抑制真菌生長(zhǎng)的絡(luò)新婦屬蜘蛛有效部位的制備及其用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種抑制真菌生長(zhǎng)的絡(luò)新婦屬蜘蛛有效部位的制備及其用途。具體而言，該有效部位由粉碎或未粉碎的蜘蛛目絡(luò)新婦科絡(luò)新婦屬（genus?Nephila）蟲體用鹽溶液提取、酸沉淀、離心分離、再經(jīng)透析方法方法純化，并經(jīng)冷凍干燥而得到絡(luò)新婦屬蜘蛛有效部位凍干粉；該有效部位具有顯著抑制白色念珠菌生長(zhǎng)的活性，可制備成水凝膠、泡沫凝膠、巴布劑、凍干粉、水劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、外用搽劑、軟膏劑形式，用于制備防治真菌感染的藥物制劑、醫(yī)療器械、日化用品、藥用輔料、外傷敷料。
【專利說(shuō)明】抑制真菌生長(zhǎng)的絡(luò)新婦屬蜘蛛有效部位的制備及其用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體而言，本發(fā)明涉及從絡(luò)新婦屬蜘蛛中提取的抗真菌活性有效部位的制備及其防治真菌感染性疾病的醫(yī)藥用途。該有效部位由粉碎或未粉碎的蜘蛛目絡(luò)新婦科絡(luò)新婦屬(genus Nephila)蟲體用鹽溶液提取、酸沉淀、離心分離、再經(jīng)透析方法方法純化；得到的有效部位經(jīng)冷凍干燥而得。其具有顯著抑制白色念珠菌生長(zhǎng)的活性，可制備成水凝膠、泡沫凝膠、巴布劑、凍干粉、水劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、外用搽劑、軟膏劑形式，用于制備防治真菌感染的藥物制劑、醫(yī)療器械、日化用品、藥用輔料、外傷敷料。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著醫(yī)學(xué)科學(xué)的發(fā)展，各種新藥物和新技術(shù)如廣譜抗生素、激素、各種導(dǎo)管插管技術(shù)、化療、移植等醫(yī)療手段的廣泛使用，以及HIV感染和腫瘤，造成人類免疫系統(tǒng)被逐漸破壞的病例逐年增多，從而導(dǎo)致深部真菌病的發(fā)病率愈來(lái)愈高。而另一方面，隨著人類濫用抗生素和臨床抗真菌藥物的廣泛使用，導(dǎo)致傳統(tǒng)抗生素不能有效對(duì)抗某些嚴(yán)重真菌感染和細(xì)菌感染，真菌的耐藥現(xiàn)象日益嚴(yán)重。傳統(tǒng)抗生素的作用已經(jīng)遭遇顯著瓶頸，大多數(shù)細(xì)菌、真菌對(duì)常見的抗生素產(chǎn)生了顯著的抗藥性；艾滋病患者、重癥患者、燒傷患者等并發(fā)真菌性感染更使病患危在旦夕。因此，尋找廣譜、高效、低毒的抗真菌新藥已成為藥物研究的熱點(diǎn)；對(duì)耐藥菌/頑固性真菌的研究迫在眉睫。
[0003]真菌病大體上可以分為以下四類:侵襲性真菌病與全身性真菌病(如曲霉病和念珠菌病等)、粘膜型真菌病(如“鵝口瘡”等)、淺表型皮膚真菌病(如“香港腳”或“頭皮癬”、“灰指甲”等)和過(guò)敏型真菌病(如哮喘與慢性炎癥等)。在以上四類真菌病中，以第一類對(duì)人類危害最大，而后三類真菌病相應(yīng)較輕一些。據(jù)來(lái)自國(guó)外的臨床統(tǒng)計(jì)資料，在死于感染性疾病的人群中，有4%是死于全身性曲霉菌類真菌感染，大約2%的人死于全身性念珠菌感染。臨床統(tǒng)計(jì)表明，病人一旦患上全身性曲霉病，其死亡率將高達(dá)85%，如患血液性念珠菌病則死亡率可達(dá)40%。利用現(xiàn)有抗真菌藥物治療全身性真菌病或血液感染型真菌病的效果至今仍無(wú)法令人滿意。因此，藥學(xué)界正在尋找可以抑制全身性感染的新型藥物。
