一種靶向治療肝癌的復(fù)合磁性納米粒及制備方法
【專利摘要】本發(fā)明是一種靶向治療肝癌的復(fù)合磁性納米粒及制備方法，該方法是分別制備重組真核表達(dá)質(zhì)粒p[HRE]AFP-p53和聚乙烯亞胺修飾的四氧化三鐵納米磁粒，再將聚乙烯亞胺修飾的納米磁粒與質(zhì)粒p[HRE]AFP-p53按照質(zhì)量比為2：1至16：1混勻，孵育30分鐘，即獲得p[HRE]AFP-p53/聚乙烯亞胺四氧化三鐵磁性納米粒復(fù)合物。本發(fā)明制得的復(fù)合物用于肝癌靶向基因治療與磁流體熱療的聯(lián)合，在體內(nèi)外治療試驗(yàn)中，均獲得了具有肝癌特異性的治療效果。
【專利說明】一種靶向治療肝癌的復(fù)合磁性納米粒及制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種靶向治療肝癌的復(fù)合磁性納米粒及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是常見的惡性腫瘤,每年全世界發(fā)病率為5.5-14.9/10萬人，有60-100萬人死于肝細(xì)胞癌，我國(guó)是肝細(xì)胞癌發(fā)病率最聞的國(guó)家，每年發(fā)病率超過30.3/10萬人。肝細(xì)胞癌侵襲性強(qiáng)、發(fā)病隱匿，大部分患者(80%)不能手術(shù)切除，僅能依賴化療、放療等治療方法，而肝細(xì)胞癌對(duì)很多傳統(tǒng)的化療藥物都有耐藥性，且肝臟放射耐受量低，治療效果有限。因此人們逐漸把更多的目光投向腫瘤的第四種治療模式:生物治療。生物治療包括免疫治療和基因治療，其中基因療法被認(rèn)為有希望能從根源上治愈腫瘤，在腫瘤治療方面顯示出良好的前景。
[0003]常用的治療基因包括抑癌基因、自殺基因和反義基因。抑癌基因是與腫瘤相關(guān)性最強(qiáng)的基因，超過50%的人類惡性腫瘤和60%的肝細(xì)胞癌中都存在的突變，選用野生型作為治療基因，能調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，修復(fù)DNA，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤血管生成，控制腫瘤轉(zhuǎn)移，還有研究顯不基因治療可以提聞腫瘤組織對(duì)熱療、化療和放療的敏感性。但是目前基因治療還不能在臨床廣泛開展，限制其應(yīng)用的瓶頸在于其安全性問題，尤其是基因表達(dá)不可控制性所引起的正常細(xì)胞損傷，通過對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，提高基因治療的靶向性，能最小程度的減少其治療的毒性和副作用。
[0004]利用腫瘤細(xì)胞的特異性啟動(dòng)子，在轉(zhuǎn)錄水平實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的調(diào)控，可使治療基因僅在靶細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，從而保護(hù)基因治療中正常的組織和細(xì)胞不受損傷。使用AFP(alpha-fetoprotein)基因啟動(dòng)子能祀向AFP陽性的肝細(xì)胞癌,但J/7/7啟動(dòng)子較弱，介導(dǎo)的治療體系很難達(dá)到理想的治療效果，且在AFP陰性以及低AFP表達(dá)的HCC細(xì)胞中僅能介導(dǎo)痕量的基因表達(dá)。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，啟動(dòng)子的表達(dá)活性在大程度上依賴于其上游增強(qiáng)子的作用，若將來源于血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)基因的乏氧反應(yīng)序列(及responsive作為增強(qiáng)子與啟動(dòng)子5’端融合，于乏氧誘導(dǎo)的條件下，在高AFP和低AFP產(chǎn)生的HCC細(xì)胞內(nèi)都能高效的表達(dá)。