一種抗凝血涂層材料及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抗凝血涂層材料及制備方法。所述抗凝血涂層材料，包括透明質(zhì)酸鈉和水蛭素，透明質(zhì)酸鈉形成凝膠網(wǎng)絡(luò)，水蛭素通過酰胺鍵與透明質(zhì)酸鈉共價結(jié)合。所述抗凝血涂層材料制備方法，包括以下步驟：（1）配置MES緩沖液；（2）配制透明質(zhì)酸鈉溶液，其濃度為1mg/ml至20mg/ml；（3）配制水蛭素溶液，其濃度為1mg/ml至10mg/ml；（4）將上述兩種溶液均勻混合，使得水蛭素與透明質(zhì)酸鈉的質(zhì)量比例為1:1至1:10；（5）向步驟（4）中得到的混合溶液中加入交聯(lián)劑，均勻混合，使得水蛭素與透明質(zhì)酸鈉共價交聯(lián)。本發(fā)明提供的抗凝血涂層材料，抗凝血活性較高，效果穩(wěn)定，持續(xù)時間長，生物相容性好，且制備方法簡單，條件溫和，適合工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)。
【專利說明】一種抗凝血涂層材料及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料領(lǐng)域，更具體地，涉及一種抗凝血涂層材料及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]抗凝血生物醫(yī)用材料是一類重要的生物材料，被廣泛應(yīng)用于與人類血液和組織相接觸的醫(yī)用材料上，如血液透析系統(tǒng)、體外循環(huán)系統(tǒng)、人工心臟瓣膜、心臟起搏器、人工血管、血管支架、外科手術(shù)線和導(dǎo)管等。進(jìn)入21世紀(jì)，心血管疾病發(fā)病率和死亡率在不斷上升，心血管疾病的防治已成為國內(nèi)外醫(yī)學(xué)界關(guān)注的重點(diǎn)。抗凝血生物醫(yī)用材料有著重要的應(yīng)用價值。
[0003]目前已有抗凝血涂層，主要是采用肝素作為抗凝血因子，將肝素通過物理吸附或者化學(xué)結(jié)合的方法固定在材料表面。采用物理吸附的方法，將材料肝素化，肝素容易流失，抗凝血效果不長；采用化學(xué)結(jié)合的方法，將材料肝素化，由于肝素為大生物分子，共價結(jié)合在金屬支架表面后，其構(gòu)象受到限制，可能造成抗凝血活性降低。另外用于固定肝素的涂層聚合物還存在生物相容性問題，不能促進(jìn)內(nèi)皮愈合，對減少再狹窄率也沒有明顯貢獻(xiàn)。
[0004]目前還沒有一種具有理想抗凝血作用且不影響其生物相容性的抗凝血涂層材料。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對現(xiàn)有技術(shù)的以上缺陷或改進(jìn)需求，本發(fā)明提供了一種抗凝血涂層材料，其目的在于通過將分子量較小、抗凝血效果穩(wěn)定的抗凝血因子水蛭素與具有良好生物相容性的透明質(zhì)酸鈉凝膠網(wǎng)絡(luò)共價結(jié)合，由此解決目前抗凝血涂層材料抗凝血效果不穩(wěn)定或者不長久、生物相容性差的技術(shù)問題。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，按照本發(fā)明的一個方面，提供了一種抗凝血涂層材料，包括透明質(zhì)酸鈉和水蛭素，所述透明質(zhì)酸鈉形成凝膠網(wǎng)絡(luò)，所述水蛭素通過酰胺鍵與所述透明質(zhì)酸鈉共價結(jié)合。
[0007]優(yōu)選地，所述的抗凝血涂層材料，其水蛭素與所述透明質(zhì)酸鈉的質(zhì)量比例為1:1至 1:10。
[0008]優(yōu)選地，所述的抗凝血涂層材料，其水蛭素與所述透明質(zhì)酸鈉的質(zhì)量比例為1:3至 1:5。
[0009]優(yōu)選地，所述的抗凝血涂層材料，還包括交聯(lián)劑。
[0010]優(yōu)選地，所述的抗凝血涂層材料，其交聯(lián)劑為1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)_碳化二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺。
[0011]按照本發(fā)明的另一方面，提供了一種抗凝血涂層材料的制備方法，包括以下步驟:
[0012](I)配制 2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)緩沖溶液(0.lmol/L, pH=6.4)。
[0013](2)使用步驟(1)配制的MES緩沖溶液，加入透明質(zhì)酸鈉，濃度為lmg/ml至20mg/ml，充分溶解制得透明質(zhì)酸鈉溶液；
