包含聚合載體貨物復(fù)合物和至少一種蛋白或肽抗原的藥物組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種藥物組合物，其包括(例如，用作佐劑)聚合載體貨物復(fù)合物，包含作為載體的由二硫鍵交聯(lián)的陽離子組分形成的聚合載體；和作為貨物的至少一種核酸分子，以及至少一種抗原，所述抗原選自下述：來自與傳染病相關(guān)的病原體的抗原；與變態(tài)反應(yīng)或變應(yīng)性疾病相關(guān)的抗原；與自身免疫病相關(guān)的抗原；或與癌癥或腫瘤疾病相關(guān)的抗原，或在每種情形中是所述抗原的片段、變體和/或衍生物。所述藥物組合物允許有效誘導(dǎo)針對所述抗原的適應(yīng)性免疫應(yīng)答。本發(fā)明還提供試劑盒以及所述藥物組合物或試劑盒作為疫苗的應(yīng)用，特別是用于治療傳染病、變態(tài)反應(yīng)、自身免疫病和腫瘤或癌癥疾病的疫苗的應(yīng)用。
【專利說明】包含聚合載體貨物復(fù)合物和至少一種蛋白或肽抗原的藥物組合物
[0001]本發(fā)明涉及一種包含聚合載體貨物復(fù)合物和至少一種抗原的藥物組合物。所述聚合載體貨物復(fù)合物優(yōu)選包含載體和貨物，其中所述載體是二硫鍵交聯(lián)的陽離子組分，所述貨物是至少一種核酸分子。所述至少一種抗原優(yōu)選地選自來自與傳染病相關(guān)的病原體的抗原，與變態(tài)反應(yīng)(allergy)或變應(yīng)性疾病相關(guān)的抗原，與自身免疫病(autoimmunedisease)相關(guān)的抗原，或與癌癥或腫瘤疾病相關(guān)的抗原，或在每種情形中是所述抗原的片段、變體和/或衍生物。所述本發(fā)明的藥物組合物可以是，例如，疫苗，其中所述聚合載體貨物復(fù)合物可以作用為佐劑以支持針對所述抗原的免疫應(yīng)答。因此，所述藥物組合物允許有效的誘導(dǎo)針對其中所包含的至少一種抗原的適應(yīng)性免疫應(yīng)答，特別是Thl-轉(zhuǎn)變的免疫應(yīng)答(Thl-shifted immune response)。
[0002]本發(fā)明還提供包含本發(fā)明的藥物組合物的組分的試劑盒或部件的試劑盒，以及本發(fā)明的藥物組合物或本發(fā)明的試劑盒或部件的試劑盒作為特別是用于治療傳染病、變態(tài)反應(yīng)、自身免疫病和腫瘤或癌癥疾病的疫苗的應(yīng)用。此外，本發(fā)明提供:(a)聚合載體貨物復(fù)合物，其與至少一種抗原或其片段、變體和/或衍生物組合用于治療；和(b)至少一種抗原或其片段、變體和/或衍生物，其與聚合載體貨物復(fù)合物組合用于治療，在(a)和(b)的每種情形中，特別是用于治療傳染病、變態(tài)反應(yīng)、自身免疫病以及腫瘤或癌癥疾病。
[0003]目前有許多疾病需要施用佐劑以提供先天性免疫應(yīng)答，從而支持適應(yīng)性免疫應(yīng)答，特別是在接種的情形中。這些疾病中的一些而不必要是全部另外或備選地需要施用基于肽、蛋白和核酸的藥物，例如，將核酸轉(zhuǎn)染到細(xì)胞或組織中。這些要求通常表示此類疾病的治療的不同方面，并且典型地難以以一種方法解決。結(jié)果，現(xiàn)有技術(shù)通常通過不同的方法處理所述的各個方面。
[0004]在上述情形中，通常認(rèn)為接種是最有效且成本有效的預(yù)防或治療疾病的方法之一。然而，疫苗開發(fā)中的一些問題已經(jīng)證明是難以解決的:對于非常年輕和非常年老的人，疫苗常常無效；許多疫苗需要給予多次，并且它們所賦予的保護(hù)隨時間減弱，需要加強(qiáng)施用，并且，對于一些疾病，如HIV，亟需開發(fā)有效的疫苗。如通常所接受的，如果其能夠激發(fā)更強(qiáng)且更持久的免疫應(yīng)答，則這些疫苗中的多種將被允許或改善。
[0005]由此，開發(fā)新的有效且安全的下述藥物組合物代表主要的有挑戰(zhàn)性問題，所述藥物組合物包含用于接種目的的佐劑，其通過起始或加強(qiáng)平行的先天性免疫應(yīng)答而支持適應(yīng)性免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)和維持。
[0006] 佐劑通常定義為能夠增加和/或調(diào)節(jié)抗原的固有免疫原性的化合物。為了減少不利的副作用，與先前的全細(xì)胞或基于病毒的疫苗相比，新的疫苗具有通常導(dǎo)致更低的免疫原性的更加限定的組成。因此，需要佐劑來輔助新的疫苗誘導(dǎo)強(qiáng)有力而且持久的免疫應(yīng)答，還有需要更少的抗原和更少注射次數(shù)的另外的益處?，F(xiàn)在，清楚的是，適應(yīng)性免疫應(yīng)答主要依賴于注射或接種后由先天免疫細(xì)胞感知到的初始危險信號的水平和特異性(Guy，B.(2007), Nat Rev Microb1l (自然微生物學(xué)綜述)5 (7):505-17.)。特別是對于新一代疫苗候選物，其日益包含高度純化的重組蛋白，并且盡管非常安全，但是免疫原性差，有效的佐劑日益變成必需的。
[0007]不幸的是，迄今為止僅有少數(shù)得到許可的佐劑是可以用的。最突出的是白礬(Alum)，已知其是安全的，但是也代表著一種非常弱的佐劑。已經(jīng)開發(fā)了多種其他的佐劑，例如，包括施用病原體、CpG-核苷酸等。然而，由于必須考慮和解決許多新的和剛出現(xiàn)的問題，這些新的或“已確定的”佐劑中大部分仍然不滿足上述要求。這些問題特別包括新的和再次出現(xiàn)的傳染病、重復(fù)的施用、流行性感冒的威脅等等。
