一種降血糖的絲瓜子提取物、其制備方法及其用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種降血糖的絲瓜子提取物及其制備方法，以及絲瓜子蛋白質(zhì)或多肽在制備降血糖藥物或者保健品中的新用途。所述提取物以絲瓜子為原料，通過蛋白質(zhì)或多肽富集工藝提取，所述提取物中蛋白質(zhì)或多肽含量(重量百分比)在65%以上。本發(fā)明的絲瓜子提取物明確了其降糖作用的活性部位主要為蛋白質(zhì)或多肽，且該提取物還具有安全、低毒、有效、高得率的優(yōu)點(diǎn)，在用于制備輔助降血糖的保健品或藥品中具有巨大的潛力。
【專利說明】一種降血糖的絲瓜子提取物、其制備方法及其用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于天然藥物化學(xué)領(lǐng)域，涉及一種降血糖的植物提取物及其制備方法，特別是一種降血糖的絲瓜子提取物及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]糖尿病是一種糖、蛋白質(zhì)和脂肪代謝障礙性內(nèi)分泌疾病，其發(fā)病率正呈逐年上升的趨勢，糖尿病發(fā)病的原因眾多，但主要的失調(diào)是胰島素分泌或生成異常。在我國，糖尿病是僅位于癌癥和心血管疾病之后的第三大死因。西醫(yī)臨床上常用的降糖藥主要包括以下幾類:(I)雙胍類，如二甲雙胍、苯乙雙胍等；(2)磺脲類，如格列美脲等；(3)噻唑烷二酮類，如羅格列酮、吡格列酮等；(4)苯甲酸衍生物，如那格列奈等；(5) α -葡萄糖苷酶抑制劑，如伏格列波糖等；(6)胰島素及其類似藥物。對于胰島素依賴型糖尿病患者來說，使用胰島素能有效降低血糖，但長期使用胰島素會給患者帶來低血糖反應(yīng)、體重增加、屈光不正、水腫、皮膚過敏、注射部位皮下脂肪萎縮等一系列副作用；對于非胰島素依賴型糖尿病患者，以口服降糖藥物為主要治療手段，但這類藥物往往副作用大，不宜長期服用。
[0003]近年來隨著糖尿病病人(特別是非胰島素依賴性糖尿病病人)的增多，人們開始重視從中草藥中尋找具有降血糖作用的藥物。公開文獻(xiàn)中已報道了一些中草藥的活性成分具有降血糖的作用，主要有萜類、多糖類、黃酮類、多肽類、生物堿類、留醇類化合物等，因此，在中藥中尋找具有降血糖作用的活性成分具有很大的前景。與化學(xué)合成藥物相比，天然的降糖藥物具有降糖作用溫和、毒副作用小、來源廣泛等優(yōu)點(diǎn)。
[0004]絲瓜子為葫蘆科絲瓜屬植物絲瓜Luffa cylinderica Roem.的干燥成熟種子。在我國古代本草中已有對其功能主治的記載，如《食物本草》、《得宜本草》、《醫(yī)林纂要》、《得配本草》等，但未有其降血糖功能的記載。在已公開文獻(xiàn)中，僅有Fathy K.等在“Effectof Luffa aegyptiaca(seeds)and Carissa edulis(leaves)extracts on blood glucoselevel of normal and streptozotocin di`abetic rats” 中報道了其同屬植物埃及絲瓜(Luffa aegyptiaca Mill.)