遲緩愛(ài)德華氏菌基因工程弱毒株及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供野生遲緩愛(ài)德華氏菌的4株基因缺失突變株及其衍生菌株，分別為EvpC基因喪失功能的E.tardaΔEvpC菌株及其衍生菌株，包括有EsrB基因喪失功能的E.tardaΔEvpCΔEsrB菌株及其衍生菌株，PstB基因喪失功能的E.tardaΔEvpCΔEsrBΔPstB菌株及其衍生菌株，PstC基因喪失功能的E.tardaΔEvpCΔEsrBΔPstC菌株及其衍生菌株。上述弱毒株的EvpC、EsrB、PstB和PstC等1—3個(gè)基因存在引起其功能喪失的部分或全部缺失、點(diǎn)突變、移位或插入。較野生1101菌株或其他強(qiáng)毒株，E.tarda△EvpC、E.tarda△EvpCΔEsrB、E.tardaΔEvpCΔEsrBΔPstB和E.tardaΔEvpCΔEsrBΔPstC菌株的毒力分別不超過(guò)野生遲緩愛(ài)德華氏菌1101株或其他強(qiáng)毒株的1/40、1/400、1/4000和1/4000。上述的遲緩愛(ài)德華氏菌基因工程弱毒株可作為愛(ài)德華氏菌的弱毒疫苗株、基因工程載體或益生菌得到應(yīng)用。
【專(zhuān)利說(shuō)明】遲緩愛(ài)德華氏菌基因工程弱毒株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的微生物基因工程技術(shù)及免疫學(xué)領(lǐng)域，具體涉及遲緩愛(ài)德華氏菌基因工程弱毒株及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]遲緩愛(ài)德華氏菌(Edwardsiellatarda)由 Hoshina (1962)首次從獲鱺(Anguillajapanica)中分離，與鲇魚(yú)愛(ài)德華氏菌(E.1ctaluri)和保科愛(ài)德華氏菌(E.hoshinae)同屬于腸桿菌科愛(ài)德華氏菌屬。遲緩愛(ài)德華氏菌對(duì)多種魚(yú)類(lèi)具有致病性，已報(bào)道可感染的魚(yú)類(lèi)有:斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictalurus punctatus)、大口黑 S盧(Micropterus salmoides)、獲魚(yú)Β0(Α.japonica)、鯔魚(yú)(Mugil cephalus)、犁齒鯛(Evynnis japonica)、羅非魚(yú)(Tilapianilotica)、奇努克鮭魚(yú)(Oncorhynchus tshawytscha)、紅鯛(Chrysophrys major)、五條飾(Seriola quinqueradiata)、牙鲆(Paralichthys olivaceus)、鯉魚(yú)(Cyprinus carpio)、海魚(yú)盧(Morone saxatilis)、大菱鲆(Scophthalmus maximus)、古月It (Clarias batrachus)、錦鯉(Anabas testudineus)、歐洲獲(Anguilla anguilla)、黃顙魚(yú)(Pelteobagrusfulvidraco)、絲足魚(yú)(Trichogaster trichopterus)、地圖魚(yú)(Astronotus ocellatus)、劍尾魚(yú)(Xiphophorus helleri)和斑馬魚(yú)(Danio rerio)等。該菌株另也有感染兩棲類(lèi)(蟾蜍、牛蛙等)、爬行類(lèi)(蜥蜴、蛇、海龜、中華鱉等)、鳥(niǎo)類(lèi)(企鵝、禿鷹、鴕鳥(niǎo)及一些水鳥(niǎo)等)、哺乳類(lèi)(海獅、海牛、豬、狗、牛、猴子等)的報(bào)道。除以上動(dòng)物外，該菌株可感染人類(lèi)，引起人的腸胃炎、流行性腹瀉和敗血癥等癥狀。該菌呈世界性分布，普遍存在于淡水和海水環(huán)境中，主要分布在中國(guó)、澳大利 亞、日本、印度、以色列、馬來(lái)群島、美國(guó)、巴拿馬等熱帶和亞熱帶國(guó)家和地區(qū)，該菌是當(dāng)前水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的有著極大危害的病原菌之一。從首次報(bào)道至今，該病原對(duì)多種魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大損失。較抗生素等藥物防治方法，采用疫苗為主的免疫防治技術(shù)因具有安全高效無(wú)公害等優(yōu)點(diǎn)，已成為國(guó)際上魚(yú)病防控技術(shù)發(fā)展的趨勢(shì)。在不同類(lèi)型疫苗研究中，利用基因工程技術(shù)構(gòu)建的基因工程弱毒株可通過(guò)感染宿主的方式誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生與自然感染接近的免疫應(yīng)答，從而可產(chǎn)生較為持久的免疫力，與傳統(tǒng)疫苗相比，其免疫接種中，具有用量小、成本低及操作方便等優(yōu)點(diǎn)，另外弱毒株也可開(kāi)發(fā)成為基因工程菌株或作為益生菌而加以應(yīng)用，因此具有極高的開(kāi)發(fā)應(yīng)用價(jià)值。
[0003]早期研究中，有學(xué)者利用轉(zhuǎn)座子或基因插入失活的方法對(duì)遲緩愛(ài)德華氏菌加以改造，但上述方法制備的弱毒株攜帶有抗生素及外源的基因片段，具有潛在的生物風(fēng)險(xiǎn)。針對(duì)這一現(xiàn)狀，近年來(lái)，人們更多的采用細(xì)菌毒力相關(guān)基因的無(wú)標(biāo)記缺失技術(shù)進(jìn)行弱毒突變株的構(gòu)建，該弱毒突變株因其不攜帶任何抗性標(biāo)記和外源基因，具有較高的生物安全性，其中雙基因或多基因缺失突變株較單基因缺失株又可有效降低因多次傳代可能產(chǎn)生的返祖現(xiàn)象，因而更具有開(kāi)發(fā)應(yīng)用的價(jià)值。
