調(diào)節(jié)性t細(xì)胞表位、組合物及其用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及T細(xì)胞表位，其中所述表位包含的肽或多肽鏈包含至少一部分免疫球蛋白恒定或可變區(qū)。本發(fā)明還涉及使用本發(fā)明表位的方法以及制備本發(fā)明表位的方法。
【專利說明】調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表位、組合物及其用途
[0001]本申請(qǐng)為分案申請(qǐng)，原申請(qǐng)的申請(qǐng)日為2008年I月29日，申請(qǐng)?zhí)枮?00880011016.5，發(fā)明名稱為“調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表位、組合物及其用途”。
發(fā)明領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明廣泛涉及新穎種類的T細(xì)胞表位組合物(稱作“Tregitopes”)。本發(fā)明提供Tregitope組合物、其制備方法和用途。
[0003]發(fā)明背景
[0004]人工誘導(dǎo)對(duì)自身或外源抗原的耐受是治療自身免疫、移植變態(tài)反應(yīng)和其他疾病的目標(biāo)，并且在用自體蛋白和非-自體蛋白的療法中也是需要的。直至最近，治療性耐受誘導(dǎo)依賴于可引起細(xì)胞排除(cell depletion)和細(xì)胞因子特性改變的基礎(chǔ)廣泛的方法。這些基礎(chǔ)廣泛的方法一般會(huì)減弱免疫系統(tǒng)并使許多受試者易于患機(jī)會(huì)感染、自身免疫攻擊和癌癥。本領(lǐng)域需要侵襲性較低并且更具靶向性的方法誘導(dǎo)免疫耐受。
[0005]免疫耐受由T細(xì)胞、B細(xì)胞、細(xì)胞因子和表面受體之間的復(fù)雜相互作用調(diào)節(jié)。最早的自我/非我辨別發(fā)生在新生兒發(fā)育過程中的胸腺，其髓質(zhì)上皮細(xì)胞表達(dá)對(duì)未成熟T細(xì)胞的特異自身蛋白表位。以高親和性識(shí)別自身抗原的T細(xì)胞被清除，但是具有中等親和性的自身反應(yīng)性T細(xì)胞可免于被清除并且可轉(zhuǎn)化成所謂的“天然”調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(TK6g)。這些天然Tlteg細(xì)胞被運(yùn)輸至外周并提供對(duì)自身免疫的長久抑制。
[0006]第二種形式的耐受發(fā)生在外周，其中成熟T細(xì)胞在IL-10和TGF-P存在下經(jīng)它們的T細(xì)胞受體活化轉(zhuǎn)化成“適應(yīng)性”Tlteg表型。這些適應(yīng)性Tlteg細(xì)胞的可能作用包括成功清除入侵病原體后緩沖免疫應(yīng)答作為控制變態(tài)反應(yīng)或低水平慢性感染可能引起的過度炎癥反應(yīng)的方法，或可能輔助有益的`共生細(xì)菌和病毒的共存?！斑m應(yīng)性”Tlteg也可在控制經(jīng)歷了體細(xì)胞超突變的人抗體的生存周期中發(fā)揮作用。
[0007]天然調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是外周免疫調(diào)節(jié)的重要組分。經(jīng)它們的TCR活化后，天然Tregs可經(jīng)接觸依賴型和非依賴型機(jī)制抑制對(duì)不相關(guān)抗原的旁觀者效應(yīng)T細(xì)胞應(yīng)答。此外這些細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子包括IL-l(^PTGF-0可誘導(dǎo)抗原特異性適應(yīng)性Tregs。盡管已做出了大量努力，除少數(shù)例外，天然Tregs并且更重要的在具有臨床意義的體積中循環(huán)的天然Tregs的特異性仍是未知。
[0008]本領(lǐng)域需要鑒別包含在普通自體蛋白例如IgG( “Tregitopes”)中的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表位以及與它們制備相關(guān)的方法和用途。
[0009]概述
[0010]本發(fā)明利用調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(TKeg)尤其是已在外周調(diào)節(jié)對(duì)外源和自身蛋白的免疫應(yīng)答的那些細(xì)胞(預(yù)存或天然Tlteg)的功能。在一方面本發(fā)明提供T-細(xì)胞表位多肽組合物。
[0011]通過使用Tregitopes和Tregitope-抗原融合物選擇性黏附和活化預(yù)存天然TKeg作為治療以不想要的免疫應(yīng)答存在為標(biāo)志的任何疾病或癥狀的手段具有治療價(jià)值。實(shí)例包括以下:自身免疫疾病例如I型糖尿病、MS、狼瘡和RA ;移植相關(guān)病癥例如移植物抗宿主疾病(GVHD);變態(tài)反應(yīng)；生物藥物例如單克隆抗體，替代蛋白例如FVIII或胰島素，治療性毒素例如肉毒桿菌毒素的應(yīng)用引起的免疫排斥；以及對(duì)急性或慢性傳染病免疫應(yīng)答的控制。