[0008]此外，通常更難以開發(fā)新的疫苗靶標(biāo)，并且，-由于其特異性定制的免疫應(yīng)答-需要更有力的佐劑才能夠成功。此外，仍然存在顯著數(shù)量的重要的病原體，我們目前甚至沒有有效的針對其的疫苗。這成為非常有挑戰(zhàn)性的遠(yuǎn)景靶標(biāo)。為了能夠進(jìn)行針對所述靶標(biāo)的疫苗開發(fā)，將需要包含佐劑和所述靶標(biāo)的更強(qiáng)效的藥物組合物。因此，在此類組合物中的新的佐劑將需要提供一些優(yōu)點(diǎn)，包括更加異源性的抗體應(yīng)答，覆蓋病原體的多樣性，誘導(dǎo)強(qiáng)效功能性抗體應(yīng)答，確保病原體殺傷或中和以及更有效的T細(xì)胞應(yīng)答的誘導(dǎo)，用于直接或間接的病原體殺傷，特別是誘導(dǎo)作為Thl免疫應(yīng)答的一部分的細(xì)胞毒性T細(xì)胞。另外，佐劑可能有必要獲得更實(shí)用的效果，包括抗原劑量減少和克服組合疫苗中的抗原競爭。并且，針對老年群體的背景，其日益對傳染病敏感，新的佐劑必須克服免疫應(yīng)答隨年齡的自然減弱(O' Hagan, D.T.和 Ε.De Gregor1 (2009), Drug Discov Today (現(xiàn)代藥物發(fā)現(xiàn))14(11-12):541-51.)。
[0009]O’Hagan(2009 ;同上)的綜述總結(jié)了亟需新的有效的佐劑的一些原因，例如，需要疫苗中更低的抗原劑量，增加免疫應(yīng)答的廣度和異源性活性的必要性，允許復(fù)雜的組合疫苗，并且克服抗原競爭，克服在一些群體組(諸如老年人、幼兒和嬰兒、患有慢性疾病和免疫受損的患者)中的有限的免疫應(yīng)答，增加效應(yīng)T細(xì)胞應(yīng)答和抗體滴度，更快速地誘導(dǎo)保護(hù)性反應(yīng)，并且還通過增強(qiáng)記憶B和T細(xì)胞應(yīng)答而延長反應(yīng)的持續(xù)時間。
[0010]綜上所述，需要包含免疫刺激劑或佐劑的新的有效的且安全的藥物組合物，其優(yōu)選有效地誘導(dǎo)先天性免疫應(yīng)答，特別是誘導(dǎo)抗病毒細(xì)胞因子IFN-α ;并且其還有效地支持適應(yīng)性免疫應(yīng)答；安全，即不與任意長期的作用相關(guān)；其是充分耐受的；其可通過簡單的合成途徑獲得；其表現(xiàn)出低成本的儲存條件(特別是可行的冷凍干燥)；其需要簡單且廉價的組分；其是可生物降解的；其與多種不同種類的疫苗抗原相容；其能夠同時遞送抗原和免疫增強(qiáng)劑，等等。
[0011]如上文已經(jīng)解釋的，佐劑或免疫刺激劑通常通過其誘導(dǎo)先天性免疫應(yīng)答的能力起作用。在大部分生物體中，先天性免疫系統(tǒng)形成宿主防御的主要系統(tǒng)，并且包括屏障，諸如體液和化學(xué)屏障(例如，包括炎癥)，補(bǔ)體系統(tǒng)和細(xì)胞屏障。先天性免疫系統(tǒng)典型地基于稱為模式識別受體(pattern recognit1n receptors)的少量的受體。它們識別區(qū)分外源生物體與宿主細(xì)胞的保守的分子模式，所述外源生物體如病毒、細(xì)菌、真菌和寄生蟲。此類病原體-相關(guān)的分子模式(PAMP)包括病毒核酸、細(xì)菌和真菌壁的組分、鞭毛蛋白及其他。詳細(xì)研究的第一模式識別受體(PAMP受體)家族是Toll樣受體(TLR)家族。TLRs是識別胞外環(huán)境的配體或內(nèi)體腔的配體的跨膜蛋白。配體結(jié)合后，它們通過胞質(zhì)銜接蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)信號，這導(dǎo)致引發(fā)宿主防御反應(yīng)并且使抗微生物肽、促炎癥趨化因子和細(xì)胞因子、抗病毒細(xì)胞因子等的產(chǎn)生(例如，參見 Meylan, E., J.Tschopp,等人，(2006), Nature (自然)442(7098):39-44)。其他相關(guān)的免疫系統(tǒng)組分包括，例如，內(nèi)體TLRs，胞質(zhì)受體，I型干擾素和胞質(zhì)受體。因此，所述免疫刺激劑或佐劑在本文中優(yōu)選定義為先天性免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)劑，其激活模式識別受體(PAMP受體)。由此，激發(fā)信號級聯(lián)，例如，其可以導(dǎo)致支持先天性免疫應(yīng)答的細(xì)胞因子(例如，IFN-α)的釋放。因此，優(yōu)選地，免疫刺激劑或佐劑的特征是結(jié)合此類受體并且激活此類PAMP受體。理想地，所述試劑或佐劑另外通過例如轉(zhuǎn)換免疫應(yīng)答而支持適應(yīng)性免疫應(yīng)答，以使優(yōu)選種類的Th細(xì)胞被激活。取決于要治療的疾病或病癥，向基于Thl的免疫應(yīng)答的轉(zhuǎn)換可能是優(yōu)選的，或者在其他情形中，向Th2免疫應(yīng)答的轉(zhuǎn)換可能是優(yōu)選的。
[0012]在現(xiàn)有技術(shù)中，存在一些有希望的佐劑候選物，其至少滿足上文限定的需要的特征中的一些而不是全部特征。