由于腫瘤組織生長(zhǎng)速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)快于新生血管的速度，瘤體內(nèi)缺乏血供，人類實(shí)體腫瘤包括肝癌中都不同程度的存在乏氧環(huán)境，而對(duì)于正常細(xì)胞，如代表肝臟恢復(fù)和儲(chǔ)備能力的肝干細(xì)胞以及肝臟的基質(zhì)細(xì)胞，即使有微弱的AFP表達(dá)，由于不存在乏氧環(huán)境，他7?及啟動(dòng)子介導(dǎo)的治療體系對(duì)它們沒有細(xì)胞毒性，可以在很大程度上保留肝臟的修復(fù)和儲(chǔ)備能力。
[0005]目前將治療基因?qū)塍w內(nèi)的運(yùn)載體包括兩類:病毒載體和非病毒載體。病毒載體轉(zhuǎn)運(yùn)效率高，但是存在不夠安全(如產(chǎn)生免疫原性、可能致宿主基因突變等)，攜帶基因量有限，載體功能單一等不足之處。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]技術(shù)問題:本發(fā)明提供了一種得到用于肝癌的體內(nèi)外治療，具有肝癌特異性的治療效果的靶向治療肝癌的復(fù)合磁性納米粒的制備方法。
[0007]技術(shù)方案:本發(fā)明的靶向治療肝癌的復(fù)合磁性納米粒的制備方法，包括下述步驟:
(1)質(zhì)粒p[HRE]AFP-p53的制備:將甲胎蛋白啟動(dòng)子序列插入質(zhì)粒P⑶NA3.1的Mlu1-HindIII質(zhì)粒限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，得到質(zhì)粒p⑶NA3.1-AFP ;將5個(gè)連續(xù)的乏氧反應(yīng)序列元件插入質(zhì)粒pCDNA3.1-AFP的質(zhì)粒限制性內(nèi)切酶MluI位點(diǎn)，得到質(zhì)粒pCDNA3.1-HRE-AFP ;將野生型p53片段亞克隆至質(zhì)粒pCDNA3.1-HRE-AFP的質(zhì)粒限制性內(nèi)切酶 EcoR 1-Xho I 位點(diǎn)，得到質(zhì)粒 p[HRE]AFP-p53 ;
(2)制備復(fù)合磁性納米粒:將質(zhì)粒p[HRE]AFP-p53和聚乙烯亞胺修飾的四氧化三鐵磁性納米粒分別用無血清培養(yǎng)基稀釋，然后將兩者按照磁性納米粒與P[HRE]AFP-p53質(zhì)量比為2:1至16:1混和均勻，孵育后即獲得靶向治療肝癌的復(fù)合磁性納米粒。 [0008]本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)選方案的步驟(2)中，磁性納米粒與p[HRE]AFP_p53質(zhì)量比為 8:1。
[0009]本發(fā)明的靶向治療肝癌的復(fù)合磁性納米粒，是按照上述方法制備得到。
[0010]有益效果:本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn):