[0012]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及T-細(xì)胞表位多肽組合物，其包括至少一種選自SEQ ID NOS:4-58的多肽。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包括本發(fā)明多肽和藥學(xué)可接受載體的藥用組合物。
[0013]在一個(gè)實(shí)施方案中本發(fā)明涉及編碼至少一種選自SEQ ID NOS:4_58的T-細(xì)胞表位多肽的核酸。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包括本發(fā)明核酸的載體。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包括本發(fā)明載體的細(xì)胞。
[0014]在一個(gè)實(shí)施方案中本發(fā)明涉及治療或預(yù)防有需要的受試者中醫(yī)學(xué)病癥的方法，其包括給予治療有效量的選自SEQ ID NOS:4-58的T-細(xì)胞表位多肽。在具體的實(shí)施方案中，該醫(yī)學(xué)病癥選自:變態(tài)反應(yīng)、自身免疫疾病、移植相關(guān)疾病、移植物抗宿主疾病、酶或蛋白質(zhì)缺乏癥、凝血障礙、癌癥、不育；以及病毒、細(xì)菌或寄生蟲感染。
[0015]在一個(gè)實(shí)施方案中本發(fā)明涉及預(yù)防或治療受試者醫(yī)學(xué)病癥的試劑盒，其中該試劑盒包括至少一種選自SEQ ID NOS:4-58的T-細(xì)胞表位多肽。
[0016]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及擴(kuò)增調(diào)節(jié)性T細(xì)胞群的方法，其包括:(a)提供受試者的生物樣品；(b)從生物樣品中分離調(diào)節(jié)性T-細(xì)胞；以及將分離的調(diào)節(jié)性T-細(xì)胞與有效量的本發(fā)明Tregitope組合物在T-調(diào)節(jié)性細(xì)胞數(shù)量增加形成擴(kuò)增的調(diào)節(jié)性T-細(xì)胞組合物的條件下接觸，藉此擴(kuò)增生物樣品中的調(diào)節(jié)性T-細(xì)胞。
[0017]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及刺激生物樣品中調(diào)節(jié)性T-細(xì)胞的方法，其包括:(a)提供受試者的生物樣品；(b)從生物樣品中分離調(diào)節(jié)性T-細(xì)胞；以及將分離的調(diào)節(jié)性T-細(xì)胞與有效量的本發(fā)明Tregitope組合物在T-調(diào)節(jié)性細(xì)胞被刺激以改變一種或多種生物學(xué)功能的條件下接觸，藉此刺激生物樣品中的調(diào)節(jié)性T-細(xì)胞。
[0018]在一個(gè)實(shí)施方案中本發(fā)明涉及抑制受試者中免疫應(yīng)答的方法，其包括給予受試者包括治療有效量的包括Tregitope的`肽的組合物,其中該肽抑制免疫應(yīng)答。在具體的實(shí)施方案中，該肽抑制效應(yīng)T細(xì)胞應(yīng)答。在具體的實(shí)施方案中，該肽抑制輔助T細(xì)胞應(yīng)答。在另一實(shí)施方案中，該肽抑制B細(xì)胞應(yīng)答。
[0019]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及通過給予治療有效量的包括一種或多種Tregitopes的組合物抑制受試者中抗原特異性免疫應(yīng)答的方法，其中一種或多種Tregitopes與特異目標(biāo)抗原或共價(jià)結(jié)合、或非共價(jià)結(jié)合或混合，引起對(duì)該目標(biāo)抗原的免疫應(yīng)答降低。在具體的實(shí)施方案中，抑制作用由天然Treg介導(dǎo)。在另一實(shí)施方案中，該抑制作用由適應(yīng)性Treg介導(dǎo)。在另一實(shí)施方案中，該肽抑制效應(yīng)T細(xì)胞應(yīng)答。在另一實(shí)施方案中，該肽抑制輔助T細(xì)胞應(yīng)答。在另一實(shí)施方案中，該肽抑制B細(xì)胞應(yīng)答。在具體的實(shí)施方案中，該肽包括選自SEQ ID NOS:4-58的序列。
[0020]在一個(gè)實(shí)施方案中。本發(fā)明涉及增強(qiáng)疫苗遞送載體免疫原性的方法，其包括鑒別和去除調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表位。在具體的實(shí)施方案中該T細(xì)胞表位選自SEQ ID N0S:4-58。
[0021]附圖簡(jiǎn)述
[0022]圖1為免疫球蛋白G(IgG)的示意圖。
[0023]圖2為比較加帽和不加帽肽的一系列圖解表示。用單獨(dú)(上圖)的CEF(陽性對(duì)照肽庫)、CEF+Tregitope289_酰胺(中圖)或CEF+Tregitope-289-不加帽(下圖)在培養(yǎng)基中刺激PBMC8天。與單獨(dú)CEF溫育相比，CEF與Tregitope-289-酰胺共溫育I)得到更高的具有調(diào)節(jié)性表型的細(xì)胞百分比(左圖)和2)導(dǎo)致響應(yīng)CEF再刺激的Y干擾素分泌的相關(guān)顯著性(P〈0.0005)降低(右圖)。相反，與單獨(dú)CEF溫育(上圖)相比，與Tregit0pe289-不加帽(下圖)共溫育未引起顯著性差異。