[0013]例如，在上述開發(fā)的新的佐劑中，一些核酸，如CpG DNA寡核苷酸或isRNA(免疫刺激RNA)，由于它們允許治療性或預(yù)防性誘導(dǎo)先天性免疫應(yīng)答而被證明是用于新的免疫刺激劑或佐劑的有希望的候選物。能夠理解，基于所述核酸的佐劑通常必須被有效地遞送至作用位點(diǎn)以允許誘導(dǎo)有效的先天性免疫應(yīng)答，而沒有不必要的佐劑活性損失，并且在一些情形中，不需要增加施用體積超過系統(tǒng)耐受的水平。
[0014]解決這一問題的一種方法可以是用免疫刺激性核酸轉(zhuǎn)染作為先天免疫系統(tǒng)的一部分的細(xì)胞(例如，樹突細(xì)胞、類漿細(xì)胞樹突細(xì)胞(PDCs))，所述免疫刺激性核酸是PAMP受體(例如，Toll-樣受體(TLRs))的配體，并且因此可以通過所述核酸配體導(dǎo)致免疫刺激。其他方法可以是直接轉(zhuǎn)染基于核酸的佐劑。然而，所有這些方法都典型地被低效率的核酸遞送減弱，并且因此減少佐劑活性，特別是在局部施用時。
[0015]然而，迄今為止，所述基于核酸的佐劑方法的一個主要的缺點(diǎn)是其有限的穿過哺乳動物細(xì)胞質(zhì)膜的能力，這導(dǎo)致差的細(xì)胞進(jìn)入和不足的治療功效。迄今為止，這種障礙成為基于核酸轉(zhuǎn)染的應(yīng)用(例如，生物醫(yī)藥開發(fā)以及因此的多種生物藥劑的商業(yè)成功)的主要挑戰(zhàn)(例如，參見Foerg，C.&Merkle, H.P., J Pharm Sci (制藥科學(xué)雜志)97，144-62(2008))。
[0016]迄今為止，已經(jīng)在體外轉(zhuǎn)染目的的情形中和在基因治療方法的情形中研究了將核酸或基因轉(zhuǎn)染到細(xì)胞或組織中。然而，目前尚沒有基于所述基因遞送技術(shù)、有效且安全的佐劑可用，特別是沒有得到許可的佐劑。這可能是由于在基于核酸的佐劑的情形中通常與要解決的穩(wěn)定性問題組合的對佐劑的復(fù)雜的要求。
[0017]然而，將核酸或基因轉(zhuǎn)染至細(xì)胞或組織中用于引發(fā)(先天性和/或適應(yīng)性)免疫應(yīng)答似乎提供了一種提供新的佐劑的有希望的方法。
[0018]然而，這些方法中的多種利用將核酸或基因轉(zhuǎn)染到細(xì)胞或組織中，而沒有誘導(dǎo)先天性免疫應(yīng)答的目的。甚至存在一些基因治療法，其必須嚴(yán)格地避免誘導(dǎo)先天性免疫應(yīng)答。甚至在少見的情形中，其中進(jìn)行接種以利用核酸的施用來誘導(dǎo)適應(yīng)性抗原特異性免疫應(yīng)答，例如，在使用DNA或mRNA編碼的抗原進(jìn)行的腫瘤接種中，適應(yīng)性免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)典型地作為針對所編碼的抗原的主動免疫而不是作為伴隨的佐劑治療而進(jìn)行，并且因此可能需要另外施用單獨(dú)的佐劑來誘導(dǎo)先天性免疫應(yīng)答。
[0019] 即使本領(lǐng)域已知多種轉(zhuǎn)染方法，將核酸或基因轉(zhuǎn)移或插入到個體細(xì)胞中仍然成為目前的主要挑戰(zhàn)，并且還沒有得到令人滿意地解決。為了解決這一復(fù)雜的問題，在近十年中開發(fā)了多種方法。這些包括通過磷酸鈣、陽離子脂質(zhì)、陽離子聚合物和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染。其他轉(zhuǎn)染方法是電穿孔和病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)。
[0020]然而，如技術(shù)人員知曉的，用于轉(zhuǎn)移或插入核酸或基因的系統(tǒng)必須滿足用于體內(nèi)應(yīng)用的一些要求，其包括以高功能性有效的向個體系統(tǒng)中的核酸遞送，保護(hù)所核酸抵抗普遍存在的核酸酶，在細(xì)胞中釋放所述核酸，沒有安全性顧慮，以能夠規(guī)?；纳虡I(yè)可接受的形式可行性制備以及在低成本條件下的儲存穩(wěn)定性(例如，可行的冷凍干燥)。這些要求應(yīng)該添加到佐劑的復(fù)雜要求中，特別是當(dāng)其是上文列出的核酸的形式時。
[0021]目前可用的用于轉(zhuǎn)移或插入核酸或基因的一些成功的策略依賴于病毒載體的使用，諸如腺病毒、腺伴隨病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒和皰疹病毒。病毒載體能夠以高效和長期基因表達(dá)的可能性介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移。然而，在基因治療臨床試驗中揭示的急性免疫應(yīng)答(“細(xì)胞因子爆發(fā)”)、免疫原性和插入誘變已經(jīng)引起了關(guān)于一些常用的病毒載體的嚴(yán)重的安全性擔(dān)憂。
[0022]對轉(zhuǎn)移或插入核酸或基因的問題的另一種解決方案可以使用非病毒載體進(jìn)行。盡管非病毒載體不如病毒載體有效，但是已經(jīng)開發(fā)了多種非病毒載體以提供更安全的備選方案。已經(jīng)使用物理(不用載體的核酸遞送)和化學(xué)方法(基于合成的載體的核酸遞送)研究了非病毒核酸遞送的方法。物理方法通常包括針頭注射、電穿孔、基因槍、超聲和流體動力學(xué)遞送，利用穿透細(xì)胞膜并且促進(jìn)胞內(nèi)基因轉(zhuǎn)移的物理力進(jìn)行?；瘜W(xué)方法典型地使用合成的或天然存在的化合物(例如，陽離子脂質(zhì)、陽離子聚合物、脂質(zhì)-聚合物雜合系統(tǒng))作為載體將核實(shí)遞送至細(xì)胞內(nèi)。盡管在基礎(chǔ)科學(xué)和各種非病毒核酸遞送系統(tǒng)的應(yīng)用中已經(jīng)取得了顯著的進(jìn)展，但是大部分非病毒方法仍然不如病毒載體有效，尤其是用于體內(nèi)基因遞送時(例如，參見 Gao, X.，Kim, K.&Liu, D.，AAPS J9, E92-104 (2007))。
