一種miR-100抑制劑在制備治療乳腺癌藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種miR-100抑制劑在制備治療乳腺癌的藥物中的應(yīng)用，所述miR-100抑制劑為miR-100反義核酸鏈，序列為5’-TTCGGATCTACGGGTT-3’；本發(fā)明miR-100抑制劑能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，有效誘導(dǎo)腫瘤移植小鼠中腫瘤的生長，增加乳腺癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性，提高化療效果；miR-100是潛在的乳腺癌治療藥物的新靶點，是藥物治療的新途徑。
【專利說明】一種miR-100抑制劑在制備治療乳腺癌藥物中的應(yīng)用
(-)【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及用于治療乳腺癌的抑制劑，特別涉及一種miR-100抑制劑在制備治療乳腺癌藥物中的應(yīng)用。
(二)【背景技術(shù)】
[0002]腫瘤實質(zhì)上是細(xì)胞的惡性增殖，伴隨著高的轉(zhuǎn)移能力。導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的外源性因素包括化學(xué)、物理、致瘤性病毒和真菌素等，內(nèi)源性因素包括機體的免疫狀態(tài)、遺傳因素、激素水平、DNA損傷、原癌基因的激活和抑癌基因的失活等等。這個過程中，細(xì)胞凋亡的抑制發(fā)揮了關(guān)鍵的作用，細(xì)胞凋亡是一種細(xì)胞的程序性死亡，細(xì)胞受到了外界或者本身的刺激，傷害，并無法修復(fù)時，發(fā)生細(xì)胞凋亡，避免損傷細(xì)胞的積累導(dǎo)致疾病的發(fā)生，癌癥實質(zhì)上是一種基因疾病，基因突變的細(xì)胞沒有及時的被清除，并且經(jīng)過若干年的積累后導(dǎo)致了癌癥的發(fā)生，所以，重新激活癌癥中的凋亡程序，對于癌癥的治療來說，是一種全新的思路。
[0003]乳腺癌死亡率高，腫瘤細(xì)胞生長迅速，且轉(zhuǎn)移能力強，人體主要器官例如肺，肝，甚至骨頭等癌細(xì)胞都能遷移過去，惡性程度非常高，世界上每年大概新增100萬新的病例，已經(jīng)發(fā)展成為了在女性癌癥發(fā)病率最高的一種。目前來說，治療乳腺癌主要的手段有放療，化療和外科手術(shù)切除，而放療和化療都會對身體造成極大的損傷，對患者的后續(xù)生存是個極大的隱患，外科手術(shù)對于早期乳腺癌患者的治療比較有效，中期和晚期癌細(xì)胞都已擴散，不能手術(shù)切除，并且，許多臨床案例表明，癌癥的手術(shù)切除都有比較高的復(fù)發(fā)風(fēng)險，研究出不同于傳統(tǒng)方法的全新治療手段迫在眉睫，對于乳腺癌乃至全部癌癥的治療，都有著至關(guān)重要的價值和意義。
[0004]MicroRNAs (miRNAs)是一類最近被發(fā)現(xiàn)的非編碼小RNA，首先由RNA聚合酶家族轉(zhuǎn)錄成pr1-miRNA, pr1-miRNA由dorsha和DGCR8形成的復(fù)合物剪切加工，形成precursormiRNA，最后通過Exportin5將其運入細(xì)胞質(zhì)，加工成為成熟體miRNA，常由19-25個核苷酸構(gòu)成，通過與靶基因mRNA的3’UTR堿基配對結(jié)合，以翻譯抑制或直接降解的方式，降低靶基因的表達(dá)，從而達(dá)到了轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的作用。
[0005]研究發(fā)現(xiàn)，許多癌癥的發(fā)生都與miRNA的異常調(diào)控有關(guān)，miRNA的表達(dá)譜會出現(xiàn)明顯的變化，其中的機理值得我們深入研究，實驗表明，降低被過表達(dá)的miRNA或升高被抑制表達(dá)的miRNA有時能夠?qū)е掳┘?xì)胞的凋亡，從而抑制腫瘤的生長，是一種潛在而有效地腫瘤治療手段。
(三)
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明目的是提供一種miR-100抑制劑在制備治療乳腺癌藥物中的應(yīng)用。 [0007]本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
[0008]本發(fā)明提供一種miR-100抑制劑在制備治療乳腺癌藥物中的應(yīng)用。
[0009]進(jìn)一步，所述miR-100抑制劑(命名為AM0_miR-100)為miR-100反義核酸鏈，序列為5’ -TTCGGATCTACGGGTT-3’。所述miR-100抑制劑用于制備治療乳腺癌的藥物。[0010]進(jìn)一步，所述乳腺癌為乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3。
[0011]miR-100基因位于細(xì)胞核11號染色體，在腫瘤中存在異常表達(dá)，研究報道，miR-100基因在卵巢癌、口腔癌、鼻咽癌中表達(dá)下調(diào)，而在肝癌、前列腺癌、子宮內(nèi)膜癌和急性粒細(xì)胞性白血病中表達(dá)上調(diào)。