[0024]圖3顯示了 Tregitope存在下天然Tregs的活化。在破傷風(fēng)毒素肽(TT83ch844)、Tregitope或無刺激物存在下體外直接刺激人PBMCs四天。用抗-⑶4和抗-⑶25胞外染色細(xì)胞并接著用FoxP3胞內(nèi)染色，用流式細(xì)胞儀分析。與TT83ch844 (745個(gè)細(xì)胞的12.5% )或無刺激物相比(497個(gè)細(xì)胞的19.5% )，用Tregitope溫育增加了 CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞的百分比(644個(gè)細(xì)胞的53.6% )0
[0025]圖4為顯示Tregitope誘導(dǎo)T-調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子和趨化因子上調(diào)和T-效應(yīng)細(xì)胞因子和趨化因子下調(diào)的一系列柱形圖。用a)衍生自C3d蛋白的免疫原性肽庫(黑色柱形)；b)C3d肽+Tregitope-167 (淺灰色柱形)或c)C3d肽+Tregitopel34 (中度灰色柱形)初始刺激后對(duì)C3d再刺激的應(yīng)答。第二次溫育中，應(yīng)答顯示為高于背景的倍數(shù)增加，其中背景為無刺激物(對(duì)照)。以Pg / ml表示的各自的基線(背景)值在X-軸標(biāo)注中指出。IL-4、TNF a或TGF P I水平?jīng)]有顯著性差異。
[0026]圖5為顯示用a)衍生自C3d蛋白的免疫原性肽庫(黑色柱形)或b)C3d肽+Tregitope-167 (淺灰色柱形)初始刺激后對(duì)C3d肽再刺激的應(yīng)答的一系列柱形圖。第二次溫育中，應(yīng)答顯示為高于背景的倍數(shù)增加，其中背景為無刺激物(對(duì)照)。對(duì)于各細(xì)胞因子，基線(無刺激物，背景)值顯示于X-軸標(biāo)注中。
[0027]圖6為顯示用衍生自TSHR的表位協(xié)同刺激的柱形圖，TSHR為格雷夫斯病的靶抗原，抑制對(duì)格雷夫斯病患者PBMC表位的免疫應(yīng)答。來自格雷夫斯病患者的PBMC首先與I)單獨(dú) TSHR 妝庫或 2) TSHR 妝庫和 Tregitope-134、Tregitope-167 和 Tregitope-289 庫溫育8天。然后收獲細(xì)胞、洗滌并與I)單個(gè)的TSHR肽和Tregitope庫或2) TSHR肽庫和Tregitope庫溫育(在所描述的IL_4ELISpot板中)。也有“無刺激物”的對(duì)照板。相對(duì)于未用抗原再刺激顯示應(yīng)答。黑色柱形對(duì)應(yīng)于單獨(dú)用抗原的溫育和再刺激，灰色柱形對(duì)應(yīng)于用抗原+Tregitope庫的溫育和再刺激。在本實(shí)驗(yàn)中Tregitope共溫育將對(duì)單獨(dú)TSHR肽的應(yīng)答抑制了 35%至67%并將對(duì)TSHR肽庫的應(yīng)答抑制了 65%。顯示成對(duì)比較的P值。
[0028]圖 7 為顯示與以下:單獨(dú)的 CEF、CEF 十 Tregitope-289、CEF+Tregitope294、CEF+Tregitope-029>CEF+Tregitope-074 或 CEF+Tregitope-009 之一溫育八天后三個(gè)受試者對(duì)商業(yè)購買的陽性對(duì)照肽(CEF)庫的平均應(yīng)答的柱形圖。對(duì)CEF的應(yīng)答被抑制了 29%至48%，取決于所使用的單個(gè)Tregitope。對(duì)CEF(在之前與單獨(dú)的CEF溫育的樣品中)的基線應(yīng)答高于背景范圍為1404至10139IFN- y SFC /百萬PBMC (背景為無刺激物)。顯示成對(duì)比較的P值。
[0029]圖8為顯示與Tregitope共溫育抑制對(duì)衍生自肉毒桿菌神經(jīng)毒素肽表位的免疫應(yīng)答的柱形圖。取有證據(jù)證明存在抗-BoNT / A抗體的受試者的外周血。PBMC首先與單獨(dú)的 BoNT / A 妝庫或 BoNT / A 妝庫+Tregitopes (Tregitope-134、Tregitope-167 和Tregitope-289)庫溫育八天。接著收集細(xì)胞、洗漆并接著與一式三份的單個(gè)BoNT / A肽或一式三份的BoNT / A肽庫溫育(在IFN- y ELISpot板中)。相對(duì)于未用抗原的再刺激顯示應(yīng)答。黑色柱形對(duì)應(yīng)于與單獨(dú)抗原的溫育，灰色柱形對(duì)應(yīng)于與抗原+Tregitopes庫的溫育。對(duì)BoNT / A的應(yīng)答被抑制了 26%至73% J^BoNT / A肽庫的應(yīng)答被抑制了 59%。顯示成對(duì)比較的P值。
[0030]圖9為顯示Tregitope-289和Tregitope-134響應(yīng)體外聯(lián)合給藥免疫顯性抗原下調(diào)增殖的一系列圖形。PMBC分離自血庫供體并用單獨(dú)的CEF、CEF+Tregitope-134或CEF+Tregitope-289刺激八天。與兩種Tregitopes之一共溫育導(dǎo)致對(duì)CEF的應(yīng)答降低(如IFN-yELISA測(cè)定(左圖))和增殖降低(如CFSE熒光測(cè)定(右圖))(灰色陰影指抗原-Tregitope共溫育抑制的應(yīng)答；黑色指與單獨(dú)的抗原溫育后的基線應(yīng)答)。
