一種腹可安片的制備方法及其在制備抑制小鼠淋巴瘤細(xì)胞bl4細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于中藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種腹可安片的制備方法及應(yīng)用。本發(fā)明的腹可安片的制備方法，由扭肚藤1000g、火炭母1000g、救必應(yīng)670g、車前草330g、石榴皮330g作為原料藥制成，采用微波萃取和大孔樹脂吸附制備而成，使得總黃酮含量有很大提高。本發(fā)明還提供了腹可安片在制備抑制小鼠淋巴瘤細(xì)胞BL4細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
【專利說明】一種腹可安片的制備方法及其在制備抑制小鼠淋巴瘤細(xì)胞BL4細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于中藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種腹可安片的制備方法及其在制備抑制小鼠淋巴瘤細(xì)胞BL4細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]腹可安片標(biāo)準(zhǔn)號WS-10256 (ZD-0256)-2002，記載于國家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編內(nèi)科脾胃分冊。由扭肚藤lOOOg、火炭母lOOOg、救必應(yīng)670g、車前草330g、石榴皮330g作為原料藥制成，具有清熱利濕，收斂，止痛的功效。用于急性胃腸炎、消化不良引起的腹痛、腹瀉、嘔吐。
[0003]現(xiàn)有技術(shù)中，尚未有腹可安片在提取制備方面采用微波技術(shù)和大孔樹脂吸附提取技術(shù)的報(bào)道，而水煮醇提，工藝粗糙、落后，雜質(zhì)多，導(dǎo)致患者用量過大，不方便服用，嚴(yán)重影響了本品在臨床上應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了解決上述的技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種腹可安片的制備方法。
[0005]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種腹可安片在制備抑制小鼠淋巴瘤細(xì)胞BL4細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明的目的是通過如下的方案實(shí)現(xiàn)的:
[0007]一種腹可安片的制備方法，由扭肚藤1000g、火炭母1000g、救必應(yīng)670g、車前草330g、石榴皮330g作為原料藥制成，其特征在于，所述的制備方法由下列步驟組成:取上五味藥材，粉碎，加入10L的65%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率600-800W，萃取2次，每次5-10分鐘，合并萃取液，濃縮，加到Diaion HP-10大孔吸附樹脂柱上，65%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，將微波提取物混合加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成500片，每片重0.3g。
[0008]上述的腹可安片的制備方法中，所述微波萃取功率為700W。
[0009]上述的腹可安片的制備方法中，所述微波萃取每次萃取時(shí)間為8分鐘。
[0010]上述的腹可安片在制備抑制小鼠淋巴瘤細(xì)胞BL4細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
[0011]現(xiàn)有技術(shù)中，腹可安片口服，一次4片，一日3次。腹可安片服藥量大。采用本發(fā)明方法制備成的腹可安片每片重0.3g，每次僅需2片，一日服用3次。在具有更多活性成分的條件下大大減少了服用量。此結(jié)論可以通過下述試驗(yàn)證明。
[0012]試驗(yàn)一、不同方法制備的腹可安片中總黃酮含量的比較
[0013]1、儀器及試藥本發(fā)明腹可安片:按實(shí)施例1方法制備，使用3330g原料藥，經(jīng)提取制成500片，每片重0.3g。原腹可安片，按照WS-10256 (ZD-0256)-2002標(biāo)準(zhǔn)方法制備，作為對照?？梢?紫外光微孔板檢測儀(美國MD公司型號:SPECTRAMAX190) ；METTLER AE240電子分析天平；蘆丁對照品(中國藥品生物制品檢定所)。[0014]2、方法
[0015]對照品溶液的制備精密稱取在120°C減壓干燥至恒重的蘆丁對照品適量，加60%乙醇制成每1ml含0.lmg的溶液，即得。
[0016]標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密量取對照品溶液1.0ml, 2.0ml, 3.0ml, 4.0ml, 5.0ml，分別置25ml量瓶中，各加10 %亞硝酸鈉溶液0.3ml，混勻，放置6分鐘，加10 %硝酸鋁溶液0.3ml，混勻，放置6分鐘，加4%氫氧化鈉溶液4ml，搖勻，加30%乙醇至刻度，搖勻，放置15分鐘；以相應(yīng)的溶液為空白。照分光光度法(中國藥典2000年版一部附錄V B)試驗(yàn)，在510nm波長處測定吸收度，以吸收度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0017]測定法取重量差異項(xiàng)下的本品，除去包衣，研細(xì)，取樣(本發(fā)明方法制備的腹可安片取0.125g，原腹可安片稱取0.2g)，精密稱定，置圓底燒瓶中，加入甲醇25ml，搖勻，加熱回流1小時(shí)，取出，冷卻至室溫，濾過，濾紙連同殘?jiān)偌蛹状?5ml，加熱回流1小時(shí)，取出，冷卻，濾過，合并濾液，殘?jiān)眉状?5ml分次洗滌，洗液與濾液合并，蒸干，殘?jiān)?0%乙醇溶液使溶解，轉(zhuǎn)移至50ml量瓶中并稀釋至刻度，搖勻。精密量取1ml，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下方法，自“分別置25ml量瓶中”起，依法測定吸收度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中蘆丁的重量，計(jì)算，即得。