的種子95%乙醇提取物對鏈脲佐菌素(streptozocin, STZ)誘發(fā)的糖尿病大鼠模型具有降血糖作用，但對其降糖活性成分缺乏進(jìn)一步的研究，而且，經(jīng)發(fā)明人多次驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)95%乙醇提取物對STZ和四氧嘧啶(alloxan，ALX)誘發(fā)的糖尿病小鼠模型的降血糖作用效果并不理想。因此，為從絲瓜子中找到降糖有效部位，本發(fā)明以絲瓜子為原料，進(jìn)行了絲瓜子降糖作用及降糖活性部位提取的研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對上述降血糖類藥物存在較大副作用的缺陷，本發(fā)明旨在從生藥絲瓜子中提取相對安全有效的具有降血糖作用的活性成分。
[0006]本發(fā)明的一個目的在于提供一種降血糖的絲瓜子提取物，所述提取物以絲瓜子為原料，通過蛋白質(zhì)及多肽富集工藝提取，所述提取物中蛋白質(zhì)及多肽含量在65%以上(重量百分比)。[0007]上述所述蛋白質(zhì)及多肽含量優(yōu)選為88%以上(重量百分比)。
[0008]本發(fā)明的另一個目的提供一種上述所述的絲瓜子提取物的制備方法，包含如下步驟:以絲瓜子粉末為原料，通過pH值在6~8之間的緩沖鹽溶液提取；提取液再經(jīng)硫酸銨或丙酮沉淀；將所得沉淀用磷酸鹽緩沖液復(fù)溶后再用透析和/或超濾的方法進(jìn)行脫鹽，即得本發(fā)明的絲瓜子提取物。
[0009]也可進(jìn)一步將提取物濃縮凍干得到凍干粉。
[0010]所述緩沖鹽溶液優(yōu)選為磷酸鹽緩沖液(PBS)、生理鹽水(NS)、三羥甲基氨基甲烷緩沖液(TBS)。更優(yōu)選為磷酸鹽緩沖液(PBS)。
[0011]所述絲瓜子提取物的制備方法優(yōu)選為:
[0012]步驟一、藥材粉碎、過篩、脫脂:絲瓜子粉碎、過篩，取絲瓜種子粉末，脫脂處理，收集殘渣并揮干。
[0013]步驟二、蛋白提取:揮干后的殘渣用PBS緩沖液冷浸提取，抽濾過濾，棄沉淀。取濾液用硫酸銨沉淀至提取液中硫酸銨的飽和度為30%~75%，離心收集沉淀。所述飽和度為硫酸銨在O °C時的飽和度。
[0014]步驟三、脫鹽處理:沉淀可進(jìn)一步用PBS緩沖液復(fù)溶，復(fù)溶液離心后用0.22 μ m~
0.8 μ m微孔濾膜過濾，再用PBS緩沖液透析，以除去硫酸銨。透析結(jié)束后可進(jìn)一步用超濾濃縮，凍干后取得絲瓜子提取物凍干粉。
[0015]上述所述脫脂處理優(yōu)選以石油醚或正己烷冷浸。
[0016]本發(fā)明的另一個目的在于提供絲瓜子蛋白質(zhì)及多肽在制備降血糖藥物或者保健品中的新用途。
[0017]優(yōu)選的，絲瓜子蛋白質(zhì)及多肽在制備治療或預(yù)防II型糖尿病的藥物或者保健品中的新用途。
[0018]更優(yōu)選的，絲瓜子蛋白質(zhì)及多肽在制備治療或預(yù)防糖尿病腎病的藥物或者保健品中的新用途。
[0019]上述所述絲瓜子蛋白質(zhì)及多肽的制備方法為:
[0020]步驟一、藥材粉碎、過篩、脫脂:絲瓜子粉碎、過篩，取絲瓜種子粉末，脫脂處理，收集殘渣并揮干。
[0021]步驟二、蛋白提取:揮干后的殘渣用PBS緩沖液冷浸提取，抽濾過濾，棄沉淀。用硫酸銨沉淀至提取液中硫酸銨的飽和度為30%~75%，離心收集沉淀。所述飽和度為硫酸銨在(TC時的飽和度。