[0031]圖10為顯示對(duì)牛痘苗肽應(yīng)答的曲線圖。PMBC分離自血庫供體并用單獨(dú)的CEF、CEF+Tregitope-134 或 CEF+Tregitope-289 刺激八天。與兩種 Tregitopes 之一共溫育導(dǎo)致對(duì)CEF的應(yīng)答降低(如IFN- Y ELISA測(cè)定(左圖))和增殖降低(如CFSE熒光測(cè)定(右圖))?；疑幱爸缚乖?Tregitope共溫育抑制的應(yīng)答；黑色指與單獨(dú)的抗原溫育后的基線應(yīng)答。
[0032]圖11為顯示Tregitope抑制由具有調(diào)節(jié)性表型的細(xì)胞介導(dǎo)的一系列圖形。Tregitope抑制依賴于⑶4+⑶25Hi T細(xì)胞。左圖:用抗-⑶4和抗-⑶25抗體染色來自過敏個(gè)體的PBMC并用流式細(xì)胞儀分析。從剩余的PBMC中排除⑶4+⑶25Hi亞群(框(gate))。中圖:用含有或不含Tregitope-289的HDM裂解物協(xié)同刺激排除和未排除⑶4+⑶25Hi的PBMC。排除CD4+CD25Hi的PBMC對(duì)IFN-Y的抑制低于未排除PBMC。右圖:HDM裂解物和Tregitope-289共溫育導(dǎo)致響應(yīng)HDM裂解物刺激的⑶4+細(xì)胞增殖降低。
[0033]圖12為顯示與IL-1O分泌相關(guān)的TReg(⑶4 /⑶25Hi)擴(kuò)增的曲線圖和圖形。與Tregitope-289和HDM共溫育后⑶4 /⑶25Hi T細(xì)胞的擴(kuò)增；和用單獨(dú)HDM再刺激后共溫育細(xì)胞分泌的IL-1O的量。用Tregitope-167共溫育的結(jié)果相似:⑶4 /⑶25hi細(xì)胞從
1.67%增加至7.5%以及IL-1O分泌增加五倍。
[0034]圖13為顯示Tregitope 共溫育引起抗原特異性變應(yīng)性Th2應(yīng)答抑制的一系列圖形和曲線。與Tregitope和Bet vll41_155變應(yīng)原共培養(yǎng)導(dǎo)致從Th2效應(yīng)細(xì)胞至Thl /TKeg的轉(zhuǎn)變。用含有或不含Tregitope-167的Bet vll41_155肽協(xié)同刺激來自三名對(duì)白樺樹花粉過敏的受試者的PBMC。十天的Tregitope協(xié)同刺激引起B(yǎng)et vll44_155四聚體陽性⑶4+細(xì)胞產(chǎn)生的IL-5分泌的降低(左下圖)和Th2_相關(guān)表面標(biāo)記(上圖)的降低。延時(shí)培養(yǎng)(30天，右下圖)引起B(yǎng)et V1144-155-特異細(xì)胞中從Th2(IL-5)至Thl (IFNi)的顯著轉(zhuǎn)變。
[0035]圖14為顯示Tregitope聯(lián)合給藥引起對(duì)體內(nèi)聯(lián)合給予的蛋白質(zhì)藥物的效應(yīng)細(xì)胞應(yīng)答(effector response)抑制的圖形。單獨(dú)ANTIGEN-XX(見實(shí)施例5A)免疫(黑色柱形)激起IL-4 (左邊成對(duì)的柱形，左軸)和抗-ANTIGEN-XX抗體滴度(右邊成對(duì)的柱形，右軸)二者的強(qiáng)烈應(yīng)答。當(dāng)聯(lián)合給予ANTIGEN-XX與Tregitope-167和Tregitope-106的鼠同源物時(shí)這些應(yīng)答均減半(灰色柱形)。在假免疫的動(dòng)物中對(duì)ANTIGEN-XX的應(yīng)答如預(yù)期為陰性?？贵w的應(yīng)答(右邊成對(duì)的柱形)和IL-4ELISpot (左邊成對(duì)的柱形)相關(guān)聯(lián)。
[0036]圖15的圖形顯示了對(duì)屋塵螨裂解物(HDML)和塵螨抗原的IL_4和抗體應(yīng)答。HDML免疫(黑色柱形)激起IL-4(左邊成對(duì)的柱形，左軸)和抗HDM抗原抗體滴度(右邊成對(duì)的柱形，右軸)二者的強(qiáng)烈應(yīng)答。當(dāng)聯(lián)合給予HDML與Tregitope-289的鼠同源物時(shí)這些應(yīng)答均減半。在假免疫動(dòng)物中對(duì)HDML的應(yīng)答如預(yù)期為陰性?？贵w的應(yīng)答(右邊成對(duì)的柱形)和IL-4ELISpot (左邊成對(duì)的柱形)相關(guān)聯(lián)。這些圖形顯示DM未免疫小鼠中38%的體內(nèi)抑制和預(yù)致敏小鼠中為84%。參見實(shí)施例5B。
[0037]圖16為顯示Tregitope聯(lián)合給予對(duì)免疫原性肽藥物(“ IPT” )的T效應(yīng)細(xì)胞應(yīng)答體內(nèi)抑制的柱形圖。每日三次皮下給予HLADR4Tg小鼠單獨(dú)IPT或IPT+鼠FC或IPT+Tregitope-289(鼠同源物)。最后一次劑量后一周，處死小鼠并在48hrIL-4ELISpot測(cè)定中用免疫原性肽藥物刺激脾細(xì)胞。聯(lián)合給予免疫原性蛋白質(zhì)藥物和Fe或Tregitope-289導(dǎo)致IL-4斑點(diǎn)形成細(xì)胞的顯著減少。參見實(shí)施例5C。
[0038]發(fā)明詳述
[0039]綜述
