鹽酸異丙嗪在制備治療或預(yù)防流感病毒感染藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了鹽酸異丙嗪（PromethazineHydrochlorine）在制備預(yù)防或治療流感病毒感染藥物中的應(yīng)用。首先檢測(cè)了鹽酸異丙嗪對(duì)MDCK細(xì)胞的毒性，結(jié)果顯示鹽酸異丙嗪的最大無(wú)毒性濃度為25.0μM。其次，在完全無(wú)毒性的濃度范圍內(nèi)測(cè)定了鹽酸異丙嗪的抗病毒活性，結(jié)果顯示這種小分子化合物具有顯著的抗病毒活性，且抗病毒作用呈劑量依賴效應(yīng)。最后，檢測(cè)了鹽酸異丙嗪對(duì)不同型和亞型的流感病毒的抗病毒活性，結(jié)果顯示鹽酸異丙嗪可以劑量依賴地抑制所有被檢測(cè)流感病毒株的復(fù)制，表明鹽酸異丙嗪的抗流感病毒活性具有廣譜性。因此，本發(fā)明披露了鹽酸異丙嗪是一種新型廣譜抗流感病毒藥物，可以用于制備預(yù)防或治療流感病毒感染的藥物。
【專(zhuān)利說(shuō)明】鹽酸異丙嗪在制備治療或預(yù)防流感病毒感染藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及鹽酸異丙嗪在制備治療或預(yù)防流感病毒感染藥物中的應(yīng)用，屬于醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]流感病毒屬于正粘病毒科(Orthomyxoviridae),流感病毒屬。根據(jù)病毒粒子核蛋白(NP)和基質(zhì)蛋白(M)的抗原特性及基因特性的不同，流感病毒分為A、B、C三型，也稱甲、乙、丙三型。A型流感病毒全基因組由8條大小不等的單股負(fù)鏈RNA組成，分別以節(jié)段I至節(jié)段8命名。病毒基因組全長(zhǎng)約13.6吐，編碼10種結(jié)構(gòu)蛋白(？82、？81、？4、撤、冊(cè)、嫩、皿1、M2、PB1-F2和NS2/NEP)和非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1)。根據(jù)病毒粒子表面糖蛋白血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)的不同，A型流感病毒可進(jìn)一步分為17個(gè)H(H1-H17)和10個(gè)N(Nl-NlO)亞型。人流感病毒主要是H1、H2和H3亞型。而目前危害嚴(yán)重的高致病性禽流感多為H5、H7和H9亞型，其中以H5N1亞型致死率最高。B型流感病毒常引起流感局部流行，不引起世界性流感大爆發(fā)，僅在人和海豹中發(fā)現(xiàn)。C型流感病毒多以散在形式存在，主要侵襲嬰幼兒，一般不引起流感流行，可感染人類(lèi)和豬。
[0003]流感病毒的整個(gè)生活周期需要在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)完成。感染的起始是病毒顆粒表面的刺突HA識(shí)別和結(jié)合宿主細(xì)胞表面含唾液酸的受體。唾液酸與次末端半乳糖的連接鍵，決定了病毒的宿主特異性，該連接鍵在禽類(lèi)中為α (2-3),在人類(lèi)中為α (2_6)。病毒吸附細(xì)胞后，細(xì)胞通過(guò)網(wǎng)格蛋白受體介導(dǎo)的胞飲作用攝入病毒。在細(xì)胞內(nèi)，網(wǎng)格蛋白分子解離，病毒與內(nèi)涵體融合形成吞噬體，使得病毒粒子周?chē)腜H值下降至5.0左右。在此pH條件下，病毒HA蛋白的構(gòu)象發(fā)生變化，使位于輕鏈(HA2) N端的融合肽暴露，從而引起病毒囊膜與細(xì)胞膜融合。低PH環(huán)境也致使大量H+經(jīng)由M2離子通道進(jìn)入病毒粒子內(nèi)部，導(dǎo)致Ml蛋白與vRNPs的解離。兩者的共同結(jié)果致使病毒粒子的vRNPs釋放到被感染細(xì)胞的胞漿。vRNPs隨后轉(zhuǎn)到細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行基因組的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，復(fù)制時(shí)病毒首先以自身RNA為模板合成互補(bǔ)RNA (cRNA)，然后以cRNA`為模板再合成vRNA。