止眩安神片在制備抑制淋巴瘤細(xì)胞el4細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于中藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種止眩安神片在制備抑制淋巴瘤細(xì)胞EL4細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用及止眩安神片的制備方法。本發(fā)明的止眩安神片在制備抑制淋巴瘤細(xì)胞EL4細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用，所述止眩安神片由鹿銜草400g、淫羊藿160g、黃芪160g、當(dāng)歸140g、川芎200g、葛根240g、炒白術(shù)120g、酸棗仁140g、制半夏120g、澤瀉120g、干姜100g、甘草100g作為原料藥制成，采用超臨界萃取和微波萃取制備而成，使得淫羊藿苷含量有很大提高。
【專利說明】止眩安神片在制備抑制淋巴瘤細(xì)胞EL4細(xì)胞增殖藥物中的
應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于中藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種止眩安神片在制備抑制淋巴瘤細(xì)胞EL4細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用及止眩安神片的制備方法。
【背景技術(shù)】 [0002]止眩安神顆粒標(biāo)準(zhǔn)號WS-11411 (ZD-1411)_2002，記載于國家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編內(nèi)科脾胃分冊。由鹿銜草400g、淫羊藿160g、黃芪160g、當(dāng)歸140g、川芎200g、葛根240g、炒白術(shù)120g、酸率仁140g、制半夏120g、澤灣120g、干姜100g、甘草100g作為原料藥制成,具有補(bǔ)肝腎，益氣血，安心神的功效。用于肝腎不足，氣血虧損所致的眩暈，耳鳴，失眠，心悸。
[0003]現(xiàn)有技術(shù)中，尚未有止眩安神顆粒在在制備抑制淋巴瘤細(xì)胞EL4細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用的報道，也未見有止眩安神顆粒提取制備方面采用超臨界和微波技術(shù)的報道，而揮發(fā)油提取，水煎煮的方法，工藝粗糙、落后，雜質(zhì)多，導(dǎo)致患者用量過大，不方便服用，嚴(yán)重影響了本品在臨床上應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]發(fā)明目的:本發(fā)明的目的在于提供一種止眩安神片在制備抑制淋巴瘤細(xì)胞EL4細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明的另一個目的在于提供一種止眩安神片的制備方法。
[0006]本發(fā)明的目的是通過如下的方案實現(xiàn)的:
[0007]止眩安神片在制備抑制淋巴瘤細(xì)胞EL4細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用，所述止眩安神片由鹿銜草400g、淫羊藿160g、黃芪160g、當(dāng)歸140g、川芎200g、葛根240g、炒白術(shù)120g、酸棗仁140g、制半夏120g、澤瀉120g、干姜100g、甘草100g作為原料藥制成，所述止眩安神片的制備方法由下列步驟組成:取干姜、川芎、炒白術(shù)、當(dāng)歸、鹿銜草，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力15-30MPa，溫度30-50°C, CO2流量l-3ml/g生藥.min，萃取時間300_340min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎，加入6.5L50%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率600-800W，萃取2次，每次5-10分鐘，合并萃取液，濃縮，加到Diaion HP-10大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成200片，每片重0.5g。
[0008]優(yōu)選的，上述的止眩安神片在制備抑制淋巴瘤細(xì)胞EL4細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用，所述止眩安神片由鹿銜草400g、淫羊藿160g、黃芪160g、當(dāng)歸140g、川芎200g、葛根240g、炒白術(shù)120g、酸棗仁140g、制半夏120g、澤瀉120g、干姜100g、甘草100g作為原料藥制成，所述止眩安神片的制備方法由下列步驟組成:取干姜、川芎、炒白術(shù)、當(dāng)歸、鹿銜草，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%，萃取壓力15-30MPa，溫度30_50°C，CO2流量l_3ml/g生藥.min，萃取時間320min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎，加入6.5L50%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率700W，萃取2次，每次5-10分鐘，合并萃取液，濃縮，加到Diaion HP-1O大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成200片，每片重0.5g。