[0040]當(dāng)可溶性蛋白質(zhì)抗原被抗原遞呈細(xì)胞(APCs)攝取并經(jīng)II類抗原遞呈途徑加工時(shí)適應(yīng)性免疫級(jí)聯(lián)開始。II類遞呈途徑中的蛋白質(zhì)抗原被存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的各種蛋白酶降解。一些形成的蛋白質(zhì)片段與MHC II類分子結(jié)合。荷載肽的MHC分子被運(yùn)輸至細(xì)胞表面，在那里被CD4+T細(xì)胞識(shí)別?？山Y(jié)合至MHC分子并介導(dǎo)APC和循環(huán)T細(xì)胞之間細(xì)胞-細(xì)胞相互作用的肽片段被稱作T細(xì)胞表位。⑶4+T細(xì)胞對(duì)這些肽-MHC復(fù)合物的識(shí)別根據(jù)應(yīng)答T細(xì)胞的表型和局部的細(xì)胞因子/趨化因子環(huán)境可引起免疫活化或免疫抑制應(yīng)答。一般而言，MHC /肽復(fù)合物和T效應(yīng)細(xì)胞的T細(xì)胞受體(TCR)之間的黏附導(dǎo)致促炎性細(xì)胞因子例如IL-4和IFN-y的活化和分泌。另一方面天然T調(diào)節(jié)性細(xì)胞(TReg)的活化導(dǎo)致免疫抑制細(xì)胞因子中 IL-1O 和 TGF-β 的表達(dá)(Shevach，E.,Nat.Rev.1mmunol.，2:389-400,2002)。這些細(xì)胞因子直接作用于附近的效應(yīng)T細(xì)胞在一些情況下引起無反應(yīng)性或凋亡。在其他情況下調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子和趨化因子將效應(yīng)T細(xì)胞轉(zhuǎn)換成T調(diào)節(jié)性表型；這一過程在本文中稱作“誘導(dǎo)性”或“適應(yīng)性”耐受?？山Y(jié)合至MHC分子并黏附和活化循環(huán)Treg的T細(xì)胞表位稱作Tregitopes0
[0041]最早的自我/非我辨別發(fā)生在新生兒發(fā)育過程中的胸腺，其髓質(zhì)上皮細(xì)胞表達(dá)對(duì)未成熟T細(xì)胞的特異自身蛋白表位。以高親和性識(shí)別自身抗原的T細(xì)胞被清除但是具有中等親和性的自身反應(yīng)性T細(xì)胞可免于被清除并且可轉(zhuǎn)化成所謂的“天然”調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Τ_)。這些天然Tlteg細(xì)胞被運(yùn)輸至外周并提供對(duì)自身免疫的長久抑制。天然調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是免疫調(diào)節(jié)和自身耐受的重要組分。
[0042]自身耐受由T細(xì)胞、B細(xì)胞、細(xì)胞因子和表面受體之間的復(fù)雜相互作用調(diào)節(jié)。T調(diào)節(jié)性免疫應(yīng)答平衡對(duì)蛋白質(zhì)抗原(不論自身的或外源的)的T效應(yīng)細(xì)胞免疫應(yīng)答。通過增加自身反應(yīng)性T效應(yīng)細(xì)胞的數(shù)量功能或通過減少T調(diào)節(jié)性細(xì)胞的數(shù)量或功能使該平衡向自身反應(yīng)性一邊的傾斜表現(xiàn)為自身免疫。
[0043]第二種形式的耐受發(fā)生在外周，其中成熟T細(xì)胞在IL-10和TGF-β (通常由旁觀者T調(diào)節(jié)性細(xì)胞提供)存在下經(jīng)它們的T細(xì)胞受體活化轉(zhuǎn)化成“適應(yīng)性”Tlteg表型。這些適應(yīng)性Tlteg細(xì)胞的可能作用包括成功清除入侵病原體后緩沖免疫應(yīng)答作為控制變態(tài)反應(yīng)或低水平慢性感染可能引起的過度炎癥反應(yīng)的手段，或可能輔助有益的共生細(xì)菌和病毒的共存。“適應(yīng)性”Tlteg也可在控制經(jīng)歷了體細(xì)胞超突變的人抗體的生存周期中發(fā)揮作用。
[0044]據(jù)信免疫球蛋白的恒定區(qū)包含數(shù)種重要的Tregitopes，其主要功能是抑制對(duì)超突變⑶Rs的免疫應(yīng)答。由于循環(huán)IgG的高容量，可能也存在對(duì)應(yīng)于包含于IgG的Tregitopes的高容量T調(diào)節(jié)性細(xì)胞。這一推斷的部分證據(jù)認(rèn)為包括免疫球蛋白Fe部分的嵌合蛋白賦予嵌合蛋白若干期望 性質(zhì)，包括穩(wěn)定性增強(qiáng)、血漿半衰期增加、與Fe受體結(jié)合以及免疫原性降低(Lei, T.等，Cell.Tmmunol., 235:12-20, 2005, Baxevanis, C.et al.，Eur.J.Tmmunol.，16: 1013-1016,1986)。
