一種編碼牙鲆胞外ATP受體P2X7 的cDNA全長(zhǎng)序列及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種編碼牙鲆胞外ATP受體P2X7的cDNA全長(zhǎng)序列及克隆和檢測(cè)方法。該序列全長(zhǎng)2058bp，含1743bp的開(kāi)放閱讀框，編碼580個(gè)氨基酸。本發(fā)明通過(guò)以不同物種P2X7基因編碼區(qū)序列的保守區(qū)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄及PCR擴(kuò)增，結(jié)合RACE技術(shù)最終得到牙鲆P2X7的全長(zhǎng)cDNA序列。P2X7蛋白是一種重要的胞外ATP受體。本基因的獲得為研究魚(yú)類P2X7基因表達(dá)調(diào)控及免疫學(xué)功能奠定基礎(chǔ)，亦可為魚(yú)類種群遺傳學(xué)和進(jìn)化遺傳學(xué)研究提供分子水平材料。
【專利說(shuō)明】—種編碼牙鲆胞外ATP受體P2X7的cDNA全長(zhǎng)序列及其應(yīng)用
[0001]本申請(qǐng)得到天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃(項(xiàng)目編號(hào):13JCYBJC38300)、天津市高等學(xué)校科技發(fā)展基金計(jì)劃項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào):20130607)、教育部留學(xué)回國(guó)人員科研啟動(dòng)基金、國(guó)家高新技術(shù)發(fā)展計(jì)劃(863)項(xiàng)目(2012AA10A401)、國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2011BAD13B07、2012BAD26B04)、天津師范大學(xué)引進(jìn)人才科研啟動(dòng)基金(項(xiàng)目編號(hào):5RL120)和天津師范大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào):2013084)的資助。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及生物學(xué)領(lǐng)域，具體是牙鲆胞外ATP受體P2X7基因全長(zhǎng)cDNA序列及其編碼的蛋白，以及該基因的克隆和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0003]近年來(lái)，隨著人們生活水平的日益提高，魚(yú)類作為一種高蛋白低脂肪的食物受到人們?cè)絹?lái)越多的親睞。由于水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模在世界范圍內(nèi)的逐漸擴(kuò)大，國(guó)內(nèi)外水產(chǎn)品貿(mào)易及水產(chǎn)苗種跨區(qū)域交流的日益頻繁，水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物病原傳播的機(jī)會(huì)大大增加。由于現(xiàn)代水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的特點(diǎn)為高度集約化和高密度生產(chǎn)，導(dǎo)致漁業(yè)水域環(huán)境惡化和水體細(xì)菌大量繁殖，這樣又會(huì)引發(fā)養(yǎng)殖動(dòng)物的應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致機(jī)體的免疫系統(tǒng)受到抑制。由于上述因素的相互作用，導(dǎo)致了世界范圍內(nèi)的水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物疾病爆發(fā)趨于頻繁，流行程度趨于廣泛，從而給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了極大的經(jīng)濟(jì)損失。通過(guò)運(yùn)用現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)作為水產(chǎn)養(yǎng)殖的技術(shù)支撐，掌握經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的病害防治技術(shù)是水產(chǎn)科技中亟待解決的問(wèn)題。因此，近年來(lái)魚(yú)類免疫學(xué)在國(guó)際上受到了越來(lái)越多的重視。