[0009]現(xiàn)有技術(shù)中，止眩安神顆粒每次I袋，每袋重5g (無糖型)或IOg (有糖型)，一日3次。止眩安神顆粒服藥量大，且顆粒劑制備需要加大量的糖，糖尿病患者不適宜，不加糖的話味道不佳，患者不容易服下，依從性差。采用本發(fā)明方法制備成的止眩安神片每片重
0.5g，每次僅需2片，一日服用3次。在具有更多活性成分的條件下大大減少了服用量。此結(jié)論可以通過下述試驗證明。且制備成片劑，患者隨水吞下即可，服藥量小且無苦味，患者易于接受。
[0010]試驗一、不同方法制備的止眩安神片中淫羊藿苷含量的比較
[0011]1、儀器及試藥本發(fā)明止眩安神片:按實施例1方法制備，使用2160g原料藥，經(jīng)提取制成200片，每片重0.5g。原止眩安神顆粒，按照WS-11411 (ZD-1411) -2002標(biāo)準(zhǔn)方法制備。Agilentl200高效液相色譜儀；METTLER AE240電子分析天平；淫羊藿苷對照品(中國藥品生物制品檢定所)。
[0012]2、方法
[0013]照高效液相色譜法(中國藥典2010年版一部附錄VI D)測定。
[0014]色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈-水(26: 74)為流動相；檢測波長為270nm。理論板數(shù)按淫羊藿苷峰計算應(yīng)不低于8000。
[0015]對照品溶液的制備精密稱取在105°C干燥至恒重的淫羊藿苷對照品適量，加70%乙醇制成每Iml含50 μ g的溶液，即得。
[0016]供試品溶液的制備取本發(fā)明的止眩安神片，研細(xì)，取0.4g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇25ml，稱定重量，密塞，放置過夜，超聲處理30分鐘，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μ m)濾過，取續(xù)濾液，即得。
[0017]對照產(chǎn)品供試品溶液的制備取本對照的止眩安神顆粒，研細(xì)，取4g，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇25ml，稱定重量，密塞，放置過夜，超聲處理30分鐘，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μ m)濾過，取續(xù)濾液，即得。
[0018]測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20μ 1，注入液相色譜儀，測定，即得。
[0019]3、結(jié)果
[0020]結(jié)果表明，本發(fā)明止眩安神片中淫羊藿苷的含量為3.5-6g/片；而原止眩安神顆粒中淫羊藿苷的含量為1.2mg/袋，每次服用量2片的淫羊藿苷含量為原顆粒劑含量的6-10倍，在服用量減少的情況下，淫羊藿苷含量有很大提高。
[0021]上述研究表明，采用本發(fā)明制備方法制備的止眩安神片，有效成分含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于WS-11411 (ZD-1411) -2002標(biāo)準(zhǔn)記載的方法制備的止眩安神顆粒。
【具體實施方式】[0022]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作更進(jìn)一步的說明，以便本領(lǐng)域的技術(shù)人員更了解本發(fā)明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
[0023]實施例1
[0024]取鹿銜草400g、淫羊藿160g、黃芪160g、當(dāng)歸140g、川彎200g、葛根240g、炒白術(shù)120g、酸棗仁140g、制半夏120g、澤瀉120g、干姜100g、甘草100g，將干姜、川芎、炒白術(shù)、當(dāng)歸、鹿銜草加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%，萃取壓力25MPa，溫度40°C，C02流量2ml/g生藥.π?η，萃取時間320min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎，加入6.5L50%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率700W，萃取2次，每次8分鐘，合并萃取液，濃縮，加到Diaion HP-1O大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成200片，每片重0.5g。
[0025]經(jīng)檢測，成品中淫羊藿苷的含量為5.9mg/片。
[0026]實施例2