轉(zhuǎn)錄生成的mRNA由核內(nèi)轉(zhuǎn)移到胞漿，翻譯出病毒的結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白。一部分合成蛋白如NP需要重新轉(zhuǎn)移到核內(nèi)與新生成的vRNA組裝成vRNP，vRNP出核后與其余的病毒蛋白開(kāi)始組裝成新的病毒粒子，新生成的子代病毒通過(guò)神經(jīng)氨酸酶(NA)水解細(xì)胞表面的糖蛋白，釋放N-乙酰神經(jīng)氨酸，促使病毒粒子從出芽位點(diǎn)釋放出來(lái)。病毒成熟的最后一步是HA在宿主蛋白酶的作用下裂解為HAl和HA2多肽，這樣的病毒粒子才具有感染性，從而開(kāi)始新一輪病毒的復(fù)制。
[0004]流感病毒自20世紀(jì)初發(fā)現(xiàn)以來(lái)已在全球范圍內(nèi)造成五次大流行，十年左右會(huì)產(chǎn)生一次暴發(fā)流行，在全球范圍內(nèi)造成了巨大的損失。流感流行每年可導(dǎo)致25萬(wàn)~50萬(wàn)例死亡，300萬(wàn)~500萬(wàn)重病例，全球約共有5~15%的人被感染。接種疫苗和使用抗病毒藥物是應(yīng)對(duì)流感大流行的重要手段，然而由于流感病毒抗原變異能力強(qiáng)，在大流行前基本上不可能大規(guī)模生產(chǎn)疫苗。目前，經(jīng)美國(guó)食品和藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)正式上市的抗流感病毒藥物有兩類(lèi):(1)以金剛烷胺和金剛乙胺為代表的M2離子通道阻斷劑。此類(lèi)藥只對(duì)甲型流感病毒有預(yù)防和治療作用，研究表明此類(lèi)藥物具有神經(jīng)毒性等毒副作用，而且由于耐藥株的普遍存在，所以CDC建議此類(lèi)藥物不再用于預(yù)防流感病毒感染。(2)神經(jīng)氨酸酶抑制劑，此類(lèi)藥的代表是奧斯他韋和扎拉米韋。此類(lèi)藥物對(duì)所有已知的人流感病毒及高致病性禽流感病毒均有效。但是近年來(lái)關(guān)于奧斯他韋的耐藥株卻不斷有報(bào)道。因此，研究并開(kāi)發(fā)新型抗流感病毒藥物有重要意義。
[0005]鹽酸異丙嗪(Promethazinehydrochlorine),又名鹽酸普魯米近(PromethazineHydrochloride)或非那根(Phenergan),化學(xué)名為N, N, α -三甲基-10H-吩喔嚷-10-乙胺鹽酸鹽(N, N-dimethyl-1- (lOH-phenothiazin-lO-yl) propan-2-amine)。臨床上作為一種吩噻嗪類(lèi)抗組胺藥，主要用于鎮(zhèn)吐、抗暈動(dòng)以及鎮(zhèn)靜催眠。其藥理作用主要包括:(1)抗組胺作用，與組織釋放的組胺競(jìng)爭(zhēng)Hl受體，能拮抗組胺對(duì)胃腸道、氣管、支氣管或細(xì)支氣管平滑肌的收縮或攣縮，解除組胺對(duì)支氣管平滑肌的致痙和充血作用；(2)止吐作用，可能與抑制了延髓的催吐化學(xué)感受區(qū)有關(guān)；(3)抗暈動(dòng)癥:可能通過(guò)中樞性抗膽堿能，作用于前庭和嘔吐中樞及中腦髓質(zhì)感受器，主要是阻斷前庭核區(qū)膽堿能突觸迷路沖動(dòng)的興奮；(4)鎮(zhèn)靜催眠作用:可能由于間接降低了腦干網(wǎng)狀上行激活系統(tǒng)的應(yīng)激性。但到目前為止，并未發(fā)現(xiàn)任何關(guān)于鹽酸異丙嗪抗流感病毒的相關(guān)報(bào)道。鹽酸異丙嗪的結(jié)構(gòu)式如下:
<img/ >
[0006]本發(fā)明的目的在于彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，是在于提供了一種小分子化合物鹽酸異丙嗪在制備治療或預(yù)防流感病毒感染藥物中的應(yīng)用，從而為臨床上流感的治療提供一種安全有效的小分子化合物。鹽酸異丙嗪在無(wú)毒性范圍內(nèi)能夠有效地抑制流感病毒的復(fù)制，可進(jìn)一步開(kāi)發(fā)為治療或預(yù)防流感病毒感染疾病的藥物，具有廣泛的應(yīng)用前景。
[0007]為了實(shí)現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