試驗(yàn)證實(shí)，在本發(fā)明中，受到甲胎蛋白啟動(dòng)子介導(dǎo)和乏氧反應(yīng)序列增強(qiáng)的P53蛋白僅僅局限在肝癌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，所以對(duì)人體正常細(xì)胞和組織不會(huì)產(chǎn)生毒副作用，與其它的基因治療方案相比，本發(fā)明的安全性和可控性極大提高。與其它靶向治療方案相比，本發(fā)明不僅可以靶向原發(fā)肝細(xì)胞癌的病灶，對(duì)于原發(fā)性肝癌的轉(zhuǎn)移灶也有靶向治療作用。在本發(fā)明中，使用的基因載體是磁性四氧化三鐵納米粒，相比較于常用的病毒載體，納米載體具有很有優(yōu)勢(shì):其一，安全性高，可反復(fù)注射而不產(chǎn)生抗原性，不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。第二，攜帶基因數(shù)量多，對(duì)非增殖期的細(xì)胞也能有效轉(zhuǎn)染，能與其他功能性材料相復(fù)合。第三。研究表明磁性納米顆粒制備簡(jiǎn)單，生物相容性好，轉(zhuǎn)染效率高，易于表面修飾，能在交變磁場(chǎng)中可控升溫，可用于腫瘤的磁流體熱療。并且，隨著納米生物技術(shù)的發(fā)展，納米粒子作為探針和造影劑被用于腫瘤的分子成像，可以在很大程度上提高腫瘤顯像的靈敏度，對(duì)腫瘤的早期診斷具有重大的意義。因此，同時(shí)具備成像和基因轉(zhuǎn)運(yùn)功能的納米粒子將能實(shí)現(xiàn)腫瘤的診斷和治療相結(jié)合。此外，本發(fā)明可以在一個(gè)系統(tǒng)內(nèi)實(shí)現(xiàn)靶向基因治療與腫瘤磁流體熱療的結(jié)合。體內(nèi)外試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，相對(duì)于單一治療，腫瘤的磁流體熱療聯(lián)合靶向基因治療具有最大的腫瘤抑制率，取得的治療效果要遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于單一療法。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1是肝癌靶向復(fù)合磁性納米顆粒介導(dǎo)肝細(xì)胞癌選擇性的細(xì)胞毒效應(yīng)示意圖； 圖中，HepG2 (產(chǎn)甲胎蛋白)和SMMC7721 (不產(chǎn)甲胎蛋白)是肝癌細(xì)胞系。Lovo (腸
癌細(xì)胞)和L929 (成纖維細(xì)胞)是非肝癌細(xì)胞系。所有的細(xì)胞系的細(xì)胞經(jīng)復(fù)合磁性納米粒轉(zhuǎn)染后72小時(shí)后，計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增值率(RPR %)。
[0012]圖2是體內(nèi)抑瘤試驗(yàn)的分組效果圖；
圖中，每個(gè)治療組的瘤塊質(zhì)量以mean 土 SD (n=5)的形式表示，*治療組相對(duì)陰性對(duì)照組 p〈0.001。[0013]圖3是體內(nèi)移植瘤經(jīng)熱療聯(lián)合基因治療后細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)TEM圖；
圖中可見細(xì)胞中染色質(zhì)聚集,邊聚,典型的凋亡小體形成。
【具體實(shí)施方式】
[0014]下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步具體說明。
[0015]本發(fā)明用于肝細(xì)胞癌的靶向基因治療與熱療的聯(lián)合治療，在具體實(shí)施例中，不論是體外細(xì)胞試驗(yàn)還是體內(nèi)腫瘤抑制試驗(yàn)的數(shù)據(jù)，都證明了該靶向肝癌的磁性納米粒具有對(duì)肝癌組織和細(xì)胞的特異性抑制作用，同時(shí)結(jié)合磁流體熱療，具有協(xié)同治療效果，腫瘤抑制率優(yōu)于單一治療方法。
[0016]實(shí)施例1:
1.復(fù)合磁性納米粒的制備