`[0004]目前，國(guó)內(nèi)外已開發(fā)上市的抗真菌藥物主要有四大類，即多烯類(如兩性霉素B)、三唑類(如氟康唑、咪康唑、益康唑、依曲康唑和酮康唑等)、烷基胺類(如特比萘芬)和新開發(fā)上市的棘白菌素(echinocandins)類(如卡帕芬凈和米卡民等)。前三大類抗真菌藥均為20世紀(jì)開發(fā)上市的老藥，而棘白霉素類則是21世紀(jì)初開發(fā)上市的新藥。但在上述藥物中，只有少數(shù)幾種能用于治療全身性真菌感染癥。三唑類抗真菌藥物無(wú)論第一代還是第二代均對(duì)有絲真菌引起的全身性感染療效不佳，而棘白霉素類抗真菌新藥則對(duì)這類疾病有效。目前棘白霉素面臨的最大問(wèn)題是:尚無(wú)口服劑型，只限于注射(且僅限于醫(yī)院使用)，故病人使用頗為不便。其次，雖然棘白霉素對(duì)常見念珠菌病等真菌性感染療效不錯(cuò)，但其價(jià)格昂貴，故而限制了它們?cè)诎l(fā)達(dá)國(guó)家以外市場(chǎng)的銷售量。如據(jù)報(bào)道，在我國(guó)市場(chǎng)上，每支卡帕芬凈注射劑(劑量為50毫克)的零售價(jià)為3148元，而日本產(chǎn)的米卡民(50毫克劑量)價(jià)格稍低一些，但每支也要650元。我國(guó)醫(yī)院臨床目前最常用的全身性抗真菌藥物仍為大扶康和特比奈分。
[0005]老品種的康唑類如氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑等通過(guò)抑制真菌麥角甾醇生物合成中的羊毛留醇14去甲基化酶而起效，此類老牌唑類抗真菌藥物抗菌譜較窄而耐受性與日俱增，新品雖抗菌譜擴(kuò)大但是代謝性質(zhì)和理化特性不佳，水溶性低、生物利用度差。患者需要高脂飲食以利藥物吸收，或服用高價(jià)的特種制劑形式方可起效。為增加水溶性而添加的環(huán)糊精等也給腎功能不全者帶來(lái)較大威脅。[0006]世界范圍內(nèi)，國(guó)際大型藥業(yè)對(duì)抗真菌感染尤其是抗深度真菌感染的創(chuàng)新性藥物的研發(fā)方興未艾，而我國(guó)由于研發(fā)經(jīng)費(fèi)投入和對(duì)抗真菌感染藥物的重視程度不夠等原因，造成我國(guó)在真菌感染類治療藥物上落后跨國(guó)藥企的事實(shí)，需要迎頭趕上。
[0007]綜上所述，盡快尋找新型、異于以往藥物的抗真菌活性物質(zhì)，是今后數(shù)十年藥物工作者們需要抓緊研制的當(dāng)務(wù)之急。
[0008]本研究團(tuán)隊(duì)以前從植物中發(fā)現(xiàn)許多對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和/或陰性菌有效的植物提取部位和有效成分，更加增添了我們研發(fā)新的“綠色抗生素”、發(fā)現(xiàn)新的抗真菌天然藥物的信心。[趙昱等，具抗病毒、抗炎、和/或抗菌作用的六棱菊屬提取物及其用途，ZL200510077457.3]、[趙昱等，生姜中單萜苷類化合物及其抗菌用途和藥物組合物，CN101012255]、[趙昱等，蒲公英中的兩個(gè)黃酮苷及其抗格蘭氏陽(yáng)性菌的醫(yī)藥用途，ZL200710067180.5]、[趙昱等，蒲公英中的木質(zhì)素及其抗菌活性和醫(yī)藥用途，ZL200710067458.9]、[趙昱等，黑紫橐吾中的含氯原子艾里莫芬烷及其抗菌和細(xì)胞毒活性，ZL200710067460.6]、[趙昱等，蒲公英中的倍半萜內(nèi)酯及其抗格蘭氏陽(yáng)性菌的用途，ZL200710067776.5]、[趙昱等，黑紫橐吾素A及其抑制格蘭氏陽(yáng)性菌的醫(yī)藥用途，ZL200710068539.0]、[趙昱等，蒲公英木質(zhì)素抑制格蘭氏陽(yáng)性菌的制藥用途，ZL200810165728.4]。
[0009]本研究團(tuán)隊(duì)另外一個(gè)開發(fā)的重點(diǎn)是昆蟲類抗菌肽資源?？咕氖亲陨鲜兰o(jì)80年代以來(lái)興起的新的抗菌藥物開發(fā)領(lǐng)域。其是指從生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的宿主產(chǎn)生的一類能夠抵御外界病原體感染的小分子多肽，由動(dòng)物體內(nèi)的分泌物、血液、淋巴組織等分離得到的大量抗菌肽與傳統(tǒng)抗生素的作用機(jī)制不同，且其對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌和真菌都有不同的選擇性。該研究方向引起了我們的興趣，大理學(xué)院藥用特種昆蟲開發(fā)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心的研發(fā)團(tuán)隊(duì)著力于從抗感染能力強(qiáng)的種群中發(fā)現(xiàn)綠色抗生素，諸如抗菌肽類物質(zhì)和其他有成藥可能的小分子物質(zhì)基礎(chǔ)。
