一種抗 cd26 抗體及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種新的可與CD26特異性結(jié)合的高親和力全人源抗體、制備方法及其應(yīng)用，屬于基因工程抗體【技術(shù)領(lǐng)域】。CD26是一種普遍存在的多功能Ⅱ型跨膜糖蛋白，具有多種生物學(xué)功能，可以和多種蛋白相互作用，如ADA、CD45、FAP-alpha等。本發(fā)明提供的一種來源于人源的抗體或其片段，所述抗體或其片段特異性結(jié)合人CD26，優(yōu)選特異性結(jié)合CD26胞外區(qū)，所述抗體或其片段的氨基酸序列包括選自含有SEQ?ID?NO:2、SEQ?ID?NO:3、SEQ?ID?NO:4、SEQ?ID?NO:6、SEQ?ID?NO:7、SEQ?ID?NO:8一組序列的6個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)的任何區(qū)域的單克隆抗體或其片段或其片段的偶聯(lián)物，或通過氨基酸置換或者修飾得到的氨基酸序列。本發(fā)明得到的抗CD26單鏈抗體與CD26具有高特異性結(jié)合，同時(shí)也可以明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移。
【專利說明】一種抗CD26抗體及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程抗體【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其是涉及一種新的可與CD26特異性結(jié)合的高親和力全人源抗體、制備方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]⑶26是一種普遍存在的多功能II型跨膜糖蛋白，具有多種生物學(xué)功能，也可以以溶解形式存在于血漿中。CD26常以同源二聚體形式存在，其單體含766個(gè)氨基酸，相對分子質(zhì)量約llOkDa。氨基酸殘基從內(nèi)向外分為5個(gè)部分:胞內(nèi)區(qū)(I~6)、跨膜區(qū)(7~28)、高度糖基化區(qū)(29~323)、富含半胱氨酸區(qū)(324~551)和C端催化結(jié)構(gòu)域(552~766)，⑶26分子三維結(jié)構(gòu)與功能密切相關(guān)。⑶26的C端催化結(jié)構(gòu)域發(fā)揮二肽基肽酶IV (Dipeptidylpeptidase4,DPPIV)活性，可以水解體內(nèi)多種底物發(fā)揮生物學(xué)作用，富含半胱氨酸區(qū)可以和體內(nèi)多種分子相互作用，從而參與體內(nèi)免疫功能。CD26在免疫調(diào)節(jié)中的作用已被廣泛研究，CD26是T細(xì)胞活化的分子標(biāo)志，也在T細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中作為共刺激分子，還涉及多種T細(xì)胞功能，包括T細(xì)胞發(fā)生成熟及遷移，細(xì)胞因子分泌，T細(xì)胞依賴的抗體產(chǎn)生，B細(xì)胞免疫球蛋白轉(zhuǎn)型等。CD26在自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，已成為臨床疾病的分子標(biāo)志，并被認(rèn)為是某些免疫性疾病的治療或診斷靶點(diǎn)。(Ohnuma et al.(2011)AdvClin Chem, 53，51-84)
[0003]⑶26由于可以和多種蛋白相互作用，如ADA、⑶45、FAP-alpha等，還可以結(jié)合ECM,導(dǎo)致表達(dá)CD26細(xì)胞浸潤活性的增加或降低，可見CD26在腫瘤生物學(xué)發(fā)揮重要作用。⑶26的表達(dá)量在多種的新生瘤細(xì)胞表面或血清中會升高，例如，⑶26高表達(dá)于某些進(jìn)攻性T細(xì)胞惡性腫瘤，惡`性間皮瘤，腎瘤，某些結(jié)腸癌(Havre et al.(2008) FrontBiosci，13，1634-1645)。某些CD26+結(jié)腸癌細(xì)胞亞群，CD26+惡性間皮瘤細(xì)胞都有明顯腫瘤干細(xì)胞特征(Ghani et al.(2011)Biochem Biophys Res Commun, 404, 735-742and Panget al.(2010)Cell Stem Cell, 6，603-615)，因此CD26可作為多種腫瘤的分子標(biāo)志。
[0004]已有多種結(jié)合⑶26的鼠源抗體報(bào)道(Havre et al.(2008)FrontBiosci, 13，1634-1645)，在治療某些⑶26高表達(dá)癌癥，以及抑制細(xì)胞遷移，血管形成方面都能發(fā)揮作用。有文獻(xiàn)報(bào)道抗CD26的鼠單克隆抗體1F7與CD26的結(jié)合導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯在G1/S限制點(diǎn)，并且CD26的結(jié)合通過增強(qiáng)表達(dá)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)p21來誘導(dǎo)⑶26Jurkat轉(zhuǎn)染子停滯在Gl，用1F7抗體治療可以抑制⑶26+腫瘤的形成，并在小鼠模型中增強(qiáng)存活率。其他抗CD26的鼠單克隆抗體E19和E26，這些抗體表現(xiàn)出抑制成纖維細(xì)胞和創(chuàng)傷細(xì)胞的細(xì)胞遷移來形成單層的抑制作用、對血管形成的抑制效果、以及對人皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞的侵入和毛細(xì)管新支的形成具有抑制效果。