[0012]本研究發(fā)現(xiàn)miR-100基因在乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3中表達(dá)量顯著上調(diào)，通過使用miR-100 抑制劑(AMO(ant1-miRNA-oligonucleotide)-miR-100),可以有效的降低細(xì)胞中的miR-100水平，與此同時，細(xì)胞發(fā)生了明顯的凋亡現(xiàn)象，將乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3接種到裸鼠成瘤后，通過采用尾靜脈注射AMO-miR-lOO，能有效的抑制腫瘤在裸鼠體內(nèi)的生長速率。用miR-100抑制劑處理細(xì)胞后，癌細(xì)胞對化療藥物順鉬變得更加敏感，顯著的增加了順鉬的效能。
[0013]本 申請人:通過研究miR-100基因的表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞系SK-BR-3的影響，發(fā)現(xiàn)miR-100基因可能是乳腺癌治療中的一個新的靶點，有選擇地調(diào)節(jié)miR-100基因的表達(dá)，可以影響整個基因網(wǎng)絡(luò)，從而影響復(fù)雜疾病的進(jìn)程。此外，miR-100抑制劑能有效地增加乳腺癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性，增加藥物效能，一定程度是減輕化療對患者毒性。因此miR-100抑制劑有望成為乳腺癌治療的新藥物，廣泛應(yīng)用于乳腺癌的防治
[0014]本發(fā)明miR-100抑制劑技術(shù)要點如下:
[0015](I)誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3的凋亡:通過轉(zhuǎn)染miR-100抑制劑進(jìn)入細(xì)胞48h后，顯微鏡觀察到癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)皺縮，凋亡小體出現(xiàn)，表明細(xì)胞發(fā)生凋亡。
[0016](2)抑制移植乳腺癌瘤塊的生長:首先將細(xì)胞種到裸鼠皮下，成瘤后，尾靜脈注射miR-100抑制劑，與對照組相比，miR-100抑制劑處理組瘤塊生長顯著受到抑制。
[0017](3)增加乳腺癌細(xì)胞對化療藥物敏感度:首先將miR-100抑制劑轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞，后用不同濃度的化療藥物順鉬處理細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，miR-100抑制劑處理組順鉬的EC50顯著的降低，顯然乳腺癌細(xì)胞對化療藥物的敏感度增加。
[0018]本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在:(I)本發(fā)明miR-100抑制劑能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；(2)本發(fā)明miR-100抑制劑能夠有效抑制腫瘤移植小鼠中乳腺癌瘤塊的生長速率；(3)本發(fā)明miR-100抑制劑能夠顯著的增加乳腺癌對化療藥物的敏感度；(4)本發(fā)明miR-100抑制劑可能成為一種新型乳腺癌治療藥物。
(四)【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1為miR-100抑制劑AMO-miR-lOO在乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3中抑制miR-100表達(dá)
效率圖。
[0020]圖2為人乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3在轉(zhuǎn)染miR-100抑制劑48小時后，細(xì)胞形態(tài)圖，A為轉(zhuǎn)染 AMO-miR-lOO-scarmbled control 的對照組，B 為轉(zhuǎn)染 AMO-miR-lOO 的實驗組。
[0021]圖3為乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3在轉(zhuǎn)染miR-100抑制劑48小時后，Annexin V檢測的流式結(jié)果圖，A為轉(zhuǎn)染AM0-miR-100-scarmbled control的對照組，B為轉(zhuǎn)染AMO-miR-lOO的實驗組，其中BI為壞死的細(xì)胞，B2為晚期凋亡的細(xì)胞，B3為活細(xì)胞，B4為早期凋亡的細(xì)胞。
[0022]圖4為不同濃度的miR-100抑制劑處理乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3后，細(xì)胞活力曲線圖。
[0023]圖5為先用miR-100抑制劑處理乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3后，再用不同濃度的化療藥物順鉬處理，腫瘤細(xì)胞活力圖。
[0024]圖6為將乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3接種于裸鼠皮下成瘤后，尾靜脈注射miR-100抑制劑I個月，腫瘤的生長速率圖。
[0025]圖7為將乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3接種于裸鼠皮下成瘤后，尾靜脈注射miR-100抑制齊Li I個月后腫瘤的外觀圖，1、2、3、4、5為陰性對照組(注射miR-100-scrambled control組)裸鼠的瘤塊外觀圖，6、7、8、9、10為實驗組(注射miR-100抑制劑組)裸鼠的瘤塊外觀圖。