[0010]絡(luò)新婦蛛，Nephila, silk spider,屬節(jié)肢動(dòng)物門(Arthropoda)蛛型綱(Arachnida)絡(luò)新婦科絡(luò)新婦屬昆蟲，云貴高原廣泛分布，結(jié)大型金黃色網(wǎng)，網(wǎng)的直徑可達(dá)一公尺以上，以拉絲懸于樹間。生活在溫暖地區(qū)。約60種，云南省分布有3種；斑絡(luò)新婦(Nephila pilipes Fabricius)、棒絡(luò)新婦(Nephila clavata L.Koch)、馬拉近絡(luò)新婦(Nephila malabarensis Walckenaer)。該屬蛛體色艷麗，雌成蛛個(gè)體較大、雄蛛小數(shù)倍。
[0011]蜘蛛入藥在我國(guó)早已有之?！短票静荨吩?“主蛇毒，溫瘧，霍亂，止嘔逆”；《日華子本草》云:“冷，無(wú)毒；斑蜘蛛治瘧疾，疔腫”；《長(zhǎng)沙藥解》云:“炒枯存性研細(xì)用；破瘀消腫”；《本草綱目》云:“主口，脫肛，疔腫，胡臭”;《吉林中草藥》云:“治瘰疬，疔瘡，蜂、蝎蜇傷”;《中藥大辭典》云:“祛風(fēng)，消腫，解毒。治狐疝偏墜，中風(fēng)口，小兒慢驚、口噤。疳積；疔腫，瘰疬，瘡瘍，蜈蚣、蜂、蝎蜇傷”。以上歷史記錄表明其體內(nèi)必應(yīng)具有某些特殊的物質(zhì)和其特有的作用機(jī)制。在對(duì)云貴高原的藥用昆蟲抗菌活性系列研究過(guò)程中，我們對(duì)蛛型綱絡(luò)新婦屬進(jìn)行了綜合采集、種屬鑒定和抑制真菌生長(zhǎng)活性的藥效學(xué)研究。
[0012]根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)，在針對(duì)藥物應(yīng)用方面，“蜘蛛”多為復(fù)方中的一味，公開資料中沒有蜘蛛作為單方應(yīng)用于治療與真菌感染相關(guān)疾病的報(bào)導(dǎo)。1995年王仁學(xué)公開的“一種速效口瘡散”(申請(qǐng)?zhí)?4103402.X)，是由蜘蛛等5種藥材構(gòu)成，主治口腔性潰瘍，兼治一般疥瘡癬、丹毒等。2008年王秀成獲得授權(quán)的專利“一種止痛止血止癢藥散”(ZL200810016451.6)，是由楊樹花、蛇皮、蜘蛛等6種材料組成。2009年孫素芬等公開的“治療腳氣病的藥物及其制備方法”(CN101411769A)，由含蜘蛛在內(nèi)的17種藥物組成，且蜘蛛僅用于涂抹藥膏配方中。顯然，蜘蛛作為單味藥單獨(dú)使用于抑制真菌生長(zhǎng)的醫(yī)藥用途在開發(fā)新的抗真菌物質(zhì)基礎(chǔ)方面仍是空白，故而本發(fā)明專門針對(duì)蛛型綱絡(luò)新婦屬進(jìn)行抗真菌活性研發(fā)尚屬首次且十分必要。
[0013]根據(jù)《中藥大辭典》，其基元是指園網(wǎng)蛛科大腹園網(wǎng)蛛等全蟲。動(dòng)物分類學(xué)中，將此屬歸為圓蛛總科絡(luò)新婦亞科絡(luò)新婦屬，是云南省優(yōu)勢(shì)資源。為明確云貴高原藥源廣泛分布的絡(luò)新婦屬蜘蛛是否具有抗真菌活性，及確定其抗真菌有效部位，指導(dǎo)進(jìn)一步探明其中起主要藥理作用的物質(zhì)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，從分子藥理學(xué)基礎(chǔ)上闡明絡(luò)新婦屬蜘蛛多種生物活性的作用機(jī)制，發(fā)明人對(duì)云南民間習(xí)用的絡(luò)新婦屬昆蟲進(jìn)行了綜合采集和藥效學(xué)活性研究。本發(fā)明使用不同濃度的鹽溶劑系統(tǒng)對(duì)蛛形類蟲體進(jìn)行了提取，并由酸沉、離心、透析除鹽等方法得到了富含多肽蛋白的有效部位，并測(cè)試了其抑制白色念珠菌的藥理活性。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn):絡(luò)新婦屬蜘蛛抗真菌有效部位能顯著抑制白色念珠菌生長(zhǎng)。且具有較強(qiáng)的抑制活性，可以作為防治真菌感染類天然藥物進(jìn)一步深入開發(fā)，從而構(gòu)成本發(fā)明。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014]本發(fā)明的目的是提供了一種絡(luò)新婦屬蜘蛛具有抗真菌活性的有效部位及其制備方法；具體而言，該有效部位通過(guò)以下方法獲得:由粉碎或未粉碎的蜘蛛目絡(luò)新婦科絡(luò)新婦屬Nephila spp.蟲體用鹽溶液提取、酸沉淀、離心分離、再經(jīng)透析方法純化；得到的有效部位經(jīng)冷凍干燥而得產(chǎn)品。