[0018]3、結(jié)果
[0019]結(jié)果表明，本發(fā)明腹可安片中總黃酮的含量以蘆丁計(jì)為80-100mg/片；而原腹可安片中總黃酮的含量以蘆丁計(jì)為10.54mg/片，每片蘆丁含量相當(dāng)于原片劑含量的8-10倍，在服用量減少的情況下，總黃酮含量有很大提高。
[0020]上述研究表明，采用本發(fā)明制備方法制備的腹可安片，有效成分含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于WS-10256 (ZD-0256) -2002標(biāo)準(zhǔn)記載的方法制備的腹可安片。
【具體實(shí)施方式】
[0021]下面結(jié)合具體實(shí)施例對本`發(fā)明作更進(jìn)一步的說明，以便本領(lǐng)域的技術(shù)人員更了解本發(fā)明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
[0022]實(shí)施例1
[0023]取扭肚藤lOOOg、火炭母lOOOg、救必應(yīng)670g、車前草330g、石榴皮330g，加入10L的65%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率700W，萃取2次，每次8分鐘，合并萃取液，濃縮，加到Diaion HP-10大孔吸附樹脂柱上，65%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，將微波提取物混合加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成500片，每片重0.3g。
[0024]經(jīng)檢測，成品總黃酮的含量以蘆丁計(jì)為98.92mg/片
[0025]實(shí)施例2
[0026]取扭肚藤1000g、火炭母1000g、救必應(yīng)670g、車前草330g、石榴皮330g，將五味藥材，粉碎，加入10L的65%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率600W，萃取2次，每次5分鐘，合并萃取液，濃縮，加到Diaion HP-10大孔吸附樹脂柱上，65%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，將微波提取物混合加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成500片，每片重0.3g。[0027]經(jīng)檢測，成品中總黃酮的含量以蘆丁計(jì)為82.16mg/片。
[0028]實(shí)施例3
[0029]取扭肚藤lOOOg、火炭母lOOOg、救必應(yīng)670g、車前草330g、石榴皮330g，將五味藥材，粉碎，加入10L的65%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率800W,萃取2次,每次10分鐘,合并萃取液,濃縮,加到DiaionHP-10大孔吸附樹脂柱上，65%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，將微波提取物混合加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成500片，每片重 0.3g。
[0030]經(jīng)檢測，成品中成品中總黃酮的含量以蘆丁計(jì)為90.44mg/片。
[0031]實(shí)施例4:腹可安片抑制小鼠淋巴瘤細(xì)胞BL4細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)研究資料
[0032]1.實(shí)驗(yàn)材料
[0033]1.1實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞株
[0034]小鼠淋巴瘤細(xì)胞BL4細(xì)胞，山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞庫，DMEM+10%FBS常規(guī)培養(yǎng)。
[0035]1.2實(shí)驗(yàn)藥物
[0036]研究藥物:本發(fā)明腹可安片:按實(shí)施例1方法制備。
[0037]藥液儲液:稱取 100mg腹可安片，溶于5ml無水乙醇中，0.2 μ m濾器過濾，500 μ ldoff管分裝，-20°c存儲，同時(shí)0.2 μ m濾器過濾無水乙醇以備對照組之用。
[0038]1.3實(shí)驗(yàn)試劑
[0039]DMEM(GIBC0 公司 Cat.N0.12100_061Lot.N0.758137);胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司Lot.N0.100419) ;NaHC03(上海久億化學(xué)試劑有限公司Cat.N0.11810_033Lot.N0.1088387) ；Trypsin (AMRESC0 公司);EDTA (AMRESC0 公司);Penicillin G Sodium Salt(AMRESC0公司1) ;Streptomycin Sulfate (AMRESC0);無水乙醇(溜博亞杜蘭經(jīng)貿(mào)有限公司)；MTT (Biosharp 批號:0793):PBS (實(shí)驗(yàn)室自配)；
[0040]1.4實(shí)驗(yàn)器材