[0022]步驟三、脫鹽處理:沉淀可進(jìn)一步用PBS緩沖液復(fù)溶，復(fù)溶液離心后用0.22 μ m~
0.8 μ m微孔濾膜過濾，再用PBS緩沖液透析，以除去硫酸銨。透析結(jié)束后可進(jìn)一步用超濾濃縮，凍干后取得絲瓜子蛋白質(zhì)及多肽提取物凍干粉。
[0023]上述所述脫脂處理優(yōu)選以石油醚或正己烷冷浸。
[0024]上述所述降血糖藥物或保健品優(yōu)選為口服制劑。
[0025]本發(fā)明的另一個目的在于提供一種降血糖的藥物組合物，其含有治療有效量的本發(fā)明的絲瓜子提取物，和藥學(xué)上可接受的輔料。
[0026]其中輔料是常規(guī)的賦形劑、調(diào)味劑、崩解劑、防腐劑、潤滑劑、濕潤劑、粘合劑、溶
劑、增稠劑、增溶劑等輔料，具體可以是:糊精、纖維素、甲基纖維素、乙基纖維素、羧甲基纖維素、微晶纖維素、滑石粉、甘油、水、聚乙二醇、甘露醇、氯化鈉、右旋糖酐、明膠、山梨醇、甘氨酸鈉、磷酸二氫鈉、氨基乙酸、L-蘋果酸、DL-蘋果酸、苯甲酸鈉、山梨甲酸、維生素C、維生素E、L-亮氨酸、β-胡蘿卜素、葉綠素、果糖十二烷基硫酸鈉、蛋黃卵磷脂、透明質(zhì)酸、殼聚糖等；輔料占整個天然藥物中的重量百分比為:1%~50%。此處所混入不同的輔料主要起到用于制成不同的劑型，增加穩(wěn)定性，改變藥物的物理化性質(zhì)，控制藥物的釋放并且增加制劑的順應(yīng)性等功能。
[0027]所述藥物可制成片劑、顆粒劑、膠囊劑、軟膠囊、口服液、丸劑、混懸劑、滴丸劑、微丸劑、口含片、膠丸。
[0028]通過藥理實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的絲瓜子提取物具有顯著的降血糖活性。其中，絲瓜子的PBS緩沖液或NS或TBS緩沖液提取物能明顯改善STZ合并高脂喂養(yǎng)誘發(fā)的II型糖尿病模型小鼠糖耐量，PBS緩沖液提取物長期給藥后能降低STZ合并高脂喂養(yǎng)誘發(fā)的糖尿病模型小鼠的空腹血糖，并對STZ誘發(fā)的糖尿病模型小鼠并發(fā)癥糖尿病腎病具有一定緩解作用，且對正常小鼠的糖耐量無影響；PBS緩沖液提取物能明顯改善ALX誘發(fā)的糖尿病模型小鼠的糖耐量，長期給藥后能降低空腹血糖，并對ALX誘發(fā)的糖尿病模型小鼠糖尿病并發(fā)癥糖尿病腎病具有一定的緩解作用。[0029]并且，在動物實(shí)驗(yàn)過程中，以絲瓜子原粉經(jīng)胃腸道給藥時出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)動物腹瀉并伴有死亡的現(xiàn)象，但是以本發(fā)明絲瓜子提取物灌胃給藥均未出現(xiàn)上述癥狀，可見本發(fā)明的絲瓜子提取物中已基本剔除了絲瓜子中的毒性成分。
[0030]本發(fā)明的絲瓜子提取物相對于現(xiàn)有技術(shù)明確了其降糖作用的有效部位，并且，本發(fā)明以資源充足的絲瓜子為原料，提取方法簡便，成本低廉，為利用絲瓜種子作為降血糖藥物或保健品的開發(fā)提供了科學(xué)合理的依據(jù)。且該提取物還具有安全、低毒、有效的優(yōu)點(diǎn)，在開發(fā)輔助降血糖的保健品或藥品中具有巨大的潛力。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0031]圖1不同批次絲瓜子提取物的ID SDS-PAGE蛋白電泳圖。泳道I為marker (預(yù)染蛋白標(biāo)準(zhǔn)品)，泳道2為0.5kg絲瓜子提取樣品，泳道3為1.5kg絲瓜子提取樣品，泳道4為5kg絲瓜子提取樣品，泳道5為IOkg絲瓜子提取樣品，從電泳圖可以看出不同批次提取的樣品的電泳行為基本一致，表明提取工藝較為穩(wěn)定。