[0015]本發(fā)明的另一目的是提供了絡(luò)新婦屬蜘蛛抗真菌有效部位在制備防治真菌感染疾病的藥物中的用途。
[0016]本發(fā)明的又一目的是提供了一種防治真菌感染的藥物或藥物組合物，其含有治療有效量的絡(luò)新婦屬蜘蛛抗真菌有效部位和可藥用輔料。其制劑形式包括水凝膠、巴布劑、凍干粉、水劑、散劑、口服液、噴霧劑、沖劑、貼膜、注射劑、片劑、膠囊劑、氣霧劑、栓劑、透皮吸收制劑、滴丸劑、外用搽劑、軟膏劑，及其控釋或緩釋劑型或納米制劑。
[0017]本發(fā)明的另一目的是提供了將絡(luò)新婦屬蜘蛛抗真菌有效部位用于制備抗真菌感染的廣譜抗菌藥物、日化用品、醫(yī)療器械、藥用輔料、外傷敷料或飼料添加劑的用途。
[0018]本發(fā)明中提供絡(luò)新婦屬蜘蛛抗真菌有效部位的動(dòng)物藥材可選用絡(luò)新婦屬蜘蛛蟲體的任一部位，或它們的混合物?？梢允歉稍锶x，也可以是未經(jīng)干燥的全蟲或活體全蟲。
[0019]本發(fā)明中所述及的經(jīng)鹽溶液提取再經(jīng)透析方法純化得到的絡(luò)新婦屬蜘蛛抗真菌有效部位可以與藥學(xué)上常用的輔料或載體結(jié)合，制備得到具有廣譜抗真菌功效的水凝膠、巴布劑、凍干粉、水劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、外用搽劑、軟膏劑、泡沫凝膠，還可以采用現(xiàn)代制藥界所公知的控釋或緩釋劑型或納米制劑。
[0020]本發(fā)明的經(jīng)鹽溶液提取再經(jīng)透析方法純化得到的絡(luò)新婦屬蜘蛛抗真菌有效部位及其制劑或其可藥用鹽還可以與現(xiàn)已上市的治療真菌感染相關(guān)病癥的治療藥物及其原料藥如多烯類(如兩性霉素B)、三唑類(如氟康唑、咪康唑、益康唑、依曲康唑和酮康唑等)、烷基胺類(如特比萘芬)和新開發(fā)上市的棘白菌素(echinocandins )類品種聯(lián)合使用，制備得到具有治療真菌感染相關(guān)病癥功效活性的組合物或復(fù)方制劑，可預(yù)期成為防治真菌感染疾病藥品、保健品、日化用品和醫(yī)療器械。上述各類藥物組合物或者藥品、保健品、日化用品和醫(yī)療器械可以采用片劑、膠囊劑、注射劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、水凝膠、泡沫凝膠、巴布劑、凍干粉、水劑、外用搽劑、軟膏劑等劑型藥物，包括采用現(xiàn)已公認(rèn)的藥劑學(xué)常識(shí)常規(guī)制備而得的各種緩釋、控釋劑型或納米制劑。
[0021]此外，本發(fā)明的經(jīng)鹽溶液提取再經(jīng)透析方法純化得到的絡(luò)新婦屬蜘蛛抗真菌有效部位及其制劑或其可藥用鹽還可以與文獻(xiàn)中報(bào)道具有殺滅真菌療效的中藥(植物藥、動(dòng)物藥、礦物藥)合用，也可與殺滅真菌活性的納米銀制劑組成混合物或者聯(lián)合使用。同樣起到本發(fā)明所述之制備預(yù)防和治療真菌感染引起的疾病的藥物、外傷敷料中的應(yīng)用，通過(guò)藥物制劑、醫(yī)療器械、日化用品形式體現(xiàn)。上述各類藥物組合物或者藥品、保健品、日化用品和醫(yī)療器械可以采用片劑、膠囊劑、注射劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、水凝膠、泡沫凝膠、巴布劑、凍干粉、水劑、外用搽劑、軟膏劑等劑型藥物，包括采用現(xiàn)已公認(rèn)的藥劑學(xué)常識(shí)常規(guī)制備而得的各種緩釋、控釋劑型或納米制劑。
[0022]經(jīng)本發(fā)明人詳細(xì)的文獻(xiàn)查閱，查新結(jié)果顯示:到目前為止，尚無(wú)由絡(luò)新婦屬蜘蛛制備出的有效部位用于制備抗真菌藥物的報(bào)道。該有效部位對(duì)于真菌生長(zhǎng)的強(qiáng)效抑制屬于意想不到的發(fā)現(xiàn)，有著確切的原創(chuàng)性，且可以預(yù)期進(jìn)一步開發(fā)成為防治真菌感染類疾病的藥物或藥物組合物。據(jù)此完成本發(fā)明。