[0041]萊卡倒置顯微鏡(德國Leica型號:DMIL);可見-紫外光微孔板檢測儀(美國MD公司型號:SPECTRAMAX190);C02培養(yǎng)箱(F0RMA型號:3111);超凈臺(蘇凈集團(tuán)安泰公司制造型號:SW-CJ-ZFD);純水儀(美國Spring公司型號:S/N020579);精密移液器(法國吉爾森公司型號:P2);電子天平(德國賽多利斯有限公司型號:BT323S);全自動(dòng)高壓滅菌鍋(日本SANYO公司型號:MLS-3020);臺式電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司型號:DHG9123A);冰箱(西門子公司型號:KG18V21TI);液氮罐(CBS型號:2001);低速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠型號:ΚΑ-1000);0.2μπι濾器(MILLIP0RE 型號:SLGP033RB);lcm 培養(yǎng)皿(NEST 公司)、96孔培養(yǎng)板(NEST公司)；細(xì)胞計(jì)數(shù)板；離心管、移液管、Tips若干。
[0042]2.實(shí)驗(yàn)方法
[0043]1) BL4細(xì)胞用DMEM+10%FBS于37°C、5%C02進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)(10cm培養(yǎng)皿)，當(dāng)細(xì)胞生長至對數(shù)期時(shí)，收集細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，PBS輕洗3遍，加入3ml0.25%胰蛋白酶-0.04%EDTA,37°C消化2min后，向其中加入5ml完全培養(yǎng)基中和反應(yīng)，吹打細(xì)胞后將其轉(zhuǎn)入離心管中，lOOOrpm離心5min，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度3X 104個(gè)/ml。
[0044]2)將細(xì)胞種入96孔培養(yǎng)板中，每孔加入細(xì)胞懸液180 μ 1,培養(yǎng)板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中(37°C，5%C02)常規(guī)培養(yǎng)。[0045]3)根據(jù)細(xì)胞生長情況，一般長至50%_70%，加入腹可安片溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24h。
[0046]4) 24h 后加入 20 μ 1 ΜΤΤ 溶液(5mg/ml，即 0.5%ΜΤΤ),繼續(xù)培養(yǎng) 4h。
[0047]5) 4h后扣板法倒去上清，用吸水紙輕輕拍干，每孔如入200 μ 1 二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩lOmin，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀490nm處測量各孔的吸光值。
[0048]6)同時(shí)設(shè)置本底(不加細(xì)胞，只加培養(yǎng)液)，對照孔(細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜)，每組設(shè)定6個(gè)復(fù)孔。
[0049]7)結(jié)果以藥物對細(xì)胞的抑制率表示:細(xì)胞增值抑制率(%)=(對照孔0D值-給藥孔0D值)、對照孔0D值X 100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
[0050]3.統(tǒng)計(jì)處理
[0051]采用Microsoft Excel2007軟件中的相關(guān)分析和Student t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以mean + S.D.表不。
[0052]4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0053]MTT法實(shí)驗(yàn)后統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，與對照組比較，當(dāng)劑量達(dá)到5mg/ml時(shí)，對BL4細(xì)胞增殖抑制有差異(p〈0.05)，劑量在10mg/ml時(shí)該差異具有顯著性(P〈0.01)，當(dāng)劑量達(dá)到15-20mg/ml時(shí)有極顯著性差異(P〈0.001)。
[0054]表1腹可安片對BL4細(xì)胞增殖抑制影響研究(X土 SD)
[0055]
【權(quán)利要求】
1.一種腹可安片的制備方法，由扭肚藤lOOOg、火炭母lOOOg、救必應(yīng)670g、車前草330g、石榴皮330g作為原料藥制成，其特征在于，所述的制備方法由下列步驟組成:取上五味藥材，粉碎，加入10L的65%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率600-800W,萃取2次，每次5-10分鐘，合并萃取液，濃縮，加到Diaion HP-10大孔吸附樹脂柱上，65%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，將微波提取物混合加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成500片，每片重0.3g。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腹可安片的制備方法，其特征在于，所述微波萃取功率為700W。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腹可安片的制備方法，其特征在于，所述微波萃取每次萃取時(shí)間為8分鐘。
4.權(quán)利要求1所述的腹可安片在制備抑制小鼠淋巴瘤細(xì)胞BL4細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61K36/704GK103655743SQ201310656231
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月6日
【發(fā)明者】魏書同, 段學(xué)文 申請人:山東中大藥業(yè)有限公司