一種pH及溫度超敏感性樹枝狀大分子藥物載體（2.5代）及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種pH及溫度超敏感性樹枝狀大分子藥物載體（2.5代）及其制備方法。本發(fā)明的目的是使樹枝狀大分子其在低代數(shù)下具有pH及溫度超敏感的特性。經(jīng)過修飾后末端三個(gè)羥基的2.5代聚酰胺樹枝狀大分子與末端變成羧基結(jié)構(gòu)的N-丙基哌嗪進(jìn)行健合，即獲得G2.5PAMAM-Tris-NPPOBA。本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明所述方法得到的產(chǎn)物具有pH及溫度雙重敏感性，且對(duì)于pH超敏感，LCST值可調(diào)節(jié)范圍十分廣泛。同時(shí)具有接近人體溫度的臨界溶解溫度。
【專利說明】一種pH及溫度超敏感性樹枝狀大分子藥物載體(2.5代)及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001]本發(fā)明涉及一種以特殊物理性質(zhì)為特征的醫(yī)藥配制品，進(jìn)一步涉及一種pH及溫度超敏感性樹枝狀大分子藥物載體(2.5代)及其制備方法。
【背景技術(shù)】:
[0002]樹枝狀大分子是高度枝化的合成大分子，它具有高度的分子均一性、明確的分子大小和形狀以及許多表面功能基團(tuán)。樹枝狀大分子的這些特性使它能夠改變內(nèi)核類型(如聚酰胺類，聚醚類)，分支數(shù)目和表面功能基團(tuán)的類型。通過表面修飾，不同的功能基團(tuán)能連接到樹枝狀大分子表面從而使樹枝狀大分子具有平衡水溶性及刺激敏感性(如溫度敏感、PH敏感、光敏感、還原敏感等)。這些刺激敏感的特性使樹枝狀大分子在生物醫(yī)學(xué)，藥物制劑學(xué)包括成像、藥物傳遞、組織工程等方面得到廣泛關(guān)注。
[0003]傳統(tǒng)的溫敏性聚合物大都是線性高分子聚合物，如聚異丙基丙烯酰胺(PNIPAAM)，聚甲基丙烯酸N，N- 二甲基氨基乙酯(PDMAEMA)，聚N，N- 二乙基丙烯酰胺(PDEA)等等，而具有體形三維結(jié)構(gòu)的溫敏材料，到目前為止報(bào)道的很少。而樹枝狀大分子這一新型材料，為了增加其功能，國內(nèi)外研究人員進(jìn)行了很多嘗試，由于其表面具有眾多可供修飾的基團(tuán)存在，最常用的方法就是對(duì)其進(jìn)行表面修飾引入各種需要的基團(tuán)，如在樹枝大分子表面接枝大分子PNIPAAM等線性溫敏高分子聚合物，但是PNIPAAM等線性溫敏高分子聚合物的多分散性導(dǎo)致PNIPAAM等線性溫敏高分子聚合物修飾的樹枝狀大分子喪失了分子的均一性。因此不同于線性溫敏聚合物使其能同時(shí)具有分子形狀和均一性的溫敏功能基團(tuán)的研究受到廣泛關(guān)注。近年來，Kenji Kono等人合成了一系列新型的具有球狀結(jié)構(gòu)的溫敏性聚合物，這些聚合物是通過在聚酰胺類樹枝狀大分子PAMAM或聚丙烯亞胺類樹枝狀大分子表面引入異丙基酰胺類結(jié)構(gòu)，而異丙基酰胺結(jié)構(gòu)則是溫度敏感性聚合物PNIPAAM的結(jié)構(gòu)單元，得到4.5代 NIPAAM-PAMAM，5 代 NIPAAM-PAMAM 和 5.5 代 NIPAAM-PAMAM，這些衍生物水溶液的 LCST 值分別為41，56和43°C，這些材料的優(yōu)點(diǎn)是線性溫敏性聚合物無法比擬的，它具有三維球狀的結(jié)構(gòu)，可控精確分子大小，分子均一性等一切屬于樹枝狀大分子的特性，但是所得到的聚合物是在高代數(shù)條件下獲得的，而且其臨界溶解溫度(LCST值Lower Critical SolutionTemperature)可調(diào)的范圍不大，并且都高于人體生理溫度，這些都影響了其應(yīng)用的范圍。