一種在心血管植入材料表面改善多種仿生功能的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種在心血管植入材料表面改善多種仿生功能的方法。首先在材料表面制備高分子量的HA條紋狀微圖形，并在該表面培養(yǎng)血管內皮細胞，通過HA條紋狀微圖形調控血管內皮細胞外基質的體外構建。然后利用脫細胞技術將材料表面的內皮細胞剝離下來，從而在心血管植入材料表面制備具有抗凝血/促內皮化/抑制平滑肌細胞粘附和增殖/抑制巨噬細胞粘附和鋪展多功能的生物化修飾表面。本發(fā)明在心血管植入材料表面構建具有抗凝血，再內皮化，抑制平滑肌細胞粘附、增殖并從促進其表型收縮，以及抑制巨噬細胞粘附和鋪展特性的多功能仿生內皮細胞外基質修飾層，顯著改善了材料的血液相容性和內皮損傷的結構和功能修復能力。
【專利說明】一種在心血管植入材料表面改善多種仿生功能的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物材料表面工程與仿生物制造工程交叉領域。
【背景技術】
[0002]心血管植入材料表面修飾技術發(fā)展至今，已逐漸趨于成熟，并廣泛應用于臨床。但目前臨床上所用材料表面療效，遠未達到預期目標。這主要是由于再好的表面修飾，其仿生功能也無法媲美機體本身心血管內血液接觸界面的生物學功能健全。
[0003]通過對材料表面的仿生，賦予材料良好的血液相容性、仿生再內皮化能力、抑制平滑肌細胞增殖能力和抑制巨噬細胞粘附能力是仿生生物化新技術的基礎。
[0004]內皮細胞外基質，是由內皮細胞分泌的由多種生物大分子和生長因子組成，在維持血管內膜和中膜的生理結構和功能中發(fā)揮重要功能。最近有研究發(fā)現(xiàn)完整的內皮細胞外基質與單一的內皮細胞外基質成分比較，更有助于植入材料表面內皮化和抗凝血。盡管如此，完整的內皮細胞外基質修飾的表面在異體植入過程中的免疫排斥和炎癥反應仍然是未來研究中亟需解決的問題。
[0005]透明質酸( HA)是細胞外基質的骨架和整合成分，其分子量從幾千到上百萬不等。不同分子量的HA對于細胞發(fā)揮不同的生物學功能。高分子量的HA對多種細胞的粘附起阻抗作用；同時由于其開放的空間鏈狀結構和自身忽視免疫排斥作用的功能，還具有保護蛋白質和生物因子免受免疫排斥作用影響的效果。高分子量的HA還具有較強的親水性，容易固定于親水性表面；同時由于其分子結構中含有大量羧基，也較容易以氫鍵、酰胺鍵或堿鍵的方式固定于羥基、氨基化或金屬表面。
[0006]材料表面圖形化是一種使細胞形態(tài)改變的技術，在條紋狀微圖形表面調控下，細胞可以在沒有流體剪切力的條件下達到形態(tài)拉長的目的，增強內皮細胞的一氧化氮(N0)和前列腺環(huán)素(PGI2)等的分泌、細胞外基質構建，從而強化內皮細胞抗凝血、抑制平滑肌細胞增生、抑制巨噬細胞粘附等功能。
[0007]生物材料表面HA微圖形制備技術是一種比較成熟的現(xiàn)有技術，該技術可通過在材料表面制備不同尺寸的HA微圖形達到調控細胞形態(tài)、行為和功能的目的，但所制備的表面血液相容性不佳，其抗凝效果甚至不如原始材料表面；將內皮細胞外基質中的一兩種成分固定于生物材料表面，以達到兼顧抗凝血和促內皮雙重效果的目的，該方法也是一種成熟的現(xiàn)有技術，缺點在于所構造的表面僅著眼于一兩種功能的仿生，而不是血管內壁完整功能的仿生；通過體外材料表面脫內皮細胞技術獲得相對完整的內皮細胞外基質目前也已有報道，但就該表面的免疫排斥和抑制炎癥反應功能并未得到描述，此外該表面制備過程中內皮細胞的培養(yǎng)并未在仿生條件下進行，其形態(tài)、功能和所分泌的細胞外基質是否具備完整的功能也未得到全面論證。