[0023]本發(fā)明的有益之處在于:首次用不同濃度的鹽溶劑系統(tǒng)提取結(jié)合蛋白組學(xué)實(shí)驗(yàn)方法制備出絡(luò)新婦屬蜘蛛有效部位，并首次發(fā)現(xiàn)了其在開發(fā)防治真菌感染類疾病的藥物領(lǐng)域中的潛力，對(duì)于開發(fā)治療真菌感染所致的病癥，包括淺部真菌感染(表面感染真菌、皮膚癬真菌和皮下組織感染真菌)和深部真菌感染疾病所需的治療藥物提供了新的蛛形類動(dòng)物藥物之物質(zhì)基礎(chǔ)。本發(fā)明再一特點(diǎn)是:該屬蜘蛛生長(zhǎng)繁殖能力旺盛，在云貴高原廣泛分布，便于養(yǎng)殖，每頭雌蛛每年可以孵育600-800只子代，有利于成為穩(wěn)定的生物藥物資源，同時(shí)也有利于貧困山區(qū)農(nóng)民養(yǎng)殖此類藥源性動(dòng)物達(dá)到脫貧目的。具有潛在的巨大社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。該藥物原料來(lái)源于天然養(yǎng)殖，制備步驟簡(jiǎn)便，成本低，污染小，利于大規(guī)模生產(chǎn)。
具體實(shí)施方案
[0024]為了更好地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面分別用該類絡(luò)新婦屬蜘蛛經(jīng)鹽溶液提取再經(jīng)透析方法純化過(guò)程，以及制備得到的絡(luò)新婦屬蜘蛛抗真菌有效部位對(duì)2株白色念珠菌ATCC: 10231和ATCC:90029抑制作用的藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果，說(shuō)明其在抗真菌研究領(lǐng)域中的新用途。必須說(shuō)明，本發(fā)明的實(shí)施例是用于說(shuō)明本發(fā)明而不是對(duì)本發(fā)明的限制。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的簡(jiǎn)單改進(jìn)都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
[0025]實(shí)施例1:斑絡(luò)新婦抗真菌有效部位的制備
[0026]新鮮捕捉到的斑絡(luò)新婦蜘蛛52頭(采自思茅地區(qū)，活體標(biāo)本由大理學(xué)院云南省藥用昆蟲及蛛形類資源利用開發(fā)工程實(shí)驗(yàn)室楊自忠教授鑒定為斑絡(luò)新婦Nephila pilipesFabricius)，將其(6.1克)直接冷凍，加入5倍體積的4°C預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液PBS溶液(0.2摩爾/升，pH=6.0)，冰鹽浴下組織勻漿機(jī)勻漿，在4°C條件下離心15分鐘，轉(zhuǎn)速2000轉(zhuǎn)/分鐘。取上清液緩慢加入飽和硫酸銨液，磁力攪拌混勻，使硫酸銨的終濃度達(dá)到30%。再重復(fù)上述步驟，使硫酸銨終濃度達(dá)到40%，50%, 60%, 70%, 80%,于4°C下靜置4小時(shí)后，再以6000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，取沉淀溶于PBS緩沖液中，4°C下以截留分子量為1000道爾頓(IKDa)的透析袋透析過(guò)夜，得到的去鹽物冷凍干燥得斑絡(luò)新婦抗真菌有效部位(BANLXF)50.3暈克。
[0027]經(jīng)福林酚法檢查，該有效部位中蛋白多肽含量為60.5%。
[0028]實(shí)施例2:棒絡(luò)新婦抗真菌有效部位的制備