[0032]圖2顯示不同提取液提取的絲瓜子提取物ID SDS-PAGE蛋白電泳圖，泳道I為marker (預(yù)染蛋白標(biāo)準(zhǔn)品)，泳道2為PBS提取物，泳道3為NS提取物，泳道4為TBS提取物，從電泳圖可以看出，不同提取液提取的樣品的電泳行為基本一致，表明不同提取液所提取的成分基本一致。
[0033]圖3顯示絲瓜子提取物的2D電泳分布情況，從圖可知絲瓜子提取物的蛋白質(zhì)/多肽組成較為復(fù)雜，具體蛋白個數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于蛋白ID電泳圖中顯示的蛋白數(shù)量，并且絲瓜子提取物中的蛋白多肽的分子量和等電點(diǎn)分布也非常廣泛。
[0034]圖4顯示絲瓜子提取物對STZ誘發(fā)糖尿病模型小鼠糖耐量的影響，從圖可以看出絲瓜子提取物可以改善由STZ誘發(fā)的糖尿病小鼠模型糖耐量。
[0035]圖5顯示不同提取液提取的絲瓜子提取物對STZ誘發(fā)糖尿病模型小鼠糖耐量的影響，從圖可以看出不同提取液提取的絲瓜子提取物可以改善由STZ誘發(fā)的糖尿病小鼠模型糖耐量。
[0036]圖6顯示絲瓜子提取物對STZ誘發(fā)糖尿病模型小鼠空腹血糖的影響，縱坐標(biāo)為血糖值，從圖可知在連續(xù)給藥18天后，絲瓜子提取物對STZ誘發(fā)的糖尿病模型小鼠具有降低空腹血糖的作用。
[0037]圖7顯示絲瓜子提取物對STZ誘發(fā)糖尿病模型小鼠腎臟病理組織學(xué)切片的影響(10x)，其中A為空白組，B為模型組，C為陽性藥組，D為絲瓜子提取物組，從圖可以看出空白組腎臟組織結(jié)構(gòu)正常；模型組出現(xiàn)腎小球增生，系膜細(xì)胞增多，基底膜增厚等較為嚴(yán)重的腎臟損傷；陽性藥物組有大量炎細(xì)胞浸潤，腎小球增生；而絲瓜子提取物組僅產(chǎn)生部分腎小球增生。由此說明絲瓜子提取物對STZ誘發(fā)的糖尿病模型小鼠并發(fā)癥糖尿病腎病具有一定緩解作用。
[0038]圖8A顯示絲瓜子提取物變性失活后對STZ誘發(fā)糖尿病模型小鼠糖耐量的影響，圖SB顯示絲瓜子提取物變性失活后對STZ誘發(fā)糖尿病模型小鼠血糖曲線下面積的影響，從圖8A可以看出，變性失活組對糖尿病模型小鼠糖耐量無影響，而蛋白質(zhì)及多肽未失活的提取物組則可以有效改善糖尿病模型動物的糖耐量，圖8B血糖曲線下面積(AUC)也同樣說明了蛋白質(zhì)及多肽未失活的提取物組可以有效改善糖尿病模型動物的糖耐量。
[0039]圖9顯示絲瓜子提取物對正常小鼠糖耐量的影響，從圖可以看出絲瓜子提取物對正常小鼠的糖耐量無影響。
[0040]圖10顯示絲瓜子提取物對ALX誘發(fā)糖尿病模型小鼠空腹血糖的影響，從圖可知在連續(xù)給藥30天后，絲瓜子提取物對ALX誘發(fā)的糖尿病模型小鼠具有更為明顯的降低空腹血糖的作用。