由此可見，抗CD26單克隆抗體可通過改變CD26的活性在治療多種疾病中發(fā)揮作用。但是，鼠單克隆抗體在直接應(yīng)用于人體治療時(shí)會產(chǎn)生人抗鼠抗體反應(yīng)(Human Ant1-Mouse Antibody, HAMA),人體會產(chǎn)生抗小鼠抗體的抗體，不僅會減弱療效，也會導(dǎo)致急性致敏反應(yīng)。為了克服鼠源單抗的缺點(diǎn)，基因工程抗體技術(shù)發(fā)展出了人-鼠嵌合抗體，嵌合抗體由鼠源性抗體的V區(qū)基因與人抗體的C區(qū)基因拼接為嵌合基因，使鼠源性成分減少70%左右，以及人源化抗體，在嵌合抗體的基礎(chǔ)上進(jìn)一步用人抗體可變區(qū)的骨架區(qū)(FR)替代鼠FR，大大減少了抗體的鼠源成分。但殘留的少量鼠抗體的序列仍有可能潛在引發(fā)HAMA。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題:本發(fā)明旨在提供一種能有效的、特異性結(jié)合人CD26的全人源抗體，及其在制備治療以CD26的表達(dá)，特別是過量表達(dá)為特征的疾病，診斷CD26變化性表達(dá)疾病的藥物中的新用途。更具體地說:
[0006]本發(fā)明第一個(gè)目的是提供一種來源于人源的抗體或其片段，所述抗體或其片段特異性結(jié)合人CD26，優(yōu)選特異性結(jié)合CD26胞外區(qū)，所述抗體或其片段的氨基酸序列包括選自含有 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8一組序列的6個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)的任何區(qū)域的單克隆抗體或其片段或其片段的偶聯(lián)物，或通過氨基酸置換或者修飾得到的氨基酸序列。
[0007]優(yōu)選的是本發(fā)明中的抗體或其片段的氨基酸序列含有如SEQ ID NO:2, SEQ IDN0:3和SEQ ID N0:4所示序列的重鏈可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)。
[0008]優(yōu)選的是本發(fā)明中的抗體或其片段的氨基酸序列含有如SEQ ID NO:6, SEQ IDN0:7和SEQ ID N0:8所示序列的輕鏈可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)。
[0009]更為優(yōu)選的是本發(fā)明中的抗體或其片段，其重鏈可變區(qū)的氨基酸序列含有以下的互補(bǔ)決定區(qū):如序列SEQ ID NO:2所示的CDRH1，如序列SEQ ID NO:3所示的CDRH2，如序列 SEQ ID NO:4 所示的 CDRH3 ；
[0010]以及其輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列含有以下的互補(bǔ)決定區(qū):如序列SEQ ID NO:6所示的CDRL1，如序列SEQ ID NO:7所示的CDRL2和如序列SEQ ID NO:8所示的CDRL3。
[0011]更為優(yōu)選的是本發(fā)明中的抗體或其片段含有重鏈可變區(qū)如SEQ ID NO:1所示序列和輕鏈可變區(qū)如SEQ ID N0:5所示序列。
[0012]本發(fā)明第二個(gè)目的是提供一種來源于人源的單鏈抗體，所述單鏈抗體的氨基酸序列如SEQ ID NO: 11所示。
[0013]本發(fā)明第三個(gè)目的是提供一種編碼上述單鏈抗體的核苷酸序列，所述核苷酸序列如 SEQ ID NO: 10 所示。
[0014]本發(fā)明第四個(gè)目的是提供一種含有上述核苷酸序列的表達(dá)載體。
[0015]本發(fā)明第五個(gè)目的是提供一種含有上述表達(dá)載體的重組宿主菌。
[0016]本發(fā)明第六個(gè)目的是提供一種生產(chǎn)上述單鏈抗體的方法，包括:
[0017]I)在合適的條件下培養(yǎng)上述重組宿主菌表達(dá)抗體；
[0018]2)然后從宿主菌中純化、收集抗體。
[0019]本發(fā)明第七個(gè)目的是提供上述抗體或其片段在制備治療CD26高表達(dá)腫瘤的藥物中的新用途。可治療以CD26的表達(dá)，特別是過量表達(dá)為特征的疾病，并為診斷CD26變化性表達(dá)疾病提供了基于抗體的方法，相關(guān)疾病包括但不限于自身免疫病和癌癥。
[0020]發(fā)明進(jìn)一步說明:
[0021]本發(fā)明中全人源抗⑶26單鏈抗體基因序列全長717個(gè)核苷酸，預(yù)期有239個(gè)氨基酸。具有115個(gè)氨基酸的重鏈可變區(qū)(SEQ ID NO:1)和109個(gè)氨基酸的輕鏈可變區(qū)(SEQ IDNO: 5)，重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)之間由15個(gè)氨基酸的柔性肽連接(SEQ ID N0:9)。
[0022]含有本發(fā)明CD26單鏈抗體基因的表達(dá)載體和宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。擴(kuò)增本發(fā)明單鏈抗體基因的任意片段的引物對也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0023]本發(fā)明的有益效果有:
[0024]本發(fā)明中的抗體或其片段具有多種特性，包括結(jié)合并中和CD26的能力。具體而言，本發(fā)明得到的抗CD26單鏈抗體與CD26具有高特異性結(jié)合，體外可以抑制腫瘤細(xì)胞通過CD26介導(dǎo)的細(xì)胞粘附作用，體外抑制腫瘤細(xì)胞生長實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明得到的單鏈抗體可以明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1是單鏈抗體ZHB-pA12的結(jié)構(gòu)示意圖。VH代表重鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域(SEQ IDNO: 1)，VL代表輕鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO: 5)，Linker為連接VH，VL的柔性肽(SEQ IDN0:9)。
[0026]圖2是⑶26胞外區(qū)蛋白的鑒定圖。A是純化后蛋白的SDS-PAGE圖，LaneI為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，Lane2為純化后⑶26胞外區(qū)蛋白(箭頭所指);B是純化后⑶26胞外區(qū)蛋白的WesternBlot鑒定圖，Lanel為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，Lane2為純化后(D26胞外區(qū)蛋白(fir頭所指),一抗為抗CD26鼠抗(購自MBL)，二抗為兔抗鼠-HRP抗體(購自life technology)。
[0027]圖3A、圖3B是噬菌體抗體與⑶26胞外區(qū)蛋白結(jié)合的ELISA測定結(jié)果。圖3A是多克隆噬菌體ELISA，⑶26胞外區(qū)蛋白包被濃度為I μ g/mL，稀釋4輪篩選擴(kuò)增的噬菌體，與包被⑶26胞外區(qū)蛋白的酶標(biāo)板孵育，抗M13-HRP抗體再次孵育，測定450nm，650nm吸光值，并以O(shè)D45tlm1-OD65tlnm作為最終值。結(jié)果表明，展示有CD26特異性單鏈抗體的噬菌體得到了明顯的富集。圖3B是單克隆噬菌體ELISA測定結(jié)果，挑選單克隆至96孔板中表達(dá)噬菌體抗體，與包被CD26胞外區(qū)蛋白的酶標(biāo)板孵育，`抗M13-HRP抗體檢測結(jié)果，測定OD45tol-OD65tlnm作為最終值，結(jié)果顯示90%以上的單克隆與CD26胞外區(qū)蛋白產(chǎn)生陽性結(jié)合作用。
[0028]圖4是單鏈抗體ZHB-pA12的鑒定圖。A是鎳柱純化后的ZHB_pA12的SDS-PAGE圖,Lane2為ZHB-pA12樣品蛋白，蛋白fif頭所指為目的蛋白大小條帶；Lanel為標(biāo)準(zhǔn)蛋白；B是純化后ZHB-pA12的Western Blot鑒定圖，一抗為抗myc鼠抗,二抗為兔抗鼠-HRP抗體，Lanel為ZHB_pA12樣品，蛋白箭頭所指為目的蛋白大小條帶，Lane2為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。
[0029]圖5展示單鏈抗體ZHB-pA12與CD26胞外區(qū)蛋白結(jié)合的Western Blot鑒定圖。一抗為抗myc鼠抗，二抗為兔抗鼠-HRP抗體。Lanel為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，Lane2為ZHB_pA12與⑶26胞外區(qū)蛋白結(jié)合作用，箭頭所指顯示了與圖2中CD26胞外區(qū)蛋白大小一致的條帶。結(jié)果表明表明抗⑶26單鏈抗體ZHB-pA12可以特異性與⑶26胞外區(qū)蛋白結(jié)合。
[0030]圖6展示單鏈抗體與人間皮瘤細(xì)胞NC1-H2452結(jié)合的免疫熒光圖。A是ZHB_pA12與NC1-H2452細(xì)胞的免疫熒光，B是陰性對照抗體與NC1-H2452細(xì)胞免疫熒光結(jié)合檢測的陰性結(jié)果，抗體濃度均由5%MPBS稀釋至10 μ g/mL。
[0031]圖7展示單鏈抗體抑制人間皮瘤細(xì)胞NC1-H2452結(jié)合ECM的檢測結(jié)果。實(shí)驗(yàn)所用ECM為纖連蛋白，實(shí)驗(yàn)分為Binding組，Blank組,抗體試驗(yàn)組,考察單鏈抗體作用12h后的細(xì)胞對纖連蛋白的粘附情況。
[0032]0D450 (Binding 組)-0D450 (Blank 組)=完全粘附細(xì)胞值；[0033]0D450 (抗體試驗(yàn)組)-0D450 (Blank組)=樣品組的細(xì)胞粘附值；
[0034]IgG control為陰性對照抗體；
[0035]細(xì)胞粘附率(％)=樣品組的細(xì)胞粘附值/完全粘附細(xì)胞值
[0036]結(jié)果表明，與陰性對照IgG control相比，ZHB_pA12及陽性對照scFv-YSllO對NC1-H2452細(xì)胞粘附均有明顯抑制作用。
[0037]圖8展示單鏈抗體對人間皮瘤NC1-H2452細(xì)胞增殖抑制的檢測結(jié)果。細(xì)胞以I X IO4/孔的數(shù)量孵于96孔板中，在單鏈抗體ZHB-PA12，scFv-YSllO及陰性對照抗體IgG(鼠)作用48h后，采用CCK-8試劑反應(yīng)30min，測定450nm的吸光度值，細(xì)胞的增殖抑制率以0D450nm的減少率％表示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ZHB_pA12及陽性對照scFv-YSllO對NC1-H2452均有明顯抑制作用，且呈濃度依賴性。