[0029]將捕捉到的棒絡(luò)新婦蜘蛛66頭(采自大理地區(qū)，活體標(biāo)本由大理學(xué)院云南省藥用昆蟲及蛛形類資源利用開發(fā)工程實(shí)驗(yàn)室楊自忠教授鑒定為棒絡(luò)新婦Nephila clavataL.Koch)(稱重為8.3克)直接冷凍，加入5倍體積的4°C預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液PBS溶液(0.2摩爾/升，pH=6.0)，冰鹽浴下組織勻漿機(jī)勻漿，在4°C條件下離心15分鐘，轉(zhuǎn)速2000轉(zhuǎn)/分鐘。取上清液緩慢加入飽和硫酸銨液，磁力攪拌混勻，使硫酸銨的終濃度達(dá)到30%。再重復(fù)上述步驟，使硫酸銨終濃度達(dá)到40%，50%, 60%, 70%, 80%,于4°C下靜置4小時(shí)后，再以6000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，取沉淀溶于PBS緩沖液中，4°C下以截留分子量為IKDa的透析袋透析過(guò)夜，得到的去鹽物冷凍干燥得棒絡(luò)新婦抗真菌有效部位(BANGLXF) 56.8毫克。
[0030]經(jīng)福林酚法檢查，該有效部位中蛋白多肽含量為52.5%。
[0031]實(shí)施例3:斑絡(luò)新婦抗真菌有效部位抑制真菌活性檢測(cè)
[0032]參照美國(guó)國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(NCCLS)提出的標(biāo)準(zhǔn)化抗真菌敏感性試驗(yàn)方法，測(cè)試實(shí)施例1制備得到的斑絡(luò)新婦抗真菌有效部位(BANLXF)的體外抗真菌活性。
[0033]3.1真菌標(biāo)準(zhǔn)株:
[0034]白色念珠菌ATCC: 10231:重慶市疾病預(yù)防控制中心提供。
[0035]白色念珠菌ATCC:90029 (5_FC耐藥菌株):北京醫(yī)院衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心。
[0036]3.2 試劑:
[0037]3.2.1沙氏瓊脂培養(yǎng)基(sabouraud dextrose agar):廣東凱微生物科技有限公司
女口
廣叩o
[0038]3.2.2酵母抽提物(yeast extract):海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司分裝。
[0039]3.2.3 三氮嗎啡啉丙橫酸(3-N-morpholinopropanesulfonicacid，MOPS)
[0040]3.2.4標(biāo)準(zhǔn)抗真菌藥物干粉及注射液:氟康唑(Fluconazole，F(xiàn)CZ)，揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)公司；兩性霉素 B (AmphotericinB, AmB)、5_ 氟胞啼卩定(Fluorocytosine，5-FC)、酮康唑(Ketoconazle’KETO)，中國(guó)藥品生物制品檢定所產(chǎn)品；配置成不同濃度梯度的倍比稀釋液。
[0041]3.2.5 二甲基亞諷(dimethylsulfoxide，DMSO)及二甲基甲酉先胺(dimethylformamide, DMF):上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司分裝產(chǎn)品。
[0042]3.3 儀器:
[0043]3.3.1電子天平JA1203N (AB204-5，METTLER TOLEDO):上海精密科學(xué)儀器公司產(chǎn)
品O
[0044]3.3.2SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái):蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品。[0045]3.3.3隔水式恒溫培養(yǎng)箱(GSP-9160MBE):上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。
[0046]3.3.4電熱恒溫培養(yǎng)箱(HZQ-F160A):上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。
[0047]3.3.5美菱電冰箱(B⑶-221CHC):合肥美菱股份有限公司產(chǎn)品。
[0048]3.3.6 微量移液器(Proline Pipette, DragonMed Pipette):芬蘭雷勃公司產(chǎn)品。
[0049]3.3.7細(xì)胞計(jì)數(shù)板(96well cell culture cluster):上海求精儀器公司產(chǎn)品。