[0014](3)使用步驟(1)配制的MES緩沖溶液,加入水蛭素,濃度為lmg/ml至10mg/ml,充分溶解制得水蛭素溶液；
[0015](4)將步驟(2)中配制的透明質(zhì)酸鈉溶液和步驟(3)中配制的水蛭素溶液均勻混合，使得水蛭素與透明質(zhì)酸鈉的質(zhì)量比例為1:1至1:10 ;
[0016](5)向步驟(4)中得到的混合溶液中加入交聯(lián)劑，均勻混合，使得水蛭素與透明質(zhì)酸鈉共價交聯(lián)，即制得抗凝血涂層材料。
[0017]優(yōu)選地，所述抗凝血涂層材料制備方法，其步驟(3)中的水蛭素溶液含有質(zhì)量濃度為0.1%至1.0%的吐溫80。
[0018]優(yōu)選地，所述抗凝血涂層材料制備方法，其步驟(5)中使用的交聯(lián)劑為新鮮配制的1-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)-碳化二亞胺溶液和N-羥基琥珀酰亞胺溶液。
[0019]優(yōu)選地，所述抗凝血涂層材料制備方法，其水蛭素、1-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)-碳化二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺的質(zhì)量比例為1:5:1。
[0020]優(yōu)選地，所述抗凝血涂層材料制備方法，還包括:
[0021](6)將步驟(5制得的抗凝血涂層材料進(jìn)行透析，去除交聯(lián)劑。
[0022]總體而言，通過本發(fā)明所構(gòu)思的以上技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比，由于采用分子量較小水蛭素與生物相容性較好的透明質(zhì)酸鈉交聯(lián)物作為抗凝血涂層材料，能夠取得下列有益效果:
[0023]( I)所述抗凝血涂層材料中包含有能直接抑制凝血酶的水蛭素作為抗凝血材料。水蛭素通過阻塞凝血酶的底物結(jié)合基團(tuán)致使凝血酶失去活性，其自由羥基與凝血酶自由氨基通過靜電引力而結(jié)合，產(chǎn)生的絡(luò)合物在凝血酶保持活性的整個PH范圍內(nèi)不會解離，因此水蛭素具有抗凝血活性高、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、不易失活的特點(diǎn)。因此所述抗凝血涂層材料抗凝血活性較高，不易因構(gòu)象變化導(dǎo)致抗凝血因子失活，抗凝血效果穩(wěn)定。透明質(zhì)酸鈉單獨(dú)作為涂層，具有一定的抗凝血作用，如附圖2所示，血小板黏附數(shù)量在1200個/mm2至2000個/mm2之間，比正常水平低，本發(fā)明提供的經(jīng)水蛭素修飾后的透明質(zhì)酸鈉涂層，能發(fā)揮顯著的抗凝血效果，血小板黏附數(shù)量下降到500個/mm2以下，如圖1所示。由此可見本發(fā)明提供的抗凝血涂層材料能發(fā)揮顯著的抗凝血效果。
[0024](2)由于水蛭素是小分子肽，因此單獨(dú)作為抗凝血涂層材料，流失嚴(yán)重導(dǎo)致抗凝血時間短。本發(fā)明采用粘性較強(qiáng)的交聯(lián)呈網(wǎng)狀的透明質(zhì)酸鈉固定水蛭素，水蛭素與透明質(zhì)酸鈉通過酰胺鍵共價結(jié)合，形成穩(wěn)定的凝膠網(wǎng)絡(luò)，可持續(xù)長久的發(fā)揮抗凝血功效。
[0025](3)透明質(zhì)酸鈉能提供高親水性表層，適合長期與血液接觸的表面，同時具有一定的抗凝血效果和良好的生物相容性，能與水蛭素協(xié)同作用，加強(qiáng)其抗凝血效果，使用本發(fā)明提供的抗凝血涂層材料，對植入物進(jìn)行改造，使得植入物本身具有長期穩(wěn)定的抗凝血效果，能幫助減少抗凝血藥的使用，從而盡量避免或減輕抗凝血藥的毒副作用。
[0026](4)本發(fā)明提供的抗凝血涂層材料制備方法，針對水蛭素谷氨酸和天門冬氨酸含量較高的特點(diǎn)，采用酰胺鍵使水蛭素與透明質(zhì)酸鈉共價結(jié)合，能使水蛭素與透明質(zhì)酸鈉結(jié)合穩(wěn)定，從而使抗凝血涂層材料發(fā)揮長久的抗凝血效果。目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道能使水蛭素與透明質(zhì)酸鈉之間形成穩(wěn)定結(jié)合的方法。
[0027](5)由于本發(fā)明提供的抗凝血涂層材料制備方法，采用交聯(lián)劑幫助形成酰胺鍵，能大幅提高反應(yīng)效率，且所選擇的交聯(lián)劑可通過透析去除，殘留少，幾乎沒有毒副作用。