鹽酸異丙嗪在制備治療或預(yù)防流感病毒(甲型或乙型)感染藥物中的應(yīng)用，其步驟
是:
鹽酸異丙嗪對(duì)MDCK細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn):犬腎細(xì)胞(MDCK)按8X IO3個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞貼壁后，分別用0.8μΜ、1.6μΜ、3.125μΜ、6.25μΜ、12.5.μ Μ、25.0μΜ、50.ΟμΜ和100.ΟμΜ的鹽酸異丙嗪進(jìn)行處理，每組重復(fù)兩個(gè)孔，置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)后，Alamarblue檢測(cè)細(xì)胞的存活率。結(jié)果顯示，鹽酸異丙嗪對(duì)MDCK的CC50 (半數(shù)致死濃度)為65.2 μ M0
[0008]鹽酸異丙嗪抗流感病毒活性的評(píng)價(jià):將MDCK細(xì)胞按照1.5 X IO4細(xì)胞/孔接種于96細(xì)胞培養(yǎng)板中，37°C、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-24h待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，用IOOTCID5q/孔的流感病毒液(A/PuertoRico/8/34 (HlNl))感染細(xì)胞，同時(shí)加入各梯度濃度的藥物至總體積共200 μ I的細(xì)胞維持液(DMEM+0.3%BSA+2.5 μ g/L胰酶)中，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中于37°C培養(yǎng)48h后取各實(shí)驗(yàn)孔上清進(jìn)行神經(jīng)氨酸酶表達(dá)量的檢測(cè)。結(jié)果顯示鹽酸異丙嗪能夠劑量依賴地抑制流感病毒的復(fù)制，其EC5tl (半數(shù)有效濃度)為4.5 μ M。
[0009]鹽酸異丙嗪抗流感病毒作用的廣譜性分析:將MDCK細(xì)胞按照1.5Χ104細(xì)胞/孔接種于96細(xì)胞培養(yǎng)板中，37°C、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-24h且長(zhǎng)成單層后，用 IOOTCID5q/ 孔的流感病毒液(分別為 A/Human/Hubei/1/2009 (HlNl)，A/human/Hubei/3/2005(H3N2)，A/human/WSN/33/(H1N1, S3 IN)，A/Duck/Hubei/5/2010(H6N6)，A/Duck/Hubei/216/1983(H7N8)， A/Chicken/Jiangsu/1/2005(H9N2)， B/human/Hubei/1/2007)感染細(xì)胞，同時(shí)加入各梯度濃度的藥物至總體積共200 μ I的細(xì)胞維持液(DMEM+0.3%BSA+2.5 μ g/L胰酶)中，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中于37°C培養(yǎng)48h后取各實(shí)驗(yàn)孔上清進(jìn)行神經(jīng)氨酸酶表達(dá)量的檢測(cè)。結(jié)果顯示鹽酸異丙嗪能夠劑量依賴的抑制甲型流感亞型HlNl株、甲型流感病毒亞型H3N2株、甲型流感病毒亞型HlNl金剛烷胺耐藥株、甲型流感病毒亞型H6N6株、甲型流感病毒亞型H7N8株、甲型流感病毒亞型H9N2株和乙型流感病毒的復(fù)制。
[0010]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果:
1.鹽酸異丙嗪是小分子化合物，其CC5tl (半數(shù)致死濃度)為65.2 μ M。鹽酸異丙嗪能夠劑量依賴的抑制流感病毒復(fù)制，其EC5tl (半數(shù)有效濃度)為4.5 μ Μ。選擇指數(shù)(SI)約為14.5。而且鹽酸異丙嗪已經(jīng)在臨床上有數(shù)十年的應(yīng)用，安全性良好。這說(shuō)明鹽酸異丙嗪是安全有效的抗流感病毒的藥物。
[0011]2.鹽酸異丙嗪能夠劑量依賴地抑制甲型流感亞型HlNl株、甲型流感病毒亞型Η3Ν2株、甲型流感病毒亞型HlNl金剛烷胺耐藥株、甲型流感病毒亞型Η6Ν6株、甲型流感病毒亞型Η7Ν8株、甲型流感病毒亞型Η9Ν2株和乙型流感病毒的復(fù)制，具有非常廣譜的抗流感病毒活性。