[0023]如上文定義的此類轉(zhuǎn)染劑典型地已經(jīng)僅在體外反應(yīng)中得到成功地應(yīng)用。然而，對于核酸在體內(nèi)的應(yīng)用，必須滿足其他的需要。例如，關(guān)于團(tuán)聚，核酸與轉(zhuǎn)染劑之間的復(fù)合物在生理鹽溶液中必須是穩(wěn)定的。此外，由于載體本身不應(yīng)該在個體中誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫應(yīng)答，因此，所述復(fù)合物典型地必須不與宿主的補(bǔ)體系統(tǒng)的各部分反應(yīng)，并且，由此本身必須不是免疫原性的。另外，所述復(fù)合物應(yīng)該保護(hù)核酸不受普遍存在的核酸酶的早期胞外降解。
[0024]在本領(lǐng)域中，有多種轉(zhuǎn)染劑可用，尤其是陽離子脂質(zhì)，其在細(xì)胞培養(yǎng)物中表現(xiàn)出極好的轉(zhuǎn)染活性。然而，這些轉(zhuǎn)染劑中的大部分在血清存在時表現(xiàn)不好，僅有一些在體內(nèi)有活性。當(dāng)脂復(fù)合物(Iipoplexes)暴露于血液、黏液、上皮細(xì)胞襯液或組織基質(zhì)中存在的極大量的帶負(fù)電荷且通常是兩親性的蛋白時，在尺寸、表面電荷和脂質(zhì)組成上發(fā)生顯著的變化。當(dāng)在體內(nèi)施用時，脂復(fù)合物(Iipoplexes)傾向于與帶負(fù)電荷的血液組分相互作用，并且形成聚集物，所述聚集物可能被吸附到循環(huán)的紅血細(xì)胞的表面上，截留在稠的黏液層中，或者在微脈管系統(tǒng)中形成栓塞，阻止其到達(dá)遠(yuǎn)端位置的意欲的靶細(xì)胞。在它們被引入到血液循環(huán)中后，有一些甚至進(jìn)行溶解(例如，參見Gao, X.，Kim, K.&Liu，D.，AAPS J9，E92-104(2007))。
[0025]一種更有希望的方法使用陽離子聚合物。由于它們能夠緊密地復(fù)合并且縮合帶負(fù)電荷的核酸，因此，陽離子聚合物被證明對核酸轉(zhuǎn)染是有效的。因此，已經(jīng)研究了多種陽離子聚合物作為體外和體內(nèi)基因遞送的載體。這些包括聚乙烯亞胺(PEI)，聚酰胺型胺類(polyamidoamine)和聚丙胺樹狀聚體,聚丙烯胺，陽離子葡聚糖，殼聚糖，陽離子蛋白和陽離子肽。盡管大部分陽離子聚合物共有將DNA縮合成小顆粒的功能并且通過經(jīng)由與細(xì)胞表面上陰離子位點(diǎn)的電荷-電荷相互作用的內(nèi)吞作用促進(jìn)細(xì)胞攝入，但是它們的轉(zhuǎn)染活性和毒性顯著不同。
[0026]在本領(lǐng)域中僅在一種方法中，F(xiàn)otin-Mleczek等人(W0 2009/030481)證明了與短的陽離子肽復(fù)合的RNA的免疫刺激作用。這些制劑似乎在免疫活性細(xì)胞中有效地誘導(dǎo)細(xì)胞因子的產(chǎn)生。不幸的是，F(xiàn)otin-Mleczek等人沒有評估這些復(fù)合物對優(yōu)選的抗病毒細(xì)胞因子IFN-α的誘導(dǎo)作用。另外，這些復(fù)合物被證明在冷凍干燥過程中是不穩(wěn)定的。
[0027]在上述情形中，陽離子聚合物隨分子量增加表現(xiàn)出更好的轉(zhuǎn)染效率。然而，增加的分子量還導(dǎo)致陽離子聚合物的增加的毒性。在上述這種情形中，(高分子量的)PEI可能是活性最強(qiáng)和研究最多的用于核酸轉(zhuǎn)染的聚合物，特別是用于基因遞送目的的聚合物。不幸的是，由于其不能生物降解的性質(zhì)和毒性，其表現(xiàn)出相同的缺點(diǎn)。此外，即使由高分子量聚合物形成的人工合成多聚復(fù)合物(polyplexes)在生理條件下表現(xiàn)出改善的穩(wěn)定性,但是數(shù)據(jù)表明此類聚合物可能妨礙載體解開(unpacking)。為了克服這種不利的影響，Read等人(參見 Read，M.L.等人，J Gene Med.(基因醫(yī)學(xué)雜志)5，232-245 (2003);和 Read，M.L.等人，Nucleic Acids Res (核酸研究)33，e86 (2005))基于通過肽 Cys-Lysltl-Cys 的氧化縮聚反應(yīng)制備的線性可還原的聚陽離子(RPC)開發(fā)了一種新型的合成載體。所述肽Cys-Lys10-Cys能夠被胞內(nèi)環(huán)境切割,從而促使核酸釋放。在這種情形中，Read等人(2003,同上)能夠證明由這些RPCs形成的人工合成多聚體通過還原條件去穩(wěn)定，能夠允許DNA和mRNA的有效釋放。然而，檢驗體外轉(zhuǎn)染效率，Read等人(2003，同上)還觀察到N/P (氮原子比磷原子)比率為2并不令人滿意，需要更高的N/P比率才能提高轉(zhuǎn)染效率。另外，Read等人(2003，同上)觀察到另外需要氯喹或陽離子脂質(zhì)DOTAP將轉(zhuǎn)染效率提高至足夠的水平。結(jié)果，Read等人(2005，同上)在具有已知的內(nèi)體緩沖能力的RPCs中包括組氨酸殘基，并且表明此類富含組氨酸的RPCs可以被細(xì)胞內(nèi)還原環(huán)境切割。這種方法能夠允許在不需要內(nèi)體裂解劑氯喹的條件下進(jìn)行寬泛范圍核酸的有效的胞質(zhì)遞送，所述核酸包括質(zhì)粒DNA、mRNA 和 siRNA 分子。