因此，開發(fā)一種細(xì)胞毒性低、LCST值可調(diào)范圍大且LCST值接近人體溫度的樹枝狀大分子藥物載體是非常有必要的。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0004]本發(fā)明的目的是提供一種以N-丙基哌嗪溫敏基團(tuán)對(duì)以多羥基胺-三羥甲基氨基甲烷修飾的樹枝狀大分子PAMAM進(jìn)行表面修飾的制備方法，使其在低代數(shù)下具有pH及溫度超敏感的特性。
[0005]本發(fā)明的基本原理如下:[0006]樹枝狀大分子的溫敏性依賴于表面功能基團(tuán)的疏水性和緊密程度，溶液的pH及載體濃度。增加功能基團(tuán)的疏水性增加了分子間相互作用從而導(dǎo)致PH引導(dǎo)的溫度敏感性。同理，增加表面功能基團(tuán)的數(shù)目也可以增加分子間相互作用從而得到更加低的臨界溶解溫度(LCSTfl^Lower Critical Solution Temperature)。
[0007]本發(fā)明通過樹枝狀大分子PAMAM的末端酯基與三羥甲基氨基甲烷反應(yīng)，將PAMAM表面基團(tuán)變成羥基，且表面基團(tuán)數(shù)增大至原來的三倍，然后用N-丙基哌嗪類似物N-丙基哌嗪-4-氧代丁酸(NPPOBA)對(duì)PAMAM-Tris進(jìn)行表面修飾，得到的新型樹枝狀聚合物具有溫度、pH雙重敏感性能，作為疏水性藥物載體(2.5代)可以提高藥物的溶解度，可以作為智能藥物載體(2.5代)應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
[0008]將具有溫度敏感性質(zhì)的PAMAM衍生物配成不同pH值(pH6、7、8、9)的磷酸鹽緩沖液，在500nm處梯度升溫用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行檢測，檢測過程中每5min升高1°C，測得聚合物的溫度-透光率曲線，透光率為50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的溫度即為其LCST值，檢測時(shí)所選用適宜的濃度為lmg/mL。
[0009]溫度敏感性質(zhì)的PAMAM衍生物在水溶液中表現(xiàn)出溫度敏感的特性，隨著溫度的逐步升高，聚合物的水溶性降低，且其水溶性隨PH的調(diào)節(jié)而發(fā)生變化。
[0010]發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的:
[0011](一)G2.5代具有酯基末端的PAMAM樹枝型聚合物的制備。
[0012]以乙二胺為核，與丙烯酸甲酯重復(fù)進(jìn)行完全的Michael加成反應(yīng)和酰胺化反應(yīng)得到直至G2.5代具有酯基末端的PAMAM樹枝型聚合物。具體過程如下:
[0013]以乙二胺和丙烯酸甲酯為原料，摩爾比按照1:4_5，冰浴，溫度保持在01:;緩慢滴加丙烯酸甲酯的甲醇溶液到乙 二胺的甲醇溶液中，滴畢，反復(fù)抽真空，氮?dú)獗Ｗo(hù)，恢復(fù)室溫，然后在35°C下反應(yīng)6h ;反應(yīng)結(jié)束后，旋蒸除去溶劑甲醇，得淡黃色的粘稠液體G0.5PAMAM ；
[0014]以G0.5PAMAM:乙二胺=1:4-8 (摩爾比)；將乙二胺的甲醇溶液加入到帶有磁力攪拌、溫度計(jì)的三口燒瓶中，冰浴，緩慢滴加G0.5PAMAM的甲醇溶液；滴畢，反復(fù)抽真空，氮?dú)獗Ｗo(hù)，在35°C下反應(yīng)24h，得產(chǎn)物Gl.0PAMAM ；