[0008]綜上所述，通過制備高分子量HA條紋狀微圖形于心血管植入材料表面，調控血管內皮細胞形態(tài)和分泌功能，再融合脫細胞技術可制備一種材料表面仿生細胞外基質表面。這種仿生的細胞外基質表面應具備較好的原位血管內壁界面功能:可有效改善材料表面血液相容性，一定程度上促進血管內膜結構和功能修復，有效抑制平滑肌細胞的粘附和增殖，促進平滑肌細胞表型收縮，對巨噬細胞等免疫排斥和炎癥相關細胞的粘附和鋪展具有明顯的抑制作用。而目前尚無利用心血管材料表面條紋狀HA微圖形體外調控內皮細胞融合脫細胞技術獲得這種多功能仿生內皮細胞外基質的相關報道。

【發(fā)明內容】

[0009]本發(fā)明的目的在于提供一種在心血管植入材料表面制備多功能仿生血管內皮細胞外基質的新方法，通過該方法對心血管植入材料表面進行生物化改性可有效提高材料的血液相容性和細胞相容性。
[0010]本發(fā)明實現(xiàn)以上目的采用的技術方案是，一種在心血管植入材料表面制備多功能血管內皮細胞外基質的方法，其步驟為:
[0011]A、HA微圖形制備。在材料表面制備分子量為1 X 105-1 X 107DA的透明質酸(HA)條紋狀微圖形，HA和裸露材料條紋寬度分別為10-40 μ m和10-40 μ m，待用；
[0012]B、材料表面血管內皮細胞外基質的制備:將傳代2-5代的血管內皮細胞以1 X 104-1 X 105個/ml的密度種植于步驟A所述微圖形表面，在37 °C，5%C02濃度的標準培養(yǎng)條件下培養(yǎng)1-3天，該步驟得到經(jīng)HA微圖形調控后，形狀拉長、排布有序的血管內皮細胞；吸除用過的細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)細胞的樣品用37°C的PBS(PH=7.4)清洗1_5遍后，加入脫細胞液，37°C，5%C02濃度的標準培養(yǎng)條件下脫細胞處理10-50分鐘，取出后吸除脫細胞液，用37°C的PBS (PH=7.4)再次清洗1_5遍，37°C干燥后即得目標物，步驟A和步驟B均在無菌條件下完成；
[0013]步驟B所述脫細胞液配置方法為:用0.1-1%的Triton X - 100溶液(PBS，PH=7.4)與25-27%的濃氨水混合，混合體積配比為Triton X - 100:濃氨水=100ml ±20ml:120 μ 1 ±20 μ 1 ;配液完畢后需用濾膜過濾除菌，4°C避光保存。
[0014]本發(fā)明的反應過程與機理主要分為兩個部分。第一部分為材料表面HA微條紋對血管內皮細胞的調控。首先通過高分子量HA對細胞粘附的阻抗作用使血管內皮細胞粘附在裸露的材料區(qū)域；其次利用條紋狀微圖形的尺寸效應調控血管內皮細胞形態(tài)拉長，促進仿生條件下內皮細胞功能性因子分泌和細胞外基質構建。第二部分為材料表面多功能血管內皮細胞外基質的獲得。使用脫細胞試劑，剝離材料表面培養(yǎng)的細胞，即可得到目標產(chǎn)物多功能血管內皮細胞外基質。由于HA本身就是細胞外基質的骨架成分，可以和內皮細胞外基質發(fā)生復雜的相互作用，因此這種多功能仿生血管內皮細胞外基質可以牢固地固定在材料表面。
[0015]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果是:
[0016]一、創(chuàng)造性的在體外材料表面制備出多功能仿生血管內皮細胞外基質，利用高分子量透明質酸對血管內皮細胞粘附的阻抗作用與條紋狀微圖形的尺寸效應，在體外材料表面拉長內皮細胞，為仿生血管內皮細胞外基質的構建創(chuàng)造條件。通過該種方法，可以有效提高材料表面血管內皮細胞外基質構造的仿生度，使其結構和功能最大限度地接近人體血管內壁中的內皮細胞外基質生理結構和功能。
[0017]二、該多功能仿生血管內皮細胞外基質表面的制備工藝簡單易操作，無需生物傳感器等昂貴復雜的設備，工藝成本較低，效果顯著。[0018]三、高分子量HA的存在可使該多功能仿生血管內皮細胞外基質免受免疫排斥和炎癥反應等巨噬細胞相關生理病理因素的影響和干擾，為該生物化表面開辟更加廣泛的應用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]下面結合附圖和實施例對本發(fā)明的方法作進一步詳細的說明。