[0004]病原材料的種株差異會(huì)直接影響其基因工程菌株的應(yīng)用效果，進(jìn)而也影響其所制備的弱毒疫苗的免疫保護(hù)效果。我們?cè)谠缙谘芯恐袕姆蛛x到的多株遲緩愛(ài)德華氏菌中篩選出1101菌株作為弱毒疫苗開(kāi)發(fā)候選株,該菌株分離自海水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)大菱鲆成魚(yú)體中，是一種具有較強(qiáng)毒力的野生菌株，其保藏編號(hào)為:CGMCCN0.7197，該菌株制備的滅活疫苗可獲得60%以上的免疫保護(hù)力的結(jié)果，說(shuō)明該1101菌株具有遲緩愛(ài)德華氏菌的免疫保護(hù)性抗原。以上述的1101菌株為基礎(chǔ)，我們構(gòu)建了遲緩愛(ài)德華氏菌VI型分泌系統(tǒng)中的毒力蛋白EvpC基因喪失功能的E.tarda'EvpC菌株及其衍生菌株，對(duì)魚(yú)類(lèi)的半致死劑量(LD5tl)可提高40—4000倍以上，用其作為活疫苗的免疫應(yīng)用中，受試魚(yú)也可獲得較好的免疫保護(hù)效果，這一結(jié)果也表明E.tarda'EvpC菌株及其衍生菌株作為基因工程弱毒株，具有良好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種遲緩愛(ài)德華氏菌基因工程弱毒株及其應(yīng)用方法。
[0006]本發(fā)明以野生遲緩愛(ài)德華氏菌(Edwardsiella tarda)菌株1101為基礎(chǔ)(保藏編號(hào)為:CGMCC N0.7197)，利用基因同源重組的原理，采用基因工程技術(shù)構(gòu)建了VI分泌系統(tǒng)毒力蛋白EvpC基因喪失功能的E.，包括此菌株的衍生菌株，其特征在于該株與野生遲緩愛(ài)德華氏菌1101株或其他強(qiáng)毒株相比，存在引起EvpC基因功能喪失的部分或全部缺失、點(diǎn)突變、移位或插入，即存在引起與SEQ ID NO:1 (EvpC基因上游核苷酸序列)和SEQ ID NO: 2 (EvpC基因下游核苷酸序列)相同或相近的序列所編碼的基因功能喪失的部分或全部缺失、點(diǎn)突變、移位或插入。上述的點(diǎn)突變、移位或插入指受內(nèi)在及外界因素誘導(dǎo)而引起的的該核苷酸序列的錯(cuò)義突變、無(wú)義突變、移碼突變以及包括轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽在內(nèi)的外源基因插入誘變等，以下同。以斑馬魚(yú)為模式動(dòng)物對(duì)其毒力分析結(jié)果表明，E.株的毒力不超過(guò)野生遲緩愛(ài)德華氏菌1101株或其他強(qiáng)毒株的1/40，其對(duì)魚(yú)的半致死量至少需要I X 105cfu/g (菌落形成單位/魚(yú)體重)。
[0007]E.tarda"Evpe菌株的衍生菌株中包括遲緩愛(ài)德華氏菌III型分泌系統(tǒng)調(diào)節(jié)蛋白基因EsrB喪失功能的E.tardaAEvpMtoB菌株，包括此菌株的衍生菌株，其特征在于E.tardaΔΕνρεΔΕ3Β株存在引起E.tardaΔΕνρε株的EsrB基因功能喪失的部分或全部缺失、點(diǎn)突變、移位或插入，即存在引起除了與SEQ ID Ν0:1和SEQ ID NO:2相同或相近的序列之外，還有與SEQ ID NO:3 (EsrB基因上游核苷酸序列)和SEQ ID NO:4 (EsrB基因下游核苷酸序列)相同或相近的序列所編碼的基因功能喪失的部分或全部缺失、點(diǎn)突變、移位或插入。以大菱鲆為模式動(dòng)物對(duì)其進(jìn)行的兩次毒力分析的結(jié)果表明，Ε.tardaΛε-ΛΕ3Ι.β菌株毒力不超過(guò)野生遲緩愛(ài)德華氏菌1101株或其他強(qiáng)毒株的1/400，其對(duì)魚(yú)的半致死量至少需要lX106cfu/g (菌落形成單位/魚(yú)體重)。以E.tardaAE—B菌株作為弱毒株的初步免疫試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)愛(ài)德華氏菌感染具有較好的免疫保護(hù)效果，受試大菱鲆在注射、浸泡和口服免疫后，可分別獲得76%、50%和42%免疫保護(hù)力。E.tarda'EvpC'EsrB菌株所述衍生菌株中包括的PST操縱子系統(tǒng)基因PstB喪失功能的E.tarda'EvpC'EsrB'PstB株，包括此菌株的衍生菌株，其特征于E.tardaΔΕνρεΔΕ3ΒΔΡ3?Β株存在引起E.tardaΔΕν?ΛΔΕ31:Β株的PstB基因功能喪失的部分或全部缺失、點(diǎn)突變、移位或插入，即存在引起除了與SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2, SEQ ID Ν0:3和SEQ ID Ν0:4相同或相近的序列之外，還有與SEQ ID NO:5(PstB基因上游核苷酸序列)和SEQ ID NO:6 (PstB基因下游核苷酸序列)相同或相近的序列所編碼的基因功能喪失的部分或全部缺失、點(diǎn)突變、移位或插入。以牙鲆為模式動(dòng)物對(duì)其毒力分析結(jié)果表明，Ε.tarda'EvpC'EsrB'PstB菌株毒力不超過(guò)野生遲緩愛(ài)德華氏菌1101株或其他強(qiáng)毒株的1/4000，其對(duì)魚(yú)的半致死量至少需要lX108cfu/g (菌落形成單位/魚(yú)體重)；E.tarda'EvpC'EsrB菌株所述衍生菌株中也包括PST操縱子系統(tǒng)基因PstC喪失功能的E.tardaΔΕνρεΔΕ3ΒΔΡ3?ε株，包括此菌株的衍生菌株，其特征于E.tarda"EvpC'EsrB'Pstc株存在引起E.tarda"EvpC"EsrB株的PstC基因功能喪失的部分或全部缺失、點(diǎn)突變、移位或插入，即存在引起除了與SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2, SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4相同或相近的序列之外，還有與SEQ ID NO:7 (PstC基因上游核苷酸序列)和SEQ ID NO:8 (PstC基因下游核苷酸序列)相同或相近的序列所編碼的基因功能喪失的部分或全部缺失、點(diǎn)突變、移位或插入。以牙鲆為模式動(dòng)物對(duì)其毒力分析結(jié)果表明，E.tardaAEvpME—Pste菌株毒力不超過(guò)野生遲緩愛(ài)德華氏菌1101株或其他強(qiáng)毒株的1/4000，其對(duì)魚(yú)的半致死劑量(LD5tl)至少需要I X I O8Cf u/g(菌落形成單位 / 魚(yú)體重)。上述的 E.tar da △EvpG Δ EsrB Δ PstB 和 Ε.tar da △EvpC Δ EsrB Δ Pstc菌株作為弱毒株的初步試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)愛(ài)德華氏菌感染也可提供較好的免疫保護(hù)效果，受試牙鲆注射免疫2周后，可分別獲得70%和85%免疫保護(hù)力。
