miR181s在制備治療急性腸炎藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了microRNA‐181s(簡(jiǎn)稱(chēng)miR‐181s)在制備急性腸炎的治療藥物中的用途，特別是miR‐181d作用明顯。膽固醇修飾過(guò)的miR181d小核酸藥物，通靜脈給藥發(fā)現(xiàn)該藥集中分布于小腸。其作用機(jī)制在于結(jié)合腫瘤壞死因子TNFα3’‐UTR區(qū)互補(bǔ)序列，促進(jìn)TNF‐αmRNA的降解，從而抑制TNBS誘導(dǎo)的急性腸炎反應(yīng)。該小核酸藥物作用明顯，能很好地富集于小腸組織，進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮作用；且能作用于多種含有miR181d結(jié)合序列的炎癥因子的3’‐UTR抑制這些炎癥因子的表達(dá)，因此是一種很的應(yīng)用價(jià)值與前景的用以治療炎癥性腸病的小核酸藥物。
【專(zhuān)利說(shuō)明】m i R181 s在制備治療急性腸炎藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)材料【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種小分子RNA即miR -1Sld在制備急性腸炎的治療藥物的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]炎癥性腸病(IBD)是指一組慢性腸道炎癥性疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎(UC)和克羅恩病(CD)。其病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，已知腸道黏膜免疫系統(tǒng)異常反應(yīng)所致的炎癥反應(yīng)在IBD發(fā)病中起重要作用。目前認(rèn)為是由多因素相互作用引起，主要包括環(huán)境變化、基因多態(tài)性、腸道菌群失調(diào)、初始及適應(yīng)性免疫反應(yīng)。環(huán)境因素如吸煙、飲食、衛(wèi)生條件等；近年來(lái)發(fā)現(xiàn)了近70種CD相關(guān)基因、50種UC相關(guān)基因，表明IBD是多基因病，而且是遺傳異質(zhì)性疾病(不同人種IBD發(fā)生與不同基因相關(guān));微生物在IBD發(fā)病中的作用一直受重視，近年認(rèn)為IBD是針對(duì)自身腸道菌群的異常免疫反應(yīng)引起；腸道粘膜免疫系統(tǒng)在IBD腸道炎癥發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸過(guò)程中始終發(fā)揮重要作用。總之，對(duì)IBD病因及發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)可概括為:環(huán)境因素作用于遺傳易感者，在腸道菌群的參與下，啟動(dòng)了腸道初始免疫及適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，最終導(dǎo)致免疫反應(yīng)和炎癥過(guò)程?？赡苡捎诳乖某掷m(xù)刺激或免疫調(diào)節(jié)紊亂，這種免疫炎癥反應(yīng)表現(xiàn)為過(guò)度亢進(jìn)和難于自限。
[0003]目前對(duì)IBD的治療手段主要有一般治療、藥物治療和手術(shù)治療。治療方案的選擇主要根據(jù)疾病的嚴(yán)重程度、病變部位、病人對(duì)藥物的耐受情況，并結(jié)合治療反應(yīng)來(lái)決定。一般治療強(qiáng)調(diào)飲食、營(yíng)養(yǎng)支持、糾正水電解質(zhì)平衡紊亂及對(duì)癥治療。藥物治療包括傳統(tǒng)藥物治療及新型生物制劑。傳統(tǒng)藥物主要有抗炎藥及免疫抑制劑。氨基水楊酸制劑是治療本病的常用藥，如柳氮磺吡啶、美沙拉嗪，適用于輕、中度患者及UC緩解后維持治療。糖皮質(zhì)激素如潑尼松龍治療中、重度患者效果更佳。免疫抑制劑如硫唑嘌呤、巰嘌呤、在疾病嚴(yán)重期的治療起重要作用。疾病難治階段則考慮選擇手術(shù)治療來(lái)改善病人的狀況。