[0038]圖9展示單鏈抗體對人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞增殖抑制的檢測結(jié)果。細(xì)胞以8X IO4/孔的數(shù)量孵于96孔板中，在單鏈抗體ZHB-pA12，scFv-YSllO及陰性對照抗體IgG (鼠)作用48h后，采用CCK-8試劑反應(yīng)30min，測定450nm的吸光度值，細(xì)胞的增殖抑制率以0D450nm的減少率％表示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ZHB-pA12及陽性對照scFv-YSllO對NC1-H2452均有明顯抑制作用，且呈濃度依賴性。
【具體實(shí)施方式】
[0039]現(xiàn)在結(jié)合以下實(shí)施例說明本發(fā)明。提供這些實(shí)施例僅用于說明的目的，本發(fā)明不限于這些實(shí)施例，而是包含明顯由本文提供的教導(dǎo)產(chǎn)生的所有改變。用于構(gòu)建載體和質(zhì)粒、將質(zhì)粒導(dǎo)入宿主細(xì)胞和基因， 以及基因產(chǎn)物的表達(dá)鑒定等常規(guī)方法的詳細(xì)描述可以從各種出版物上獲得，例如《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南第三版》。實(shí)施例中涉及的百分比，其中固體試劑為重量百分比，液體試劑為體積百分比。
[0040]部分材料來源說明于此:
[0041]細(xì)胞系:HLF細(xì)胞，是人的未分化的肝癌細(xì)胞，獲自JCRB cell bank (JapaneseCollection of Research Bioresources Cell Bank)。NC1-H2452,是人間皮瘤細(xì)胞，獲自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫/中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。HCT116，是人結(jié)腸癌細(xì)胞，獲自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫/中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。
[0042]培養(yǎng)基和緩沖液等試劑:RPM1-1640(GIBC0，Cat#31800022,添加NaHCO3L 5g/L,glucose2.5g/L, Sodium Pyruvate0.llg/L), 90% ;優(yōu)質(zhì)胎牛血清，(GIBCO) 10%。
[0043]2YT 培養(yǎng)基:IL 內(nèi)含 Trptone (OXID) 16g, Yeast Extract (OXID) IOg, NaC15g.[0044]2YT-AK培養(yǎng)基:2YT含100 μ g/mL氨芐青霉素和50 μ g/mL卡那霉素.[0045]2YT-AG培養(yǎng)基:2YT含100 μ g/mL氨芐青霉素和2%葡萄糖.[0046]10XPBS:(購自北京索萊寶，Cat#P1022).[0047]5%MPBS 或 2%MPBS:含有 5% 或 2% 脫脂奶粉(OXID)的 PBS.[0048]0.1%PBST:含有 0.l%Tween20 (購自北京索萊寶)的 PBS.[0049]2%BSA:含有 2%BSA (購自 MP Biomedicals)的 PBS
[0050]Amp:氨芐青霉素(購自上海生工).[0051]Kan:卡那霉素(購自上海生工).[0052]IPTG:(購自 Amresco).[0053]其他常見試劑如鹽酸，NaCl, Tris,甘氨酸等購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
[0054]菌株:TG1，大腸桿菌(獲自中國微生物菌種網(wǎng))；HB2151，大腸桿菌(獲自中國微生物菌種網(wǎng))
[0055]質(zhì)粒:p3XFLAG_CMV9(購自 Sigma-Aldrich) ；pHEN2 (獲自 Medical ResearchCouncil(UK))
[0056]實(shí)施例1⑶26胞外區(qū)蛋白的制備
[0057]本研究的目的在于通過重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，G418抗性篩選獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，分泌表達(dá)⑶26胞外區(qū)蛋白，經(jīng)親和層析分離純化出⑶26胞外區(qū)蛋白。
[0058]CD26胞外區(qū)基因是選自Uniprot:P27487序列中氨基酸29-766位“Extracellular”區(qū)域的合成基因，將⑶26胞外區(qū)基因連入質(zhì)粒p3XFLAG_CMV9，酶切位點(diǎn)為Hind III，Xba I，構(gòu)建重組質(zhì)粒(J.薩姆布魯克.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南.第三版.科學(xué)出版社.2002.P68)。