[0020]圖1為本發(fā)明方法中多功能仿生血管內皮細胞外基質表面制備的各步驟示意圖。
[0021]圖2為樣品表面原子力顯微鏡圖和表面粗糙度檢測結果。圖2a為空白材料；圖2b為制備有多功能仿生血管內皮細胞外基質的材料表面。
[0022]圖3為樣品表面纖維蛋白原變性檢測結果。(a)空白材料；(b)制備有多功能仿生血管內皮細胞外基質的Ti表面。
[0023]圖4為樣品表面內皮祖細胞培養(yǎng)后熒光染色和細胞數(shù)量統(tǒng)計結果(CCK-8檢測法，細胞數(shù)量與吸光度呈正相關)。 圖4a為空白材料表面內皮祖細胞免疫熒光圖；圖413為制備有多功能仿生血管內皮細胞外基質的材料表面的內皮祖細胞免疫熒光圖。圖4c為其對比統(tǒng)計圖。
[0024]圖5為樣品表面平滑肌細胞培養(yǎng)后熒光染色和細胞數(shù)量統(tǒng)計結果(CCK-8檢測法，細胞數(shù)量與吸光度呈正相關)。圖5a為空白材料表面的平滑肌細胞免疫熒光圖；圖5b為制備有多功能仿生血管內皮細胞外基質的材料表面的平滑肌細胞免疫熒光圖。圖5c為其對比統(tǒng)計圖。
[0025]圖6為樣品表面巨噬細胞培養(yǎng)后熒光染色和細胞數(shù)量統(tǒng)計結果。圖6a為空白材料表面的巨噬細胞免疫熒光圖；圖6b為制備有多功能仿生血管內皮細胞外基質的材料表面的巨噬細胞免疫熒光圖。圖6c為其對比統(tǒng)計圖。
【具體實施方式】
[0026]實施例一
[0027]參見圖1，本發(fā)明的第一種【具體實施方式】是，一種在不銹鋼表面獲得多功能血管內皮細胞外基質的方法，其步驟為:
[0028]A、在拋光的不銹鋼表面制備分子量為5X105DA的透明質酸(HA)條紋狀微圖形，HA和裸露材料條紋寬度分別為35 μ m和15 μ m,待用；
[0029]B、不銹鋼表面血管內皮細胞外基質的制備:將傳代3代的血管內皮細胞以5X104個/ml的密度種植于步驟A所述微圖形表面，在37°C，5%C02濃度的標準培養(yǎng)條件下培養(yǎng)2天，該步驟得到經(jīng)HA微圖形調控后，形狀拉長、排布有序的血管內皮細胞；吸除用過的細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)細胞的樣品用37°C的PBS清洗3遍后，加入脫細胞液，37°C，5%C02濃度的標準培養(yǎng)條件下脫細胞處理15分鐘，取出后吸除脫細胞液，用37°C的PBS再次清洗3遍，37°C干燥后即得目標物，步驟A和步驟B均在無菌條件下完成；
[0030]C、步驟B所述脫細胞液配置方法為:用0.1%的Triton X - 100溶液(PBS，PH=7.4)與27%的濃氨水混合，混合體積配比為Triton X - 100:濃氨水=100ml:120 μ 1 ;配液完畢后需用濾膜過濾除菌，4°C避光保存。
[0031]實施例二[0032]一種在鈦表面獲得多功能血管內皮細胞外基質的方法，其步驟為:
[0033]A、在拋光的鈦表面制備分子量為1 X 106DA的透明質酸(HA)條紋狀微圖形，HA和裸露材料條紋寬度分別為25 μ m和25 μ m,待用；
[0034]B、鈦表面血管內皮細胞外基質的制備:將傳代2代的血管內皮細胞以1父105個/ml的密度種植于步驟A所述微圖形表面，在37°C，5%C02濃度的標準培養(yǎng)條件下培養(yǎng)1天，該步驟得到經(jīng)HA微圖形調控后，形狀拉長、排布有序的血管內皮細胞；吸除用過的細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)細胞的樣品用37°C的PBS清洗4遍后，加入脫細胞液，37°C，5%C02濃度的標準培養(yǎng)條件下脫細胞處理20分鐘，取出后吸除脫細胞液，用37°C的PBS再次清洗5遍，37°C干燥后即得目標物，步驟A和步驟B均在無菌條件下完成；