[0008]以上結(jié)果也表明E.tarda'EvpC菌株及其衍生菌株已具備適宜用于制備弱毒疫苗的能力及疫苗開(kāi)發(fā)的應(yīng)用前景。
[0009]本發(fā)明的E.tardallOlAEvpG株(遲緩愛(ài)德華氏菌Edwardsiella tarda),其中一個(gè)菌株于2013年8月21日保藏于北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC N0.8061。
[0010]E.tardaAEvpCAEsrB 菌株(遲緩愛(ài)德華氏菌 Edwardsiella tarda),于 2013 年 8 月 21日保藏于北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC N0.8062 ；
[0011]E.tarda"EvpG?PstB株，于2013年8月21日保藏于北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為 CGMCC N0.8063 ；
[0012]E.tarda'EvpC'EsrB'Pstc株，于2013年8月21日保藏于北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為 CGMCC N0.8064 ；
[0013]本發(fā)明的遲緩愛(ài)德華氏菌E.tarda AEvpC、E.tarda AEvpC'EsrB, E.tarda'EvpC'EsrB'PstB和E.tardaAE—Pste菌株及其衍生菌株可培養(yǎng)于Luria-Bertani (LB)、胰大豆蛋白胨培養(yǎng)基(TSB)或2216E海水培養(yǎng)基，培養(yǎng)方法如下:從_80°C保存的菌種中挑取少量劃線于上述培養(yǎng)基的固體平板，培養(yǎng)溫度范圍為28— 37 °C，24— 48h后，取上述單菌落接種于上述培養(yǎng)基的培養(yǎng)液中，28— 37°C，180r/min搖瓶培養(yǎng)至0D_為0.5—0.6，即可獲得該菌株的新鮮菌液。遲緩愛(ài)德華氏菌弱毒株作為疫苗菌株可以有多種應(yīng)用方式，生產(chǎn)的疫苗可以是使用該弱毒株的活菌，也可以使用該弱毒株的滅活菌、菌蛻成分及部分抗原；可以制備源于該弱毒株的單一疫苗，可以制備該菌株與源于其他病原的聯(lián)合疫苗，也可以將制備的單一或聯(lián)合疫苗再添加佐劑生產(chǎn)疫苗產(chǎn)品，還可以是將弱毒株作為表達(dá)一種或多種外源抗原的活菌載體中的疫苗應(yīng)用。弱毒株與佐劑配伍應(yīng)用中，佐劑可與疫苗抗原混合制成疫苗制劑，也可以不與疫苗抗原制成單一制劑但同時(shí)使用，也可以與疫苗抗原不同時(shí)使用。由本發(fā)明遲緩愛(ài)德華氏菌弱毒株生產(chǎn)的疫苗在接種應(yīng)用中，可以采用浸泡免疫、口服免疫、創(chuàng)傷免疫(即將受免疫魚(yú)體表進(jìn)行無(wú)菌人工輕微創(chuàng)傷處理，增強(qiáng)魚(yú)體對(duì)抗原的吸收)和注射免疫等多種不同的免疫接種方式?？乖膭┝颗c免疫效果密切相關(guān)，劑量過(guò)低，不能誘導(dǎo)足夠強(qiáng)的免疫應(yīng)答，劑量過(guò)高，也可能會(huì)導(dǎo)致機(jī)體的免疫耐受。因此，為取得較好的免疫效果，在抗原接種前，應(yīng)先確定疫苗接種的有效劑量范圍，其中，弱毒株作為活疫苗或活菌載體應(yīng)用中，因其潛在的毒力并未完全喪失，還應(yīng)事先確定其免疫應(yīng)用中的安全接種劑量范圍。此外，抗原在應(yīng)用中也應(yīng)考慮諸如動(dòng)物生長(zhǎng)階段、抗原種類(lèi)、疫苗劑型及接種次數(shù)等因素對(duì)其劑量需求的影響。本發(fā)明的遲緩愛(ài)德華氏菌弱毒株作為活疫苗應(yīng)用中，注射免疫接種時(shí)，可采用腹腔或肌肉注射兩種方式，使用的劑量為IO4 — 107CFU/g(菌落形成單位/魚(yú)體重)；創(chuàng)傷免疫或浸浴免疫接種時(shí)，浸泡水體中活疫苗的濃度為IO6 — 109CFU/mL (菌落形成單位/浸泡體積)，浸泡時(shí)間2min — 12h ; 口服免疫接種時(shí)，配合飼料中活疫苗的添加劑量為IO6 — IO9CFU/g(菌落形成單位/飼料重量)，連續(xù)投喂2— 7天。以上活疫苗在使用中，還可根據(jù)實(shí)際情況對(duì)受免疫魚(yú)實(shí)施加強(qiáng)免疫2— 3次，兩次免疫的時(shí)間間隔為14一30天。
[0014]本發(fā)明的遲緩愛(ài)德華氏菌基因工程弱毒株，其所制備疫苗抗原可應(yīng)用于魚(yú)類(lèi)、兩棲類(lèi)和爬行類(lèi)的免疫接種，用于預(yù)防經(jīng)免疫接種的水生動(dòng)物發(fā)生愛(ài)德華氏菌病，包括海水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)(如牙鲆、大菱鲆、半滑舌鰨、石斑魚(yú)、鱸魚(yú)、真鯛、軍曹魚(yú)、大西洋鮭、河飩等)、半咸水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)(如羅非魚(yú)、 虹鱒、鯔魚(yú)等)、洄游魚(yú)類(lèi)(如鰻鱺、小黃魚(yú)等)、淡水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)(如青魚(yú)、鰱魚(yú)、鳙魚(yú)、鯉魚(yú)、鯽魚(yú)、鯰魚(yú)、鱖魚(yú)、鱘魚(yú)、澳洲寶石鱸、黃顙魚(yú)等)、觀賞魚(yú)類(lèi)(如金魚(yú)、錦鯉等)、兩棲類(lèi)(如牛蛙、大鯢等)和爬行類(lèi)(如鱉、龜、蛇等)的疫苗接種。不同的水生動(dòng)物的抗原的免疫劑量有所不同，對(duì)于特定水生動(dòng)物及特定抗原的在使用中的具體劑量，應(yīng)該進(jìn)行單獨(dú)測(cè)試。