[0059]采用Lipofectamine LTX Reagent(購自Invitrogen)并按照說明書方法將含⑶26胞外區(qū)基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入HLF細(xì)胞。根據(jù)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系構(gòu)建方法(Current Protocolsin Molecular Biology, P9.5.5)獲得CD26胞外區(qū)穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，記為HLF-4D9，無血清大量培養(yǎng)，分泌表達(dá)⑶26胞外區(qū)蛋白，該蛋白帶有Flag標(biāo)簽，采用ANT1-FLAG M2AffinityGel (購自Sigma-Aldrich)，對無血清培養(yǎng)上清進(jìn)行純化獲得⑶26胞外區(qū)蛋白純品，SDS-PAGE (圖2A)分析及Western Blot (J.S.博尼費(fèi)斯農(nóng).精編細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南.科學(xué)出版社.2007.P177)鑒定(圖2B)，一抗為抗⑶26鼠抗(購自MBL)，二抗為兔抗鼠-HRP抗體(購自 life technology)。
`[0060]結(jié)果如圖2所示，圖2A是SDS-PAGE對純化蛋白的鑒定圖，經(jīng)一步親和層析獲得電泳純級目的蛋白大小的單條帶(Lane2),圖2B是對純化的蛋白進(jìn)行Western Blot鑒定圖，Lane2所示條帶與SDS-PAGE鑒定結(jié)果蛋白大小一致，表明⑶26胞外區(qū)基因經(jīng)克隆重組轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞并表達(dá)，純化后獲得電泳純級CD26胞外區(qū)蛋白。
[0061]實(shí)施例2全人源抗⑶26單鏈抗體的分離
[0062]該單鏈抗體從人單鏈抗體噬菌體展示庫，采用CD26胞外區(qū)蛋白的固相親和篩選得到，該人單鏈抗體噬菌體展示庫由江蘇眾紅生物工程創(chuàng)藥研究院有限公司構(gòu)建。該含有人細(xì)胞產(chǎn)生的抗體的重鏈及輕鏈可變區(qū)的噬菌體展示庫構(gòu)建自人外周血淋巴細(xì)胞，通過使用抗體可變區(qū)基因特異的引物進(jìn)行首輪擴(kuò)增，二輪擴(kuò)增將重鏈輕鏈可變區(qū)采用柔性連接肽基因連接形成單鏈抗體基因，并將單鏈抗體基因克隆入質(zhì)粒PHEN2中轉(zhuǎn)化大腸桿菌TGl，獲得IO8p.f.u.噬菌體單鏈抗體展示庫。(沈倍奮.重組抗體.科學(xué)出版社.2005.P107)
[0063]將該單鏈抗體庫原種培養(yǎng)到對數(shù)生長階段，用M13K07輔助噬菌體感染，在2YT-AK培養(yǎng)基中，30°C搖床培養(yǎng)過夜。噬菌體用4%PEG/2.5M NaCl沉淀，并重懸于PBS中并測定抗體庫滴度，獲得滴度為IO11P.f.u的噬菌體單鏈抗體庫。(甄永蘇.抗體工程藥物.化學(xué)工業(yè)出版社.2002.P51)以PBS稀釋⑶26胞外區(qū)蛋白至50 μ g/mL ;包被至酶標(biāo)板(Max1-sorp96, Nunc)中，同時(shí)設(shè)置空白對照孔(不含⑶26胞外區(qū)蛋白)，隨后進(jìn)行封閉。將噬菌體單鏈抗體庫懸浮于2%MPBS，取100 μ L加入到封閉過的空白孔中，室溫放置60min后，加入到含有⑶26胞外區(qū)蛋白的孔中，室溫放置2h ；0.P/oPBST及PBS分別洗滌10次，加入100 μ L0.1M鹽酸(用甘氨酸調(diào)至ρΗ2.2)，室溫振蕩IOmin, 15 μ LlM Tris (ρΗ9.0)用于迅速中和洗脫下來的噬菌體；中和后的噬菌體感染5mL對數(shù)期的大腸桿菌TG1，取IOOuL,做I~3次100倍系列稀釋，然后將系列稀釋物鋪TYE固體培養(yǎng)基(含有100 μ g/mL Amp和1%葡萄糖)，剩余的菌液再加入20mL含2X 101QM13K07輔助噬菌體的2YT-AG進(jìn)行擴(kuò)增和制備噬菌體庫，用于下一輪篩選過程，共進(jìn)行4輪篩選。
[0064]被展示在噬菌體顆粒表面的抗體片段被稱為噬菌體抗體，本實(shí)驗(yàn)先通過多克隆噬菌體ELISA鑒定4輪篩選后⑶26特異性噬菌體抗體的富集情況，后通過單克隆噬菌體ELISA進(jìn)一步鑒定挑選出髙親和力的噬菌體抗體。 [0065]多克隆噬菌體ELISA鑒定，包被抗原即I μ g/mL⑶26胞外區(qū)蛋白至酶標(biāo)板，封閉后，取10 μ L每輪篩選后獲得的噬菌體，2%MPBS稀釋后加入到抗原包被酶條中。室溫孵育90min，洗滌后加入鼠抗M13噬菌體-HRP抗體(購自北京義翹神州生物技術(shù)公司)室溫孵育lh，洗滌后，加入IOOyL TMB顯色液(購自AMRESC0)。室溫孵育IOmin后，IM稀硫酸終止反應(yīng)。測定OD45tl和OD65tl，并以O(shè)D45tl-OD65tl作為最后檢測結(jié)果。如圖3A所示，以BSA包被的酶標(biāo)板作為陰性對照，隨著篩選輪數(shù)增加，噬菌體抗體與CD26胞外區(qū)蛋白的結(jié)合增強(qiáng)，表明帶有CD26特異性抗體的噬菌體得到了明顯的富集。
[0066]單克隆噬菌體ELISA鑒定，隨機(jī)挑選第三輪第四輪篩選過程的滴度測定平板上挑取單克隆到96孔細(xì)菌培養(yǎng)板(購自Corning)中，每孔已經(jīng)添加2YT培養(yǎng)基(含有100 μ g/mL Amp和1%葡萄糖)，37°C培養(yǎng)至對數(shù)期，每孔加109p.f.u.M13K07輔助噬菌體37°C靜置感染30min，37°C培養(yǎng)lh。1800g離心lOmin，棄上清。將菌體沉淀重懸于200 μ L2YT-AK培養(yǎng)基，30°C搖床培養(yǎng)過夜。次日1800g離心IOmin獲得的含噬菌體的培養(yǎng)上清，用1/10體積的20%MPBS室溫孵育lh，再加入到包被有重組⑶26胞外區(qū)蛋白的酶標(biāo)板中，ELISA鑒定(方法及試劑同多克隆噬菌體ELISA鑒定)。測定OD45tl和OD65tl，并以O(shè)D45tl-OD65tl作為最后檢測結(jié)果。選出讀數(shù)高的克隆進(jìn)行DNA序列測定。圖3B顯示了部分單克隆噬菌體ELSIA的檢測結(jié)果，90%以上的單克隆顯示陽性結(jié)合作用，進(jìn)一步表明通過4輪篩選，帶有⑶26特異性抗體的噬菌體得到了明顯的富集。從中挑選50個(gè)讀數(shù)高的單克隆測序，獲得核苷酸編碼序列如SEQ ID NO: 10所示的單鏈抗體(記為ZHB-pA12)。所對應(yīng)的單鏈抗體ZHB_pA12的氨基酸序列為SEQ ID NO: 11。
