林蛙提取液在制備治療及預(yù)防宮頸癌的藥物中的用途
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及林蛙提取液在制備治療及預(yù)防宮頸癌的藥物中的用途，提供了林蛙提取液新的醫(yī)用用途，利用林蛙提取液對(duì)的抑制和消炎抗菌作用，對(duì)由SiHa細(xì)胞及Caski細(xì)胞引起的宮頸癌進(jìn)行治療及預(yù)防；本發(fā)明還可改變細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性，且其不易產(chǎn)生耐藥性；選用純生物制劑，毒副作用小，標(biāo)本兼治，療效顯著，臨床癥狀消失迅速，還可起到預(yù)防效果。
【專(zhuān)利說(shuō)明】林蛙提取液在制備治療及預(yù)防宮頸癌的藥物中的用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及林蛙提取液在制備治療及預(yù)防宮頸癌的藥物中的用途，以及一種治療及預(yù)防宮頸癌的林蛙提取液軟膏劑，屬于醫(yī)學(xué)生物制藥【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]宮頸癌是最常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤之一，發(fā)病率在女性惡性腫瘤中居第二位，僅次于乳腺癌。每年大約有47萬(wàn)左右宮頸癌新發(fā)病例，占所有癌癥新發(fā)病例的5%，并有23萬(wàn)人死于該病，其中80%的病例發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家。目前研究己確認(rèn)高危型人乳頭瘤病毒(human papilloma virus,HPV)是宮頸癌形成最重要的危險(xiǎn)因子,在99.7%的浸潤(rùn)性宮頸癌中可以檢測(cè)到它的存在?，F(xiàn)已確認(rèn)有超過(guò)200種HPV，其中大約有30種型別在子宮頸癌中被發(fā)現(xiàn)，根據(jù)HPV亞型與宮頸癌的相關(guān)性可將HPV分為高危型和低危型。公認(rèn)的高危型有16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73 和 82 型等，其中 HPV16 是子宮頸癌患者最常見(jiàn)的感染型別(58.9%)，其次分別依次為HPV18 (15.0 %)，HPV45 (5.9 %)，HPV31 (4.3%)
，HPV33 (3.0%)，HPV52 (2.3%)，HPV58 (1.2%)，HPV35 (0.3%)等等。
[0003]目前的治療方法主要有物理治療及藥物治療。物理治療主要是采用激光、微波、冷凍、電灼、手術(shù)切除(婦科的LEEP刀等)、光動(dòng)力療法等，缺點(diǎn)是治療深度需要熟練的操作者控制，傷口深愈合慢，尤其在外生殖器部位，傷口易出血、易感染、易復(fù)發(fā)，有時(shí)還會(huì)在病灶周?chē)纬勺泽w種植。藥物治療采用的藥物大部分具有一定腐蝕性，需要保護(hù)好周?chē)＝M織，否則易形成周?chē)＝M織的種植。不太適合粘膜疣的應(yīng)用；腐蝕性不大的藥物用藥時(shí)間長(zhǎng)，有一定的刺激性，也可以出現(xiàn)皮膚的淺糜爛面。目前治療HPV感染的藥物無(wú)確切療效，疫苗大規(guī)模投入臨床使用尚需時(shí)日，研制開(kāi)發(fā)抗HPV藥物對(duì)于宮頸癌的防治具有重大意義。
[0004]本發(fā)明治療及預(yù)防由宮頸癌SiHa細(xì)胞及Caski細(xì)胞引起的宮頸癌。經(jīng)檢索未見(jiàn)林蛙提取液治療及預(yù)防宮頸癌的藥物中的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明公開(kāi)了林蛙提取液在制備治療及預(yù)防宮頸癌的藥物中的用途。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)解決方案如下:
本發(fā)明所述林蛙提取液是按照下述方法制備的:
將林蛙干粉碎后，加入到1-10%醋酸中，醋酸與林蛙干的體積重量比(ml/g)為1:1-30:1 (即Ig林蛙干加入l_30ml醋酸)，超聲提取，過(guò)濾，離心，得到林蛙提取液。
[0007]優(yōu)選的，超聲時(shí)間為:10-80min，超聲溫度為-4-30°C，離心溫度為-4_30°C，離心時(shí)間為5-60min，離心轉(zhuǎn)速為2000_15000rpm。
[0008]本發(fā)明中由林蛙提取液制備成的治療或預(yù)防宮頸癌的藥物的用法為外用陰道給藥。
·[0009]所述林蛙提取液可以與藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑形成藥物制劑，所述制劑可以為噴霧劑、氣霧劑、霜?jiǎng)?、軟膏劑、凝膠劑、栓劑或濕巾等。
[0010]本發(fā)明提供一種治療及預(yù)防宮頸癌的林蛙提取液軟膏劑，其特征在于有以下原料按重量份數(shù)比制成的:
林娃干10-75份,石臘6-35份,液體石臘5-45份，白凡士林5_40份,單硬脂酸甘油酯5-80份，司盤(pán)40 1-35份，乳化劑OP 2-15份，對(duì)羥基苯甲酸乙酯1-8份，冰片5-20份。
[0011]本發(fā)明所提供所述治療及預(yù)防宮頸癌的林蛙提取液軟膏劑的制備方法，其包括如下步驟:
(1)林蛙提取液的制備:稱(chēng)取林蛙干粉碎后，加入1-30倍體積(ml:g)的1-10%醋酸超聲提取10-80min，超聲溫度為-4_30°C ;過(guò)濾，離心，離心溫度為-4_30°C，離心時(shí)間為5-60min，離心轉(zhuǎn)速為2000-15000rpm，得林蛙提取液；
(2)油相的制備:取石蠟、單硬脂酸甘油脂、白凡士林、液體石蠟、司盤(pán)40、乳化劑0P、對(duì)羥基苯甲酸乙酯研磨混勻，得到油相；
(3)林蛙提取液軟膏劑的制備:將步驟(2)制得的油相與林蛙提取液分別加熱至70-100°C，將林蛙提取液加入到所述油相中，邊加邊攪拌至冷凝，115°C滅菌lOmin，冰片加熱到70-100°C過(guò)膜，無(wú)菌條件下混合均勻，分裝。
[0012]本發(fā)明的積極效果在于:提供了林蛙提取液新的醫(yī)用用途，利用林蛙提取液對(duì)的抑制和消炎抗菌作用，對(duì)由SiHa細(xì)胞及Caski細(xì)胞引起的宮頸癌進(jìn)行治療及預(yù)防；本發(fā)明還可改變細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性，且其不易產(chǎn)生耐藥性；選用純生物制劑，毒副作用小，標(biāo)本兼治，療效顯著，臨床癥狀消失迅速，還可起到預(yù)防效果。
【具體實(shí)施方式】
[0013]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述。本發(fā)明所用林蛙干產(chǎn)自是我國(guó)東北地區(qū)長(zhǎng)白山麓。中國(guó)林娃(Rana temporaria chensinensis)俗稱(chēng)田雞、哈士蟆、雪哈等,在動(dòng)物分類(lèi)上屬兩棲綱、無(wú)尾目、蛙科、蛙屬，是我國(guó)東北地區(qū)長(zhǎng)白山麓的特有品種，屬于藥、食兩用的珍貴蛙種，并且資源豐富。
[0014]實(shí)施例1林蛙提取液的制備
取林娃干15g (中國(guó)林娃長(zhǎng)白山亞種,購(gòu)自吉林大藥房)粉碎后,加入20倍體積(ml:g)的9%醋酸300ml ;超聲提取，超聲時(shí)間為lOmin，超聲溫度為18°C ;超聲后進(jìn)行過(guò)濾，離心，離心溫度為4°C,離心時(shí)間為16min,離心轉(zhuǎn)速為5500rpm,得林娃提取液。
[0015]實(shí)施例2林蛙提取液軟膏劑的制備
處方組成(按重量份):林蛙干24份、石蠟17份，液體石蠟45份，白凡士林18份，單硬脂酸甘油酯34份，司盤(pán)40 29份，乳化劑OP 6份，對(duì)羥基苯甲酸乙酯3份，冰片7份。
[0016]制備方法:
(1)林蛙提取液的制備:稱(chēng)取林蛙干20g(中國(guó)林蛙長(zhǎng)白山亞種，購(gòu)自吉林大藥房)粉碎后，加入25倍體積(ml:g)的7%醋酸超聲500ml ;超聲提取，超聲時(shí)間為60min，超聲溫度為40C ;超聲后進(jìn)行過(guò)濾，離心，離心溫度為4°C，離心時(shí)間為5min，離心轉(zhuǎn)速為4000rpm，得林娃提取液；
(2)油相的制備:取石蠟、單硬脂酸甘油脂、白凡士林、液體石蠟、司盤(pán)40、乳化劑0P、對(duì)羥基苯甲酸乙酯研磨混勻，得到油相；(3)林蛙提取液軟膏劑的制備:將步驟(2)制得的油相與林蛙提取液分別加熱至90°C，將林蛙提取液加入到所述油相中，邊加邊攪拌至冷凝，115°C滅菌lOmin，冰片加熱到90°C過(guò)膜，無(wú)菌條件下混合均勻，分裝，即可。
[0017]實(shí)施例3林蛙提取液軟膏劑的制備
處方組成(按重量份):林蛙干36份、石蠟14份，液體石蠟39份，白凡士林22份，單硬脂酸甘油酯37份，司盤(pán)40 29份，乳化劑OP 3份，對(duì)羥基苯甲酸乙酯4份，冰片8份。
[0018]制備方法:
(1)林蛙提取液的制備:取林蛙干26g(中國(guó)林蛙長(zhǎng)白山亞種，購(gòu)自吉林大藥房)粉碎后，加入15倍體積(ml:g)的6%醋酸390ml ;超聲提取，超聲時(shí)間為16min，超聲溫度為28°C ；超聲后進(jìn)行過(guò)濾，離心，離心溫度為28°C，離心時(shí)間為40min，離心轉(zhuǎn)速為8000rpm，得林蛙提取液；
(2)油相的制備:取石蠟、單硬脂酸甘油脂、白凡士林、液體石蠟、司盤(pán)40、乳化劑0P、對(duì)羥基苯甲酸乙酯研磨混勻，得到油相；
(3)林蛙提取液軟膏劑的制備:將步驟(2)制得的油相與林蛙提取液分別加熱至90°C，將林蛙提取液加入到油相中，邊加邊攪拌至冷凝，115°C滅菌lOmin，冰片加熱到90°C過(guò)膜，無(wú)菌條件下混合均勻，分裝，即可。
[0019]實(shí)施例4林蛙提取液軟膏劑的制備
處方組成(按重量份):林蛙干62份、石蠟15份，液體石蠟43份，白凡士林29份，單硬脂酸甘油酯19份，司盤(pán)40 21份，乳化劑OP 8份，對(duì)羥基苯甲酸乙酯1份，冰片3份。
[0020]制備方法:
(1)林蛙提取液的制備:取林蛙干20g(中國(guó)林蛙長(zhǎng)白山亞種，購(gòu)自吉林大藥房)粉碎后，加入13倍體積(ml:g)的4%醋酸260ml，超聲提取，超聲時(shí)間為20min，超聲溫度為17°C ；超聲后進(jìn)行過(guò)濾，離心，離心溫度為4°C，離心時(shí)間為35min，離心轉(zhuǎn)速為4000rpm，得林蛙提取液；
(2)油相的制備:取石蠟、單硬脂酸甘油脂、白凡士林、液體石蠟、司盤(pán)40、乳化劑0P、對(duì)羥基苯甲酸乙酯研磨混勻，得到油相；
(3)林蛙提取液軟膏劑的制備:將步驟(2)得到的油相與林蛙提取液分別加熱至60°C，將林蛙提取液加入到油相中，邊加邊攪拌至冷凝，115°C滅菌lOmin，冰片加熱到60°C過(guò)膜，無(wú)菌條件下混合均勻，分裝，即可。
[0021]實(shí)施例5林蛙提取液噴霧劑的制備
處方組成(按重量份):林蛙干67份、氯化鈉18份PEG.29份，苯扎溴銨4份。
[0022]制備方法:
(I)林蛙提取液制備:取林蛙干30g (中國(guó)林蛙長(zhǎng)白山亞種，購(gòu)自吉林大藥房)粉碎后，加入16倍體積(ml:g)的2%醋酸480ml，超聲提取，超聲時(shí)間為48min，超聲溫度為16°C ；超聲后進(jìn)行過(guò)濾，離心，離心溫度為10°C，離心時(shí)間為5min，離心轉(zhuǎn)速為4000rpm，得林蛙提取液；
(2)林蛙提取液噴霧劑的制備:加入PEG4_、氯化鈉、苯扎溴銨，混勻，115 °C滅菌IOmin0冷卻，分裝入氣霧劑瓶，即得。
[0023]實(shí)施例6林蛙提取液栓劑的制備處方組成(按重量份):林蛙干37份、3 -⑶包合物10份、半合成脂肪酸甘油酯21份，酒精1份，甘油1份。
[0024]制備方法:
第一步:林蛙提取液制備，取林蛙干40g (中國(guó)林蛙長(zhǎng)白山亞種，購(gòu)自吉林大藥房)粉碎后，加入14倍體積(ml:g)的6%醋酸560ml，超聲提取，超聲時(shí)間為19min，超聲溫度為10°C;超聲后進(jìn)行過(guò)濾，離心，離心溫度為15°C，離心時(shí)間為17min，離心轉(zhuǎn)速為4600rpm，得林蛙提取液；
第二步:取8g@ -⑶包合物加入240ml水中混合，于60°C水浴中研成糊狀，加入林蛙提取液，充分研磨，于恒溫干燥器中干燥，得到林蛙提取液包合物；
第三步:取20g半合成脂肪酸甘油酯置蒸發(fā)皿中，于水浴上加熱，使其充分融熔制得均勻的基質(zhì)溶液；
第四步:將第二步所得林蛙提取液包合物及適量雙蒸水混合均勻，然后在攪拌下將其加入到第三步的基質(zhì)溶液中，加入石蠟，攪勻，趁熱注入已涂有酒精、甘油等潤(rùn)滑劑的栓模中，冷卻，削去?？谝绯霾糠?，脫模，即得栓劑。
[0025]試驗(yàn)例I
林蛙提取液治療宮頸癌體外實(shí)驗(yàn) 1.實(shí)驗(yàn)原理
MTT法生物活性測(cè)試又稱(chēng)MTT比色法，是一種檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的方法。其檢測(cè)原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚(Formazan)并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測(cè)、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及腫瘤放射敏感性測(cè)定等。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)光密度值的變化觀察樣品對(duì)宮頸癌細(xì)胞的抑制作用。
[0026]2.實(shí)驗(yàn)材料 (I)細(xì)胞系
Caski細(xì)胞，HPV16陽(yáng)性的人宮頸癌細(xì)胞株，由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院提供。細(xì)胞在含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于37°C，5%C02的飽和濕度二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞接種密度均為:100ml培養(yǎng)瓶，10.0X104/10ml ;6孔培養(yǎng)板，3.0 X 104/10ml ;24孔培養(yǎng)板，1.0X 104/lml ； 96 孔培養(yǎng)板，0.2X 104/0.2ml。
[0027]SiHa細(xì)胞株為人宮頸癌細(xì)胞，香港大學(xué)饋贈(zèng)。懸浮生長(zhǎng)于RPM1-1640培養(yǎng)液中，內(nèi)含10%小牛血清，lmmol/L谷胺酞胺及100U/ml青霉素、100 u g/ml鏈霉素。于37°C，5%C02的飽和濕度二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2-3天換液傳代一次。
[0028](2)主要試劑及儀器
RPM1-1640培養(yǎng)基(賽默飛世爾科技有限公司)，青霉素、鏈霉素(華北制藥廠)，小牛血清、胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)，胰蛋白酶(美國(guó)Sigma公司)，臺(tái)盼藍(lán)(美國(guó)Sigma公司)；超凈工作臺(tái)·(上海智城有限公司，ZHJH-Cl 109C)，二氧化碳培養(yǎng)箱(日本SANYO, MC0-18AIC)，倒置相差顯微鏡(德國(guó)Olympus，CKX41)，全自動(dòng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(美國(guó)BioTek，Gen5)，細(xì)胞培養(yǎng)板及血球計(jì)數(shù)板。[0029](3)林蛙提取液