[0027]取鹿銜草400g、淫羊藿160g、黃芪160g、當(dāng)歸140g、川彎200g、葛根240g、炒白術(shù)120g、酸棗仁140g、制半夏120g、澤瀉120g、干姜100g、甘草100g，將干姜、川芎、炒白術(shù)、當(dāng)歸、鹿銜草加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4%，萃取壓力30MPa，溫度50°C，C02流量3ml/g生藥.π?η，萃取時間300min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎，加入6.5L50%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率600W，萃取2次，每次5分鐘，合并萃取液，濃縮，加到Diaion HP-10大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成200片，每片重0.5g。
[0028]經(jīng)檢測，成品中淫羊藿苷的含量為3.6mg/片。
[0029]實施例3
[0030]取鹿銜草400g、淫羊藿160g、黃芪160g、當(dāng)歸140g、川彎200g、葛根240g、炒白術(shù)120g、酸棗仁140g、制半夏120g、澤瀉120g、干姜100g、甘草100g，將干姜、川芎、炒白術(shù)、當(dāng)歸、鹿銜草加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為6%，萃取壓力15MPa，溫度30°C，C02流量lml/g生藥.π?η，萃取時間340min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎，加入6.5L50%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率800W，萃取2次，每次10分鐘，合并萃取液，濃縮，加到Diaion HP-10大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成200片，每片重0.5g。
[0031]經(jīng)檢測，成品中淫羊藿苷的含量為4.5mg/片。
[0032]實施例4:止眩安神片抑制小鼠淋巴瘤細(xì)胞EL4細(xì)胞增殖的實驗研究資料
[0033]1.實驗材料
[0034]1.1實驗用 細(xì)胞株[0035]小鼠淋巴瘤細(xì)胞EL4細(xì)胞，山東大學(xué)實驗室細(xì)胞庫，DMEM+10%FBS常規(guī)培養(yǎng)。
[0036]1.2實驗藥物
[0037]研究藥物:本發(fā)明止眩安神片:按實施例1方法制備。
[0038]藥液儲液:稱取IOOmg止眩安神片，溶于5ml無水乙醇中，0.2 μ m濾器過濾，500 μ Idoff管分裝，-20°c存儲，同時0.2 μ m濾器過濾無水乙醇以備對照組之用。
[0039]1.3實驗試劑
[0040]DMEM(GIBC0 公司 Cat.N0.12100-061 Lot.N0.758137);胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司Lot.N0.100419) ;NaHC03(上海久億化學(xué)試劑有限公司Cat.N0.11810-033Lot.N0.1088387) ；Trypsin (AMRESCO 公司)；EDTA (AMRESCO 公司)！Penicillin G SodiumSalt (AMRESCO公司I );Streptomycin Sulfate (AMRESCO);無水乙醇(溜博亞杜蘭經(jīng)貿(mào)有限公司)；MTT (Biosharp批號:0793) =PBS (實驗室自配)；
[0041]1.4實驗器材
[0042]萊卡倒置顯微鏡(德國Leica型號:DMIL);可見-紫外光微孔板檢測儀(美國MD公司型號:SPECTRAMAX190);C02培養(yǎng)箱(F0RMA型號:3111);超凈臺(蘇凈集團(tuán)安泰公司制造型號=SW-CJ-ZFD);純水儀(美國Spring公司型號:S/N020579);精密移液器(法國吉爾森公司型號:P2);電子天平(德國賽多利斯有限公司型號:BT323S);全自動高壓滅菌鍋(日本SANYO公司型號:MLS-3020);臺式電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海精密實驗設(shè)備公司型號:DHG9123A);冰箱(西門子公司型號:KG18V21TI);液氮罐(CBS型號:2001);低速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠型號:ΚΑ-1000);0.2μπι濾器(MILLIP0RE 型號:SLGP033RB);Icm 培養(yǎng)皿(NEST 公司)、96孔培養(yǎng)板(NEST公司)；細(xì)胞計數(shù)板；離心管、移液管、Tips若干。
[0043]2.實驗方法
[0044]I) EL4細(xì)胞用DMEM+10%FBS于37°C、5%C02進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)(IOcm培養(yǎng)皿)，當(dāng)細(xì)胞生長至對數(shù)期時，收集細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，PBS輕洗3遍，加入3ml0.25%胰蛋白酶-0.04%EDTA,37°C消化2min后，向其中加入5ml完全培養(yǎng)基中和反應(yīng)，吹打細(xì)胞后將其轉(zhuǎn)入離心管中，1000rpm離心5min，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度3X IO4個/ml。