[0067]實(shí)施例3抗⑶26單鏈抗體的可溶性表達(dá)及分離純化
[0068]pHEN2是一個(gè)雙功能噬菌粒載體，在表達(dá)檢測標(biāo)簽(c-my tag)與外殼蛋白基因之間有一個(gè)琥珀型終止密碼子(Amber) TAG。如果噬菌體感染琥珀突變(SupE)抑制型菌株，如TG1，TAG密碼子被翻譯為谷氨酸，序列可以通讀翻譯，抗體片段與外殼蛋白p3融合表達(dá)于噬菌體表面；當(dāng)噬菌體感染非琥珀突變抑制型菌株時(shí)，如HB2151，翻譯在TAG處終止，可得到可溶型表達(dá)的抗體片段?？贵w片段C端帶有6XHis tag及c-myc tag,利于純化和檢測鑒定。ZHB-pA12單鏈抗體采用大腸桿菌周質(zhì)空間的可溶性表達(dá)，純化采用高滲透法提取細(xì)胞周質(zhì)蛋白，再利用鎳柱親和層析一步分離純化獲得純度較高的目的蛋白。
[0069]采用質(zhì)粒小提試劑盒從菌體TGl中提取出含有編碼單鏈抗體ZHB-pA12基因的質(zhì)粒(記為pA12-pHEN2)，用于轉(zhuǎn)化非抑制子大腸桿菌HB2151，轉(zhuǎn)化采用氯化鈣法制備和轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌HB2151(J.薩姆布魯克.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南.第三版.科學(xué)出版社.2002.P96)，所得轉(zhuǎn)化后菌株記為HB2151-pA12。[0070]HB2151-pA12在2YT-AG培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至對數(shù)期時(shí)(OD6tltl=0.8)，加入終濃度ImM的IPTG，30°C誘導(dǎo)過夜(16~20h)，表達(dá)可溶性單鏈抗體ZHB_pA12。6000rpm，4°C離心15min，收集菌體，高滲溶液(50mM Tris-HCl，20%蔗糖，ImM EDTA, pH8.0)重懸菌體，緩慢攪拌lh，4°C，1000Og離心lOmin，倒出上清進(jìn)行鎳柱親和層析(購自GE)，純化步驟按照GE的標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行，即采用含有5mM咪唑的平衡緩沖液(Tris50mM，NaC1500mM，pH7.5)平衡ImL鎳柱，10個(gè)柱體積后上樣，再次采用含有5mM咪唑的平衡緩沖液洗滌鎳柱上非特異性結(jié)合的雜蛋白，用含有50mM咪唑的平衡緩沖液洗滌非特異性雜蛋白，最后用含有IOOmM咪唑的平衡緩沖液洗脫目的蛋白。15%SDS-PAGE檢測收集的樣品，Western Blot進(jìn)一步鑒定單鏈抗體，一抗為抗c-myc鼠抗(購自恩晶生物),二抗為兔抗鼠-HRP抗體。圖4A顯示純化后樣品中含有目的蛋白大小條帶(箭頭所指)，Western Blot (圖4B)鑒定結(jié)果與SDS-PAGE —致，表明經(jīng)過鎳柱一步親和層析ZHB-pA12單鏈抗體得到了較好的純化。
[0071]實(shí)施例4抗⑶26單鏈抗體與⑶26胞外區(qū)蛋白結(jié)合的Immunoblot鑒定
[0072]該實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菫榱蓑?yàn)證篩選獲得的抗⑶26單鏈抗體ZHB-pA12與⑶26胞外區(qū)蛋白的特異性結(jié)合作用。重組⑶26胞外區(qū)蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，半干轉(zhuǎn)法lh，將蛋白轉(zhuǎn)印到NC膜(購自Millipore);轉(zhuǎn)印結(jié)束，將膜在5%MPBS中室溫封閉Ih ;用5%MPBS稀釋ZHB-pA12單鏈抗體至I μ g/mL,室溫孵育lh，TBS洗滌3遍；用鼠anti_Myc抗體(購自恩晶生物)室溫孵育lh，TBS洗滌3遍；用兔抗鼠-HRP 二抗孵育Ih后凝膠成像儀(ImageQuantLAS4000, GE)曝光，結(jié)果如圖5所示，在⑶26胞外區(qū)目的蛋白大小處有明顯條帶，表明抗⑶26單鏈抗體ZHB-pA12可以特異性與⑶26胞外區(qū)蛋白結(jié)合。
[0073]實(shí)施例5可溶性單鏈抗體ZHB-pA12與人間皮瘤細(xì)胞NC1-H2452的免疫熒光
[0074]CD26在人間皮瘤細(xì)胞NC1-H2452細(xì)胞表面高表達(dá)(Inamoto et al.(2007)ClinCancer Res, 13，4191-200)，本實(shí)驗(yàn)通過鑒定ZHB_pA12與NC1-H2452細(xì)胞的免疫熒光結(jié)合情況，進(jìn)一步驗(yàn)證篩選獲得的單鏈抗體ZHB-pA12可以與高表達(dá)⑶26的NC1-H2452細(xì)胞特異性結(jié)合，同時(shí)證明ZHB-pA12可以與細(xì)胞表面的⑶26特異性結(jié)合。