[0041]圖1lA顯示絲瓜子提取物對ALX誘發(fā)糖尿病模型小鼠糖耐量的影響，圖1lB顯示絲瓜子提取物對ALX誘發(fā)糖尿病模型小鼠血糖曲線下面積的影響，從圖11可知，在長期給藥后，絲瓜子提取物可明顯改善ALX誘發(fā)的糖尿病模型小鼠的糖耐量。
[0042]圖12A顯示絲瓜子提取物對ALX誘發(fā)糖尿病模型小鼠血清中尿素氮含量的影響，圖12B顯示絲瓜子提取物對ALX誘發(fā)糖尿病模型小鼠血清中肌酐含量的影響，從圖12A和圖12B可知，絲瓜子提取物對ALX誘發(fā)的糖尿病小鼠模型的糖尿病腎病具有預(yù)防及緩解的作用。
【具體實(shí)施方式】
[0043]材料來源:
[0044]生藥:絲瓜子為 秋季收購于江浙一帶的絲瓜的干燥成熟種子；95%乙醇提取物(按如文獻(xiàn) “Effect of Luffa aegyptiaca (seeds) and Carissa edulis (leaves) extracts onblood glucose level of normal and streptozotocin diabetic rats”所述的提取方法提取得到);動物:實(shí)驗(yàn)用小鼠購買于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司，品系名為ICR ;飼料:購買于南京君科生物科技有限公司(配方:基礎(chǔ)飼料，70% ;蔗糖，20% ;豬油，10%);STZ(批號:SLBB7526V), ALX (批號:BCBD6557V)為 Sigma 產(chǎn)品；Tris (批號:2222C194)為 Amresco 產(chǎn)品；Superdex75prep grade 為 GE Healthcare 產(chǎn)品(批號:10056437) ;Bradford 檢測液(批號=500-0006)為Bio-Rad產(chǎn)品;氯化鉀(批號:F20110809)，氯化鈉(批號:20130109)，磷酸二氫鉀(批號:F20110913)，磷酸氫二鈉(批號:20120706)，硫酸銨(批號:20130128)均為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；尿素氮檢測試劑盒(批號:20130417)、尿肌酐檢測試劑盒(批號:20130416)均購自南京建成生物工程研究所。
[0045]實(shí)施例1絲瓜子提取物的制備
[0046]步驟一、藥材粉碎、過篩:取絲瓜子0.5kg~IOkg,清理干凈,隨后將絲瓜子研磨成粉末，過30目篩。
[0047]步驟二、脫脂處理:絲瓜子粉末加3~6倍石油醚于4°C冷浸提取2~4次，每次24h,離心，收集殘渣并揮干溶劑。
[0048]步驟三、蛋白提取:揮干后的殘渣用3~6倍PBS緩沖液于4°C冷浸提24h，抽濾過濾，棄沉淀。取濾液用硫酸銨沉淀至濾液中硫酸銨的飽和度為75% (硫酸銨在0°C時的飽和度)，離心收集沉淀。
[0049]步驟四、脫鹽處理:沉淀用PBS緩沖液復(fù)溶，離心后用0.8 μ m微孔濾膜過濾，再用PBS緩沖液透析。透析結(jié)束后可進(jìn)一步用超濾杯濃縮后凍干，制成絲瓜子提取物凍干粉。留待實(shí)施例3~13中使用。
[0050]針對上述提取方法中各具體參數(shù)與用量所得絲瓜子提取物凍干粉復(fù)溶后用bradford法檢測蛋白濃度(結(jié)果見表1)，并進(jìn)行ID SDS-PAGE電泳，15%SDS_PAGE，6ug上樣，結(jié)果見圖1。