[0015]遲緩愛(ài)德華氏菌為一種胞內(nèi)寄生菌，可在上皮細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等胞內(nèi)生長(zhǎng)繁殖，具有多種逃避機(jī)體的免疫殺傷的能力，其弱毒株在安全性具有保證的前提下，具有進(jìn)一步開(kāi)發(fā)成為基因工程菌株的潛在價(jià)值，其應(yīng)用包括可以作為在質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、噬粒轉(zhuǎn)染、外源基因整合、DNA疫苗等方面所需的基因工程菌株，也可以在克隆特定的核酸序列，表達(dá)特定基因編碼的外源蛋白、多肽，轉(zhuǎn)錄特定基因編碼的單鏈或雙鏈RNA等方面獲得應(yīng)用。遲緩愛(ài)德華氏菌弱毒株作為載體在應(yīng)用前，有必要進(jìn)行對(duì)該載體系統(tǒng)的安全性及外源基因遺傳穩(wěn)定性的評(píng)估，應(yīng)用中的接種方式也可采用浸泡、口服、創(chuàng)傷和注射等接種方式。
[0016]本發(fā)明的遲緩愛(ài)德華氏菌基因工程弱毒株也可作為益生菌加以應(yīng)用，可以作為陸生動(dòng)物或水生動(dòng)物腸道、體表定植或體內(nèi)暫存的益生菌，用于刺激動(dòng)物非特異性免疫力的提高或抑制致病微生物的存在與繁殖。弱毒株作為益生菌，其應(yīng)用的接種方式也可采用浸泡、口服、創(chuàng)傷和注射等接種方式，為確保應(yīng)用中的安全性，應(yīng)用前，也應(yīng)確定不同接種方式中使用的安全劑量范圍。
[0017]本發(fā)明的積極效果在于:本發(fā)明的遲緩愛(ài)德華氏菌基因工程弱毒株無(wú)任何抗性標(biāo)記及外源基因，其中的雙基因和三基因缺失弱毒株及其衍生株可有效降低了減毒株在使用中可能發(fā)生的返祖現(xiàn)象，進(jìn)一步提高了疫苗的安全性。免疫接種后，弱毒株可通過(guò)感染宿主的方式，通過(guò)在機(jī)體中的繁殖生長(zhǎng)，進(jìn)而誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生與自然感染接近的免疫應(yīng)答，這對(duì)于可在胞內(nèi)感染并具有免疫逃避能力的愛(ài)德華氏菌感染的有效免疫防控具有重要意義，使用中具有用量小、成本低及接種方便等優(yōu)點(diǎn)。對(duì)魚(yú)類(lèi)初步免疫試驗(yàn)結(jié)果，已證實(shí)本發(fā)明的弱毒株一次注射、浸泡或口服途徑接種均對(duì)愛(ài)德華氏菌感染具有較好的免疫保護(hù)作用。本發(fā)明的遲緩愛(ài)德華氏菌基因工程弱毒株也可用于包括重組活疫苗在內(nèi)的不同基因工程菌株的開(kāi)發(fā)，也可作為水生生物的有益菌而加以應(yīng)用。本發(fā)明的應(yīng)用也可有效減少或消除由于愛(ài)德華氏菌病發(fā)生所致的消毒劑、抗生素等化學(xué)藥物的濫用，因此也具有顯著的經(jīng)濟(jì)及生態(tài)效益。
[0018]以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
[0019]實(shí)施例1:遲緩愛(ài)德華氏菌基因工程弱毒株的培養(yǎng)
[0020]遲緩愛(ài)德華氏菌基因工程弱毒株E.tarda Δ EvpC, E.tarda Δ EvpC'EsrB,Ε.tardaΔΕνρεΔΕ3rΒΔΡ3rΒ 和 Ε.tarda"EvpC'EsrB'Pstc 可培養(yǎng)于 LB 培養(yǎng)基(胰化蛋白胨 10g，酵母提取物5g，NaCllOg，去離子水定容至1L，pH7.0)、TSB培養(yǎng)基(北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司)或2216E培養(yǎng)基(根據(jù)培養(yǎng)基成分中海水的有無(wú)，該培養(yǎng)基分為兩種，其一:酵母提取物lg，胰化蛋白胨5g，F(xiàn)ePO40.lg，海水定容至1L，pH7.6—7.8 ;其二:酵母提取物lg，胰化蛋白胨5g，F(xiàn)ePO40.lg, NaC134g，去離子水定容至1L，pH7.6—7.8)，上述培養(yǎng)基的固體平板的配制中則需要另外添加2%瓊脂。菌株培養(yǎng)方法如下:從_80°C保存的菌種中挑取少量劃線于上述培養(yǎng)基的固體平板，在28— 37°C培養(yǎng)24— 48h，即可在平板上獲得單克隆菌落，取一單菌落接種于上述培養(yǎng)基的培養(yǎng)液中，28— 37°C，180r/min搖瓶培養(yǎng)至0D_為0.5—0.6，即可獲得該菌株的新鮮菌液。
[0021]實(shí)施例2:遲緩愛(ài)德華氏菌基因工程弱毒疫苗E.tardaΔΕνρε菌株的構(gòu)建方法
[0022](1)EvpC基因上、下游核苷酸序列擴(kuò)增及連接
[0023]以遲緩愛(ài)德華氏菌1101菌株(保藏編號(hào)為=CGMCC N0.7197) DNA為模板，用引物EvpC-up-for/EvpC-up-rev進(jìn)行EvpC基因上游片段Fl(826bp)擴(kuò)增,所獲序列記為SEQ IDNO:1。用引物 EvpC-down-for/EvpC-down-rev 進(jìn)行 EvpC 基因下游片段 F2 (583bp)擴(kuò)增，所獲序列記為SEQ ID N0:2。對(duì)SEQ ID NO:1和2進(jìn)行測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，結(jié)果表明以上兩序列具備了遲緩愛(ài)德華氏菌菌株的EvpC基因上、下游的序列特征。
[0024]上述引物序列如下:
[0025]EvpC-up-for:AAGGTACCGGTCGAGTCATTCAATTTT
[0026]EvpC-up-rev:ACCAATTTTGCCGCCATCAACCTTATCCAGTT
[0027]EvpC-down-for:GGCGGCAAAATTGGTCCTG
[0028]EvpC-down-rev:AAGGTACCCCGTCGAGGTTGAAAAGG