[0028](6)本發(fā)明提供的抗凝血涂層材料制備方法，工藝較為簡單，反應(yīng)條件溫和，適合大批量生產(chǎn)。
[0029]優(yōu)選方案，通過對水蛭素和透明質(zhì)酸鈉的質(zhì)量比例范圍、交聯(lián)劑的種類和交聯(lián)劑添加比例做優(yōu)化，使得抗凝血涂層材料在抗凝血效果、制備難度、生產(chǎn)時間和生產(chǎn)成本之間取得平衡，獲得成本較為低廉，生產(chǎn)相對簡單，抗凝血效果好、抗凝血時間長的抗凝血涂層材料。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]圖1是本發(fā)明提供的抗凝血涂層材料進(jìn)行血小板黏附測試的掃描電子顯微鏡照片;
[0031]圖2是透明質(zhì)酸鈉涂層進(jìn)行血小板粘附測試后的掃描電子顯微鏡照片。
【具體實(shí)施方式】
[0032]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。此外，下面所描述的本發(fā)明各個實(shí)施方式中所涉及到的技術(shù)特征只要彼此之間未構(gòu)成沖突就可以相互組合。
[0033]透明質(zhì)酸鈉是一種酸性粘多糖透明質(zhì)酸的鈉鹽。透明質(zhì)酸在人體各種軟組織中分布廣泛，可以形成凝膠，透明質(zhì)酸具有高度粘彈性、滲透性和獨(dú)特的流變學(xué)特性以及良好的生物相容性，并且透明質(zhì)酸形成的凝膠還是一種可吸收生物材料。
[0034]水蛭素是一種由65個氨基酸組成的低分子量多肽，其中谷氨酸和天門冬酰胺的含量較高，分子量為7000左右，含有三個二硫鍵。水蛭素通過其自由羥基與凝血酶的自由氨基結(jié)合，致使凝血酶失去活性，在這個結(jié)合作用在凝血酶的活性PH范圍內(nèi)不會解離，因此水蛭素具有抗凝血活性高、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、不易失活等特點(diǎn)，此外，水蛭素后期純化成本低，這些優(yōu)點(diǎn)使得水蛭素成為一種抗凝、溶栓的理想原料。
[0035]本發(fā)明提供的一種抗凝血涂層材料，包括透明質(zhì)酸鈉和水蛭素，所述透明質(zhì)酸鈉形成凝膠網(wǎng)絡(luò)，所述水蛭素通過酰胺鍵與所述透明質(zhì)酸鈉共價結(jié)合。所述水蛭素與所述透明質(zhì)酸鈉的質(zhì)量比例為1:1至1:10，優(yōu)選范圍為1:3至1:5。為了縮短交聯(lián)反應(yīng)時間，促進(jìn)酰胺鍵形成，所述抗凝血涂層材料還包括交聯(lián)劑，如1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)。
[0036]本發(fā)明提供的一種抗凝血涂層材料的制備方法，包括以下步驟:
[0037](1)配制2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)緩沖溶液，濃度為0.lmol/L，調(diào)節(jié)pH值至6.4。
[0038]( 2 )配制透明質(zhì)酸鈉溶液:
[0039]取透明質(zhì)酸鈉(HA，分子量約200萬)于2-(N_嗎啡啉)乙磺酸緩沖溶液(MES，
0.1M，pH=6.4)中，使其充分溶解得到透明質(zhì)酸鈉溶液，透明質(zhì)酸鈉溶液濃度為lmg/ml至20mg/ml?？刹捎么帕嚢杓铀偻该髻|(zhì)酸鈉溶解，攪拌12小時。制得的透明質(zhì)酸鈉溶液可密封冷凍保存?zhèn)溆?。[0040](3)配制水蛭素溶液:
[0041]取水蛭素于MES緩沖液中，使水蛭素均勻分散于MES緩沖液中。為增加水蛭素的溶解度，可添加表面活性劑，例如質(zhì)量比例為0.1%至1.0%的吐溫80。制得的水蛭素溶液可密封冷凍保存?zhèn)溆谩?br> [0042](4)將步驟(2)中配制的透明質(zhì)酸鈉溶液和步驟(3)中配制的水蛭素溶液均勻混合:
[0043]在MES緩沖液中加入步驟(2)中制得的透明質(zhì)酸鈉溶液，然后加入水蛭素溶液，使得水蛭素與透明質(zhì)酸鈉的質(zhì)量比例為1:1至1:10，混合均勻。
[0044](5)向步驟(4)中得到的混合溶液中加入交聯(lián)劑: [0045]選擇1-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)_碳化二亞胺(EDC)溶液和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)溶液作為交聯(lián)劑，即EDC/NHS交聯(lián)劑。取新鮮配制的50mg/ml的EDC溶液，加入步驟(4)中得到的混合溶液中，加入比例為水蛭素與EDC質(zhì)量比例1:5，混合均勻后靜置15分鐘。然后取新鮮配制的10mg/ml的NHS溶液，加入所述混合溶液，加入比例為水蛭素與NHS質(zhì)量比例1:1。在避光條件下均勻混合，12小時候得到透明質(zhì)酸鈉與水蛭素交聯(lián)混合物，SP制得所述抗凝血涂層材料。