[0028]不幸的是，Read等人(2003，同上)和Read等人(2005，同上)都沒有評價RPCs是否可以直接用于體內(nèi)應(yīng)用。在他們在2005年的研究中，轉(zhuǎn)染在不存在血清的條件下進(jìn)行，以避免可能由于血清蛋白與限制細(xì)胞攝入的人工合成多聚體的結(jié)合導(dǎo)致的對組氨酸殘基增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)運(yùn)的能力的掩蔽。然而，初步的實(shí)驗表明富含組氨酸的RPC人工合成多聚體的轉(zhuǎn)染特性可以受到血清蛋白存在的影響，在10% FCS中觀察到GFP-陽性細(xì)胞減少50%。對于體內(nèi)應(yīng)用，Read等人(2005，同上)提議用親水性聚合物聚_[N-(2羥基-丙基)甲基丙烯酰胺]進(jìn)行修飾。不幸的是，他們沒有防止人工合成多聚體的聚集和聚陽離子復(fù)合物與血清蛋白的結(jié)合。此外，由于陽離子聚合物大量過剩(其特征在于高N/P比率)，當(dāng)復(fù)合核酸時，形成強(qiáng)陽離子復(fù)合物。由此，由于它們強(qiáng)烈的鹽誘導(dǎo)凝集的傾向和與血清內(nèi)容物的相互作用(調(diào)理作用(opsonizat1n)),所述復(fù)合物僅在體內(nèi)有有限的應(yīng)用。另外，當(dāng)用于基因治療目的時，這些(帶正電荷的)復(fù)合物可能激發(fā)補(bǔ)體活化。還證明這些基于帶正電荷RPC的復(fù)合物在局部施用到皮膚中后表現(xiàn)出差的核酸貨物翻譯。
[0029]以與 Read 等人相似的方法，McKenzie 等人(McKenzie, D.L., K.Y.Kwok,等人，(2000)，J B1l Chem(生物化學(xué)雜志)275(14):9970-7 和 McKenzie，D.L.，Ε.Smiley，等人，(2000), B1conjug Chem(生物綴合物化學(xué))11 (6):901-9)通過將多個半胱氨酸插入到短的合成肽中而開發(fā)了交聯(lián)的肽作為基因遞送劑。在他們的研究中，他們檢驗了與DNA的最佳復(fù)合物形成，并且結(jié)果，他們能夠證明，對于充分形成的肽DNA縮合物，需要至少為2的N/P比率。因此，只有帶正電荷的復(fù)合物似乎表現(xiàn)出最佳的DNA縮合作用。與這些數(shù)據(jù)相比，由于在之前的研究中已經(jīng)表明正電性DNA縮合物的靜脈內(nèi)應(yīng)用導(dǎo)致快速的調(diào)理作用和到肺和肝的非特異性生物分布(Collard, ff.T.，Evers, D.L.，McKenzie, D.L.,和Rice,K.G.(2000)，Carbohydr.Res.323，176-184)，他們提議開發(fā)帶負(fù)電荷的復(fù)合物用于體內(nèi)基因遞送。因此，McKenzie等人(2000 ;同上)提議用聚乙二醇和靶向配體衍生所述載體。應(yīng)該注意，McKenzie等人(2000，同上)的方法是專利(US 6，770，740 BI)的另一個主題，該專利具體公開了編碼核酸、反義核酸和核酶的轉(zhuǎn)染。
[0030]因此，核酸的體內(nèi)應(yīng)用似乎仍然是最有挑戰(zhàn)性的問題之一，原因在于帶有陰離子電荷的血漿蛋白可以非特異性結(jié)合帶正電荷的復(fù)合物并且快速除去它們，例如，通過網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)除去。通過陽離子復(fù)合物進(jìn)行的調(diào)理作用和補(bǔ)體系統(tǒng)的激活是可能參與降低體內(nèi)施用的陽離子復(fù)合物的效力的另外的生理現(xiàn)象。這特別適用于施用基于核酸的藥物，例如，將核酸轉(zhuǎn)染到細(xì)胞或組織中，特別是當(dāng)旨在進(jìn)行編碼的蛋白或肽的表達(dá)或轉(zhuǎn)染的核酸的RNA的轉(zhuǎn)錄時。
[0031]綜上所述，現(xiàn)有技術(shù)沒有提供允許建立有效且安全的藥物組合物的可行性的方式或方法，所述藥物組合物包含用于接種目的的佐劑，特別是當(dāng)需要Th1-轉(zhuǎn)變的免疫應(yīng)答時。
[0032]因此，本發(fā)明的目的是提供解決這些問題中的一種或多種的此類手段或方法。
[0033]本發(fā)明潛在的目的通過本發(fā)明的主題得以解決，優(yōu)選通過后附權(quán)利要求的主題得以解決。
[0034]為了清楚和易讀的目的，提供下述定義。其中公開的任何技術(shù)特征可以是本發(fā)明的每一個實(shí)施方案的一部分。另外的定義和解釋可以提供在本公開內(nèi)容的上下文中。
[0035]核酸:術(shù)語核酸典型地意指任意的DNA-或RNA-分子，并且與多核苷酸同義使用。此外，本文定義的核酸的修飾或衍生物清楚地包含在通用術(shù)語“核酸”中，例如，PNA也包含在術(shù)語“核酸”中。