[0045]TReg細(xì)胞也在B細(xì)胞耐受中發(fā)揮作用。B細(xì)胞在它們的細(xì)胞表面表達(dá)單個(gè)低親和性 Fe 受體 FcyRIIB(Ravetch，J.等，Science，234:718_725，1986)。這一受體在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中包含免疫受體酪氨酸基抑制基序序列(ITIM)。免疫復(fù)合物對(duì)FCyRIIB和BCR的共連接可觸發(fā)Ι--Μ的酪氨酸磷酸化導(dǎo)致肌醇磷酸酶SHIP的募集，其可通過干擾MAP激酶的活化抑制BCR誘導(dǎo)的增殖并通過將Burton酪氨酸激酶(Btk)從細(xì)胞膜解離阻斷吞噬作用，其抑制進(jìn)入細(xì)胞的鈣內(nèi)流。FcyRIIB也可誘導(dǎo)不依賴Ι--Μ的凋亡。在ICs作用下FcRIIB同類聚集時(shí)Btk與細(xì)胞膜的聯(lián)系被增強(qiáng)，觸發(fā)凋亡性應(yīng)答(Pearse，R.等，Immunity, 10 =753-760,1999)。FcyRIIB的表達(dá)高度可變并依賴于細(xì)胞因子。由活化的Th2和TReg細(xì)胞表達(dá)的IL-4 和 IL-1O 已顯示可協(xié)同增強(qiáng) FcyRIIB 表達(dá)(Joshi，T.等，Mol.1mmunol.,43:839-850,2006)，因此有助于抑制體液應(yīng)答。
[0046]有可能利用Tregitope特異性TReg細(xì)胞抑制不想要的免疫應(yīng)答并誘導(dǎo)對(duì)共遞送蛋白質(zhì)的適應(yīng)性TReg。這一發(fā)現(xiàn)對(duì)設(shè)計(jì)治療方案和用于移植的抗原特異療法、蛋白質(zhì)藥物、變態(tài)反應(yīng)、慢性感染、自身免疫和疫苗設(shè)計(jì)具有意義。與Tregitope —起給予藥物、蛋白質(zhì)或變應(yīng)原可抑制效應(yīng)細(xì)胞免疫應(yīng)答。Tregitope可用于有意操縱免疫系統(tǒng)的耐受性。
[0047]本發(fā)明肽可用于調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的選擇性黏附和活化。本文例證了某些預(yù)存調(diào)節(jié)性T細(xì)胞群可被黏附、活化并用于抑制全身的和限制性的疾病特異性條件下的不想要的免疫應(yīng)答。
[0048]盡管付出了許多努力，除了少數(shù)例外，天然Tregs并且更重要的在具有臨床意義的體積中循環(huán)的天然Tregs的抗原特異性仍是未知。本文例證了一些在血液中循環(huán)的人類蛋白，例如免疫球蛋白或血清白蛋白，包含與T調(diào)節(jié)性細(xì)胞的天然種群相關(guān)的T細(xì)胞表位。在正常的免疫監(jiān)督過程中這些蛋白質(zhì)被專職APC例如樹突狀細(xì)胞或巨噬細(xì)胞攝取并降解。在降解過程中一些包含于這些蛋白質(zhì)的表位`與MHV分子結(jié)合，轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞表面遞呈給調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。這些細(xì)胞一旦被APC活化即釋放細(xì)胞因子和趨化因子幫助抑制自身免疫應(yīng)答，否則自身免疫應(yīng)答會(huì)阻礙胞外蛋白質(zhì)功能。
[0049]通過使用本發(fā)明肽選擇性活化這些預(yù)存調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，本文顯示本發(fā)明肽可用于抑制各種不想要的免疫應(yīng)答。在最簡(jiǎn)單的形式中，本發(fā)明肽的全身應(yīng)用可用作全身免疫抑制劑，其可用于控制嚴(yán)重的自身免疫反應(yīng)例如多發(fā)性硬化癥急性發(fā)作、變態(tài)反應(yīng)、移植反應(yīng)或?qū)Ω腥镜牟豢煽貞?yīng)答。在更加受控的應(yīng)用中，例如局部應(yīng)用至受風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)影響的關(guān)節(jié)，本發(fā)明肽可用于抑制局部自身免疫應(yīng)答。在靶向應(yīng)用中，例如可通過該肽與一些其他T細(xì)胞表位的融合或結(jié)合所達(dá)到的，這些肽可抑制高特異性免疫反應(yīng)并使免疫系統(tǒng)的平衡保持完整。舉例而言，通過給予和自身免疫抗原例如胰島素或變應(yīng)原例如Brazil nut抗原融合的調(diào)節(jié)性肽，免疫系統(tǒng)可經(jīng)訓(xùn)練通過將應(yīng)答效應(yīng)T細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)換至適應(yīng)性調(diào)節(jié)T細(xì)胞的表型而“耐受”共遞送的抗原。
[0050]如上所述，本發(fā)明肽衍生自循環(huán)胞外蛋白。為了具有可用性這些肽必須是真正的T細(xì)胞表位(即可與MHC分子和TCRs 二者結(jié)合)并與足夠大以具有治療作用的預(yù)存調(diào)節(jié)性T細(xì)胞群相關(guān)。T細(xì)胞表位簇，可結(jié)合至多個(gè)MHC等位基因和多個(gè)TCRs的表位，是滿足后一資格的關(guān)鍵。[0051]定義
[0052]為了進(jìn)一步輔助對(duì)本發(fā)明的理解，在下文中定義多個(gè)術(shù)語和短語。
[0053]如本文所使用，術(shù)語“生物樣品”指生物體的組織、細(xì)胞或分泌物的任何樣品。
[0054]如本文所使用，術(shù)語“移植”指從一個(gè)受試者取出細(xì)胞、組織或器官，稱作“移植體”或“移植物”并將它們置于(通常)不同的受試者中。提供移植物的受試者稱作“供體”，接受該移植物的受試者稱作“受體”。在兩個(gè)相同種但基因不同的受試者之間移植的器官或移植物稱作“同種異體移植物”。在不同種受試者之間移植的移植物稱作“異種移植物”。