[0004]免疫學(xué)研究的歷史中，一直以細(xì)胞免疫和體液免疫作為研究的主要內(nèi)容，相比之下，對(duì)于先天免疫的研究相對(duì)滯后。20世紀(jì)90年代，Janeway等提出了“病原體相關(guān)分子模式”以及“模式識(shí)別受體”相關(guān)概念，標(biāo)志著先天免疫研究進(jìn)入了一個(gè)嶄新的階段。魚(yú)類屬于低等脊椎動(dòng)物，已具備免疫的基本特征，其體內(nèi)具有2種免疫應(yīng)答類型:先天免疫應(yīng)答和獲得性免疫應(yīng)答。但與哺乳動(dòng)物相比，魚(yú)類的先天免疫的研究才剛剛起步。
[0005]P2X受體是一種在 多種細(xì)胞類型中表達(dá)的膜受體，該受體可以選擇性的與胞外ATP結(jié)合，產(chǎn)生多種生物學(xué)效應(yīng)。P2X家族共有7個(gè)亞型(P2Xi_7)，其中P2X7與其他P2X家族的其它亞型在結(jié)構(gòu)和通道性質(zhì)等方面顯著不同。P2X7受體位于細(xì)胞內(nèi)的C端區(qū)域比P2X家族其它成員長(zhǎng)，是P2X7有別于該家族其它亞型的標(biāo)志，也是其具有獨(dú)特生物學(xué)功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。研究表明，在多種病理狀態(tài)下，P2X7受體的表達(dá)上調(diào)，并調(diào)節(jié)炎癥性介質(zhì)和細(xì)胞因子的合成與釋放，參與機(jī)體的先天免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，并可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生凋亡。
[0006]牙鲆(Paralichthysolivaceus)屬碟形目、牙鲆科、牙鲆屬，俗稱“比目魚(yú)”、“左口”，屬于冷溫性底棲魚(yú)類，主要分布在我國(guó)的渤海、黃海、南海以及朝鮮、日本、俄羅斯遠(yuǎn)東沿海地區(qū)。近10年來(lái)，由于過(guò)度捕撈，牙鲆資源逐步枯竭，養(yǎng)殖業(yè)被迅速發(fā)展起來(lái)。由于其肉質(zhì)鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，牙鲆逐步成為我國(guó)北方重要的海水經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚(yú)類之一。高密度集約化養(yǎng)殖導(dǎo)致了各種魚(yú)類病害，如腹水病、病毒性神經(jīng)壞死癥、寄生蟲(chóng)病等的爆發(fā)和流行，給養(yǎng)殖企業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重制約了牙鲆養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。由于目前對(duì)于牙鲆的免疫調(diào)控機(jī)理了解較少，尚無(wú)有效的免疫防治技術(shù)和治療方法。
[0007]P2X7受體參與了機(jī)體多種重要生理、病理活動(dòng)，如神經(jīng)遞質(zhì)傳遞、激素釋放、自噬性凋亡、免疫細(xì)胞因子IL β-1的釋放、活性氧和NO的產(chǎn)生等。Ρ2Χ7在胞外ATP重復(fù)或延長(zhǎng)刺激的情況下可以通透大分子，造成細(xì)胞自溶而死亡。因此，Ρ2Χ7與機(jī)體內(nèi)的許多炎癥反應(yīng)與免疫反應(yīng)有著密切的關(guān)系，可以在一定程度上反映魚(yú)類的免疫能力。牙鲆胞外ATP受體Ρ2Χ7基因結(jié)構(gòu)的解析，有助于人們更加深入地了解Ρ2Χ7結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系及其與魚(yú)類免疫應(yīng)答的關(guān)系，加深人們對(duì)魚(yú)類精細(xì)而復(fù)雜的免疫應(yīng)答過(guò)程的全面認(rèn)識(shí)，從而為尋找診斷、預(yù)防和治療相關(guān)魚(yú)病提供新的策略以及抗病育種設(shè)計(jì)、抗病性轉(zhuǎn)基因魚(yú)的設(shè)計(jì)、基因疫苗的設(shè)計(jì)和疫苗安全使用等提供重要的理論基礎(chǔ)，并在魚(yú)類疾病防治、環(huán)境監(jiān)測(cè)以及生態(tài)系統(tǒng)保護(hù)等方面發(fā)揮作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是提供一種牙鲆胞外ATP受體Ρ2Χ7的cDNA序列及克隆方法。