[0050]3.3.8普通光學(xué)顯微鏡(Olympus ):日本奧林巴斯光學(xué)儀器株式會(huì)社產(chǎn)品。
[0051]3.3.9干烤箱(101A-2):上海崇明實(shí)驗(yàn)儀器公司產(chǎn)品。
[0052]3.3.10立式高壓蒸汽滅菌器(YXQ-LS-50S II ):上海博訊實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品。
[0053]3.3.11磁力加熱攪 拌器(ARE):意大利VELP公司產(chǎn)品。
[0054]3.3.12濾膜、濾器(0.22 u m, SARTORIUS):德國(guó)賽多利斯公司產(chǎn)品。
[0055]3.3.13酸度計(jì)(PHSJ-4A):上海精科雷磁公司產(chǎn)品。
[0056]3.3.14試管振蕩器(MS2):廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)公司產(chǎn)品。
[0057]3.3.15恒溫振蕩培養(yǎng)箱(THZ-18AB):上海一恒科學(xué)儀器公司產(chǎn)品。
[0058]3.3.16低溫冰箱(_20°C，科龍B⑶-219WAK):廣東科龍電器有限責(zé)任公司產(chǎn)品。
[0059]3.3.1796孔平底微量培養(yǎng)板:美國(guó)Corning Incorporated產(chǎn)品。
[0060]3.4實(shí)驗(yàn)方法:
[0061]3.4.1實(shí)驗(yàn)步驟:
[0062]3.4.1.1RPM1-1640液的配制:取10.4克RPM1-1640粉(含L谷氨酰胺，不含碳酸氫鈉，GIBC0)溶于900毫升無(wú)菌水中，加入34.53克三氮嗎啡啉丙磺酸(MOPS)至其終點(diǎn)濃度為0.165摩爾/升，室溫下用磁力攪拌器混勻2-3小時(shí)，使其充分溶解，用氫氧化鈉(I摩爾/升)調(diào)節(jié)PH值至7.0 (25°C)，用滅菌水定容至I升，濾過(guò)除菌，分裝后_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0063]3.4.1.2儲(chǔ)備液的制備:儲(chǔ)備液濃度應(yīng)為應(yīng)用液的10倍，5-FC(5-氟尿嘧啶)和FCZ(氟康唑)為1，280微克/毫升，AmB (兩性霉素B)和KETO (酮康唑)為320微克/毫升，用電子天平分別稱取5-FC、FCZ、KETO和AmB各10毫克，5-FC用I毫升雙蒸水溶解，F(xiàn)CZ用I毫升二甲基甲酰胺(DMF)溶解，AmB和KETO分別用二甲亞砜(DMSO)溶解，之后用RPM1-1640稀釋至儲(chǔ)存液濃度，分裝后_70°C保存?zhèn)溆谩?br> [0064]3.4.1.3應(yīng)用液的制備:用RPM1-1640液將儲(chǔ)備液作1:10稀釋后再作倍比稀，F(xiàn)CZ、5-FC和AmB為128微克/毫升-0.25微克/毫升作10個(gè)系列的濃度，KETO為32微克/毫升-0.06微克/毫升10個(gè)系列濃度，均為2倍終濃度。
[0065]3.4.1.4微量藥敏培養(yǎng)板的制備:使用一次性的96孔板，第1-10列分別加入10個(gè)濃度梯度的測(cè)試藥物的應(yīng)用液，從高濃度到低濃度。第11列加入RPM1-1640，每孔100微升，第12列作為空白對(duì)照，放入_20°C冰箱備用，使用時(shí)經(jīng)_4°C、4°C和室溫各I小時(shí)。
[0066]3.4.1.5念珠菌的激活與稀釋:將待測(cè)的菌株在YPD瓊脂培養(yǎng)基(1%酵母抽提物，1%蛋白胨，2%葡萄糖)上激活兩次后，取直徑大于I毫米的菌落少許于3毫升無(wú)菌生理鹽水中混勻制成菌懸液，取少許，用血細(xì)胞技術(shù)板計(jì)數(shù)四個(gè)大方格中的菌細(xì)胞數(shù)，取平均值X，此時(shí)菌細(xì)胞數(shù)為XX IO4CFU/毫升，用RPM1-1640液調(diào)整濃度為3X IO4CFU/毫升(兩倍終濃度)。
[0067]3.4.1.6測(cè)試樣品:稱取實(shí)施例1中得到的斑絡(luò)新婦抗真菌有效部位(BANLXF)l.0毫克作為測(cè)試樣品。[0068]3.4.1.7加樣:在上述制備好的含有測(cè)試藥物的培養(yǎng)板上加入念珠菌懸液,每孔100微升空白對(duì)照不加，震蕩混勻后放入濕盒(防止微量板中的液體揮發(fā)而影響藥物的濃度)35°C孵育24-48小時(shí)后觀察結(jié)果。