[0015]以G1.0PAMAM:丙烯酸甲酯=1:16 (摩爾比);將丙烯酸甲酯的甲醇溶液加入到帶有磁力攪拌、溫度計(jì)的三口瓶中，冰浴，緩慢滴加Gl.0PAMAM的甲醇溶液；滴畢，反復(fù)抽真空，氮?dú)獗Ｗo(hù)，在35°C下反應(yīng)24h ;旋蒸除去未反應(yīng)的丙烯酸甲酯和溶劑甲醇，得到淺黃色的黏稠液體 Gl.5PAMAM ；
[0016]以G1.5PAMAM:乙二胺=1:80 (摩爾比)；將乙二胺的甲醇溶液加入到帶有磁力攪拌、溫度計(jì)的三口燒瓶中，冰浴，緩慢滴加Gl.5PAMAM的甲醇溶液；滴畢，反復(fù)抽真空，氮?dú)獗Ｗo(hù)，在35°C下反應(yīng)72h;反應(yīng)完畢，采用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在35°C下蒸除甲醇，得產(chǎn)物G2.0PAMAM ；
[0017]以G2.0PAMAM:丙烯酸甲酯=1:24 (摩爾比);將丙烯酸甲酯的甲醇溶液加入到帶有磁力攪拌、溫度計(jì)的三口瓶中，冰浴，緩慢滴加G2.0PAMAM的甲醇溶液；滴畢，反復(fù)抽真空，氮?dú)獗Ｗo(hù)，在35°C下反應(yīng)72h ;旋蒸除去未反應(yīng)的丙烯酸甲酯和溶劑甲醇，得到淺黃色的黏稠液體 G2.5PAMAM。
[0018](二)以三羥甲基氨基甲烷(Tris)對(duì)G2.5代PAMAM進(jìn)行修飾，使其末端三羥基化。
[0019]G2.5PAMAM、三羥甲基氨基甲烷、無水碳酸鉀按照摩爾比1:24:24投料；[0020]取三羥甲基氨基甲烷(Tris)和無水碳酸鉀的無水DMSO溶液或DMF溶液于冰水浴(溫度3~5°C )下的圓底燒瓶中，G2.5PAMAM0.2876g溶于少量無水DMSO或無水DMF于恒壓滴液漏斗中，反復(fù)三次抽真空，氮?dú)獗Ｗo(hù)后，在磁力攪拌器的勻速攪拌下，G2.5PAMAM的DMSO溶液或DMF溶液緩慢滴入圓底燒瓶中，滴加完畢后取下恒壓滴液漏斗，將反應(yīng)裝置移入恒溫油浴鍋，溫度控制在50°C，連續(xù)反應(yīng)72h ；
[0021]反應(yīng)結(jié)束后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去溶劑DMS0，得到淡黃色不透明粘稠液體，將其溶于少量蒸餾水中攪拌溶解為澄清溶液，然后滴入大量丙酮中產(chǎn)生白色沉淀，棄去上清液，反復(fù)進(jìn)行三次除去水溶性雜質(zhì)，得到的產(chǎn)物加入透析袋(截留分子量為3500)透析24h后進(jìn)行冷凍干燥，得到 G2.5PAMAM-Tris。
[0022](三)末端變成羧基結(jié)構(gòu)的N-丙基哌嗪的制備。
[0023]利用酸酐對(duì)N-丙基哌嗪進(jìn)行修飾，使其末端變成羧基結(jié)構(gòu)；經(jīng)純化得到產(chǎn)
[0024]
【權(quán)利要求】
1.一種pH及溫度超敏感性樹枝狀大分子藥物載體(2.5代)，其特征在于，載體為G2.5PAMAM-Tris-NPPOBA,即經(jīng)過修飾后末端三個(gè)羥基的2.5代聚酰胺樹枝狀大分子與末端變成羧基結(jié)構(gòu)的N-丙基哌嗪進(jìn)行健合的產(chǎn)物。
2.權(quán)利要求1所述一種pH及溫度超敏感性樹枝狀大分子藥物載體(2.5代)的制備方法，其特征在于，反應(yīng)過程為:經(jīng)過修飾后末端三個(gè)羥基的2.5代聚酰胺樹枝狀大分子與末端變成羧基結(jié)構(gòu)的N-丙基哌嗪進(jìn)行健合。
