一株高抗逆性屎腸球菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一株高抗逆性屎腸球菌及其應(yīng)用。屎腸球菌(Enterococcus?faecium)WEI-9?CGMCC?No.7455分離自60日齡仔豬糞便，能夠耐受低pH環(huán)境和高濃度豬膽鹽，可以在胃腸消化液中長時(shí)間保持活性。本發(fā)明的屎腸球菌(Enterococcus?faecium)WEI-9?CGMCC?No.7455對大腸桿菌、沙門氏菌、藤黃微球菌、金黃色葡萄球菌均有抑菌作用，抑菌圈直徑達(dá)到30-40mm。借此開發(fā)的微生態(tài)活菌制劑具有顯著的益生特性，可以用于調(diào)節(jié)畜禽腸道微生態(tài)平衡，并在預(yù)防或輔助治療畜禽細(xì)菌性腹瀉有著廣闊的應(yīng)用前景。
【專利說明】一株高抗逆性屎腸球菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種屎腸球菌，特別是涉及一株高抗逆性屎腸球菌及其應(yīng)用。
[0002]背景介紹
[0003]食品安全已是人們越來越關(guān)注的問題。飼料作為動物的食品和人類的間接食品，成為食品安全工程的重要一環(huán)。我國已啟動“飼料安全工程”，并禁用了一批毒性和殘留較大的飼料添加劑產(chǎn)品。加快安全性較高的新型飼料添加劑產(chǎn)品的開發(fā)與生產(chǎn)，對于實(shí)現(xiàn)健康養(yǎng)殖及養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。微生態(tài)制劑作為一種綠色、安全的飼料添加劑受到人們的廣泛關(guān)注，對于動物健康和養(yǎng)殖業(yè)的促進(jìn)作用正在逐漸的顯現(xiàn)出來。
[0004]然而，目前市售微生態(tài)制劑產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊，很多產(chǎn)品所用菌種對胃腸消化液、膽鹽耐受能力差，真正能夠到達(dá)小腸發(fā)揮功效的菌種很少。為了提高產(chǎn)品效果，不少企業(yè)推出微囊化的微生態(tài)制劑產(chǎn)品，雖然提高了進(jìn)入小腸的活菌數(shù)，但也大幅增加了生產(chǎn)成本。開發(fā)對胃腸消化液、膽鹽有高耐受性的益生菌菌株能大大簡化生產(chǎn)工藝，降低生產(chǎn)成本。
[0005]屎腸球菌是農(nóng)業(yè)部《飼料添加劑品種目錄》所列菌種，可以在微生態(tài)制劑中安全使用。屎腸球菌具有 很強(qiáng)的產(chǎn)酸能力，是動物體內(nèi)天然存在的有益乳酸菌之一，能夠維持宿主腸道微生態(tài)平衡，抑制腸道病原菌的大量增殖，能夠刺激腸道粘膜免疫，提高機(jī)體的抗病能力，產(chǎn)生有益的代謝產(chǎn)物，防止有害物質(zhì)產(chǎn)生，改善機(jī)體健康水平。
[0006]因此，開發(fā)一種能夠耐受胃腸消化液和膽鹽，并對病原微生物有較強(qiáng)抑菌活性的屎腸球菌菌株，對于降低微生態(tài)制劑生產(chǎn)成本，強(qiáng)化微生態(tài)制劑功效具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一株可用于調(diào)節(jié)畜禽腸道微生態(tài)平衡及預(yù)防畜禽細(xì)菌性腹?寫的高抗逆性屎腸球菌(Enterococcus faecium)WE1-9CGMCC N0.7745。
[0008]從健康仔豬糞便中分離、篩選得到一株乳酸菌，經(jīng)16S rDNA測序鑒定為屎腸球菌(Enterococcus faecium) WE1-9,并于2013年6月19日送中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，編號為CGMCC N0.7745，保藏地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院中科院微生物研究所郵編:100101電話:86-10-64807596。
[0009]屎腸球菌(Enterococcusfaecium)WE1-9CGMCC N0.7745 屬革蘭氏陽性細(xì)菌，圓形或橢圓形，呈鏈狀排列，無芽孢，無鞭毛。生長溫度范圍在30-40°C，適宜pH值的范圍
6.0-7.5，是兼性厭氧乳酸菌。該菌株在常規(guī)和改良MRS培養(yǎng)基中生長良好，繁殖速度快，在改良MRS培養(yǎng)基中的生長曲線如圖1所示，2h后進(jìn)入對數(shù)期，14h菌數(shù)增殖達(dá)到最高，穩(wěn)定期活菌數(shù)為0.98X IO9-L 2X IO9CFU / mL。所述改良MRS配方為:每1000mL水中加入蛋白胨 10g，牛肉粉 5g，酵母粉 5g，葡萄糖 20g,吐溫 801mL, K2HPO4.7H202g, NaAC.3H205g，檸檬酸銨 2g, MgSO4.7Η200.58g, MnSO4.H2O0.25g, pH6.8。