`[0012]3.利用現(xiàn)代常用藥物制劑手段，可將鹽酸異丙嗪作為活性成分制成片劑、膠囊、顆粒劑、口服液、緩釋制劑、控釋制劑、納米制劑或注射劑等任何一種藥學(xué)上可接受的劑型。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0013]圖1為鹽酸異丙嗪化學(xué)結(jié)構(gòu)式。
[0014]圖2為鹽酸異丙嗪細(xì)胞毒性檢測(cè)示意圖。
[0015]圖3為鹽酸異丙嗪處理劑量依賴抑制流感病毒復(fù)制水平示意圖。
[0016]圖4為鹽酸異丙嗪抗流感病毒活性廣譜性檢測(cè)示意圖:
圖 4Α 為甲型流感病毒亞型 HlNl 株(A/Human/Hubei/1/2009 (HlNl))；
圖 4B 為甲型流感病毒亞型 H3N2 株(A/human/Hubei/3/2005 (H3N2))；
圖4C為甲型流感病毒亞型HlNl金剛烷胺耐藥株(A/human/WSN/33/(H1N1，S3 IN))；
圖 4D 為甲型流感病毒亞型 H6N6 株(A/Duck/Hubei/5/2010 (H6N6))；
圖 4E 為甲型流感病毒亞型 H7N8 株(A/Duck/Hubei/216/1983 (H7N8))；
圖 4F 為甲型流感病毒亞型 H9N2 株(A/Chicken/Jiangsu/1/2005 (H9N2))；
圖 4G 為乙型流感病毒(B/human/Hubei/1/2007)。具體實(shí)施方案
[0017]為了更好地理解本發(fā)明的內(nèi)容，下面結(jié)合具體實(shí)施方法對(duì)本
【發(fā)明內(nèi)容】
作進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明的保護(hù)內(nèi)容不局限于以下實(shí)施例。
[0018]目前，抗流感病毒藥物體外篩選模型分為細(xì)胞培養(yǎng)模型和病毒酶的無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)篩選模型。酶反應(yīng)篩選模型具有高通量的特點(diǎn)，但篩選的化合物仍需進(jìn)行更多的細(xì)胞學(xué)、組織學(xué)和體內(nèi)毒性、藥效實(shí)驗(yàn)等以確定其效果。細(xì)胞培養(yǎng)模型是最常用的篩選模型，其優(yōu)點(diǎn)在于:可提供大量遺傳性狀相同的細(xì)胞為研究對(duì)象，操作方便，可消除其它外界因素的影響，并可以檢測(cè)藥物的有效濃度和治療指數(shù)，為后期機(jī)理研究提供更多基礎(chǔ)。本發(fā)明采用MDCK細(xì)胞培養(yǎng)篩選法檢測(cè)鹽酸異丙嗪對(duì)流感病毒感染的影響，基于對(duì)上清中代表流感病毒復(fù)制水平的神經(jīng)氨酸酶表達(dá)水平的檢測(cè)，定量分析鹽酸異丙嗪的抗流感病毒活性。
[0019]實(shí)施例1:鹽酸異丙嗪抗流感病毒活性的評(píng)價(jià)
1.實(shí)驗(yàn)材料 1.1細(xì)胞、病毒和藥物
MDCK細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)模式菌種保藏中心(ATCC);病毒株:A/PuertoRico/8/34 (HlNl)；藥物:鹽酸異丙嗪購(gòu)于Sigma公司。
[0020]1.2實(shí)驗(yàn)儀器
多標(biāo)記微孔板讀取儀(Perkin Elmer)。
[0021]2.實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果
2.1細(xì)胞培養(yǎng):37°C，5% CO2加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。使用含有10% FBSU00U/mL的青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基。細(xì)胞至90%匯合度后傳代，傳代比例1/3 - 1/4。