[0045]2)將細(xì)胞種入96孔培養(yǎng)板中，每孔加入細(xì)胞懸液180 μ 1，培養(yǎng)板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中(37°C，5%C02)常規(guī)培養(yǎng)。
[0046]3)根據(jù)細(xì)胞生長情況，一般長至50%_70%，加入止眩安神片溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24h。
[0047]4) 24h 后加入 20 μ I MTT 溶液(5mg/ml，即 0.5%MTT)，繼續(xù)培養(yǎng) 4h。
[0048]5) 4h后扣板法倒去上清，用吸水紙輕輕拍干，每孔如入200 μ I 二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩lOmin，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀490nm處測量各孔的吸光值。
[0049]6)同時設(shè)置本底(不加細(xì)胞，只加培養(yǎng)液)，對照孔(細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜)，每組設(shè)定6個復(fù)孔。
[0050]7)結(jié)果以藥物對細(xì)胞的抑制率表示:細(xì)胞增值抑制率(%)=(對照孔OD值-給藥孔OD值)、對照孔OD值X 100%。實驗重復(fù)3次。
[0051]3.統(tǒng)計處理
[0052]采用Microsoft Excel2007軟件中的相關(guān)分析和Student t檢驗，數(shù)據(jù)以mean + SD 表不。
[0053]4.實驗結(jié)果[0054]MTT法實驗后統(tǒng)計結(jié)果顯示，與對照組比較，當(dāng)劑量達(dá)到5mg/ml時，對EL4細(xì)胞增殖抑制有差異(p〈0.05)，劑量在10mg/ml時該差異具有顯著性(P〈0.01)，當(dāng)劑量達(dá)到15-20mg/ml時有極顯著性差異(P〈0.001)。
[0055]表1止眩安神片對EL4細(xì)胞增殖抑制影響研究(X土 SD)
[0056]
【權(quán)利要求】
1.止眩安神片在制備抑制淋巴瘤細(xì)胞EL4細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用，所述止眩安神片由鹿銜草400g、淫羊藿160g、黃芪160g、當(dāng)歸140g、川芎200g、葛根240g、炒白術(shù)120g、酸棗仁140g、制半夏120g、澤瀉120g、干姜100g、甘草100g作為原料藥制成，其特征在于，所述止眩安神片的制備方法由下列步驟組成:取干姜、川芎、炒白術(shù)、當(dāng)歸、鹿銜草，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力15-30MPa，溫度30_50°C，C02流量l_3ml/g生藥.π?η，萃取時間300_340min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎，加入6.5L50%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率600-800W，萃取2次，每次5-10分鐘，合并萃取液，濃縮，加到Diaion HP-1O大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成200片，每片重0.5g。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的止眩安神片在制備抑制淋巴瘤細(xì)胞EL4細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用，所述止眩安神片由鹿銜草400g、淫羊藿160g、黃芪160g、當(dāng)歸140g、川芎200g、葛根240g、炒白術(shù)120g、酸棗仁140g、制半夏120g、澤瀉120g、干姜100g、甘草100g作為原料藥制成，其特征在于，所述止眩安神片的制備方法由下列步驟組成:取干姜、川芎、炒白術(shù)、當(dāng)歸、鹿銜草，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%，萃取壓力15-30MPa，溫度30_50°C，C02流量l_3ml/g生藥.π?η，萃取時間320min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎，加入6.5L50%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率700W，萃取2次，每次5-10分鐘，合并萃取液，濃縮，加到Diaion HP-10大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥,壓片，制成200片，每片重0.5g。`
【文檔編號】A61K36/9068GK103768561SQ201310669929
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2013年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月10日
【發(fā)明者】孫波 申請人:濟(jì)南新起點(diǎn)醫(yī)藥科技有限公司