[0029]以上述純化后的F1、F2為模板,用引物EvpC-up-f or/EvpC-down-r e V進(jìn)行Over I apPCR擴(kuò)增，所獲片段即為EvpC基因上、下游核苷酸連接序列F1-F2 (1409bp)。
[0030](2)重組自殺質(zhì)粒的構(gòu)建及電轉(zhuǎn)
[0031]用Kpn I內(nèi)切酶(Takara生物工程有限公司，大連)，對(duì)上述的F1-F2產(chǎn)物和PRE112自殺質(zhì)粒進(jìn)行酶切，獲得酶切后的F1-F2產(chǎn)物及線性pRE112片段再用T4DNA連接酶(NEB有限公司，北京)16°C連接過(guò)夜，構(gòu)建重組自殺質(zhì)粒pRE112-DEvpC。再將該重組自殺質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入事先制備的大腸桿菌(Escherichia coli)SM10菌株的電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞中，加入適量的LB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)60min，取適量菌液涂布含有氯霉素(34 μ g/mL,以下濃度同)的LB固體平板上，以篩選含有pRE112-DEvpC重組自殺質(zhì)粒的大腸桿菌SMlO菌株。
[0032](3)兩次同源重組構(gòu)建E.tardaAEvpG菌株
[0033]取0D600 值約為 0.5 左右的 160 μ L SMlO (pRE112_DEvpC)和 40 μ LllOl 新鮮菌
液，混勻，離心并用200 μ L新鮮LB培養(yǎng)基洗2次，轉(zhuǎn)移至TSA平板中央，28°C靜置培養(yǎng)24h進(jìn)行第一次同源重組。用PBS沖洗菌液并涂布含有氯霉素和粘菌素(12.5 μ g/mL，以下濃度同)的TSA平板，28 °C靜置培養(yǎng)48h后，用EvpC-up-for/EvpC-down-rev進(jìn)行菌落PCR以篩選正確的第一次同源重組子。將第一次正確同源重組的菌落接種至5mL新鮮LB培養(yǎng)基中，280C，振蕩培養(yǎng)48h，進(jìn)行2次同源重組后，涂布于含有粘菌素和含有10—20%蔗糖的TSA平板上，28°C靜置培養(yǎng)48h后，將同一單菌落分別劃線于含有粘菌素的TSA及含有氯霉素和粘菌素的TSA平板，選取在含有上述粘菌素的TSA平板上生長(zhǎng)但在上述含有氯霉素和粘菌素TSA平板上不生長(zhǎng)的菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)，PCR陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果中含有單一 F1-F2條帶的菌落即是E.tardaAEvpG菌株，該菌株于2013年8月21日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC N0.8061。
[0034]除以上方法外，也可采用其他的基因工程技術(shù)，通過(guò)SEQ ID N0:1和SEQ IDNO:2相同或相近的序列所編碼的基因功能喪失的部分或全部缺失、點(diǎn)突變、移位或插入的方式來(lái)構(gòu)建EvpC喪失功能的遲緩愛(ài)德華氏菌基因工程弱毒株及其衍生菌株。 [0035]實(shí)施例3:遲緩愛(ài)德華氏菌基因工程弱毒疫苗E.tardaAEvpC'EsrB菌株的構(gòu)建方法
[0036](I) EsrB基因上、下游核苷酸序列擴(kuò)增及連接
[0037]以遲緩愛(ài)德華氏菌1101菌株DNA為模板,用引物EsrB-up-for/EsrB-up-rev進(jìn)行EsrB基因上游片段F3(860bp)擴(kuò)增，所獲序列記為SEQ ID NO:3。用引物EsrB-down-for/EsrB-down-rev進(jìn)行EsrB基因下游片段F4 (765bp)擴(kuò)增,所獲序列記為SEQ ID NO:4。對(duì)SEQ ID NO:3和4進(jìn)行測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，結(jié)果表明以上兩序列具備了遲緩愛(ài)德華氏菌菌株1101的EsrB基因上、下游的序列特征。上述引物序列如下:
[0038]EsrB-up-for:AAGGTACCGGCGACAATCCCGATCTG
[0039]EsrB-up-rev:ATCCGTAATCTCTTGGCGGAGCTGAGCAACTGGG
[0040]EsrB-down-for:CAAGAGATTACGGATGCCATC
[0041]EsrB-down-rev:AAGGTACCGAAAGGCTCTCCGTTGA
[0042]以上述純化后的F3、F4為模板，用引物EsrB-up-for/EsrB-down-rev進(jìn)行OverlapPCR擴(kuò)增，所獲片段即為EsrB基因上、下游核苷酸連接序列F3-F4 (1625bp)。
[0043](2)重組自殺質(zhì)粒的構(gòu)建及電轉(zhuǎn)
[0044]參加實(shí)施例2的方法構(gòu)建重組自殺質(zhì)粒pRE112_DEsrB和含有該重組自殺質(zhì)粒的大腸桿菌SMlO菌株。
[0045](3)兩次同源重組構(gòu)建E.tardaΔΕνρεΔΕ3 Β菌株
[0046]用0D600值約為0.5左右的160 μ L含有pRE112_DEsrB質(zhì)粒的大腸桿菌SMlO(實(shí)施例3)和40 μ L遲緩愛(ài)德華氏菌Ε.tardaΔΕνρε的新鮮菌液，混勻，離心并用200 μ L新鮮LB培養(yǎng)基洗2次，轉(zhuǎn)移至TSA平板中央，28°C靜置培養(yǎng)24h進(jìn)行第一次同源重組。另參見(jiàn)實(shí)驗(yàn)例2中的方法進(jìn)行二次同源重組及篩選確認(rèn)，最終獲得E.tardaAEvpC'EsrB菌株，該菌株于2013年8月21日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC N0.8062。