[0026]圖8為將乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3接種于裸鼠皮下成瘤后，尾靜脈注射miR-100抑制劑I個月后，腫瘤的重量圖。
[0027]圖9為將乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3接種于裸鼠皮下成瘤后，尾靜脈注射miR-100抑制劑I個月后，瘤塊中miR-100的抑制效率圖。
(五)【具體實施方式】
[0028]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此:
[0029]實施例1:合成miR-100反義核酸鏈和陰性對照
[0030]將miR-100反義核酸鏈命名為miR-100抑制劑(即AMO-miR-lOO)，其序列為:5’ -TTCGGATCTAC GGGTT-3’，其堿基修飾方式為:(I):粗體字母的堿基(第3位、第6位、第9位)LNA修飾、(2)斜體字母的堿基2’ OME修飾(第12位、第15位)、(3)全部堿基硫代修飾。(參考專利 CN102311956A)。
[0031]陰性對照(Scrambled control, NC)為堿基序列隨機打亂的序列，堿基的GC含量與堿基的修飾方式與miR-100抑制劑均一致，序列為5’ -GTCGGTTCTGATGTCA-3’。
[0032]上述序列均由丹麥Exiqon公司合成。
[0033]實施例2:
[0034](I)取人乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3 (中科院上海細(xì)胞庫)，用含10%FBS的1640培養(yǎng)基
培養(yǎng)至細(xì)胞密度40%左右。
[0035](2)按照說明書使用Lipofectamine? RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑，轉(zhuǎn)染miR-100抑制劑以及陰性對照，終濃度50nM。
[0036](3)轉(zhuǎn)染48小時后鏡檢細(xì)胞，觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，隨后收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，用qPCR檢測miR-100抑制劑的抑制效率，及用Annexin V試劑盒(購自美國BD(Becton, Dickinson and Company)公司)檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的凋亡情況，以未轉(zhuǎn)染的人乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3作為空白對照。
[0037]結(jié)果見圖1、圖2及圖3。結(jié)果顯示miR-100抑制劑(AMO-miR-lOO)能有效的抑制乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3中miR-100的表達(dá)，而且當(dāng)乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3中miR-100被抑制之后，細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)了明顯的凋亡現(xiàn)象，Annexin V檢測結(jié)果也表明用miR-100抑制劑轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中凋亡細(xì)胞所占的比例顯著的增加了，表明miR-100抑制劑能夠有效地誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。
[0038]實施例3
[0039](I)取人乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3，用含10%FBS的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)至細(xì)胞密度40%左右。[0040](2)按照說明書使用Lipofectamine'? RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑，轉(zhuǎn)染不同濃度miR-100抑制劑(AMO-miR-lOO)以及陰性對照。
[0041](3)轉(zhuǎn)染 48 小時后，收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，用 MTS[3-(4，5-dimethylthiazol-2_yl)-5- (3-carboxymethoxyphenyl)~2~(4-sulfophenyl) -2H~te trazolium, inner salt]assay試劑盒(購自美國promega公司)檢測細(xì)胞的活力及增殖活性。
[0042]結(jié)果見圖4。結(jié)果表明miR-100抑制劑能有效的抑制乳腺癌細(xì)胞的活力及增殖活性，且隨著抑制劑濃度的加大，細(xì)胞活力及增殖活性的抑制就越明顯，表明miR-100抑制劑能抑制乳腺癌細(xì)胞的活力及增殖活性，結(jié)果表明了 miR-100抑制劑作為一種乳腺癌治療藥物的可行性。