[0055]如本文所使用，術(shù)語“醫(yī)學(xué)病癥”包括但不限于表現(xiàn)為一種或多種身體和/或心理癥狀(需要對(duì)其進(jìn)行治療和/或預(yù)防)的任何病癥或疾病，并包括之前和新鑒定的疾病和其他病癥。
[0056]如本文所使用，術(shù)語“免疫應(yīng)答”指淋巴細(xì)胞、抗原遞呈細(xì)胞、吞噬細(xì)胞、粒細(xì)胞和上述細(xì)胞或肝臟產(chǎn)生的可溶性大分子(包括抗體、細(xì)胞因子和補(bǔ)體)的協(xié)同作用，其可選擇性損傷、破壞或從人體清除癌性細(xì)胞、轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞、惡性黑色素瘤、侵入病原體、病原體感染的細(xì)胞或組織或自身免疫或病理性炎癥的情況下的正常的人體細(xì)胞或組織。
[0057]如本文所使用，術(shù)語組合物的“有效量”為足以達(dá)到預(yù)期治療和/或預(yù)防作用的量，例如可引起被治療疾病相關(guān)癥狀的預(yù)防或減少的量。給予受試者的本發(fā)明組合物的量取決于疾病的類型和嚴(yán)重性以及個(gè)體的特征，例如總體健康、年齡、性別、體重和對(duì)藥物的耐受。也取決于疾病的程度、嚴(yán)重性和類型。技術(shù)人員可根據(jù)這些和其他因素確定適當(dāng)?shù)膭┝俊１景l(fā)明組合物也可相互之間或與一種或多種其他治療性化合物聯(lián)合給藥。 [0058]如本文所使用術(shù)語“T細(xì)胞表位”指蛋白決定簇，長度為7至30個(gè)氨基酸并可特異結(jié)合HLA分子并與特異TCRs相互作用。一般而言，T細(xì)胞表位是線性的并且不表達(dá)特異的三維特征。T細(xì)胞表位不受變性溶劑的影響。
[0059]如本文所使用，術(shù)語“B細(xì)胞表位”指可特異結(jié)合抗體的蛋白決定簇。表位通常由分子例如氨基酸或糖側(cè)鏈的化學(xué)活性表面基團(tuán)組成并通常具有特異的三維結(jié)構(gòu)特性以及特異的電荷特性。構(gòu)象和非構(gòu)象表位的區(qū)別為在變性溶劑存在下喪失與前者而不是與后者的結(jié)合。
[0060]如本文所使用，術(shù)語“受試者”指可在其中引起免疫應(yīng)答的任何活的生物體。術(shù)語受試者包括但不限于人、非人靈長類例如猩猩和其他猿猴和猴子種；農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物例如牛、羊、豬、山羊和馬；家養(yǎng)哺乳動(dòng)物例如狗和貓；實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物包括嚙齒類例如小鼠、大鼠和豚鼠。該術(shù)語不表示具體的年齡或性別。因此成年或新生兒受試者以及胎兒不論雄性或雌性均被涵蓋。
[0061]如本文所使用，術(shù)語MHC復(fù)合物指可與被稱作HLA配體的特異性全部多肽(repertoire)結(jié)合并將所述配體運(yùn)輸至細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)復(fù)合物。
[0062]如本文所使用，術(shù)語“MHC配體”指可結(jié)合一個(gè)或多個(gè)特異MHC等位基因的多肽。術(shù)語“HLA配體”可與術(shù)語MHC配體互換。在其表面表達(dá)MHC /配體復(fù)合物的細(xì)胞被稱作“抗原遞呈細(xì)胞”(APCs)。
[0063]如本文所使用，術(shù)語T細(xì)胞受體或TCR指由可與遞呈于APCs表面的特異的全部MHC /配體復(fù)合物黏附的T細(xì)胞表達(dá)的蛋白質(zhì)復(fù)合物。
[0064]如本文所使用，術(shù)語“T細(xì)胞表位”指可與特異T細(xì)胞受體(TCRs)相互作用的MHC配體。可通過計(jì)算機(jī)(in silico)法(De Groot, A.等，AIDS Res.Hum.Retroviruses, 13:539-541,1997 ；Schafer, J.等，Vaccine, 16:1880-1884，1998 ；De Groot, A.等，Vaccine,19:4385-95,2001 ；De Groot, A.等，Vaccine，21:4486-504, 2003)預(yù)測(cè) T 細(xì)胞表位。
[0065]如本文所使用，術(shù)語“MHC結(jié)合基序”指預(yù)測(cè)可與具體MHC等位基因結(jié)合的蛋白質(zhì)序列中的氨基酸模式。
[0066]如本文所使用，術(shù)語“T細(xì)胞表位簇”指包含約4個(gè)至約40個(gè)MHC結(jié)合基序的多肽。在具體的實(shí)施方案中，T細(xì)胞表位簇包含約5個(gè)至約35個(gè)MHC結(jié)合基序，約8個(gè)至約30個(gè)MHC結(jié)合基序；以及約10個(gè)至約20個(gè)MHC結(jié)合基序。
[0067]如本文所使用術(shù)語“EpiBar”指經(jīng)預(yù)測(cè)與至少四種不同HLA等位基因具有反應(yīng)性的單個(gè)9-mer框架。包含EpiBars的已知免疫原的序列包括流感病毒血凝素307-319、破傷風(fēng)毒素825-850和GAD65557-567。包含EpiBar的免疫原性肽的實(shí)例顯示于下文。