·[0004]近年來(lái)，新型生物制劑的應(yīng)用越來(lái)越受到人們重視。目前治療IBD的抗腫瘤壞死因子TNF- a制劑主要有三種:英夫利昔、阿達(dá)木單抗、賽妥珠單抗。IFN- y抑制物Fontolizumab，是一種人源化的抗干擾素Y抗體，治療節(jié)段性腸炎有很好療效。選擇性細(xì)胞粘附分子抑制劑如那他珠單抗以被FDA批準(zhǔn)用于中重度克羅恩病。其他生物學(xué)治療藥物如粒細(xì)胞集落刺激因子、CD3單抗也相繼進(jìn)行了相關(guān)的臨床研究。但是還沒(méi)有治療炎癥性腸病的小核酸藥物出現(xiàn)。
[0005]miRNA是一類(lèi)具有調(diào)控功能的非編碼RNA，它們主要參與基因轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控。miRNA對(duì)靶基因的調(diào)控主要是通過(guò)對(duì)靶基因轉(zhuǎn)錄體的切割和或?qū)ζ浞g抑制兩種機(jī)制來(lái)實(shí)現(xiàn)的。這兩種機(jī)制的選擇主要取決于它與靶基因轉(zhuǎn)錄體序列互補(bǔ)的程度，如果miRNA與靶基因轉(zhuǎn)錄體信使RNA有充分的互補(bǔ)，miRNA將通過(guò)切割方式來(lái)調(diào)控靶基因；如果miRNA與靶基因轉(zhuǎn)錄體信使RNA沒(méi)有充分的互補(bǔ)，但有多個(gè)互補(bǔ)位點(diǎn)，miRNA將通過(guò)翻譯抑制的方式來(lái)調(diào)控靶基因。在大多數(shù)情況下(例如在動(dòng)物中)，復(fù)合物中的單鏈miRNA與靶mRNA的3’ -UTR不完全互補(bǔ)配對(duì)，從而阻斷該基因的翻譯過(guò)程。RISC是miRNA對(duì)基因調(diào)控的物質(zhì)基礎(chǔ)。RISC組成的核心成分是miRNA或siRNA以及各種蛋白，其中Ago蛋白是RISC中對(duì)靶基因轉(zhuǎn)錄體進(jìn)行剪切的物質(zhì)。與mRNA的切割機(jī)制相比，miRNA抑制翻譯機(jī)制的認(rèn)識(shí)還不是完全清楚。通過(guò)實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞因子mRNA降解與翻譯抑制，miRNA調(diào)控許多細(xì)胞因子的半衰期、翻譯水平與時(shí)空分布，廣泛參與機(jī)體免疫反應(yīng)，其中包括調(diào)節(jié)T、B細(xì)胞的發(fā)育及分化，免疫細(xì)胞的增殖，抗體類(lèi)型轉(zhuǎn)換，炎性介質(zhì)的釋放及各種免疫性疾病等。
[0006]miR181s是最近發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)microRNA新家族,包含miR181a/b/c/d,它們之間僅存在個(gè)別核苷酸的差異，其序列分別如SEQ ID N0.1 - 4所示。2004年Chen等將miR - 181a轉(zhuǎn)入造血前體祖細(xì)胞，觀察其在體外的分化過(guò)程，結(jié)果顯示miR - 181a過(guò)表達(dá)后，B淋巴細(xì)胞數(shù)目顯著上升，推測(cè)miR - 181a可能是B淋巴細(xì)胞分化的陽(yáng)性調(diào)節(jié)因子。將上述過(guò)表達(dá)的miR - 181a前體祖細(xì)胞轉(zhuǎn)入經(jīng)致死性放射治療的小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)miR - 181a不僅促使了 B淋巴細(xì)胞的分化，同時(shí)伴隨有外周血T淋巴細(xì)胞數(shù)目降低，尤其是CD8+T淋巴細(xì)胞，提示miR - 181a在體內(nèi)環(huán)境下同時(shí)參與了 T淋巴細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程(Chen CZ, Science, 2004，303(5654):83 - 86.)。miR - 181a 通過(guò)蛋白非受體型 22 酪氨酸磷酸酶(proteintyrosine phosphatase nonrec印tor22, PTPN22)、雙特異性蛋白憐酸酶(dual specificityphosphatase, DUSP)等調(diào)控TCR信號(hào)通路，進(jìn)而影響T細(xì)胞耐受性和對(duì)外源抗原的免疫反應(yīng)(Li, QJ, Cell2007, 129 (I): 147 -161.。另外，de Yebenes 等研也發(fā)現(xiàn)，miR -181 家族的另一個(gè)成員miR-181b,通過(guò)下調(diào)活化誘導(dǎo)的胞苷脫氨酶(activation -1nduced cytidinedeaminase, AID)的活性，抑制抗原特異性B細(xì)胞發(fā)生抗體類(lèi)別轉(zhuǎn)換(de Yebenes VG, TheJournal of experimental medicine2008, 205(10):2199 - 2206)。
