體效價(jià)得到1:256以上，其余病毒血凝抑制抗體效價(jià)達(dá)到1:256以上為合格。
[0040]3.血液采集及血清分離:
強(qiáng)化免疫后14-30d之間檢測(cè)抗體效價(jià)，達(dá)到規(guī)定的效價(jià)水平要求后即可采血。采血最好在上午空腹時(shí)進(jìn)行，禁食時(shí)間在6h以上，可避免血中乳糜的發(fā)生從而獲得澄清的血清。將待采血母豬用清水沖洗干凈后固定在“X”型的保定架上，使豬仰臥，將豬尾部墊高，將位于胸前口左側(cè)的被毛刮除干凈，并用3%碘酒消毒，后用75%酒精脫碘，將事先消毒完好的空心銅管(一端尖、一端平，長40cm、直徑約Icm)平頭一端套上消毒完好的硅橡膠管，經(jīng)消毒的胸前口捅入豬的心臟(不宜深入太長防止完全穿透心臟)，將膠管游離端插入預(yù)先裝有少量滅菌生理鹽水的離心管中收集血液，室溫放置，待血塊收縮完全后置4°C過夜，4000rpm離心20min收集血清。
[0041]4.血清滅活除菌
將上述收集的血清混合均勻，加入終濃度為0.3%的TNBP和3%的吐溫-80，24°C 6h ；再經(jīng)6tlCo-Y射線輻照滅菌，輻照溫度為20°C，輻照劑量率為14.0Gy/min，輻照吸收劑量為12kGy。
[0042]5.效價(jià)測(cè)定
犬瘟熱抗體通過微量中和試驗(yàn)測(cè)定，犬副流感、腺病毒I型和2型及犬細(xì)小病毒病毒抗體均通過微量血凝抑制病毒試驗(yàn)測(cè)定，犬瘟熱病毒中和抗體效價(jià)得到1:256以上，其余病毒血凝抑制抗體效價(jià)達(dá)到1:256以上為合格。
[0043]6.無菌檢 查
血清通過接種瓊脂平板,37°C培養(yǎng)48h無菌落生長為合格。
[0044]7.安全試驗(yàn)
將上述無細(xì)菌生長的血清注射犬約10頭(5日齡-10日齡)(腹腔注射)5-10ml/頭，觀察一周(每日量體溫，觀察是否發(fā)病)，一切正常者為合格。
[0045]其它項(xiàng)按照中華人民共和國獸用生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(2001年版)中抗血清成品有關(guān)規(guī)定進(jìn)行。
[0046]將合格的血清制品分裝，5ml/瓶，-18°C以下冷凍保存。
[0047]所述的黃芪多糖為廣西南寧市桃源獸藥廠生產(chǎn)的黃芪多糖注射液，含量為0.2g/10ml。
[0048]應(yīng)用例:
1、新鄉(xiāng)市郊區(qū)一農(nóng)戶，患犬初期糞便稀薄，體溫4 0.5°C，2d后，糞便呈番茄醬色或咖啡色，味腥臭，排便次數(shù)不定，有里急后重的癥狀，連續(xù)注射0.5-1.012-3d，K3，3d后癥狀明顯減輕，一周后癥狀消失，基本康復(fù)。
[0049]2.2011年以來，河南科技學(xué)院獸醫(yī)院對(duì)前來就診的表現(xiàn)高燒、下痢、便中帶血、咳嗽氣喘等癥診斷為犬細(xì)小病毒病及犬瘟熱的患犬376只，肌肉注射或皮下注射本產(chǎn)品
2-5ml/頭，同時(shí)配合K3及安乃近等進(jìn)行對(duì)癥治療，每天一次，連用2-3天，3天后癥狀消失，治愈率達(dá)85%，有效率達(dá)90%，療效顯著。
[0050]本發(fā)明的豬源犬用多聯(lián)高免血清對(duì)治療早期的犬瘟熱、犬細(xì)小病毒病等疫病效果極好，與其它犬用多聯(lián)高免血清效果相當(dāng)，而制備工藝簡(jiǎn)單，價(jià)格低廉，優(yōu)勢(shì)明顯。
【權(quán)利要求】
1.一種利用豬源生產(chǎn)犬用多聯(lián)高免血清的制備方法，其特征在于:選擇健康狀況良好的母豬，對(duì)其使用含有黃芪多糖的犬五聯(lián)活疫苗多次強(qiáng)化免疫，接種的方法為皮下或肌肉多點(diǎn)注射，接種的部位為頸部兩側(cè)或臀部兩側(cè)，接種劑量從首次的3-5頭份逐次遞增至15-20頭份，最后一次免疫劑量增加至20頭份，每次免疫間隔2-4周，最后一次免疫后2-4周，然后進(jìn)行心臟采血，分離血清，再將血清滅活除菌，然后檢測(cè)抗體效價(jià)，其中犬瘟熱及狂犬病病毒中和抗體效價(jià)得到1:256以上，其余病毒血凝抑制抗體效價(jià)達(dá)到1:256以上為適用。
2.如權(quán)利要求1所述的一種利用豬源生產(chǎn)犬用多聯(lián)高免血清的制備方法，其特征在于:血清滅活除菌步驟為:收集的血清混合均勻，加入終濃度為0.3%-0.5%的TNBP (磷酸三丁脂)和1%_3%的吐溫-80或l%-3%Triton-100，24°C 6_8h ;再經(jīng)60Co- Y射線輻照滅菌，輻照溫度為20°C，輻照劑量率為14.0Gy/min，輻照吸收劑量為12kGy。
3.如權(quán)利要求1所述的一種利用豬源生產(chǎn)犬用多聯(lián)高免血清的制備方法，其特征在于:所述的含有黃芪多糖的犬五聯(lián)活疫苗，其黃芪
多糖320ug/ml。
【文檔編號(hào)】A61K39/39GK103585627SQ201310550849
【公開日】2014年2月19日 申請(qǐng)日期:2013年11月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月9日
【發(fā)明者】姚四新, 歐長波, 趙淑秋, 劉興友, 胡建和 申請(qǐng)人:河南科技學(xué)院