3.權(quán)利要求2所述一種pH及溫度超敏感性樹枝狀大分子藥物載體(2.5代)的制備方法，其特征在于，反應(yīng)過程為: 將N-丙基哌嗪-4-氧代丁酸(NPPOBA)的DMSO溶液或DMF溶液與1_ (3- 二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDOHCl)以及4-二甲氨基吡啶(DMAP)混合室溫下攪拌lh，對(duì)NPPOBA進(jìn)行活化，直到溶液從無色變?yōu)榧t棕色為止活化完成； 然后取定量G2.5PAMAM-Tris的DMSO溶液或DMF溶液(反應(yīng)摩爾比:G2.5PAMAM_Tris/NPPOBA/EDC.HC1/DMAP=1:96:96:96)于恒壓滴液漏斗中，反復(fù)三次抽真空，氮?dú)獗Ｗo(hù)后，在磁力攪拌器的勻速攪拌下，G2.5PAMAM-Tris的DMSO溶液或DMF溶液緩慢滴入圓底燒瓶中，滴加完畢后取下恒壓滴液漏斗，在室溫下連續(xù)反應(yīng)72h以上； 用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去大部分溶劑DMSO或DMF，得到的產(chǎn)物用少量蒸餾水溶解，低于一定溫度為澄清的棕紅色溶液，高于此溫度時(shí)溶液變渾濁，將渾濁的液體用超速離心機(jī)在溫度為40°C，轉(zhuǎn)速5000rpm條件 下離心，所得沉淀物用透析袋(截留分子量為3500)大量蒸餾水透析24h得到目標(biāo)產(chǎn)物。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述一種pH及溫度超敏感性樹枝狀大分子藥物載體(2.5代)的制備方法，其特征在于，所述原料末端三羥基的2.5代聚酰胺樹枝狀大分子G2.5PAMAM-Tris的制備方法如下: 以三羥甲基氨基甲烷Tris對(duì)G2.5PAMAM進(jìn)行修飾，使其末端有三個(gè)羥基。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述一種pH及溫度超敏感性樹枝狀大分子藥物載體(2.5代)的制備方法，其特征在于，所述原料末端三羥基的2.5代聚酰胺樹枝狀大分子G2.5PAMAM-Tris的制備方法如下: G2.5PAMAM、三羥甲基氨基甲烷、無水碳酸鉀按照摩爾比1:24:24投料； 取三羥甲基氨基甲烷(Tr i s )和無水碳酸鉀的無水DMSO溶液或DMF溶液于冰水浴(溫度3~5°C )下的圓底燒瓶中，G2.5PAMAM溶于少量無水DMSO或無水DMF于恒壓滴液漏斗中，反復(fù)三次抽真空，氮?dú)獗Ｗo(hù)后，在磁力攪拌器的勻速攪拌下，G2.5PAMAM的DMSO溶液或DMF溶液緩慢滴入圓底燒瓶中，滴加完畢后取下恒壓滴液漏斗，將反應(yīng)裝置移入恒溫油浴鍋，溫度控制在50°C，連續(xù)反應(yīng)72h ； 反應(yīng)結(jié)束后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去溶劑DMS0，得到淡黃色不透明粘稠液體，將其溶于少量蒸餾水中攪拌溶解為澄清溶液，然后滴入大量丙酮中產(chǎn)生白色沉淀，棄去上清液，反復(fù)進(jìn)行三次除去水溶性雜質(zhì)，得到的產(chǎn)物加入透析袋(截留分子量為3500)透析24h后進(jìn)行冷凍干燥，得到 G2.5PAMAM-Tris。