[0046](6)將步驟(5)制得的抗凝血涂層材料進(jìn)行透析，去除交聯(lián)劑，從而純化抗凝血涂層材料。
[0047]本發(fā)明提供的抗凝血涂層材料，以浸涂法修飾并常溫干燥，即可修飾上具有抗凝血性能的涂層。對本發(fā)明提供的抗凝血涂層材料進(jìn)行血小板黏附測試，測試后用掃面電子顯微鏡成像，照片如圖1所示。僅采用透明質(zhì)酸鈉涂層材料進(jìn)行血小板黏附測試，其測試結(jié)果如圖2所示。對測試結(jié)果進(jìn)行對比，可觀察到，本發(fā)明提供的抗凝血涂層材料發(fā)揮了顯著的抗凝血效果。
[0048]以下為實(shí)施例:
[0049]實(shí)施例1
[0050]一種抗凝血涂層材料，包括透明質(zhì)酸鈉和水蛭素，所述透明質(zhì)酸鈉形成凝膠網(wǎng)絡(luò)，所述水蛭素通過酰胺鍵與所述透明質(zhì)酸鈉共價結(jié)合。所述水蛭素與所述透明質(zhì)酸鈉的質(zhì)量比例為1:1。所述抗凝血涂層材料還包括交聯(lián)劑，1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)。
[0051]所述抗凝血涂層材料的制備方法，包括以下步驟:
[0052](I)配制2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)緩沖溶液，濃度為0.lmol/L，調(diào)節(jié)pH值至6.4。
[0053](2 )配制透明質(zhì)酸鈉溶液。
[0054]取透明質(zhì)酸鈉(HA，分子量約200萬)于2-(N_嗎啡啉)乙磺酸緩沖溶液(MES，
0.1M, pH=6.4)中，使其充分溶解得到透明質(zhì)酸鈉溶液,透明質(zhì)酸鈉溶液濃度為lmg/ml?？刹捎么帕嚢杓铀偻该髻|(zhì)酸鈉溶解，攪拌12小時。制得的透明質(zhì)酸鈉溶液可密封冷凍保存?zhèn)溆谩?br> [0055](3)配制水蛭素溶液。
[0056]取水蛭素于MES緩沖液中，水蛭素濃度為lmg/ml，通過磁力攪拌，使水蛭素均勻分散于MES緩沖液中，加入質(zhì)量濃度為0.1%的吐溫80。制得的水蛭素溶液可密封冷凍保存?zhèn)溆谩?br> [0057](4)將步驟(2)中配制的透明質(zhì)酸鈉溶液和步驟(3)中配制的水蛭素溶液均勻混
口 ο
[0058]在6mL MES緩沖液中加入步驟(2)中制得的透明質(zhì)酸鈉溶液20mL，然后加入步驟(3)制得的水蛭素溶液20mL，透明質(zhì)酸鈉與水蛭素的質(zhì)量比例為1:1，攪拌混合均勻。
[0059](5)向步驟(4)中得到的混合溶液中加入交聯(lián)劑。
[0060]選擇1-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)_碳化二亞胺(EDC)溶液和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)溶液作為交聯(lián)劑，即EDC/NHS交聯(lián)劑。取新鮮配制的50mg/ml的EDC溶液2mL，加入步驟(4)中得到的混合溶液中，水蛭素與EDC質(zhì)量比例1:5，混合均勻后靜置15分鐘。然后取新鮮配制的10mg/ml的NHS溶液2mL，加入所述混合溶液，水蛭素與NHS質(zhì)量比例1:1。在避光條件下均勻混合，12小時候得到透明質(zhì)酸鈉與水蛭素交聯(lián)混合物，即制得所述抗凝血涂層材料。
[0061](6)將步驟(5)制得的抗凝血涂層材料進(jìn)行透析，去除交聯(lián)劑，從而純化抗凝血涂層材料。
[0062]將所述抗凝血涂層材料采用浸凃法涂覆在測試材料聚乙烯(PE)片上，對聚乙烯片做紅外光譜檢測，觀察到 1650-175001^(0=0)和 1200_132001^((:-幻的酰胺(R1-C0-NH-R2)峰增強(qiáng)，說明透明質(zhì)酸鈉與水蛭素發(fā)生酰胺鍵交聯(lián)。
[0063]對所述抗凝 血涂層材料進(jìn)行抗凝血測試:
[0064]將所述抗凝血涂層材料，采用浸涂法涂覆在聚乙烯片上，將聚乙烯片剪成2cm*2cm的正方形，將新鮮血液離心收集富血小板血漿，接種于涂覆了抗凝血涂層的聚乙烯片上，孵育固定脫水后，通過掃描電子顯微鏡觀察血小板粘附情況，將未修飾水蛭素的透明質(zhì)酸鈉涂層作為對照組，結(jié)果表明，修飾水蛭素的透明質(zhì)酸鈉涂層的單位面積血小板粘附數(shù)量為未添加水蛭素的透明質(zhì)酸鈉涂層的樣品的45%，共價結(jié)合水蛭素后提高了涂層的抗凝血能力。