[0043] 實施例4
[0044](1)取人乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3，用含10%FBS的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)至細(xì)胞密度40%左右。
[0045](2 )按照說明書使用Lipofectamine? RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑，轉(zhuǎn)染miR-100抑制劑以及陰性對照，終濃度50nM。
[0046](3)轉(zhuǎn)染6小時后，用生理鹽水配制不同濃度的化療藥物順鉬溶液((Cisplatin,⑶DP)購自上海生工)，分別加入轉(zhuǎn)染后的培養(yǎng)基中，使順鉬終濃度分別達(dá)到0、6.25、12.5、18.75,25,50,100 μ Mo
[0047](4)不同濃度的順鉬加入細(xì)胞培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)42小時后，用MTS試劑盒檢測處理的細(xì)胞的活力及增殖活性。以不添加miR-100抑制劑作為空白對照(即AMO-Free)。
[0048]結(jié)果見圖5。結(jié)果表明，用miR-100抑制劑處理乳腺癌細(xì)胞后，相比與對照，細(xì)胞對于化療藥物的敏感度顯著提升，EC5tl顯著的降低，增加了化療藥物順鉬的效能。結(jié)果表明miR-100抑制劑能顯著的提升化療藥物對乳腺癌細(xì)胞的效能。顯示了 miR-100抑制劑在乳腺癌治療中的潛在功能。
[0049]實施例5
[0050](I)選取周齡4-5周，體重20g左右的裸鼠20只，每籠五只，飼養(yǎng)在無菌的動物房。
[0051](2)培養(yǎng)乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3，胰酶消化后用生理鹽水重懸細(xì)胞，將密度調(diào)整為5X IO6 個/ml。
[0052](3)將收集好的細(xì)胞皮下注射裸鼠，100 μ I/只，實驗組(miR-100抑制劑)和陰性對照組(Scrambled control)每組分別注射10只。
[0053](4)以公知的培養(yǎng)條件在無菌培養(yǎng)室培養(yǎng)至注射的乳腺癌細(xì)胞成瘤后，往每組裸鼠分別尾靜脈注射80mg/Kg體重的miR-100抑制劑、Scrambled control,每三天注射一次，連續(xù)注射一個月后，處死裸鼠，拍照稱重。
[0054]結(jié)果見圖7。結(jié)果表明注射miR-100抑制劑后，小鼠的乳腺癌瘤塊的重量和大小要明顯小于陰性對照組。表明miR-100抑制劑能夠有效地抑制小鼠體內(nèi)乳腺癌的生長。
[0055]實施例6
[0056](I)選取周齡4-5周，體重20g左右的裸鼠20只，每籠五只，飼養(yǎng)在無菌的動物房。
[0057](2)培養(yǎng)乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3，胰酶消化后用生理鹽水重懸細(xì)胞，將密度調(diào)整為5X IO6 個/ml。[0058](3)將收集好的細(xì)胞皮下注射裸鼠，100 μl/只，實驗組(miR-100抑制劑)和陰性對照組(Scrambled control)每組分別注射10只。
[0059](4)等注射的乳腺癌細(xì)胞成瘤后，往每組裸鼠分別尾靜脈注射80mg/Kg體重的miR-100抑制劑、Scrambled control,每三天注射一次,連續(xù)注射一個月后,期間測量并記錄腫瘤大小，統(tǒng)計瘤塊的生長速率。
[0060](5)斷頸處死裸鼠后，取出瘤塊，通過qPCR檢測瘤塊里面miR-100抑制情況。
[0061]結(jié)果見圖8和圖9。qPCR結(jié)果表明尾靜脈注射miR-100抑制劑能有效的抑制小鼠瘤塊中miR-100的含量，并且miR-100抑制劑處理的小鼠體內(nèi)的乳腺癌瘤塊生長速率明顯小于陰性對照組，表明miR-100抑制劑能夠有效地敲低小鼠瘤塊中miR-100的含量并抑制乳腺癌瘤塊的生長。
【權(quán)利要求】
1.一種miR-100抑制劑在制備治療乳腺癌藥物中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述miR-100抑制劑在制備治療乳腺癌藥物中的應(yīng)用，所述miR-100抑制劑為miR-100反義核酸鏈，序列為5’ -TTCGGATCTACGGGTT-3’。
3.如權(quán)利要求1所述miR-100抑制劑在制備治療乳腺癌藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述乳腺癌為乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3。
【文檔編號】A61K48/00GK103893780SQ201310697679
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2013年12月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月17日
【發(fā)明者】章曉波, 龔燚, 楊璐 申請人:浙江大學(xué), 中國大洋礦產(chǎn)資源研究開發(fā)協(xié)會