[0047]除以上方法外，也可采用其他的基因工程技術(shù)，在已有EvpC喪失功能的遲緩愛(ài)德華氏菌基因工程弱毒株基礎(chǔ)上，通過(guò)SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4相同或相近的序列所編碼的基因功能喪失的部分或全部缺失、點(diǎn)突變、移位或插入的方式來(lái)構(gòu)建EvpC和EsrB基因喪失功能的遲緩愛(ài)德華氏菌基因工程弱毒株及其衍生菌株。
[0048]實(shí)施例4:遲緩愛(ài)德華氏菌基因工程弱毒疫苗E.tarda'EvpC'EsrB'PstB菌株構(gòu)建方法[0049]( I) PstB基因上、下游核苷酸序列擴(kuò)增及連接
[0050]以遲緩愛(ài)德華氏菌1101菌株DNA為模板,用引物PstB-up-for/PstB-up-rev進(jìn)行PstB基因上游片段F5(822bp)擴(kuò)增，所獲序列記為SEQ ID NO:5。用引物PstB-down-for/PstB-down-rev進(jìn)行PstB基因下游片段F6 (648bp)擴(kuò)增，所獲序列記為SEQ ID NO:6。對(duì)SEQ ID NO:5和6進(jìn)行測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，結(jié)果表明以上兩序列具備了遲緩愛(ài)德華氏菌菌株1101的PstB基因上、下游的序列特征。
[0051]上述引物序列如下:
[0052]PstB-up-for:5’AAGGTACCATCCTGCTATCCACCTTT3’
[0053]PstB-up-rev:5’AGGGGCGGTAAACAGGTTGGTCGGGTCTGTCAC3’
[0054]PstB-down-for:5’ CTGTTTACCGCCCCTGC3’
[0055]PstB-down-rev:5’AAGGTACCAATACGCTGGGAATGGT3’
[0056]以上述純化后的F5、F6為模板，用引物PstB-up-for/PstB-down-rev進(jìn)行OverlapPCR擴(kuò)增，所獲片段即為PstB基因上、下游核苷酸連接序列F5-F6 (1470bp)。
[0057](2)重組自殺質(zhì)粒的構(gòu)建及電轉(zhuǎn)
[0058]參加實(shí)施例2的方法構(gòu)建重組自殺質(zhì)粒pRE112_DPstB和含有該重組自殺質(zhì)粒的大腸桿菌SMlO菌株。
[0059](3)兩次同源重組構(gòu)建 E.tarda'EvpC'EsrB'PstB 菌株
[0060]用0D600值約為0.5左 右的160 μ L含有pRE112_DPstB質(zhì)粒的大腸桿菌SMlO和
40 μ L遲緩愛(ài)德華氏菌E.tardaΔΕνρεΔΕ31~Β的新鮮菌液，混勻，離心并用200 μ L新鮮LB培養(yǎng)基洗2次，轉(zhuǎn)移至TSA平板中央，28°C靜置培養(yǎng)24h進(jìn)行第一次同源重組。另參見(jiàn)實(shí)驗(yàn)例2中的方法進(jìn)行二次同源重組及篩選確認(rèn)，最終獲得E.tarda'EvpC'EsrB'PstB菌株，該菌株于2013年8月21日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCCN0.8063。
[0061]除以上方法外，也可采用其他的基因工程技術(shù)，在已有EvpC和EsrB基因喪失功能的遲緩愛(ài)德華氏菌基因工程弱毒株基礎(chǔ)上，通過(guò)SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6相同或相近的序列所編碼的基因功能喪失的部分或全部缺失、點(diǎn)突變、移位或插入的方式來(lái)構(gòu)建EvpC、EsrB和PstB基因喪失功能的遲緩愛(ài)德華氏菌基因工程弱毒株及其衍生菌株。
[0062]實(shí)施例5:遲緩愛(ài)德華氏菌基因工程弱毒疫苗E.tarda'EvpC'EsrB'Pstc菌株構(gòu)建方法
[0063](I)PstC基因上、下游核苷酸序列擴(kuò)增及連接
[0064]以遲緩愛(ài)德華氏菌1101菌株DNA為模板,用引物PstC-up-for/PstC-up-rev進(jìn)行PstC基因上游片段F7(332bp)擴(kuò)增，所獲序列記為SEQ ID NO:7。用引物PstC-down-for/PstC-down-rev進(jìn)行PstC基因下游片段F8 (657bp)擴(kuò)增，所獲序列記為SEQ ID NO:8。對(duì)SEQ ID NO:7和8進(jìn)行測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，結(jié)果表明以上兩序列具備了遲緩愛(ài)德華氏菌菌株1101的PstC基因上、下游的序列特征。
[0065]上述引物序列如下:
[0066]PstC-up-for:5’AAGGTACCAAGGACAGCGGCGGCAA3’
[0067]PstC-up-rev:5’ CTCAGCAAACTCATTGATAGGCACCAGCGCG3’
[0068]PstC-down-for:5’AATGAGTTTGCTGAGGCGGAGTC3’
[0069]PstC-down-rev:5’AAGGTACCGTGGTGCGGATAACG3’[0070]以上述純化后的F7、F8為模板,用引物PstC-up-for/PstC-down-rev進(jìn)行OverlapPCR擴(kuò)增，所獲片段即為PstC基因上、下游核苷酸連接序列F7-F8 (989bp)。
[0071](2)重組自殺質(zhì)粒的構(gòu)建及電轉(zhuǎn)
[0072]參加實(shí)施例2的方法構(gòu)建重組自殺質(zhì)粒pRE112_DPstC和含有該重組自殺質(zhì)粒的大腸桿菌SMlO菌株。[0073](3)兩次同源重組構(gòu)建 E.tarda'EvpC'EsrB'Pstc 菌株
[0074]用0D600值約為0.5左右的160 μ L含有pRE112_DPstC質(zhì)粒的大腸桿菌SMlO和
40 μ L遲緩愛(ài)德華氏菌E.tardaΔΕνρεΔΕ3Β的新鮮菌液，混勻，離心并用200 μ L新鮮LB培養(yǎng)基洗2次，轉(zhuǎn)移至TSA平板中央，28°C靜置培養(yǎng)24h進(jìn)行第一次同源重組。另參見(jiàn)實(shí)驗(yàn)例2中的方法進(jìn)行二次同源重組及篩選確認(rèn)，最終獲得E.tarda'EvpC'EsrB'Pstc菌株，該菌株于2013年8月21日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCCN0.8064。