[0007]本發(fā)明發(fā)現(xiàn)miR181s能作用于TNF - a a mRNA的3’非翻譯區(qū)，促進(jìn)TNF - a mRNA降解，體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)膽固醇修飾過(guò)和miRlSls能較好地分布于腸道組織，并抑制腸道組織中TNF-a的表達(dá)水平，抑制炎癥性腸病的發(fā)展，因此在相關(guān)領(lǐng)域是較好的創(chuàng)新，對(duì)治療炎癥性腸病有較好的應(yīng)用價(jià)值。`

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于提供miR181s的藥物用途。
[0009]本發(fā)明為了實(shí)現(xiàn)上述目的，分析了 TNF - a 3 ’ -UTR序列，發(fā)現(xiàn)在該細(xì)胞因子3 ’ -UTR上存在物種中高度保守的miR181a/b/c/d結(jié)合序列。
[0010]通過(guò)合成miR181a/b/c/d mimics,轉(zhuǎn)染細(xì)胞發(fā)現(xiàn)miR181a/b/c/d能作用于TNF- a 3’ -UTR的結(jié)合序列，促進(jìn)TNF- a降解與抑制TNF - a細(xì)胞因子的表達(dá)。在miR181a/b/c/d中以miR181d的促進(jìn)降解作用最強(qiáng)。為了體現(xiàn)miR181d的體內(nèi)應(yīng)用價(jià)值，我們合成了 miR181d序列，并進(jìn)行膽固醇修飾,在其端標(biāo)記上cy5分子示蹤miR181d在體內(nèi)的分布。研究結(jié)果表明miRlSld尾靜脈給藥后，能快速分布于小鼠腹部小腸組織，抑制小腸組織TNF - a mRNA及其它含有miR181d結(jié)合序列的細(xì)胞因子mRNA表達(dá)。在該研究前提下，制作小鼠TNBS誘導(dǎo)的急性腸炎模型，并給藥膽固醇修飾的miR18ld，發(fā)現(xiàn)miR18Id能有效改善急性腸炎癥狀，降低腸炎組織內(nèi)TNF- a等炎癥因子的表達(dá)。
[0011]通過(guò)上述研究，本發(fā)明公開(kāi)了 miRlSls在制備急性腸炎的治療藥物中的用途。特別是miRlSld在制備急性腸炎的治療藥物中的用途。
[0012]所述miR181s 是 miR181a/b/c 或 d，miR181a 序列為 SEQ ID N0.1 所示；miR181b的序列為SEQ ID N0.2所示；miR181c的序列為SEQ ID N0.3所示；miR181d的序列為SEQID N0.4 所示。
[0013]本發(fā)明中基于miR181s的藥物以注射劑或輸液劑給藥。
[0014]本發(fā)明提出利用膽固醇修飾過(guò)的miR181d或miR181a/b/c制備治療急性腸炎的藥物。
[0015]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下的優(yōu)勢(shì)
[0016](I)核酸藥物相對(duì)于蛋白質(zhì)藥物具有免疫原性小，制作合成工藝相對(duì)簡(jiǎn)單，成本低廉等優(yōu)點(diǎn)。
[0017](2)制約核酸藥物的很大因素在于給藥系統(tǒng)的不足。無(wú)論是對(duì)miRNA還是siRNA小核酸藥物，傳統(tǒng)的給藥方式是設(shè)計(jì)合適表達(dá)載體，并采用相應(yīng)的轉(zhuǎn)染試劑將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)入組織與細(xì)胞中，但實(shí)際上很多轉(zhuǎn)染試劑具有毒性、轉(zhuǎn)染細(xì)胞無(wú)選擇性、構(gòu)建的載體要在細(xì)胞內(nèi)是否能表達(dá)、表達(dá)效率如何等等，這些都是限制核酸藥物發(fā)揮作用的主要障礙。本發(fā)明針對(duì)腸小皮細(xì)胞含有豐富的膽固醇受體這一特點(diǎn)，將直接人工合成的miRNA進(jìn)行膽固醇修飾后給藥，結(jié)果表明這些miRNAs能很好地富集于小腸部位，并進(jìn)入腸組織與細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用。因此在小核酸藥物給藥方式上是較好的創(chuàng)新。