[0069]3.4.2數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法
[0070]肉眼判斷結(jié)果，以生長(zhǎng)對(duì)照空為依據(jù)。AmB為完全抑制即MIC100作為觀察終點(diǎn)，液體清亮；其余藥物以80%抑制(即MIC8tl)為觀察終點(diǎn)，菌種生長(zhǎng)明顯減少，液體輕微混濁；陽(yáng)性對(duì)照中菌種生長(zhǎng)良好；空白對(duì)照清涼，無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。質(zhì)控菌株MIC值在美國(guó)臨床微生物實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)CLSI M27-A2方案規(guī)定的范圍內(nèi)，顯示實(shí)驗(yàn)結(jié)果是有效的。
[0071]3.5實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
[0072]3.5.1質(zhì)控株對(duì)抗真菌藥物的敏感性:四種陽(yáng)性藥物對(duì)質(zhì)控菌株ATCC:90029和ATCC: 10231標(biāo)準(zhǔn)株藥敏結(jié)果符合CLSI M27-A2方案對(duì)于質(zhì)控株標(biāo)準(zhǔn)株的要求。即:重復(fù)3次以上進(jìn)行AmB、5-FC、FCZ和KETO的MIC值變化不超過(guò)2個(gè)濃度梯度。
[0073]3.5.2斑絡(luò)新婦抗真菌有效部位(BANLXF)及陽(yáng)性對(duì)照的抗真菌活性結(jié)果見表1。
[0074]表1斑絡(luò)新婦抗真菌有效部位(BANLXF)對(duì)白色念珠菌的抑制作用
[0075]
【權(quán)利要求】
1.一種從絡(luò)新婦屬蜘蛛中提取的抗真菌有效部位，其特征是:所述抗真菌有效部位是絡(luò)新婦屬蜘蛛經(jīng)由鹽提蛋白法提取并由透析得來(lái)的富含蛋白多肽的部位，該抗真菌有效部位中蛋白和多肽的含量在50%或以上。
2.一種制備權(quán)利要求1所述的抗真菌有效部位的方法，其特征是:粉碎或未粉碎的蜘蛛目絡(luò)新婦科絡(luò)新婦屬蟲體干品或鮮品，用鹽溶液提取、酸沉淀、離心分離、再經(jīng)透析方法純化，得到的有效部位經(jīng)冷凍干燥而得產(chǎn)品；其中透析法純化時(shí)采用的是截留分子量為I千道爾頓的透析膜。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從絡(luò)新婦屬蜘蛛中提取的抗真菌有效部位用于制備防治真菌感染性疾病的藥物用途。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的藥物用途，其特征是:所述抗真菌感染藥物用途通過(guò)藥物制劑、醫(yī)療器械、日化用品形式體現(xiàn)，所述藥物制劑、醫(yī)療器械、日化產(chǎn)品的形式是水凝膠、泡沫凝膠、巴布劑、凍干粉、水劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、外用搽劑、軟膏劑。
5. 一種具有預(yù)防和治療真菌感染的藥物組合物，其特征是:該藥物組合物是由含有治療有效量的權(quán)利要求1的從絡(luò)新婦屬蜘蛛中提取的抗真菌有效部位及其與制劑允許的藥物賦形劑或載體制備成藥物組合物，在制備預(yù)防和治療真菌感染引起的疾病的藥物、外傷敷料中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61P31/10GK103655631SQ201310625246
【公開日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年12月1日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月1日
【發(fā)明者】巫秀美, 郭華, 馮萍, 杰瑞米·米勒, 楊自忠, 趙昱 申請(qǐng)人:大理學(xué)院