[0036]單順反子RNA:單順反子RNA可以典型地是RNA，優(yōu)選為mRNA，其只編碼一個開放閱讀框。在這種情形中，一個開放閱讀框是可以翻譯成肽或蛋白的數(shù)個核苷酸三聯(lián)體(triplet)(密碼子)的序列。
[0037]雙/多順反子RNA:RNA,優(yōu)選mRNA，典型地可以具有兩個(雙順反子)或更多個(多順反子)開放閱讀框(0RF)。在這種情形中，一個開放閱讀框是可以翻譯成肽或蛋白的數(shù)個核苷酸三聯(lián)體(密碼子)的序列。
[0038]5’-帽結(jié)構(gòu):5,帽典型地是添加在RNA分子的5’末端的修飾的核苷酸，特別是鳥嘌呤核苷酸。優(yōu)選地，5’-帽使用5' -5'-三磷酸酯鍵添加。
[0039]多聚(C)序列:多聚(C)序列典型地是一段長的胞嘧啶核苷酸的序列，典型地約10至約200個胞苷核苷酸，優(yōu)選約10至約100個胞苷核苷酸，更優(yōu)選地約10至約70個胞苷核苷酸或甚至更優(yōu)選地約20至約50個或甚至約20至約30個胞苷核苷酸。多聚(C)序列可以優(yōu)選地位于核酸所包含的編碼區(qū)的3’。
[0040]多聚(K)尾:多聚⑷尾也稱為“3'-多聚⑷尾”，典型地是添加在RNA的3’端的一段多至約400個腺苷核苷酸的長的腺嘌呤核苷酸序列,例如,約25至約400個,優(yōu)選約50至約400個，更優(yōu)選約50至約300個，甚至更優(yōu)選約50至約250個，最優(yōu)選約60至約250個腺苷核苷酸。
[0041]穩(wěn)定的核酸:穩(wěn)定的核酸典型地可以基本上抵抗體內(nèi)降解(例如，被外切或內(nèi)切核酸酶降解)和/或離體降解(例如，通過疫苗施用之前的制備過程，例如，在制備要施用的疫苗溶液的過程中)。例如，mRNA的穩(wěn)定可以通過提供5’ -帽結(jié)構(gòu)、多聚(A)尾、多聚
(C)尾或任意其他的UTR修飾而實(shí)現(xiàn)。其還可以通過核酸的主鏈修飾或G/C含量的修飾而實(shí)現(xiàn)。在本發(fā)明的情形中可以考慮多種其他方法。
[0042]核酸修飾(修飾的核酸):核酸分子的修飾典型地可以包含主鏈修飾、糖修飾或堿基修飾。與本發(fā)明相聯(lián)系的主鏈修飾典型地是這樣的修飾，即，核酸分子中所包含的核苷酸的主鏈的磷酸可以進(jìn)行化學(xué)修飾。與本發(fā)明相聯(lián)系的糖修飾典型地可以是所述核酸的核苷酸的糖的化學(xué)修飾。此外，與本發(fā)明相聯(lián)系的堿基修飾典型地可以是所述核酸分子的核苷酸的堿基結(jié)構(gòu)部分的化學(xué)修飾。因此，修飾的核酸在本文中也可以定義為可以包含核苷酸類似物的核酸分子。此外，核酸分子的修飾可以包含脂質(zhì)修飾。所述脂質(zhì)-修飾的核酸典型地可以包含本文定義的核酸。所述脂質(zhì)-修飾的核酸分子典型地可以進(jìn)一步包含與所述核酸分子共價連接的至少一個接頭，和與各個接頭共價連接的至少一個脂質(zhì)。備選地，所述脂質(zhì)-修飾的核酸分子可以包含如本文定義的至少一種核酸分子和與所述核酸分子共價連接(不用接頭)的至少一個(雙功能)脂質(zhì)。根據(jù)第三備選方案，所述脂質(zhì)-修飾的核酸分子可以包含如本文定義的核酸分子，與所述核酸分子共價連接的至少一個接頭和與各個接頭共價連接的至少一個脂質(zhì)，以及還有與所述核酸分子共價連接(不用接頭)的至少一個(雙功能)脂質(zhì)。
[0043]核酸的修飾還可以包含核酸分子編碼區(qū)的G/C含量的改變，尤其是當(dāng)所述核酸分子以mRNA形式存在時。在該情形中，特別優(yōu)選的是，與其特定的野生型編碼序列(即，未修飾的mRNA)編碼區(qū)的G/C含量相比，核酸分子編碼區(qū)的G/C含量增加。與特定野生型mRNA的編碼氨基酸序列相比，所述核酸序列的編碼氨基酸序列優(yōu)選不被改變核酸分子的G/C-含量的改變，尤其是當(dāng)所述核酸分子以mRNA形式存在或編碼mRNA時，是基于這樣的事實(shí)，即，要被翻譯的任意mRNA區(qū)的序列對于該mRNA的有效翻譯是重要的。因此，各種核苷酸的組成和序列是重要的。特別地，與具有增加的A(腺苷)/U(尿嘧啶)含量的序列相比，具有增加的G(鳥苷)/C(胞嘧啶)含量的序列更穩(wěn)定。因此，與其野生型編碼序列或mRNA相比，所述編碼序列或mRNA的密碼子由此是改變的，但是保留翻譯的氨基酸序列，以使其包含增加量的G/C核苷酸。關(guān)于幾種密碼子編碼同一種氨基酸(所謂的遺傳密碼的簡并性)的事實(shí)，可以確定對穩(wěn)定性最有利的密碼子(所謂的替代密碼子使用(alternative codon usage))。優(yōu)選地，與野生型mRNA編碼區(qū)的G/C含量相比，所述核酸分子編碼區(qū)的G/C含量，特別是當(dāng)所述核酸以mRNA形式存在或編碼mRNA時，增加至少7%，更優(yōu)選增加至少15%，特別優(yōu)選地增加至少20%。根據(jù)具體的實(shí)施方案，在編碼本文定義的蛋白或肽或其片段、其變體和/或衍生物的區(qū)域中或野生型mRNA序列的全部序列或編碼序列中至少5%，10%，20%，30%,40%, 50%,60%,更優(yōu)選至少70%，甚至更優(yōu)選至少80%且最優(yōu)選至少90%，95%或甚至100%的可取代的密碼子被取代，由此增加所述序列的G/C含量。在這一情形中，與野生型序列相比，特別優(yōu)選的是增加所述核酸分子的G/C含量，特別是當(dāng)所述核酸以mRNA形式存在或編碼mRNA時，增加至最大(即，100%可取代的密碼子)，特別是在編碼蛋白的區(qū)域中。