[0075]除以上方法外，也可采用其他的基因工程技術(shù)，在已有EvpC和EsrB基因喪失功能的遲緩愛(ài)德華氏菌基因工程弱毒株基礎(chǔ)上，通過(guò)SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:8相同或相近的序列所編碼的基因功能喪失的部分或全部缺失、點(diǎn)突變、移位或插入的方式來(lái)構(gòu)建EvpC、EsrB和PstC基因喪失功能的遲緩愛(ài)德華氏菌基因工程弱毒株及其衍生菌株。
[0076]實(shí)施例6:遲緩愛(ài)德華氏菌E.tardaΔΕνρε菌株對(duì)斑馬魚(yú)半致死劑量(LD5tl)測(cè)定
[0077](I)遲緩愛(ài)德華氏菌Ε.tardaΔΕνρε菌株的培養(yǎng):將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的遲緩愛(ài)德華氏菌Ε.tardaΔΕνρε (約IX 105CFU/mL)以1:100的比例接種至TSB液體培養(yǎng)基中，28°C恒溫培養(yǎng)箱，180rpm振蕩培養(yǎng)5h，6000rpm，4°C離心IOmin收集菌體，以無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌菌體三次，并用PBS重懸菌體，制成I X 109CFU/mL菌懸液。
[0078](2)試驗(yàn)魚(yú)飼養(yǎng)及管理:選用健康斑馬魚(yú)(0.29±0.07g),置于斑馬魚(yú)養(yǎng)殖設(shè)備(上海海圣水族設(shè)備廠)中，水溫為(28± I) °C。每日燈光照明12h。試驗(yàn)期間按魚(yú)體重3%投喂配合飼料日投喂2次，定期對(duì)濾網(wǎng)進(jìn)行清洗消毒，試驗(yàn)前暫養(yǎng)2周。斑馬魚(yú)注射前用MS222 (1:10000稀釋)進(jìn)行浸泡麻醉處理。
[0079](3)試驗(yàn)分組:將新鮮培養(yǎng)的菌液(IX 109cells/mL)用PBS (pH7.2) 10倍系列稀釋?zhuān)譃?組，另設(shè)一組只注射PBS作為對(duì)照。每組15尾，置于IOL槽內(nèi)。MS222進(jìn)行麻醉后，分別注射 10 μ L 的 IO8、ΙΟ7、ΙΟ6、ΙΟ5、ΙΟ4、103、102CFU/mL 及 PBS (ρΗ7.2)，實(shí)驗(yàn)重復(fù) 2 次。
實(shí)驗(yàn)觀察2周，每日記錄死亡魚(yú)數(shù)。
[0080](4)統(tǒng)計(jì)與分析:實(shí)驗(yàn)觀察14天，各組斑馬魚(yú)死亡數(shù)見(jiàn)表1，注射PBS的對(duì)照組中斑馬魚(yú)無(wú)死亡。實(shí)驗(yàn)中對(duì)各組中瀕死魚(yú)隨機(jī)取I一3尾，浸泡于MS222( 1:5000)過(guò)量麻醉致死后,加入適量TSB勻衆(zhòng)后涂布EIM培養(yǎng)基(Edwardsiella Ictaluri Medium,北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司定制)，28°C培養(yǎng)48h，參照Pressley等(2005)的方法進(jìn)行斑馬魚(yú)感染遲緩愛(ài)德華氏菌致死認(rèn)定。遲緩愛(ài)德華氏菌菌株對(duì)斑馬魚(yú)的LD5tl的計(jì)算方法采用Reed-Muench法。
[0081]表1.遲緩愛(ài)德華氏菌1101和E.tardaΛΕνρε菌株對(duì)斑馬魚(yú)LD5tl實(shí)驗(yàn)死亡魚(yú)記錄表
[0082]
【權(quán)利要求】
1.遲緩愛(ài)德華氏菌基因工程弱毒株及其應(yīng)用，其特征是遲緩愛(ài)德華氏菌的VI型分泌系統(tǒng)毒力蛋白基因EvpC喪失功能的菌株(E.包括此菌株的衍生菌株。
2.如權(quán)利要求1所述的遲緩愛(ài)德華氏菌基因工程弱毒株，其特征在于該弱毒株與野生遲緩愛(ài)德華氏菌1101株或其他強(qiáng)毒株相比，存在引起EvpC基因功能喪失的部分或全部缺失、點(diǎn)突變、移位或插入，即存在引起與SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2相同或相近的序列所編碼的基因功能喪失的部分或全部缺失、點(diǎn)突變、移位或插入。
3.如權(quán)利要求1所述的遲緩愛(ài)德華氏菌基因工程弱毒株，其特征在于所述的E.tardaAEvpC的毒力不超過(guò)野生遲緩愛(ài)德華氏菌1101株或其他強(qiáng)毒株的1/40，其對(duì)魚(yú)的半致死量至少需要I X 105cfu/g (菌落形成單位/魚(yú)體重)。
4.如權(quán)利要求1所述的遲緩愛(ài)德華氏菌基因工程弱毒株，其特征在于E.tardaAEvpe株III型分泌系統(tǒng)的調(diào)節(jié)蛋白基因EsrB喪失功能的菌株(E.tarda—Mw株)，包括此菌株的衍生菌株。
5.如權(quán)利要求4所述的遲緩愛(ài)德華氏菌基因工程弱毒株，其特征在于所述的E.tardaΔEvpGΔEslB株存在引起E.tarda"EvpG株的EsrB基因功能喪失的部分或全部缺失、點(diǎn)突變、移位或插入，即存在引起除了與SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2相同或相近的序列之外，還有與SEQ ID NO:3和SEQ ID N0:4相同或相近的序列所編碼的基因功能喪失的部分或全部缺失、點(diǎn)突變、移位或插入。
6.如權(quán)利要求4所述的遲緩愛(ài)德華氏菌基因工程弱毒株，其特征在于所述的E.tardaAEvpMEslrB毒力不超過(guò)野生遲緩愛(ài)德華氏菌1101株或其他強(qiáng)毒株的1/400，其對(duì)魚(yú)的半致死量至少需要lX106cfu/g (菌落形成單位/魚(yú)體重)。
7.如權(quán)利要求4所述的遲緩愛(ài)德華氏菌基因工程弱毒株，其特征在于在E.tar da Δ EvpG Δ EsrB株的PST操縱子系統(tǒng)基因Ps tB喪失功能的菌株(Ε.tar da Δ EvpC Δ EsrB Δ PstB株)，包括此菌株的衍生菌株。