[0018](3)相對(duì)于siRNA的單一靶標(biāo)，miRNA通常能作用于多個(gè)靶標(biāo)，如本發(fā)明中用到的miR181d，除了在TNF - a 3’ - UTR含有該miRNA結(jié)合序列，在其它炎癥因子如ILl中均發(fā)現(xiàn)具有miR181d的結(jié)合位點(diǎn)，因?yàn)閙iR181d發(fā)揮抗炎作用機(jī)制在于其影響了很多與炎癥相關(guān)的因子mRNA的穩(wěn)定性，因此能發(fā)揮較siRNA更有效的抗炎作用。
[0019](4)本發(fā)明提出的針對(duì)TNF - a設(shè)計(jì)miRNA治療急性腸炎的作用，能彰顯TNF - a在急性炎癥中的重要性，圍繞該炎癥因子可以設(shè)計(jì)更多的miRNA藥物，因?yàn)門(mén)NF - a 3’ -UTR上存在多個(gè)miRNA結(jié)合位點(diǎn)。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0020]圖1TargetScan 預(yù)測(cè) TNF - a 3’ - UTR 上含有的 miR181a/b/c/d 結(jié)合位點(diǎn)。
[0021]圖2過(guò)表達(dá)miR- 181s抑制TNF- a 3' -UTR報(bào)告基因的表達(dá)。
[0022]圖3Antagomir - 181 促進(jìn) TNF - a 3' - UTR 報(bào)告基因活性。
[0023]圖4miR - 181d 降低 TNF - a mRNA 的半衰期。
[0024]圖5Antagomir - 181 減緩 TNF - a mRNA 的降解。
[0025]圖6miRNA修飾示意圖。
[0026]圖7Agomir藥物整體分布。
[0027]圖8Agomir藥物在離體腸道中的富集。
[0028]圖9miR - 181d抑制腸道組織細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)。
[0029]圖1OmiR - 181結(jié)合序列在炎癥因子中的分布。
[0030]圖11膽固醇修飾的agomir - 181d藥物緩解結(jié)腸的紅腫程度。
[0031]圖12膽固醇修飾的agomir - 181d降低小鼠死亡率。
[0032]圖13膽固醇修飾的agomir - 181d抑制TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸組織MPO活性增高?！揪唧w實(shí)施方式】[0033]實(shí)施例一:miR181 結(jié)合 TNF - a 3’ - UTR,并促進(jìn) TNF - a mRNA 降解
[0034]1.1實(shí)驗(yàn)方法
[0035]1.1.1構(gòu)建TNF - a 3’ - UTR全長(zhǎng)及其點(diǎn)突變報(bào)告質(zhì)粒
[0036]用PCR方法從cDNA中擴(kuò)增TNF - a全長(zhǎng)3’ -UTR目的片段，以該全長(zhǎng)片段為模板，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增miR - 181結(jié)合位點(diǎn)突變3’ - UTR片段。
[0037]PCR擴(kuò)增引物如下
[0038]
【權(quán)利要求】
1.miR181s在制備治療急性腸炎藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述miR181s是miR181d，其序列如SEQIDN0.4所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于miRlSls以注射劑或輸液劑給藥。
4.膽固醇修飾的miR181s在制備治療急性腸炎藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K48/00GK103623431SQ201310654116
【公開(kāi)日】2014年3月12日 申請(qǐng)日期:2013年12月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月5日
【發(fā)明者】殷武, 曹丹 申請(qǐng)人:南京大學(xué)