[0065]實(shí)施例2
[0066]一種抗凝血涂層材料，包括透明質(zhì)酸鈉和水蛭素，所述透明質(zhì)酸鈉形成凝膠網(wǎng)絡(luò)，所述水蛭素通過酰胺鍵與所述透明質(zhì)酸鈉共價結(jié)合。所述水蛭素與所述透明質(zhì)酸鈉的質(zhì)量比例為1:3。所述抗凝血涂層材料還包括交聯(lián)劑，1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)。
[0067]所述抗凝血涂層材料的制備方法，包括以下步驟:
[0068](I)配制2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)緩沖溶液，濃度為0.lmol/L，調(diào)節(jié)pH值至6.4。
[0069](2)配制透明質(zhì)酸鈉溶液。
[0070]取透明質(zhì)酸鈉(HA，分子量約200萬)于2-(N_嗎啡啉)乙磺酸緩沖溶液(MES，
0.1M, pH=6.4)中，使其充分溶解得到透明質(zhì)酸鈉溶液,透明質(zhì)酸鈉溶液濃度為3mg/ml?？刹捎么帕嚢杓铀偻该髻|(zhì)酸鈉溶解，攪拌12小時。制得的透明質(zhì)酸鈉溶液可密封冷凍保存?zhèn)溆谩?br> [0071](3)配制水蛭素溶液。
[0072]取水蛭素于MES緩沖溶液中，水蛭素濃度為lmg/ml，通過磁力攪拌，使水蛭素均勻分散于MES緩沖液中，加入質(zhì)量濃度為0.1%的吐溫80。制得的水蛭素溶液可密封冷凍保存?zhèn)溆谩?br> [0073](4)將步驟(2)中配制的透明質(zhì)酸鈉溶液和步驟(3)中配制的水蛭素溶液均勻混
口 ο
[0074]在6mL MES緩沖液中加入步驟(2)中制得的透明質(zhì)酸鈉溶液20mL，然后加入步驟
(3)制得的水蛭素溶液20mL，水蛭素與透明質(zhì)酸鈉的質(zhì)量比例為1:3，攪拌混合均勻。
[0075](5)向步驟(4)中得到的混合溶液中加入交聯(lián)劑。
[0076]選擇1-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)_碳化二亞胺(EDC)溶液和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)溶液作為交聯(lián)劑，即EDC/NHS交聯(lián)劑。取新鮮配制的50mg/ml的EDC溶液2mL，加入步驟(4)中得到的混合溶液中，水蛭素與EDC質(zhì)量比例1:5，混合均勻后靜置15分鐘。然后取新鮮配制的10mg/ml的NHS溶液2mL，加入所述混合溶液，水蛭素與NHS質(zhì)量比例1:1。在避光條件下均勻混合，12小時候得到透明質(zhì)酸鈉與水蛭素交聯(lián)混合物，即制得所述抗凝血涂層材料。
[0077]將所述抗凝血涂層材料采用浸凃法涂覆在測試材料聚乙烯(PE)片上，對聚乙烯片做紅外光譜檢測，觀察到 1650-175001^(0=0)和 1200_132001^((:-幻的酰胺(R1-C0-NH-R2)峰增強(qiáng)，說明透明質(zhì)酸鈉與水蛭素發(fā)生酰胺鍵交聯(lián)。[0078]對所述抗凝血涂層材料進(jìn)行抗凝血測試:
[0079]將所述抗凝血涂層材料，采用浸涂法涂覆在聚乙烯片上，將聚乙烯片剪成2cm*2cm的正方形，將新鮮血液離心收集富血小板血漿，接種于涂覆了抗凝血涂層的聚乙烯片上，孵育固定脫水后，通過掃描電子顯微鏡觀察血小板粘附情況，將未修飾水蛭素的透明質(zhì)酸鈉涂層作為對照組，結(jié)果表明，修飾水蛭素的透明質(zhì)酸鈉涂層的單位面積血小板粘附數(shù)量為未添加水蛭素的透明質(zhì)酸鈉涂層的樣品的23%，共價結(jié)合水蛭素后提高了涂層的抗凝血能力。
[0080]實(shí)施例3
[0081]一種抗凝血涂層材料，包括透明質(zhì)酸鈉和水蛭素，所述透明質(zhì)酸鈉形成凝膠網(wǎng)絡(luò)，所述水蛭素通過酰胺鍵與所述透明質(zhì)酸鈉共價結(jié)合。所述水蛭素與所述透明質(zhì)酸鈉的質(zhì)量比例為1:4。所述抗凝血涂層材料還包括交聯(lián)劑，1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)。
[0082]所述抗凝血涂層材料的制備方法，包括以下步驟:
[0083](I)配制2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)緩沖溶液，濃度為0.lmol/L，調(diào)節(jié)pH值至
6.4。
[0084]( 2 )配制透明質(zhì)酸鈉溶液。