[0035]C、步驟B所述脫細胞液配置方法為:用0.1%的Triton X - 100溶液(PBS，PH=7.4)與27%的濃氨水混合，混合體積配比為Triton X - 100:濃氨水=100ml:134 μ 1 ;配液完畢后需用濾膜過濾除菌，4°C避光保存。
[0036]實施例三
[0037]—種在聚氨酯材料表面獲得多功能血管內皮細胞外基質的方法，其步驟為:
[0038]A、在聚氨酯材料表面制備分子量為3X 106DA的透明質酸(HA)條紋狀微圖形，HA和裸露材料條紋寬度分別為30 μ m和20 μ m,待用；
[0039]B、聚氨酯材料表面血管內皮細胞外基質的制備:將傳代3代的血管內皮細胞以8 X 104個/ml的密度種植于步驟A所述微圖形表面，在37 °C，5%C02濃度的標準培養(yǎng)條件下培養(yǎng)3天，該步驟得到經(jīng)HA微圖形調控后，形狀拉長、排布有序的血管內皮細胞；吸除用過的細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)細胞的樣品用37°C的PBS清洗5遍后，加入脫細胞液，37°C，5%C02濃度的標準培養(yǎng)條件下脫細胞處理30分鐘，取出后吸除脫細胞液，用37°C的PBS再次清洗5遍，37°C干燥后即得目標物，步驟A和步驟B均在無菌條件下完成；
`[0040]C、步驟B所述脫細胞液配置方法為:用0.6%的Triton X - 100溶液(PBS, PH=7.4)與25%的濃氨水混合，混合體積配比為Triton X - 100:濃氨水=120ml:139 μ 1 ;配液完畢
后需用濾膜過濾除菌，4°C避光保存。
【權利要求】
1.一種在心血管植入材料表面改善多種仿生功能的方法，其步驟為:A、在材料表面制備分子量為1X 105-1 X 107DA的透明質酸(HA)條紋狀微圖形，HA和裸露材料條紋寬度分別為10-40 μ m和10-40 μ m,待用；B、材料表面血管內皮細胞外基質的制備:將傳代2-5代的血管內皮細胞以1 X 104-1 X 105個/ml的密度種植于步驟A所述微圖形表面，在37 °C，5%C02濃度的標準培養(yǎng)條件下培養(yǎng)1-3天，該步驟得到經(jīng)HA微圖形調控后，形狀拉長、排布有序的血管內皮細胞；吸除用過的細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)細胞的樣品用37°C的PBS清洗1-5遍后，加入脫細胞液，在37°C，5%C02濃度的標準培養(yǎng)條件下脫細胞處理10-50分鐘，取出后吸除脫細胞液，用37°C的PBS再次清洗1-5遍，37°C干燥后即得目標物，步驟A和步驟B均在無菌條件下完成。
2.根據(jù)權利要求1所述的在心血管植入材料表面改善多種仿生功能的方法，其特征在于:所述步驟B所用脫細胞液配置方法為:用0.1-1%的Triton X - 100溶液(PBS，PH=7.4)與25-27%的濃氨水混合，混合體積配比為Triton X - 100:濃氨水=100ml ±20ml:120 μ 1 ±20 μ 1 ;配液完畢后需用濾膜過濾除菌，4°C避光保存。
3.根據(jù)權利要求1所述的在心血管植入材料表面改善多種仿生功能的方法，其特征在于:所述材料包括適宜作為生物醫(yī)學功能使用的多種金屬材料和高分子材料，如不銹鋼、鈦和聚氨酯材料。
【文檔編號】A61L31/06GK103656750SQ201310671971
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月7日 優(yōu)先權日:2013年12月7日
【發(fā)明者】楊蘋, 李敬安, 張琨, 黃楠, 王進, 涂秋芬, 趙安莎, 向利潔, 吳玨玨 申請人:西南交通大學