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述一種pH及溫度超敏感性樹枝狀大分子藥物載體(2.5代)的制備方法，其特征在于，2.5代聚酰胺樹枝狀大分子G2.5PAMAM的制備方法如下: 以乙二胺和丙烯酸甲酯為原料，摩爾比按照1:4-5，冰浴，溫度保持在01:;緩慢滴加丙烯酸甲酯的甲醇溶液到乙二胺的甲醇溶液中，滴畢，反復(fù)抽真空，氮?dú)獗Ｗo(hù)，恢復(fù)室溫，然后在35°C下反應(yīng)6h ;反應(yīng)結(jié)束后，旋蒸除去溶劑甲醇，得淡黃色的粘稠液體G0.5PAMAM ； 以G0.5PAMAM:乙二胺=1:4-8 (摩爾比);將乙二胺的甲醇溶液加入到帶有磁力攪拌、溫度計(jì)的三口燒瓶中，冰浴，緩慢滴加G0.5PAMAM的甲醇溶液；滴畢，反復(fù)抽真空，氮?dú)獗Ｗo(hù)，在35°C下反應(yīng)24h，得產(chǎn)物Gl.0PAMAM ； 以Gl.0PAMAM:丙烯酸甲酯=1:16 (摩爾比);將丙烯酸甲酯的甲醇溶液加入到帶有磁力攪拌、溫度計(jì)的三口瓶中，冰浴，緩慢滴加Gl.0PAMAM的甲醇溶液；滴畢，反復(fù)抽真空，氮?dú)獗Ｗo(hù)，在35°C下反應(yīng)24h ;旋蒸除去未反應(yīng)的丙烯酸甲酯和溶劑甲醇，得到淺黃色的黏稠液體 Gl.5PAMAM ； 以G1.5PAMAM:乙二胺=1:80 (摩爾比)；將乙二胺的甲醇溶液加入到帶有磁力攪拌、溫度計(jì)的三口燒瓶中，冰浴，緩慢滴加Gl.5PAMAM的甲醇溶液；滴畢，反復(fù)抽真空，氮?dú)獗Ｗo(hù)，在35°C下反應(yīng)72h;反應(yīng)完畢，采用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在35°C下蒸除甲醇，得產(chǎn)物G2.0PAMAM ； 以G2.0PAMAM:丙烯酸甲酯=1:24 (摩爾比)；將丙烯酸甲酯的甲醇溶液加入到帶有磁力攪拌、溫度計(jì)的三口瓶中，冰浴，緩慢滴加G2.0PAMAM的甲醇溶液；滴畢，反復(fù)抽真空，氮?dú)獗Ｗo(hù)，在35°C下反應(yīng)72h;旋蒸除去未反應(yīng)的丙烯酸甲酯和溶劑甲醇，得到淺黃色的黏稠液體 G2.5PAMAM。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至3任何一項(xiàng)所述一種pH及溫度超敏感性樹枝狀大分子藥物載體(2.5代)的制備方法，其特征在于，所述末端變成羧基結(jié)構(gòu)的N-丙基哌嗪的制備方法為: 利用酸酐對(duì)N-丙基哌嗪進(jìn)行修飾，使其末端變成羧基結(jié)構(gòu)；經(jīng)純化得到產(chǎn)物；如下所
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述一種pH及溫度超敏感性樹枝狀大分子藥物載體(2.5代)的制備方法，其特征在于，所述末端變成羧基結(jié)構(gòu)的N-丙基哌嗪的制備方法為: 將二氯甲烷加入容器中，在攪拌下向容器中慢慢加入丁二酸酐，邊攪拌邊使丁二酸酐溶解； N-丙基哌嗪，用二氯甲烷溶解，然后裝入恒壓漏斗中；在15°C，將二氯甲烷溶解的胺類化合物慢慢滴加到三口瓶中，滴加完畢，在此溫度下反應(yīng)5h ； 反應(yīng)結(jié)束后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)蒸出多余的二氯甲烷，溶液變?yōu)榧t棕色粘稠狀液體，取出后加入少量乙醚，靜置一段時(shí)間后，有粉色固體析出，過濾，濾餅用二氯甲烷洗滌兩次，用無水乙醇重結(jié)晶，80真空干燥24h。
【文檔編號(hào)】A61K47/34GK103736097SQ201310755965
【公開日】2014年4月23日 申請(qǐng)日期:2013年12月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月31日
【發(fā)明者】王征, 趙燕軍, 劉瑞紅, 曹延武, 陳超, 高敏 申請(qǐng)人:天津大學(xué)