[0051]表1不同批次絲瓜子提取物處理方法及蛋白含量測定
[0052]
【權(quán)利要求】
1.一種降血糖的絲瓜子提取物，其特征在于所述提取物以絲瓜子為原料，通過蛋白質(zhì)及多肽富集工藝提取，所述提取物中蛋白質(zhì)及多肽含量在65%以上(重量百分比)。
2.如權(quán)利要求1所述的絲瓜子提取物，其中蛋白質(zhì)及多肽含量在85%以上(重量百分比)。
3.權(quán)利要求1至2中任一項所述的絲瓜子提取物的制備方法，其特征在于包括:用pH值在6~8之間的緩沖鹽溶液提取，之后將提取液以硫酸銨或丙酮沉淀，將所得沉淀用所述緩沖鹽溶液復(fù)溶后以透析法和/或超濾法進(jìn)行脫鹽。
4.如權(quán)利要求3所述的制備方法，其中所述的緩沖鹽溶液是磷酸鹽緩沖液、生理鹽水或三羥甲基氨基甲烷緩沖液。
5.如權(quán)利要求3所述的制備方法，包含如下步驟: 步驟一:取絲瓜種子粉末，脫脂處理，收集殘渣并揮干； 步驟二:揮干后的殘渣用磷酸鹽緩沖液冷浸提取，抽濾過濾； 步驟三:取濾液用硫酸銨沉淀至硫酸銨的飽和度為30%~75%時，離心收集沉淀；步驟四:沉淀用磷酸鹽緩沖液復(fù)溶，復(fù)溶液離心后用0.22 μ m~0.8 μ m微孔濾膜過濾，濾液再用磷酸鹽緩沖液透析。
6.如權(quán)利要求5所述的制備方法，所述脫脂處理優(yōu)選以石油醚或正己烷冷浸提取。
7.—種降血糖的藥物組合物，其含有治療有效量的權(quán)利要求1至2中任一項中所述的絲瓜子提取物，和藥學(xué)上可接受的輔料。
8.絲瓜子蛋白質(zhì)及多肽在制備降血糖藥物或者保健品中的新用途。
9.絲瓜子蛋白質(zhì)及多肽在制備預(yù)防或治療糖尿病腎病的藥物或者保健品中的新用途。
10.如權(quán)利要求8或9所述的新用途，其中所述絲瓜子蛋白質(zhì)及多肽通過以下方法制備:用PH值在6~8之間的緩沖鹽溶液提取，之后將提取液以硫酸銨或丙酮沉淀，將所得沉淀用所述緩沖鹽溶液復(fù)溶后以透析法和/或超濾法進(jìn)行脫鹽。
11.如權(quán)利要求8或9所述的新用途，其中所述絲瓜子蛋白質(zhì)及多肽通過以下方法制備: 步驟一:取絲瓜種子粉末，脫脂處理，收集殘渣并揮干； 步驟二:揮干后的殘渣用磷酸鹽緩沖液、生理鹽水或三羥甲基氨基甲烷緩沖液冷浸提取,抽濾過濾； 步驟三:取濾液用硫酸銨沉淀至硫酸銨的飽和度為30%~75%時，離心收集沉淀；步驟四:沉淀用磷酸鹽緩沖液復(fù)溶，復(fù)溶液離心后用0.22 μ m~0.8 μ m微孔濾膜過濾，再用磷酸鹽緩沖液透析。
12.如權(quán)利要求8或9所述的新用途，所述藥物或保健品優(yōu)選為口服制劑。
【文檔編號】A61P3/10GK103610730SQ201310590379
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月20日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月20日
【發(fā)明者】馬永, 曹锫沛, 潘紅, 馬麗強(qiáng), 唐亮, 侯景, 王俊, 王耀方 申請人:江蘇眾紅生物工程創(chuàng)藥研究院有限公司, 常州京森生物醫(yī)藥研究所有限公司