(I)質(zhì)粒p[HRE]AFP-p53的制備:p[HRE]AFP_p53為一種重組真核表達(dá)質(zhì)粒的命名，其中HRE是指代乏氧反應(yīng)序列元件，在質(zhì)粒表達(dá)中起到增強(qiáng)子的作用，AFP是指代甲胎蛋白啟動(dòng)子，作用是介導(dǎo)下游的抑癌基因P53 (—種基因的名稱)僅能在肝癌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。甲胎蛋白啟動(dòng)子序列通過堿基合成法制備，合成的序列兩端分別含有質(zhì)粒限制性內(nèi)切酶MluI (MluI是內(nèi)切酶的名稱，以下相同)和HindIII位點(diǎn)，分別將真核表達(dá)質(zhì)粒p⑶NA3.1(PCDNA3.1是一個(gè)常用的基因克隆質(zhì)粒的名稱，最早由西方生物公司合成并應(yīng)用，目前尚沒有對(duì)應(yīng)的中文名稱)和甲胎蛋白啟動(dòng)子片段用內(nèi)切酶Mlu1-HindIII雙酶切后，純化的片段用質(zhì)粒連接酶連接，既將甲胎蛋白啟動(dòng)子序列插入質(zhì)粒P⑶NA3.1的Mlu1-HindIII質(zhì)粒限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，替換原有的啟動(dòng)子，得到質(zhì)粒pCDNA3.1-AFP ;含有5個(gè)連續(xù)的乏氧反應(yīng)序列元件也采用堿基合成法合成，兩端均有質(zhì)粒限制性內(nèi)切酶MluI的酶切位點(diǎn)，將其和質(zhì)粒P⑶NA3.1-AFP均用MluI酶切后，純化片段用質(zhì)粒連接酶連接，即將5個(gè)連續(xù)的乏氧反應(yīng)序列元件插入質(zhì)粒pCDNA3.1-AFP的質(zhì)粒限制性內(nèi)切酶MluI位點(diǎn)，得到質(zhì)粒pCDNA3.1-HRE-AFP ;將野生型p53片段亞克隆至質(zhì)粒pCDNA3.1-HRE-AFP的質(zhì)粒限制性內(nèi)切酶EcoR 1-Xho I位點(diǎn)，得到質(zhì)粒p[HRE]AFP-p53，經(jīng)酶切鑒定及測(cè)序分析，合成質(zhì)粒序列正確。
[0017](2)聚乙烯亞胺修飾的四氧化三鐵納米磁粒的制備:用化學(xué)共沉淀法制備四氧化三鐵磁性納米顆粒:在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，于250毫升容積的三口燒瓶中將氯化亞鐵(1.0摩爾每升)和氯化鐵(1.0摩爾每升)以摩爾比5:3的比例溶于150毫升純水，300轉(zhuǎn)/分邊攪拌邊加入氨水調(diào)整溶液PH值至9.5±0.1，50°C反應(yīng)30分鐘后得到磁性四氧化三鐵納米粒，磁分離，水洗至PH為7.0，真空冷凍干燥。0.5克磁性納米顆粒溶于50ml純水中，超聲分散60分鐘后，逐滴滴入2ml體積比為20%的聚乙烯亞胺水溶液，得到聚乙烯亞胺修飾的四氧化三鐵納米磁粒。
[0018](3)制備復(fù)合磁性納米粒:將質(zhì)粒p[HRE]AFP_p53和聚乙烯亞胺修飾的四氧化三鐵磁性納米粒分別用無血清培養(yǎng)基稀釋，然后將兩者按照磁性納米粒與P[HRE]AFP-p53質(zhì)量比為8:1混和均勻，孵育后即獲得靶向治療肝癌的復(fù)合磁性納米粒。
[0019]2.納米材料的表征:
磁性納米材料用透射電鏡(SEM，HITACH1-600)和掃描電鏡(SEM，JE0LJSM-6360LV)觀察形貌、粒徑、分散性； 掃描電鏡能譜儀(SEM-EDS，GENESIS2000XMS60)對(duì)材料成分進(jìn)行分析；用傅立葉紅外光譜分析儀(FTIR，Nicolet 560)分析表面官能團(tuán)的變化；用X射線衍射儀(ARL-X’ TRA)分析樣品的晶體結(jié)構(gòu)；結(jié)果顯示磁性納米粒構(gòu)建成功。