[0009]本發(fā)明采用的技術(shù)方案是通過(guò)以不同物種P2X7基因的⑶S序列保守區(qū)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，通過(guò)RT-PCR反轉(zhuǎn)錄及PCR擴(kuò)增，結(jié)合RACE技術(shù)獲得牙鲆P2X7基因cDNA的全長(zhǎng)表達(dá)序列。
[0010]牙鲆P2X7基因全長(zhǎng)cDNA共2058bp，含有1743bp的開(kāi)放閱讀框，編碼580個(gè)氨基酸。P2X7基因的起始密碼子上游有IlObp的5’非編碼序列，距poly (A)尾9個(gè)堿基位置存在加尾信號(hào)AATAAA。 結(jié)合這兩方面的特征可以說(shuō)明所得的cDNA序列為牙鲆P2X7基因的全長(zhǎng)cDNA序列。P2X7基因編碼的蛋白質(zhì)分子量為65.3KDa，等電點(diǎn)為9.18，其與其它物種的P2X7蛋白有60-88%的序列相似性。
[0011]本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了牙鲆胞外ATP受體P2X7基因序列在作為牙鲆疾病防治靶標(biāo)基因方面的應(yīng)用。以及在作為牙鲆疾病實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方面的應(yīng)用。還有作為牙鲆疾病防治方面的應(yīng)用。
[0012]本發(fā)明更進(jìn)一步公開(kāi)了牙鲆胞外ATP受體P2X7的基因cDNA序列克隆方法，其特征是包括如下主要步驟:
(I)健康牙鲆解剖分離頭腎組織:
選取健康牙鲆，于水族箱中暫養(yǎng)3天后處死，解剖分離頭腎組織。
[0013](2)總RNA的提取和純化:
采用Trizol法從牙鲆頭腎中提取得到牙鲆頭腎總RNA?？俁NA純化采用DNA酶處理法。
[0014](3)牙鲆P2X7基因cDNA中間片段的克隆測(cè)序:
(3.DcDNA第一鏈的合成
以純化的牙鲆頭腎總RNA作為模板，以O(shè)ligo (dT) 16作為反轉(zhuǎn)錄引物，進(jìn)行cDNA第一鏈合成，得到cDNA第一鏈，作為下述PCR擴(kuò)增的cDNA模板。
[0015](3.2) PCR 擴(kuò)增
采用巢式PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。以前述所得的cDNA第一鏈為模板，利用下述第一引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增:
正向引物:5 ’ 一 GTTWCWGCKTGGTGYCCWATTG-3，
反向引物:5 ’ -TYCAGGTYRCAGTCCCAKTTGA-3 ’
擴(kuò)增得到牙鲆胞外ATP受體P2X7基因cDNA中間片段，通過(guò)克隆測(cè)序，得到中間片段序列。
[0016]本步驟中，擴(kuò)增體系可優(yōu)選如下:
【權(quán)利要求】
1.牙鲆胞外ATP受體P2X7基因cDNA序列，該基因cDNA全長(zhǎng)2058bp，含有1743bp的開(kāi)放閱讀框，具有SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
2.權(quán)利要求1所述的基因序列，其中所述的核苷酸序列對(duì)應(yīng)的氨基酸序列如SEQIDN0.2所示；該序列編碼580個(gè)氨基酸，分子量為65.3KDa，等電點(diǎn)為9.18。
3.權(quán)利要求1所述牙鲆胞外ATP受體P2X7基因序列在制備作為牙鲆疾病防治靶標(biāo)基因方面的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1所述牙鲆胞外ATP受體P2X7基因序列在制備作為牙鲆疾病實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方面的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求1所述牙鲆胞 外ATP受體P2X7基因序列在制備作為牙鲆疾病防治方面的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K48/00GK103642817SQ201310685979
【公開(kāi)日】2014年3月19日 申請(qǐng)日期:2013年12月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月16日
【發(fā)明者】孫金生, 李碩, 李雪靜, 耿緒云, 王青華 申請(qǐng)人:天津師范大學(xué)