[0010]屎腸球菌(Enterococcusfaecium) WE1-9CGMCC N0.7745 在 pH 為 2-3 的人工胃液中保持3h，存活率80%;在人工胃腸消化液中保持26h，活菌數(shù)可以維持在IO7CFU / mL，這個(gè)時(shí)間符合腸道生理周期，能夠保證菌體發(fā)揮益生作用；在豬膽鹽濃度為20g / L的人工豬膽鹽溶液中，保持3h，存活率為51%，這個(gè)膽鹽濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于動物體內(nèi)的0.3g / L的平均膽鹽濃度。
[0011]上述特性評價(jià)試驗(yàn)中，所述人工胃液包括如下成分:每1000mL水中含有胃蛋白酶3g，NaC12g，調(diào)pH至2-3 ;所述人工胃腸消化液包括如下成分:人工胃液pH調(diào)至3，人工腸液包括如下成分:每1000mL水中含有胰蛋白酶10g，KH2P047gJ pH至7.5，測試過程中，菌體在人工胃液中保持2h，然后接入人工腸液中保持24h ;所述人工豬膽鹽溶液成分包括:每1000mL水中含有胰蛋白酶lg，豬膽鹽20g，NaC15g，調(diào)pH至7.0。
[0012]屎腸球菌(Enterococcusfaecium) WE1-9CGMCC N0.7745 對大腸桿菌、沙門氏菌、藤黃微球菌、金黃色葡萄球菌均有抑菌作用，抑菌圈直徑達(dá)到30-40mm。
[0013]基于上述特性，本發(fā)明提供的屎腸球菌(Enterococcus faecium)WE1-9CGMCCN0.7745具有顯著的益生特性，可以在畜禽腸道定殖，調(diào)節(jié)畜禽腸道微生態(tài)平衡，并在預(yù)防或輔助治療畜禽細(xì)菌性腹瀉有著廣闊的應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1 為屎腸球菌(Enterococcus faecium)WE1-9CGMCC N0.7745 在改良 MRS 培養(yǎng)基中的生長曲線。
[0015]圖2 為尿腸球菌(Enterococcus faecium)WE1-9CGMCC N0.7745 對人工胃腸消化液的耐受性。圖中前2h是菌株在人工胃液中的存活曲線，隨后的24h是菌株從人工胃液轉(zhuǎn)接至人工腸液后的存活曲線。
[0016]圖3 為屎腸球菌(Enterococcus faecium) WE1-9CGMCC N0.7745 對金黃色葡萄球菌的抑菌效果，圖中是兩個(gè)相同劑量實(shí)驗(yàn)組。
【具體實(shí)施方式】
[0017]實(shí)施例一:屎腸球菌(Enterococcusfaecium)WE1-9CGMCC N0.7745 的分離和鑒定
[0018]稱取60日齡健康仔豬的糞便lg，放入盛有99mL滅菌的0.85%生理鹽水的三角瓶中(三角瓶中預(yù)先放入20粒無菌玻璃珠)，37°C，180rpm震蕩30min，吸取ImL懸濁液做十倍遞增梯度稀釋，選取2-3個(gè)適宜稀釋度，吸取ImL稀釋液于無菌培養(yǎng)皿中，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平行；向加有稀釋液的培養(yǎng)皿中加入融化后冷卻至46°C的MRS瓊脂培養(yǎng)基，小心轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿使試樣與培養(yǎng)基充分混合，37°C培養(yǎng)48-72h。從培養(yǎng)皿上挑選不同形態(tài)的菌落劃線純化，分別保藏并進(jìn)行16S rDNA的測序鑒定。
[0019]實(shí)施例二:屎腸球菌(Enterococcusfaecium) WE1-9CGMCC N0.7745 耐受低 pH 胃液、人工胃腸消化液和豬膽鹽
[0020]從屎腸球菌(Enterococcusfaecium) WE1-9CGMCC N0.7745 的保藏斜面(常規(guī)MRS培養(yǎng)基)挑一環(huán)菌苔接于裝有IOOmL改良MRS培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于37°C，180rpm振蕩培養(yǎng)14h，將菌液在6000rpm的條件下離心10min，棄去上清，用滅菌的0.85%的生理鹽水洗滌一次，再用同體積生理鹽水懸浮。吸取IOmL懸浮菌液分別接于裝有90mL pH分別為1、2、3、4、5的人工胃液和90mL人工豬膽鹽溶液的250mL三角瓶中，豬膽鹽濃度分別為3g/L、5g / LUOg / L、15g / L、20g/L，以不加膽鹽的樣品為對照。然后在37°C，靜置培養(yǎng)180min,分別于初始接種、30min、60min、120min、180min對培養(yǎng)物進(jìn)行活菌計(jì)數(shù),繪制活菌數(shù)變化曲線，計(jì)算菌株在不同PH人工胃液和不同濃度人工膽鹽中保溫180min時(shí)的存活率。菌液在人工胃液中保溫2h后吸取IOmL菌懸液接于裝有90mL人工腸液的250mL三角瓶中，同樣在371:，靜置培養(yǎng)，分別于初始接種、311、611、2111、2411對培養(yǎng)物進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，繪制活菌數(shù)變化曲線。