[0020]3.納米粒子DNA結(jié)合能力的檢測(cè):將納米粒子與質(zhì)粒DNA按O:1，3:1，5:1，10:1的質(zhì)量比混合，終體積50 μ 1，質(zhì)粒濃度恒定在0.01 Ug/μ I,室溫靜置結(jié)合30分鐘后，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)合情況，以未加材料的等濃度質(zhì)粒作為對(duì)照，若材料與質(zhì)粒充分結(jié)合將能阻止質(zhì)粒電泳，即電泳抑制試驗(yàn)陽性。結(jié)果顯示，在納米粒子與質(zhì)粒DNA質(zhì)量比高于2:1之后,質(zhì)粒電泳均被抑制,表明以高于納米粒子和質(zhì)粒質(zhì)量比2:1的比例混合時(shí)，質(zhì)粒均能被納米粒子完全結(jié)合。 [0021]4.體外熱動(dòng)力學(xué)試驗(yàn):將測(cè)試材料用生理鹽水配置成濃度為1.0mg/mL的磁流體溶液，各取5ml加入直徑25mm的平底試管中，置于230kHZ，30A的SPG-06A高頻磁感應(yīng)加熱設(shè)備平板線圈上加熱lh，起始室溫25°C，試管底距線圈中心0.5cm，每5分鐘用TM902C數(shù)字測(cè)溫器測(cè)溫一次，繪制磁流體的升溫曲線圖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，前30分鐘，溫度上升速度很快，30分鐘時(shí)達(dá)到42攝氏度，然后在接下來的30分鐘內(nèi)，溫度僅有緩慢上升，穩(wěn)定在44攝氏度左右，顯示出磁性納米粒子在交變磁場(chǎng)中升溫的可控性，用于體內(nèi)腫瘤熱療時(shí)，可以達(dá)到有效溫度，且不會(huì)過度加溫傷害正常組織。
[0022]5.體外靶向肝癌的治療試驗(yàn):
選用肝癌細(xì)胞系H印G2 (產(chǎn)甲胎蛋白)和SMMC7721 (不產(chǎn)甲胎蛋白)。非肝癌細(xì)胞系Lovo (腸癌細(xì)胞)和L929 (成纖維細(xì)胞)進(jìn)行試驗(yàn)。所有的細(xì)胞系的細(xì)胞經(jīng)復(fù)合磁性納米粒轉(zhuǎn)染后72小時(shí)后，計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增值率(RPR %)。試驗(yàn)結(jié)果顯示，該復(fù)合磁性納米粒僅對(duì)肝癌細(xì)胞H印G2和SMMC7721的增殖有抑制作用，且該抑制作用可以被乏氧培養(yǎng)誘導(dǎo)增強(qiáng)，而對(duì)非肝癌細(xì)胞沒有顯示出明顯的抑制作用。該試驗(yàn)顯示出復(fù)合磁性納米粒對(duì)肝癌的治療效果是具有靶向性的。
[0023]6.體外聯(lián)合治療試驗(yàn):
將H印G2細(xì)胞分為陰性對(duì)照組，單獨(dú)熱療組，單獨(dú)基因治療組，熱療聯(lián)合基因治療組，陰性對(duì)照組的細(xì)胞不采用任何操作，各處理組細(xì)胞MTT吸光度和對(duì)照組的比值為增值率，并用流式細(xì)胞檢測(cè)凋亡細(xì)胞率，與空白對(duì)照組相比較。體外靶向試驗(yàn)結(jié)果顯示，熱療聯(lián)合基因治療組細(xì)胞增殖抑制率為76.11%，單獨(dú)熱療組為35.22%，單獨(dú)基因治療組為50.18%。聯(lián)合治療組在體外試驗(yàn)中顯示出良好的協(xié)同效應(yīng)。
[0024]7.荷瘤模型動(dòng)物的建立:
取培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞，經(jīng)計(jì)數(shù)后調(diào)整濃度為6.0X IO6細(xì)胞/ml，裸鼠稱重后，皮下注射細(xì)胞培養(yǎng)液0.2ml，所有裸鼠在SPF條件下的層流架中飼養(yǎng)。試驗(yàn)后觀察動(dòng)物存活量和生理狀態(tài)。