[0085]取透明質(zhì)酸鈉(HA，分子量約200萬)于2-(N_嗎啡啉)乙磺酸緩沖溶液(MES，
0.1M，pH=6.4)中，使其充分溶解得到透明質(zhì)酸鈉溶液，透明質(zhì)酸鈉溶液濃度為5mg/ml?？刹捎么帕嚢杓铀偻该髻|(zhì)酸鈉溶解，攪拌12小時。制得的透明質(zhì)酸鈉溶液可密封冷凍保存?zhèn)溆谩?br> [0086](3)配制水蛭素溶液。
[0087]取水蛭素于MES緩沖溶液中，水蛭素濃度為2.5mg/ml,通過磁力攪拌，使水蛭素均勻分散于MES緩沖液中，加入質(zhì)量濃度為0.5%的吐溫80。制得的水蛭素溶液可密封冷凍保存?zhèn)溆谩?br> [0088](4)將步驟(2)中配制的透明質(zhì)酸鈉溶液和步驟(3)中配制的水蛭素溶液均勻混合。
[0089]在6mL MES緩沖液中加入步驟(2)中制得的透明質(zhì)酸鈉溶液8mL，然后加入步驟(3)制得的水蛭素溶液4mL，水蛭素與透明質(zhì)酸鈉的質(zhì)量比例為1:4，攪拌混合均勻。
[0090](5)向步驟(4)中得到的混合溶液中加入交聯(lián)劑。
[0091]選擇1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)_碳化二亞胺(EDC)溶液和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)溶液作為交聯(lián)劑，即EDC/NHS交聯(lián)劑。取新鮮配制的50mg/ml的EDC溶液lmL，加入步驟(4)中得到的混合溶液中，水蛭素與EDC質(zhì)量比例1:5，混合均勻后靜置15分鐘。然后取新鮮配制的10mg/ml的NHS溶液lmL，加入所述混合溶液，水蛭素與NHS質(zhì)量比例1:1。在避光條件下均勻混合，12小時候得到透明質(zhì)酸鈉與水蛭素交聯(lián)混合物，即制得所述抗凝血涂層材料。
[0092](6)將步驟(5)制得的抗凝血涂層材料進(jìn)行透析，去除交聯(lián)劑，從而純化抗凝血涂層材料。
[0093]將所述抗凝血涂層材料采用浸凃法涂覆在測試材料聚乙烯(PE)片上，對聚乙烯片做紅外光譜檢測，觀察到 1650-175001^(0=0)和 1200_132001^((:-幻的酰胺(R1-C0-NH-R2)峰增強(qiáng)，說明透明質(zhì)酸鈉與水蛭素發(fā)生酰胺鍵交聯(lián)。
[0094]對所述抗凝血涂層材料進(jìn)行抗凝血測試:
[0095]將所述抗凝血涂層材料，采用浸涂法涂覆在聚乙烯片上，將聚乙烯片剪成2cm*2cm的正方形，將新鮮血液離心收集富血小板血漿，接種于涂覆了抗凝血涂層的聚乙烯片上，孵育固定脫水后，通過掃描電子顯微鏡觀察血小板粘附情況，將未修飾水蛭素的透明質(zhì)酸鈉涂層作為對照組，結(jié)果表明，修飾水蛭素的透明質(zhì)酸鈉涂層的單位面積血小板粘附數(shù)量為未添加水蛭素的透明質(zhì)酸鈉涂層的樣品的25%，共價結(jié)合水蛭素后提高了涂層的抗凝血能力。
[0096]實(shí)施例4
[0097]—種抗凝血涂層材料，包括透明質(zhì)酸鈉和水蛭素，所述透明質(zhì)酸鈉形成凝膠網(wǎng)絡(luò)，所述水蛭素通過酰胺鍵與所述透明質(zhì)酸鈉共價結(jié)合。所述水蛭素與所述透明質(zhì)酸鈉的質(zhì)量比例為1:5。所述抗凝血涂層材料還包括交聯(lián)劑，1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)_碳化二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)。
[0098]所述抗凝血涂層材料的制備方法，包括以下步驟:
[0099](I)配制2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)緩沖溶液，濃度為0.lmol/L，調(diào)節(jié)pH值至6.4。
[0100](2)配制透明質(zhì)酸鈉溶液:
[0101]取透明質(zhì)酸鈉(HA，分子量約200萬)于2-(N_嗎啡啉)乙磺酸緩沖溶液(MES，
0.1Μ，ρΗ=6.4)中，使其充分溶解得到透明質(zhì)酸鈉溶液，透明質(zhì)酸鈉溶液濃度為10mg/ml?？刹捎么帕嚢杓铀偻该髻|(zhì)酸鈉溶解，攪拌12小時。制得的透明質(zhì)酸鈉溶液可密封冷凍保存?zhèn)溆谩?br> [0102](3)配制水蛭素溶液。
[0103]取水蛭素于MES緩沖溶液中，水蛭素濃度為5mg/ml，通過磁力攪拌，使水蛭素均勻分散于MES緩沖液中，加入質(zhì)量濃度為0.5%的吐溫80。制得的水蛭素溶液可密封冷凍保存?zhèn)溆谩?br> [0104](4)將步驟(2)中配制的透明質(zhì)酸鈉溶液和步驟(3)中配制的水蛭素溶液均勻混