[0075]將人間皮瘤細(xì)胞NC1-H2452消化`，離心后重懸，I X IO5/孔包被24孔板讓細(xì)胞貼壁12h，4%多聚甲醛固定，PBS洗3次，5%MPBS室溫封閉lh。PBS洗3次，不同孔分別加入抗體ZHB-pA12或陰性對照抗體IgG (鼠)(購自life technology)，37°C孵育2h，以PBS洗滌3次，ZHB-pA12抗體孔加入鼠抗myc-FITC抗體(購自Sigma-Aldrich),對照抗體孔加入羊抗鼠熒光二抗(購自life technology)，37°C孵育lh，PBS洗滌3次，熒光顯微鏡(Olympus)觀察并拍照，結(jié)果如圖6所示ZHB-pA12單鏈抗體與NC1-H2452有明顯的熒光顯色，而對照抗體無明顯熒光顯色，表明篩選獲得的單鏈抗體ZHB-pA12可以與高表達(dá)⑶26的NC1-H2452細(xì)胞特異性結(jié)合，進(jìn)一步證明ZHB-pA12可以與細(xì)胞表面的⑶26特異性結(jié)合。
[0076]實(shí)施例6抗⑶26單鏈抗體對人間皮瘤細(xì)胞NC1-H2452的粘附抑制作用
[0077]⑶26通過與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(ECM)的結(jié)合，介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的粘附作用，纖連蛋白是常見的ECM之一，CD26與纖連蛋白發(fā)生特異性結(jié)合作用，從而介導(dǎo)細(xì)胞的粘附，而這種結(jié)合作用可被抗 CD26 抗體所阻斷(Inamoto et al.(2007)Clin Cancer Res, 13，4191-200)，從而阻斷腫瘤細(xì)胞的粘附作用。
[0078]YSllO為Y’s Therapeutics公司開發(fā)的抗0)26單克隆鼠抗的人源化抗體，目前已開展抗⑶26高表達(dá)腫瘤的臨床實(shí)驗(yàn)。根據(jù)YSllO抗體的重鏈及輕鏈可變區(qū)基因序列(CN101282994)，全合成構(gòu)建YSllO的單鏈抗體型式，即scFv-YSllO作為本實(shí)驗(yàn)的陽性對照，表達(dá)及純化過程同ZHB-pA12。
[0079]粘附實(shí)驗(yàn)采用24孔板，五組平行實(shí)驗(yàn)，每組4個(gè)復(fù)孔，其中一組為空白對照組(Blank),直接用2%BSA封閉，其余四組用10 μ g/mL纖連蛋白(購自BD Biosciences)室溫20 ~25°C包被 90min。PBS 洗 3 次后加入 2%BSA37°C封閉 Ih。同時(shí)將 10 X IO5 個(gè) NC1-H2452細(xì)胞用PBS洗3次后分成等量的五組，三組為抗體試驗(yàn)組，細(xì)胞分別用含50 μ g/mL的ZHB-pA12，陽性對照scFv-YSllO，陰性對照抗體IgG (鼠)的RPM1-1640培養(yǎng)基處理2h，另外兩組為對照組(Binding組，Blank組)用與試驗(yàn)組含等量PBS的RPM1-1640培養(yǎng)基處理2h后，等分加入五組封閉后的24孔板中，培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)12h。用PBS洗孔3次，洗掉未粘附的細(xì)胞，每孔加入270 μ L RPM1-1640及30 μ L的CCK-8 (購自同仁化學(xué)研究所)，37°C繼續(xù)培養(yǎng)30min，在酶標(biāo)儀450nm波長處測定光吸收值(0D值)，OD值的大小與活細(xì)胞數(shù)量成正比，據(jù)此計(jì)算細(xì)胞的粘附率。細(xì)胞粘附率(％)=[0D (抗體試驗(yàn)組)-OD (Blank組)]/[0D(Binding組)-OD (Blank組)]。圖7顯示，用scFv-YSllO及ZHB_pA12處理后的細(xì)胞對纖連蛋白的粘附下降，而陰性對照抗體IgG (鼠)則不影響細(xì)胞粘附，表明ZHB-pA12可以抑制CD26對ECM的結(jié)合，抑制CD26介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞粘附效應(yīng)，抑制了腫瘤細(xì)胞的向其他器官的侵襲轉(zhuǎn)移。
[0080]實(shí)施例7抗⑶26單鏈抗體對人間皮瘤細(xì)胞NC1-H2452的增殖抑制作用
[0081]將NC1-H2452細(xì)胞I X IO4/孔接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，100 μ L/孔，培養(yǎng)12h后用1%小牛血清培養(yǎng)基(含作用抗體)替換原培養(yǎng)基。將培養(yǎng)的細(xì)胞分為三組，分別對應(yīng)加入的作用抗體為:不同濃度的單 鏈抗體ZHB-pA12，陽性對照scFv-YSllO及陰性對照抗體IgG(鼠)。作用抗體終濃度分組為0，0.1, 1.0, 10 μ g/mL,每組5個(gè)實(shí)驗(yàn)復(fù)孔。培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48h，觀察細(xì)胞生長狀況后每孔加入10 μ L的CCK-8 (購自同仁化學(xué)研究所)，37°C繼續(xù)培養(yǎng)30min，在酶標(biāo)儀450nm波長處測定光吸收值(0D值)，OD值的大小與活細(xì)胞數(shù)量成正比，據(jù)此計(jì)算單鏈抗體ZHB-pA12對細(xì)胞增殖的抑制率。如圖8所示，ZHB-pA12及陽性對照scFv-YSllO對NC1-H2452均有明顯抑制作用，且呈濃度依賴性，ZHB-pA12與陽性對照的活性相當(dāng)，陰性對照IgG對NC1-H2452沒有明顯抑制作用，表明ZHB_pA12可以對高表達(dá)⑶26的間皮瘤細(xì)胞增殖有抑制作用，可用作⑶26高表達(dá)腫瘤的潛在治療藥物，且相比于陽性對照scFv-YSllO，ZHB-pA12為全人源化抗體，消除了外源蛋白對人體免疫系統(tǒng)的影響。