林蛙提取液為實(shí)施例1制備得到的林蛙提取液。
[0030]3.試驗(yàn)方法及結(jié)果
以培養(yǎng)液作為對(duì)照，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，將Cask1、SiHa細(xì)胞接種于6板96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加100 ill細(xì)胞懸液(細(xì)胞數(shù)量控制在2飛X IO3個(gè)細(xì)胞/孔)，第二天更換為含林蛙提取液的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基所含林蛙提取液的濃度分別為5 mg/1 UO mg/1,20 mg/1，每孔加入藥液100 U 1，并設(shè)正常對(duì)照，每個(gè)濃度平行12孔。培養(yǎng)板置于二氧化碳培養(yǎng)箱中，37°C5%C02培養(yǎng)24h，每孔加入20 u I MTT溶液(5mg/ml，生理鹽水配制)，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄上清液，每孔加入DMSO 150u 1,37°C放置20min，緩慢震蕩，待藍(lán)紫色結(jié)晶完全溶解后用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)570nm下測(cè)定OD值，并計(jì)算抑制率；連續(xù)6天測(cè)點(diǎn)做生長(zhǎng)曲線。結(jié)果見(jiàn)表1。
[0031]細(xì)胞抑制率(％)=(正常OD值一加藥組OD值/正常OD值)X 100%
表1本發(fā)明對(duì)于Cask1、SiHa細(xì)胞抑制率統(tǒng)計(jì)表:
【權(quán)利要求】
1.林蛙提取液在制備治療及預(yù)防宮頸癌的藥物中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的林蛙提取液在制備治療及預(yù)防宮頸癌的藥物中的用途，其特征在于，宮頸癌為SiHa細(xì)胞及Caski細(xì)胞引起的宮頸癌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的林蛙提取液在制備治療及預(yù)防宮頸癌的藥物中的用途，其特征在于:所述的藥物為噴霧劑、氣霧劑、霜?jiǎng)?、軟膏劑、凝膠劑或濕巾制劑。
4.一種治療及預(yù)防宮頸癌的林蛙提取液軟膏劑，是由以下原料按重量分?jǐn)?shù)比制成的: 林娃干10-75份,石臘6-35份,液體石臘5-45份，白凡士林5_40份,單硬脂酸甘油酯5-80份，司盤(pán)40 1-35份，乳化劑OP 2-15份，對(duì)羥基苯甲酸乙酯1_8份，冰片5_20份。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療及預(yù)防宮頸癌的林蛙提取液軟膏的制備方法，其特征在于包括如下步驟: 1)林蛙提取液的制備:稱(chēng)取林蛙干粉碎后，加入1-30倍體積(ml:g)的1-10%醋酸超聲提取，過(guò)濾，離心，得林蛙提取液； 2)油相的制備:取石蠟、單硬脂酸甘油脂、白凡士林、液體石蠟、司盤(pán)40、乳化劑0P、對(duì)羥基苯甲酸乙酯研磨混勻，得到油相； 3)林蛙提取液軟膏劑的制備:將步驟2)制得的油相與林蛙提取液分別加熱至70-100°C，將林蛙提取液加入到所述油相中，邊加邊攪拌至冷凝，115°C滅菌lOmin，冰片加熱到70-100°C過(guò)膜，無(wú)菌條件`下混合均勻，分裝。
【文檔編號(hào)】A61K9/06GK103655625SQ201310745157
【公開(kāi)日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年12月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月29日
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