口 ο[0105]在2mL MES緩沖液中加入步驟(2)中制得的透明質(zhì)酸鈉溶液10mL，然后加入步驟(3 )制得的水蛭素溶液4mL，水蛭素與透明質(zhì)酸鈉的質(zhì)量比例為1:5，攪拌混合均勻。
[0106](5)向步驟(4)中得到的混合溶液中加入交聯(lián)劑。
[0107]選擇1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)_碳化二亞胺(EDC)溶液和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)溶液作為交聯(lián)劑，即EDC/NHS交聯(lián)劑。取新鮮配制的50mg/ml的EDC溶液2mL，加入步驟(4)中得到的混合溶液中，水蛭素與EDC質(zhì)量比例1:5，混合均勻后靜置15分鐘。然后取新鮮配制的10mg/ml的NHS溶液2mL，加入所述混合溶液，水蛭素與NHS質(zhì)量比例1:1。在避光條件下均勻混合，12小時候得到透明質(zhì)酸鈉與水蛭素交聯(lián)混合物，即制得所述抗凝血涂層材料。
[0108]將所述抗凝血涂層材料采用浸凃法涂覆在測試材料聚乙烯(PE)片上，對聚乙烯片做紅外光譜檢測，觀察到 1650-175001^(0=0)和 1200_132001^((:-幻的酰胺(R1-C0-NH-R2)峰增強(qiáng)，說明透明質(zhì)酸鈉與水蛭素發(fā)生酰胺鍵交聯(lián)。
[0109]對所述抗凝血涂層材料進(jìn)行抗凝血測試:
[0110]將所述抗凝血涂層材料，采用浸涂法涂覆在聚乙烯片上，將聚乙烯片剪成2cm*2cm的正方形，將新鮮血液離心收集富血小板血漿，接種于涂覆了抗凝血涂層的聚乙烯片上，孵育固定脫水后，通過掃描電子顯微鏡觀察血小板粘附情況，將未修飾水蛭素的透明質(zhì)酸鈉涂層作為對照組，結(jié)果表明，修飾水蛭素的透明質(zhì)酸鈉涂層的單位面積血小板粘附數(shù)量為未添加水蛭素的透明質(zhì)酸鈉涂層的樣品的30%，共價結(jié)合水蛭素后提高了涂層的抗凝血能力。
[0111]實(shí)施例5
[0112]—種抗凝血涂層材料，包括透明質(zhì)酸鈉和水蛭素，所述透明質(zhì)酸鈉形成凝膠網(wǎng)絡(luò)，所述水蛭素通過酰胺鍵與所述透明質(zhì)酸鈉共價結(jié)合。所述水蛭素與所述透明質(zhì)酸鈉的質(zhì)量比例為1:10。所述抗凝血涂層材料還包括交聯(lián)劑，1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)_碳化二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)。
[0113]所述抗凝血涂層材料的制備方法，包括以下步驟:
[0114](I)配制2-(N_嗎啡啉)乙磺酸(MES)緩沖溶液，濃度為0.lmol/L，調(diào)節(jié)pH值至
6.4。
[0115](2)配制透明質(zhì)酸鈉溶液。
[0116]取透明質(zhì)酸鈉(HA，分子量約200萬)于2-(N_嗎啡啉)乙磺酸緩沖溶液(MES，
0.1Μ，ρΗ=6.4)中，使其充分溶解得到透明質(zhì)酸鈉溶液，透明質(zhì)酸鈉溶液濃度為20mg/ml?？刹捎么帕嚢杓铀偻该髻|(zhì)酸鈉溶解，攪拌12小時。制得的透明質(zhì)酸鈉溶液可密封冷凍保存?zhèn)溆谩?br> [0117](3)配制水蛭素溶液。
[0118]取水蛭素于MES緩沖溶液中，水蛭素濃度為10mg/ml，通過磁力攪拌，使水蛭素均勻分散于MES緩沖液中，加入質(zhì)量濃度為1.0%的吐溫80。制得的水蛭素溶液可密封冷凍保存?zhèn)溆谩?br> [0119](4)將步驟(2)中配制的透明質(zhì)酸鈉溶液和步驟(3)中配制的水蛭素溶液均勻混
口 O
[0120]在4mL MES緩沖液中加入步驟(2)中制得的透明質(zhì)酸鈉溶液10mL，然后加入步驟
(3)制得的水蛭素溶液2mL，水蛭素與透明質(zhì)酸鈉的質(zhì)量比例為1:10，攪拌混合均勻。
[0121](5)向步驟(4)中得到的混合溶液中加入交聯(lián)劑。
[0122]選擇1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)_碳化二亞胺(EDC)溶液和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)溶液作為交聯(lián)劑，即EDC/NHS交聯(lián)劑。取新鮮配制的50mg/ml的EDC溶液2mL，加入步驟(4)中得到的混合溶液中，水蛭素與EDC質(zhì)量比例1:5，混合均勻后靜置15分鐘。然后取新鮮配制的10mg/ml的NHS溶液2mL，加入所述混合溶液，水蛭素與NHS質(zhì)量比例1:1。在避光條件下均勻混合，12小時候得到透明質(zhì)酸鈉與水蛭素交聯(lián)混合物，即制得所述抗凝血涂層材料。