此外，核酸的修飾，特別是當(dāng)所述核酸以mRNA形式存在或編碼mRNA時，是基于這樣的發(fā)現(xiàn)，即，翻譯效率還取決于tRNAs在細(xì)胞中存在的不同頻率。tRNAs在細(xì)胞中存在的頻率，以及由此在所述細(xì)胞中的密碼子應(yīng)用，取決于所述細(xì)胞所來源的物種。因此，酵母細(xì)胞通常表現(xiàn)出與哺乳動物細(xì)胞(如人細(xì)胞)不同的密碼子應(yīng)用。由此，如果在核酸分子中存在增加程度的所謂的“稀少密碼子”(關(guān)于各自的表達(dá)系統(tǒng)而言)，特別是當(dāng)所述核酸以mRNA形式存在或編碼mRNA時，與其中存在編碼相對“常見的” tRNAs的密碼子的情形相比，相應(yīng)的修飾的核酸分子以顯著更少的程度翻譯。因此，特別是如果修飾的核酸分子以mRNA形式存在或編碼mRNA時，與野生型mRNA或編碼序列的對應(yīng)區(qū)域相比，所述修飾的核酸的編碼區(qū)優(yōu)選被修飾，以使編碼在細(xì)胞中相對稀少的tRNA的野生型序列的至少一個密碼子交換為編碼在細(xì)胞中相對常見且攜帶與所述相對稀少的tRNA相同的氨基酸的tRNA的密碼子。通過這種修飾，修飾核酸分子的序列，特別是當(dāng)所述核酸以mRNA形式存在或編碼mRNA時，被改變，以插入關(guān)于常見的tRNAs是可用的密碼子。換言之，通過這種修飾，在每種情形中，編碼在細(xì)胞中相對稀少的tRNA的野生型序列的所有密碼子可以交換為編碼在細(xì)胞中相對常見且在每種情形中與所述相對稀少的tRNA攜帶相同的氨基酸的tRNA的密碼子。哪些tRNAs在細(xì)胞中相對常見，相比之下，哪些tRNAs相對稀少，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的；例如，參考 Akashi，Curr.0pin.Genet.Dev.(現(xiàn)代遺傳發(fā)育觀點(diǎn))2001，11 (6):660_666。特別優(yōu)選的是編碼用于本發(fā)明的蛋白的核酸序列針對人密碼子應(yīng)用進(jìn)行密碼子優(yōu)化。特別優(yōu)選為特定氨基酸使用最常見的tRNA的密碼子，例如，Gly密碼子，其利用在(人)細(xì)胞中最常見的tRNA。在這種情形中，特別優(yōu)選的是，在不改變由核酸分子的編碼區(qū)所編碼的蛋白序列的前提下，將修飾的核酸分子中(尤其是當(dāng)所述核酸以mRNA的形式存在或編碼mRNA時)增加的(特別是最大化的)序列G/C含量與“常見”密碼子聯(lián)系起來。這種優(yōu)選的實(shí)施方案允許提供特別有效翻譯的和穩(wěn)定的(修飾的)核酸，尤其是當(dāng)所述核酸以mRNA的形式存在或編碼mRNA時。
[0044]核酸分子的衍生物:核酸分子的衍生物在本文中可以典型地理解為修飾的核酸，如上文定義。
[0045]核苷酸類似物:核苷酸類似物典型地是結(jié)構(gòu)上與天然存在的核苷酸相似(類似)的核苷酸，其包含磷酸主鏈修飾、糖修飾或核堿基(nucleobase)修飾。
[0046]UTR修飾=UTR修飾典型地是核酸分子、特別是編碼核酸分子的5’和/或3’區(qū)的修飾。其中，“UTR”典型地意指“不翻譯區(qū)”。例如，UTR可以含有、包含穩(wěn)定序列(UTR修飾)或由穩(wěn)定序列(UTR修飾)組成。這些在5’和/或3’不翻譯區(qū)的穩(wěn)定序列可以具有增加所述核酸在細(xì)胞溶膠中的半衰期的作用。這些穩(wěn)定序列可以與在病毒、細(xì)菌和真核生物中天然存在的序列具有100%的序列同一性，但是也可以是部分或完全合成的?？梢蕴峒?α-)珠蛋白基因(例如，來自智人(Homo sapiens)或光滑爪蟾(Xenopus Iaevis))的不翻譯序列(UTR)作為可以用于穩(wěn)定的核酸的穩(wěn)定序列的實(shí)例。穩(wěn)定序列的另一個實(shí)例具有通式:(C/U) CCANxCCC (U/A) PyxUC (C/U)CC，其包含在編碼(α-)珠蛋白、⑴型-膠原蛋白、15-脂氧合酶或編碼酪氨酸羥化酶的非常穩(wěn)定的RNA的3’UTR中(參見Holcik等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA(美國國家科學(xué)院學(xué)報)1997，94 =2410-2414)。所述穩(wěn)定序列當(dāng)然能夠單獨(dú)使用或與另一種組合使用并且還與本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他穩(wěn)定序列組合使用。在本發(fā)明的情形中，UTR修飾優(yōu)選地意指通過添加或交換5’ -和/或3’ -UTR，優(yōu)選地通過添加或交換穩(wěn)定5’ -和/或3’ -UTR對編碼核酸(諸如基因或mRNA)的修飾，例如，如上文所述。
[0047]核酸合成:如本文定義的按照本發(fā)明使用的核酸分子可以使用本領(lǐng)域已知的任意方法制備，包括合成方法，諸如例如固相合成、以及體外方法，諸如體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。