[0025]8.體內(nèi)基因治療聯(lián)合熱療:
荷瘤動(dòng)物手術(shù)兩周后按體外試驗(yàn)分組，分為陰性對(duì)照組，單獨(dú)熱療組，單獨(dú)基因治療組，熱療聯(lián)合基因治療組，每組5只裸鼠，治療后6周，各組動(dòng)物活殺，剝離瘤體稱重，取平均值。結(jié)果顯示，聯(lián)合治療組對(duì)腫瘤生長(zhǎng)抑制率為85.18%，單獨(dú)基因治療組抑制率為42.85%，單獨(dú)熱療組抑制率為46.93%。體內(nèi)試驗(yàn)的結(jié)果與體外試驗(yàn)結(jié)果相符合。
實(shí)施例2:
基本步驟和流程同實(shí)施例1，不同之處在于，制備復(fù)合磁性納米粒時(shí):將質(zhì)粒p[HRE]AFP-p53和聚乙烯亞胺修飾的四氧化三鐵磁性納米粒分別用無血清培養(yǎng)基稀釋，然后將兩者按照磁性納米粒與P[HRE]AFP-p53質(zhì)量比為2:1混和均勻，孵育后即獲得靶向治療肝癌的復(fù)合磁性納米粒。
[0026]其余實(shí)施部分與實(shí)施例1相同。
[0027]實(shí)施例3:
基本步驟和流程同實(shí)施例1，不同之處在于，制備復(fù)合磁性納米粒時(shí):將質(zhì)粒p[HRE]AFP-p53和聚乙烯亞胺修飾的四氧化三鐵磁性納米粒分別用無血清培養(yǎng)基稀釋，然后將兩者按照磁性納米粒與P[HRE]AFP-p53質(zhì)量比為16:1混和均勻，孵育后即獲得靶向治療肝癌的復(fù)合磁性納米粒。
[0028]其余實(shí)施部分與實(shí)施例1相同。
【權(quán)利要求】
1.一種靶向治療肝癌的復(fù)合磁性納米粒的制備方法，其特征在于，該方法包括下述步驟: (1)質(zhì)粒p[HRE]AFP-p53的制備:將甲胎蛋白啟動(dòng)子序列插入質(zhì)粒P⑶NA3.1的Mlu1-HindIII質(zhì)粒限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，得到質(zhì)粒p⑶NA3.1-AFP ;將5個(gè)連續(xù)的乏氧反應(yīng)序列元件插入質(zhì)粒pCDNA3.1-AFP的質(zhì)粒限制性內(nèi)切酶MluI位點(diǎn)，得到質(zhì)粒pCDNA3.1-HRE-AFP ;將野生型p53片段亞克隆至質(zhì)粒pCDNA3.1-HRE-AFP的質(zhì)粒限制性內(nèi)切酶 EcoR 1-Xho I 位點(diǎn)，得到質(zhì)粒 p[HRE]AFP-p53 ; (2)制備復(fù)合磁性納米粒:將質(zhì)粒p[HRE]AFP-p53和聚乙烯亞胺修飾的四氧化三鐵磁性納米粒分別用無血清培養(yǎng)基稀釋，然后將兩者按照磁性納米粒與P[HRE]AFP-p53質(zhì)量比為2:1至16:1混和均勻，孵育后即獲得靶向治療肝癌的復(fù)合磁性納米粒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶向治療肝癌的復(fù)合磁性納米粒的制備方法，其特征在于，所述的步驟(2)中，磁性納米粒與p[HRE]AFP-p53質(zhì)量比為8:1。
3.—種靶向治療肝癌的復(fù)合磁性納米粒，其特征在于，該方法復(fù)合磁性納米粒是按照權(quán)利要求1或2所述方法制備得到。
【文檔編號(hào)】A61K48/00GK103611168SQ201310626550
【公開日】2014年3月5日 申請(qǐng)日期:2013年12月2日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月2日
【發(fā)明者】張東生, 袁晨燕, 張皓 申請(qǐng)人:東南大學(xué)