[0022]2.2病毒培養(yǎng):取9~11日齡SPF雞胚，接種病毒前用驗(yàn)蛋器檢查，并在遠(yuǎn)離胚胎的位置標(biāo)記，消毒并打孔后按0.2ml/枚接種24血凝效價(jià)的病毒液，用指甲油封口，置37°C恒溫箱孵育48h (接種24h后死亡的雞胚一般為操作不當(dāng)致死，棄之)。取出雞胚置4°C冷胚12h。75%酒精消毒雞胚氣室，無(wú)菌操作剪去氣室外殼，毛細(xì)吸管吸取雞胚尿囊液和羊水，3000rpm 4°C離心30min，檢測(cè)血凝效價(jià)，200 μ I/管分裝并置_70°C凍存?zhèn)溆谩?br> [0023]2.3鹽酸異丙嗪的細(xì)胞毒性檢測(cè):MDCK細(xì)胞按8 X IO3細(xì)胞/孔(體積100 μ I)接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞貼壁后備用；用細(xì)胞維持液(DMEM+2%血清)將藥物按照0.8μΜ、1.6μΜ、3.125μΜ、6.25 μ Μ、12.5.μ Μ、25.0 μ Μ、50.0 μ M 和 100.0 μ M 共 8 個(gè)梯度濃度配制，每個(gè)梯度濃度設(shè)2個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48h后棄掉培養(yǎng)上清，于每孔中加入100 μ I含有10%Alamarblue試劑的新DMEM培養(yǎng)基，置細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)lh，Ih后用微孔板讀取儀分別測(cè)量熒光強(qiáng)度和吸光值，計(jì)算細(xì)胞存活率。
[0024]結(jié)果(圖2)顯示鹽酸異丙嗪在50.0 μ M以下的濃度范圍內(nèi)對(duì)MDCK細(xì)胞完全沒(méi)有細(xì)胞毒性。本實(shí)施例中鹽酸異丙嗪細(xì)胞水平抗病毒實(shí)驗(yàn)的給藥劑量范圍為0.78~50.0 μ Μ，完全處在安全無(wú)毒性濃度范圍。
[0025]2.4鹽酸異丙嗪對(duì)流感病毒株A/PuertoRico/8/34 (HlNl)的抗病毒活性評(píng)價(jià)
2.4.1.實(shí)驗(yàn)原理:MUNANA (4-methylumbelliferyl- a -N-acety 1-neuraminate)是流感病毒神經(jīng)氨酸酶的特異性底物，在神經(jīng)氨酸酶作用下產(chǎn)生的催化產(chǎn)物在355nm激發(fā)光照射下，可以產(chǎn)生460nm熒光，熒光強(qiáng)度的強(qiáng)弱代表了病毒神經(jīng)氨酸酶表達(dá)量的多少，反映了培養(yǎng)細(xì)胞上清中的病毒量。
[0026]2.4.2.將MDCK細(xì)胞按1.5 X IO4細(xì)胞/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14~18h后，待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后備用。將孔板中培養(yǎng)基棄去，PBS液洗兩遍，加IOOTCId50/孔(100 μ I)病毒液感染細(xì)胞，同時(shí)加入各梯度濃度的藥物(以50.0 μ M為起始濃度，連續(xù)2倍梯度稀釋7個(gè)梯度，每梯度兩個(gè)復(fù)孔)至總體積為200 μ I的細(xì)胞維持培養(yǎng)液(DMEM+0.3 %BSA+2.5ug/L胰酶)中，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)48h后取各實(shí)驗(yàn)孔上清進(jìn)行神經(jīng)氨酸酶表達(dá)量的檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組(利巴韋林)、陰性對(duì)照組(病毒感染后無(wú)藥物處理)和實(shí)驗(yàn)藥物組。
[0027]2.4.3.黑色 96 孔微量板中加入 40 μ I 緩沖液(32.5mmol/L MES, pH 6.5,4mmol/L CaCl2)配制的底物20umol/L MUNANA，再加入各實(shí)驗(yàn)孔培養(yǎng)上清20 μ 1，37°C避光孵育60min，加入反應(yīng)終止液(0.014μΜ NaOH, 83%乙醇)100 μ I/孔，微孔讀板儀上測(cè)定熒光值(激發(fā)光波長(zhǎng)355nm,發(fā)射光波長(zhǎng)465nm)。