[0082]實(shí)施例8抗⑶26單鏈抗體對人結(jié)腸癌細(xì)胞HCTl 16的增殖抑制作用
[0083]除人間皮瘤細(xì)胞NC1-H2452外，高表達(dá)CD26的結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116 (Abe etal.(2011)BMC Cancer, 2011，11:51)也被用于考察單鏈抗體對細(xì)胞的增殖抑制效果。
[0084]將HCTl 16細(xì)胞8 X IO4/孔接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，100 μ L/孔，培養(yǎng)12h后用1%小牛血清培養(yǎng)基(含作用抗體)替換原培養(yǎng)基。將培養(yǎng)的細(xì)胞分為三組，分別對應(yīng)加入的作用抗體為:不同濃度的單鏈抗體ZHB-pA12，陽性對照scFv-YSllO及陰性對照抗體IgG (鼠)。作用抗體終濃度分組為0，0.1, 1.0, 10 μ g/mL,每組5個(gè)實(shí)驗(yàn)復(fù)孔。培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48h，觀察細(xì)胞生長狀況后每孔加入10 μ L的CCK-8 (購自同仁化學(xué)研究所)，37°C繼續(xù)培養(yǎng)30min，在酶標(biāo)儀450nm波長處測定光吸收值(OD值)，OD值的大小與活細(xì)胞數(shù)量成正比，據(jù)此計(jì)算單鏈抗體ZHB-pA12對細(xì)胞增殖的抑制率。如圖9所示，ZHB-pA12及陽性對照scFv-YSllO對HCT116均有明顯抑制作用，且呈濃度依賴性，ZHB-pA12與陽性對照的活性相當(dāng)，陰性對照IgG對HCT116沒有明顯抑制作用，表明ZHB-pA12可以對高表達(dá)⑶26的結(jié)腸癌細(xì)胞增殖有抑制作用，再次證明ZHB-pA12可用作⑶26高表達(dá)腫瘤的潛在治療藥物，且相比于陽性對照scFv-YSllO，ZHB-pA1 2為全人源化抗體，消除了外源蛋白對人體免疫系統(tǒng)的影響。
【權(quán)利要求】
1.一種抗CD26抗體或其片段，其特征在于，所述抗體或其片段特異性結(jié)合人CD26，所述抗體或其片段的氨基酸序列包括選自含有SEQ ID NO: 2,SEQ ID NO: 3,SEQ ID NO: 4,SEQID N0:6、SEQ ID NO:7,SEQ ID N0:8—組序列的6個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)的任何區(qū)域的單克隆抗體或其片段或其片段的偶聯(lián)物，或通過對其氨基酸置換或者修飾得到的氨基酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述的抗CD26抗體或其片段，其特征在于，所述抗體或其片段的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列含有如SEQ ID NO:2,SEQ ID N0:3和SEQ ID NO:4所示的互補(bǔ)決定區(qū)，和/或所述抗體或其片段的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列含有如SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:8所示的互補(bǔ)決定區(qū)。
3.如權(quán)利要求1所述的抗CD26抗體或其片段，其特征在于，所述抗體或其片段的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述抗體或其片段的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如 SEQ ID NO:5 所示。
4.一種抗⑶26的單鏈抗體,其特征在于,所述單鏈抗體的氨基酸序列如SEQ ID NO: 11所示。
5.一種編碼如權(quán)利要求4所述的單鏈抗體的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID NO: 10所示。
6.一種含有如權(quán)利要求5所述的核苷酸序列的表達(dá)載體。
7.一種含有如權(quán)利要求6所述表達(dá)載體的重組宿主菌。
8.—種生產(chǎn)如權(quán)利要求4所述單鏈抗體的方法，包括: 1)在合適的條件下培養(yǎng)如權(quán)利要求7所述的重組宿主菌并表達(dá)抗體； 2)然后從宿主菌中純化、收集抗體。
9.如權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的抗體或其片段在制備抑制CD26高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移的藥物中的新用途。
10.如權(quán)利要求4所述的單鏈抗體在制備抑制CD26高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移的藥物中的新用途。
【文檔編號】A61P35/00GK103694352SQ201310704143
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月19日
【發(fā)明者】馬永, 周雅瓊, 高云霞, 黃梁敏, 徐春林, 陳晨, 王耀方 申請人:江蘇眾紅生物工程創(chuàng)藥研究院有限公司, 常州京森生物醫(yī)藥研究所有限公司