8.如權(quán)利要求7所述的遲緩愛(ài)德華氏菌基因工程弱毒株，其特征在于所述的E.tarda'EvpC'EsrB'PstB株存在引起E.tardaΔΕνρΕΔΕ3rΒ株的PstB基因功能喪失的部分或全部缺失、點(diǎn)突變、移位或插入，即存在引起除了與SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2,SEQ ID ΝΟ:3和SEQID Ν0:4相同或相近的序列之外，還有與SEQ ID ΝΟ:5和SEQ ID ΝΟ:6相同或相近的序列所編碼的基因功能喪失的部分或全部缺失、點(diǎn)突變、移位或插入。
9.如權(quán)利要求7所述的遲緩愛(ài)德華氏菌基因工程弱毒株，其特征在于所述的Ε.tarda"E—PstB株毒力不超過(guò)野生遲緩愛(ài)德華氏菌1101株或其他強(qiáng)毒株的1/4000，其對(duì)魚(yú)的半致死量至少需要lX108cfu/g (菌落形成單位/魚(yú)體重)。
10.如權(quán)利要求4所述的遲緩愛(ài)德華氏菌基因工程弱毒株，其特征在于在E.tar da Δ EvpG Δ EsrB株的PST操縱子系統(tǒng)基因Ps tC喪失功能的菌株(E.tar da Δ EvpC Δ EsrB Δ Pstc株)，包括此菌株的衍生菌株。
11.如權(quán)利要求10所述的遲緩愛(ài)德華氏菌基因工程弱毒株，其特征在于所述的E.tarda'EvpC'EsrB'Pstc株存在引起E.tardaΔΕνρΕΔΕ3rΒ株的PstC基因功能喪失的部分或全部缺失、點(diǎn)突變、移位或插入，即存在引起除了與SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2,SEQ ID ΝΟ:3和SEQID Ν0:4相同或相近的序列之外，還有與SEQ ID ΝΟ:7和SEQ ID ΝΟ:8相同或相近的序列所編碼的基因功能喪失的部分或全部缺失、點(diǎn)突變、移位或插入。
12.如權(quán)利要求10所述的遲緩愛(ài)德華氏菌基因工程弱毒株，其特征在于所述的E.tarda"E—PstG株毒力不超過(guò)野生遲緩愛(ài)德華氏菌1101株或其他強(qiáng)毒株的1/4000，其對(duì)魚(yú)的半致死劑量(LD5tl)至少需要lX108cfu/g (菌落形成單位/魚(yú)體重)。
13.如權(quán)利要求1所述的遲緩愛(ài)德華氏菌基因工程弱毒株的應(yīng)用，其特征在于上述遲緩愛(ài)德華氏菌弱毒株可作為疫苗菌株、基因工程菌株、有益菌株等應(yīng)用。
14.如權(quán)利要求13所述的遲緩愛(ài)德華氏菌基因工程弱毒株的應(yīng)用，其特征在于該弱毒株作為的疫苗菌株的應(yīng)用，可以是使用該弱毒株的活菌，也可以使用該弱毒株的滅活菌、菌蛻成分、部分抗原；可以制備源于該弱毒株的單一疫苗，可以制備該菌株與源于其他病原的聯(lián)合疫苗，也可以將制備的單一或聯(lián)合疫苗再添加佐劑生產(chǎn)疫苗產(chǎn)品，還可以是將弱毒株作為表達(dá)外源抗原的活菌載體的疫苗應(yīng)用。
15.如權(quán)利要求14所述的遲緩愛(ài)德華氏菌基因工程弱毒株的應(yīng)用，其特征在于所生產(chǎn)的疫苗可采用浸泡免疫、口服免疫、創(chuàng)傷免疫和注射免疫等免疫接種方式。
16.如權(quán)利要求14所述的遲緩愛(ài)德華氏菌基因工程弱毒株的應(yīng)用，其特征在于注射免疫接種時(shí)，可采用腹腔或肌肉注射兩種方式，使用的劑量為IO4 — 107cfu/g(菌落形成單位/魚(yú)體重)；創(chuàng)傷免疫或浸浴免疫接種時(shí)，浸泡水體中活疫苗的濃度為IO6 — 109cfu/mL(菌落形成單位/浸泡體積)，浸泡時(shí)間2min — 12h ； 口服免疫接種時(shí)，配合飼料中活疫苗的添加劑量為IO6 — 109cfu/g(菌落形成單位/飼料重量)，連續(xù)投喂2— 7天。
17.如權(quán)利要求14所述的遲緩愛(ài)德華氏菌基因工程弱毒株的應(yīng)用，其特征在于免疫接種的對(duì)象包括海水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)、半咸水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)、洄游魚(yú)類(lèi)、淡水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)、觀賞魚(yú)類(lèi)和淡水養(yǎng)殖的兩棲類(lèi)和爬行類(lèi)，用于預(yù)防經(jīng)免疫接種的水生動(dòng)物發(fā)生愛(ài)德華氏菌病。
18.如權(quán)利要求13所述的遲緩愛(ài)德華氏菌基因工程弱毒株的應(yīng)用，其特征在于該弱毒株可以作為基因工程菌株的應(yīng)用，可以在質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、噬粒轉(zhuǎn)染、外源基因整合、DNA疫苗等方面所需的基因工程菌株，在克隆特定的核酸序列，表達(dá)特定基因編碼的外源蛋白、多肽，轉(zhuǎn)錄特定基因編碼的單鏈或雙鏈RNA等方面獲得應(yīng)用。
19.如權(quán)利要求13所述的遲緩愛(ài)德華氏菌基因工程弱毒株的應(yīng)用，其特征在于該弱毒株作為有益菌株的應(yīng)用，可以作為陸生動(dòng)物或水生動(dòng)物腸道、體表定植或體內(nèi)暫存的益生菌，用于刺激動(dòng)物非特異性免疫力的提高或抑制致病微生物的存在與繁殖。
【文檔編號(hào)】A61P37/04GK103667145SQ201310674468
【公開(kāi)日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年12月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月11日
【發(fā)明者】黃倢, 謝國(guó)駟, 莫照蘭, 王秀華, 許華, 張慶利, 隋虎辰, 楊春志, 李晨 申請(qǐng)人:中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所