[0123]將所述抗凝血涂層材料采用浸凃法涂覆在測試材料聚乙烯(PE)片上，對聚乙烯片做紅外光譜檢測，觀察到 1650-175001^(0=0)和 1200_132001^((:-幻的酰胺(R1-C0-NH-R2)峰增強(qiáng)，說明透明質(zhì)酸鈉與水蛭素發(fā)生酰胺鍵交聯(lián)。
[0124]對所述抗凝血涂層材料進(jìn)行抗凝血測試:`[0125]將所述抗凝血涂層材料，采用浸涂法涂覆在聚乙烯片上，將聚乙烯片剪成2cm*2cm的正方形，將新鮮血液離心收集富血小板血漿，接種于涂覆了抗凝血涂層的聚乙烯片上，孵育固定脫水后，通過掃描電子顯微鏡觀察血小板粘附情況，將未修飾水蛭素的透明質(zhì)酸鈉涂層作為對照組，結(jié)果表明，修飾水`蛭素的透明質(zhì)酸鈉涂層的單位面積血小板粘附數(shù)量為未添加水蛭素的透明質(zhì)酸鈉涂層的樣品的50%，共價結(jié)合水蛭素后提高了涂層的抗凝血能力。
[0126]本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種抗凝血涂層材料，其特征在于，包括透明質(zhì)酸鈉和水蛭素，所述透明質(zhì)酸鈉形成凝膠網(wǎng)絡(luò)，所述水蛭素通過酰胺鍵與所述透明質(zhì)酸鈉共價結(jié)合。
2.如權(quán)利要求1所述的抗凝血涂層材料，其特征在于，所述水蛭素與所述透明質(zhì)酸鈉的質(zhì)量比例為1:1至1:10。
3.如權(quán)利要求2所述的抗凝血涂層材料，其特征在于，所述水蛭素與所述透明質(zhì)酸鈉的質(zhì)量比例為1:3至1:5。
4.如權(quán)利要求1至3任意一項(xiàng)所述的抗凝血涂層材料，其特征在于，所述抗凝血涂層材料還包括交聯(lián)劑。
5.如權(quán)利要求4所述的抗凝血涂層材料，其特征在于，所述交聯(lián)劑為1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺。
6.一種抗凝血涂層材料的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)配制2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)緩沖溶液。 (2)使用步驟(1)配制的MES緩沖溶液,加入透明質(zhì)酸鈉，濃度為lmg/ml至20mg/ml,充分溶解制得透明質(zhì)酸鈉溶液； (3)使用步驟(1)配制的MES緩沖溶液,加入水蛭素,濃度為lmg/ml至10mg/ml,充分溶解制得水蛭素溶液； (4)將步驟(2)中配制的透明質(zhì)酸鈉溶液和步驟(3)中配制的水蛭素溶液均勻混合，使得水蛭素與透明質(zhì)酸鈉的質(zhì)量比例為1:1至1:10 ; (5)向步驟(4)中得到的混合溶液中加入交聯(lián)劑，均勻混合，使得水蛭素與透明質(zhì)酸鈉共價交聯(lián)，即制得抗凝血涂層材`料。
7.如權(quán)利要求6所述的抗凝血涂層材料制備方法，其特征在于，所述步驟(3)中的水蛭素溶液含有質(zhì)量濃度為0.1%至1.0%的吐溫80。
8.如權(quán)利要求6所述的抗凝血涂層材料制備方法，其特征在于，所述步驟(5)中使用的交聯(lián)劑為新鮮配制的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺溶液和N-羥基琥珀酰亞胺溶液。
9.如權(quán)利要求8所述的抗凝血涂層材料制備方法，其特征在于，所述水蛭素、1-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)-碳化二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺的質(zhì)量比例為1:5:1。
10.如權(quán)利要求6至9任意一項(xiàng)所述的抗凝血涂層材料制備方法，其特征在于，還包括: (6)將步驟(5)制得的抗凝血涂層材料進(jìn)行透析，去除交聯(lián)劑。
【文檔編號】A61L33/12GK103721300SQ201310700680
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2013年12月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月19日
【發(fā)明者】馬軍, 方堃, 雷冰雨, 花城 申請人:華中科技大學(xué)