[0068]實(shí)例EpiBar
[0069]登錄號(hào):流感-序列:HA306-318
[0070]
【權(quán)利要求】
1.一種T細(xì)胞表位組合物，其包含至少一種選自SEQ ID N0:4-58的分離的T細(xì)胞多肽。
2.—種核酸，其編碼選自SEQ ID NO:4-58的T細(xì)胞表位多肽。
3.一種載體,其包含根據(jù)權(quán)利要求2的核酸。
4.一種細(xì)胞,其包含根據(jù)權(quán)利要求3的載體。
5.一種藥用組合物，其包含權(quán)利要求1的T細(xì)胞表位多肽組合物和藥學(xué)可接受的載體。
6.包含至少一種選自SEQID NO:4-58的分離的T細(xì)胞多肽的T細(xì)胞表位組合物在制備用于治療或預(yù)防醫(yī)學(xué)病癥的藥物中的用途，其中所述醫(yī)學(xué)病癥以不想要的免疫應(yīng)答存在
7.根據(jù)權(quán)利要求6的用途，其中所述醫(yī)學(xué)病癥選自由以下組成的組:變態(tài)反應(yīng)、自身免疫疾病、移植相關(guān)病癥、酶或蛋白缺乏癥、凝血障礙、癌癥、不育；以及病毒、細(xì)菌或寄生蟲感染，其中所述治療或預(yù)防以上所列組獲益于暫時(shí)或延長的免疫抑制。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述移植相關(guān)病癥為移植物抗宿主病。
9.預(yù)防或治療受試者中醫(yī)學(xué)病癥的藥盒，其中所述藥盒包括包含至少一種選自SEQIDNO:4-58的分離的T細(xì)胞多肽的T細(xì)胞表位組合物，其中所述醫(yī)學(xué)病癥以不想要的免疫應(yīng)答存在為標(biāo)志。
10.擴(kuò)增調(diào)節(jié)性T細(xì)胞群的方法，其包括:` (a)提供受試者的生物樣品； (b)從生物樣品中分離調(diào)節(jié)性T-細(xì)胞；以及 (C)將分離的調(diào)節(jié)性T-細(xì)胞與有效量的Tregitope組合物在使T-調(diào)節(jié)性細(xì)胞數(shù)量增加以形成擴(kuò)增的調(diào)節(jié)性T-細(xì)胞組合物的條件下接觸， 其中所述Tregitope組合物包含至少一種選自SEQ ID N0:4_58的分離的T細(xì)胞多肽， 藉此擴(kuò)增生物樣品中的調(diào)節(jié)性T-細(xì)胞。
11.刺激生物樣品中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的方法，其包括: (a)提供受試者的生物樣品； (b)從生物樣品中分離調(diào)節(jié)性T-細(xì)胞；以及 (C)將分離的調(diào)節(jié)性T-細(xì)胞與有效量的Tregitope組合物在T-調(diào)節(jié)性細(xì)胞被刺激以改變一種或多種生物學(xué)功能的條件下接觸， 其中所述Tregitope組合物包含至少一種選自SEQ ID NO: 4_58的分離的T細(xì)胞多肽， 藉此刺激生物樣品中的調(diào)節(jié)性T-細(xì)胞。
12.包含至少一種選自SEQID N0:4-58的分離的T細(xì)胞多肽的肽在制備抑制受試者中免疫應(yīng)答的藥物中的用途，其中所述肽抑制免疫應(yīng)答。
13.權(quán)利要求12的用途，其中所述肽抑制效應(yīng)T細(xì)胞應(yīng)答。
14.權(quán)利要求12的用途，其中所述肽抑制輔助T細(xì)胞應(yīng)答。
15.權(quán)利要求12的用途，其中所述肽抑制B細(xì)胞應(yīng)答。
16.Tregitope組合物在制備用于抑制受試者中抗原特異性免疫應(yīng)答的藥物中的用途， 其中所述Tregitope組合物包含至少一種選自SEQ ID NO: 4_58的分離的T細(xì)胞多肽，以及 其中所述一種或多種分離的T細(xì)胞表位多肽與特異目標(biāo)抗原共價(jià)結(jié)合、非共價(jià)結(jié)合或混合，引起對(duì)目標(biāo)抗原免疫應(yīng)答的降低。
17.權(quán)利要求16的用途,其中所述抑制作用由天然Treg介導(dǎo)。
18.權(quán)利要求16的用途，其中所述抑制作用由適應(yīng)性Treg介導(dǎo)。
19.權(quán)利要求16的用途，其中所述Tregitope組合物抑制效應(yīng)T細(xì)胞應(yīng)答。
20.權(quán)利要求16的用途，其中所述Tregitope組合物抑制輔助T細(xì)胞應(yīng)答。
21.權(quán)利要求16的用途，其中所述Tregitope組合物抑制B細(xì)胞應(yīng)答。
22.增強(qiáng)疫苗遞送載體的免疫原性的方法，其包括鑒定和去除一種或多種調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表位，其中所述一種或多種T細(xì)`胞表位選自SEQ ID NO:4-58o
【文檔編號(hào)】A61P37/00GK103755789SQ201310685046
【公開日】2014年4月30日 申請(qǐng)日期:2008年1月29日 優(yōu)先權(quán)日:2007年1月30日
【發(fā)明者】A.德格魯特, W.馬丁, D.里韋拉 申請(qǐng)人:埃皮瓦克斯公司