測定結(jié)果顯不，屎腸球菌(Enterococcus faecium)WE1-9CGMCC N0.7745在pH高于 I的人工胃液中保持180min(3h)，存活率達(dá)到80%以上；在濃度為20g/L的人工豬膽鹽溶液中保持180min(3h)，存活率超過50% ;在人工胃腸消化液中保持26h，活菌數(shù)可以維持在IO7CFU / mL，這個(gè)時(shí)間符合腸道生理周期，能夠保證菌體發(fā)揮益生作用。上述結(jié)果表明，屎腸球菌(Enterococcus faecium)WE1-9CGMCC N0.7745能夠耐受酸性環(huán)境,耐受高濃度豬膽鹽，并且能夠在消化液中保持足夠長的存活時(shí)間，說明屎腸球菌(EnterococcusFaecium)WE1-9CGMCC N0.7745是一株高抗逆性益生乳酸菌，可以經(jīng)過畜禽的胃、十二指腸后保持活性，并最終進(jìn)入小腸定殖。
[0021]實(shí)施例三:屎腸球菌(Enterococcusfaecium)WE1-9CGMCC N0.7745 的抑菌活性
[0022]1.培養(yǎng)液上清的制備
[0023]從屎腸球菌(EnterococcusFaecium) WE1-9CGMCC N0.7745 的保藏斜面(常規(guī)MRS培養(yǎng)基)挑一環(huán)菌苔接種于液體改良MRS培養(yǎng)基中，37°C，180rpm培養(yǎng)14h，取ImL菌液12000rpm離心Imin,取上清液。
[0024]2.抑菌活性檢測平板的制備
[0025]將15mL完全熔化的LB瓊脂培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，待其凝固后垂直放上牛津杯；另取完全熔化的LB瓊脂培養(yǎng)基，待其冷卻到55°C時(shí)加入指示菌混勻，取IOmL混有指示菌的培養(yǎng)基倒入放有牛津杯的培養(yǎng)皿中，待完全凝固后拔出牛津杯，制成檢測平板。所述指示菌包括大腸桿菌、沙門氏菌、藤黃微球菌、金黃色葡萄球菌。
[0026]3.抑菌活性的測定
[0027]取200 μ L培養(yǎng)液上清加入檢測平板的孔中，4°C放置24h后放入37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20h，測量抑菌圈直徑大小為30-40mm。
【權(quán)利要求】
1.一株高抗逆性屎腸球菌及其應(yīng)用，其特征在于,所述的屎腸球菌(Enterococcusfaecium)為 WE1-9，保藏編號為 CGMCC N0.7745。
2.權(quán)利要求1所述的一株高抗逆性屎腸球菌及其應(yīng)用，其特征在于所述的屎腸球菌WE1-9能夠耐受pH為2-3的人工胃液，并在人工胃液中存活。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述人工胃液，其特征在于:所述人工胃液包括如下成分:每1000mL水中含有胃蛋白酶3g，NaC12g，調(diào)pH至2-3。
4.權(quán)利要求1所述的一株高抗逆性屎腸球菌及其應(yīng)用，其特征在所述的屎腸球菌WE1-9能夠在人工腸消液中存活。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述人工腸液，其特征在于:所述人工腸液包括如下成分:每1000mL水中含有胰蛋白酶10g，KH2P047g，調(diào)pH至7.5。
6.權(quán)利要求1所述的屎腸球菌(Enterococcusfaecium)WE1-9CGMCC N0.7745能夠耐受的豬膽鹽濃度達(dá)到20g / L0
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述豬膽鹽，其特征在于:配制的豬膽鹽溶液成分包括:每1000mL水中含有胰蛋白酶lg，豬膽鹽20g，NaC15g，調(diào)pH至7.0。
8.權(quán)利要求1所述的一株高抗逆性屎腸球菌及其應(yīng)用，其特征在于，屎腸球菌WE1-9對大腸桿菌、沙門氏菌、藤黃微球菌、金黃色葡萄球菌均有抑菌作用，抑菌圈直徑達(dá)到30-40mmo
9.權(quán)利要求1所述的一株高抗逆性屎腸球菌及其應(yīng)用，其特征在于，屎腸球菌WE1-9在調(diào)節(jié)畜禽腸道微生態(tài)平衡中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求1所述的一株高抗逆性屎腸球菌及其應(yīng)用，其特征在于，屎腸球菌WE1-9在預(yù)防或輔助治療畜禽細(xì)菌性腹瀉中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61P31/04GK103981115SQ201310719804
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2013年12月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月24日
【發(fā)明者】喬琳, 姚宏明, 高長斌, 劉蕊, 金忠輝 申請人:北京偉嘉人生物技術(shù)有限公司, 沈陽偉嘉牧業(yè)技術(shù)有限公司