[0028]2.4.4.計(jì)算各檢測(cè)孔中藥物對(duì)流感病毒復(fù)制的抑制率
抑制率(％) =100-(樣品孔-空白對(duì)照)/ (酶活對(duì)照-空白對(duì)照)* 100%
結(jié)果顯示:鹽酸異丙嗪明顯抑制了流感病毒復(fù)制，并且呈劑量依賴關(guān)系(見(jiàn)圖3)。
[0029]實(shí)施例2:鹽酸異丙嗪抗流感病毒作用廣譜性的評(píng)價(jià)
本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)鹽酸異丙嗪對(duì)甲型流感亞型HlNl株、甲型流感病毒亞型H3N2株、甲型流感病毒亞型HlNl金剛烷胺耐藥株、甲型流感病毒亞型H6N6株、甲型流感病毒亞型H7N8株、甲型流感病毒亞型H9N2株 和乙型流感病毒的抗病毒活性。
[0030]1.實(shí)驗(yàn)使用的病毒株包括:A/Human/Hubei/1/2009 (HlNl)，A/human/Hubei/3/2005(H3N2), A/human/WSN/33/(H1N1, S3IN)，A/Duck/Hubei/5/2010 (H6N6)，A/Duck/Hubei/216/1983(H7N8)， A/Chicken/Jiangsu/1/2005(H9N2)， B/human/Hubei/1/2007。
[0031]2.將MDCK細(xì)胞按1.5X IO4細(xì)胞/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14~18h后，待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后備用。將孔板中培養(yǎng)基棄去，PBS液洗兩遍，加IOOTCId50/孔(100 μ I)病毒液感染細(xì)胞，同時(shí)加入各梯度濃度的藥物(以25.0 μ M為起始濃度，連續(xù)2倍梯度稀釋6個(gè)梯度，每梯度兩個(gè)復(fù)孔)至總體積為200 μ I維持培養(yǎng)液(DMEM+0.3%BSA+2.5ug/L胰酶)中，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)48h后取各實(shí)驗(yàn)孔上清進(jìn)行神經(jīng)氨酸酶表達(dá)量的檢測(cè)。
[0032]3.黑色 96 孔微量板中加入 40μ I 緩沖液(32.5mmol/L MES，pH 6.5,4mmol/L CaCl2)配制的底物20umol/L MUNANA，再加入各實(shí)驗(yàn)孔培養(yǎng)上清20 μ 1，37°C避光孵育60min，加入反應(yīng)終止液(0.014 μ M NaOH, 83%乙醇)100 μ I/孔，多功能檢測(cè)儀上測(cè)定熒光值(激發(fā)光波長(zhǎng)355nm,發(fā)射光波長(zhǎng)465nm)。
[0033]4.計(jì)算各檢測(cè)孔中藥物對(duì)流感病毒復(fù)制的抑制效率
抑制率(％) =100-(樣品孔-空白對(duì)照)/ (酶活對(duì)照-空白對(duì)照)* 100%
結(jié)果顯示:鹽酸異丙嗪呈劑量依賴地抑制了各種流感病毒毒株的復(fù)制(見(jiàn)圖4)。
【權(quán)利要求】
1.鹽酸異丙嗪在制備治療或預(yù)防流感病毒感染藥物中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:所述的流感病毒為甲型流感病毒或乙型流感病毒。
3.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:所述的藥物是鹽酸異丙嗪作為藥物活性成分，制成任何一種藥學(xué)上可接受的劑型。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于:所述劑型為片劑、膠囊劑、顆粒劑、口服液、注射液、緩釋制劑、控釋制劑或納米制`劑等。
【文檔編號(hào)】A61K31/5415GK103705522SQ201310667779
【公開(kāi)日】2014年4月9日 申請(qǐng)日期:2013年12月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月11日
【發(fā)明者】陳緒林, 安利偉 申請(qǐng)人:武漢威立得生物醫(yī)藥有限公司