[0048]為了制備核酸分子，尤其是當(dāng)所述核酸以mRNA形式存在時，例如，可以在體外轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的DNA分子。該DNA基質(zhì)優(yōu)選地包含合適的啟動子，例如T7或SP6啟動子，以用于體外轉(zhuǎn)錄，其后跟隨著編碼待制備的核酸分子(例如mRNA)的理想核苷酸序列和體外轉(zhuǎn)錄的終止信號。形成至少一種目的RNA基質(zhì)的DNA分子可以通過發(fā)酵增殖和隨后分離為可以在細(xì)菌內(nèi)復(fù)制的質(zhì)粒的一部分來制備?？梢宰鳛檫m合于本發(fā)明提及的質(zhì)粒是例如質(zhì)粒 pT7Ts (GenBank 編號 U26404 ；Lai 等人，Development (發(fā)育)1995，121:2349-2360)，
pGEMR’系列，例如 pGEM."-1 (GenBank 編號 X65300 ;來自 Promega)和 pSP64 (GenBank 編號 X65327);還參考:Mezei 和 Storts，Purificat1n of PCR Products (PCR 產(chǎn)物的純化)，在:Gr if fin 和 Griffin (編)，PCR Technology: Current Innovat1n (PCR 技術(shù):當(dāng)前改革)中，CRC Press (CRC 出版社)，Boca Raton, FL, 2001。
[0049]蛋白:蛋白典型地由一種或多種折疊成3維形式的、促進(jìn)生物功能的多肽組成。
[0050]肽:肽典型地是通過肽鍵連接的短的氨基酸單體聚合物。其典型地包含少于50個單體單位。然而，術(shù)語肽不排除具有多于50個單體單位的分子。長肽也稱為多肽，典型地具有50-600個單體單位，更具體地是50-300個單體單位。此外，“肽”在本文中還定義為包括任意的肽基分子，包括肽類似物。
[0051]肽類似物:肽類似物典型地可以包含可以用于本發(fā)明目的的天然或非天然存在的氨基酸。例如，其可以包含選自氨基酸的等構(gòu)物或手性類似物(D-氨基酸或L-氨基酸)的氨基酸。另外，所述類似物可以包含優(yōu)選地選自下述的一個或多個氨基酸:羥脯氨酸，β-丙氨酸，2，3-二氨基丙酸，α-氨基異丁酸，N-甲基甘氨酸(肌氨酸)，鳥氨酸，瓜氨酸，叔丁基丙氨酸，叔丁基甘氨酸，N-甲基異亮氨酸，苯基甘氨酸，丙氨酸環(huán)己酯，正亮氨酸，萘基丙氨酸，吡啶基丙氨酸，3-苯并噻吩基丙氨酸4-氯苯丙氨酸，2-氟苯丙氨酸，3-氟苯丙氨酸，4-氟苯丙氨酸，青霉胺，1,2,3,4-四氫-tic異喹啉-3-羧酸[β ]-2_噻吩基丙氨酸，蛋氨酸亞砜，高精氨酸，N-乙?；嚢彼?，2，4-二氨基丁酸，對氨基酸苯丙氨酸，N-甲基纈氨酸，高半胱氨酸，高絲氨酸，ε-氨基己酸，δ -氨基戊酸，2，3-二氨基丁酸。本文定義的肽類似物可以進(jìn)一步包含修飾的肽。該術(shù)語具體包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的肽主鏈修飾(即，酰胺鍵模擬物)。所述修飾包括酰胺氮、α -碳、酰胺羰基的修飾，酰胺鍵的完全替換，延伸，缺失或主鏈交聯(lián)。一些肽主鏈修飾是已知的，包括W[CH2S]，Ψ0Η2ΝΗ], Ψ [CSNH2]，Ψ [NHC0], Ψ [C0CH2]和Ψ[(Ε)或(Z) CH = CH]。在上述所用的術(shù)語中，Ψ表示不存在酰胺鍵。替代酰胺基的結(jié)構(gòu)表示在括號中。其他修飾包括，例如，N-烷基(或芳基)取代(Ψ [C0NR])，或主鏈交聯(lián)以構(gòu)建內(nèi)酰胺類和其他環(huán)式結(jié)構(gòu)，C端羥甲基修飾，O-修飾的修飾(例如，C端羥甲基二芐醚)，N端修飾，包括取代的酰胺類諸如alkylaniides和酰肼。
[0052]肽合成:肽、肽類似物或其衍生物優(yōu)選地使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的化學(xué)方法合成。例如， 使用已知的固相、液相或肽縮合或它們的任意組合的技術(shù)來制備合成的肽，并且可以包含天然的和/或非天然的氨基酸。通常，化學(xué)合成方法包括向生成的肽鏈順序添加一個或多個氨基酸。通常，第一個氨基酸的氨基或羧基用適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基團(tuán)保護(hù)。然后，被保護(hù)的或衍生的氨基酸可以連接到惰性固體支持物上或者用在溶液中，通過在允許形成酰胺鍵的條件下加入序列中具有被適當(dāng)?shù)乇Ｗo(hù)的互補(bǔ)(氨基或羧基)基團(tuán)的下一個氨基酸。然后，從新加入的氨基酸殘基去除保護(hù)基團(tuán)，然后加入下一個氨基酸(被適當(dāng)?shù)乇Ｗo(hù)的)，等等。在已經(jīng)以正確的順序連接需要的氨基酸后，順序地或同時去除任何剩余的保護(hù)基團(tuán)(以及任何固體支持物，如果使用固相合成技術(shù)的話)，以得到最終的多肽。這些方法適于合成用于本發(fā)明目的的肽(如肽類似物)或其衍生物。典型的保護(hù)基團(tuán)包括叔丁氧基羰基(Boc) ,9-荷基甲氧基羰基(Fmoc)苯甲氧基羰基(Cbz);對甲苯磺酰基(Tx) ;2,4_二硝基苯基；芐基(BzI);聯(lián)苯基異丙基氧基羧基-羰基,叔戍氧基羰基(t-amyloxycarbonyl),異冰片基氧基羰基，鄰-溴苯甲氧基羰基，環(huán)己基，異丙基，乙?；?硝基苯磺?；?。典型的固體支持物是交聯(lián)的聚合物支持物。這些可以包括二乙烯基苯交聯(lián)的苯乙烯系聚合物，例如,二乙烯基苯輕甲基苯乙烯共聚物,二乙烯基苯-氯甲基苯乙烯共聚物和二乙烯基苯-二苯甲基氨基聚苯乙烯共聚物。
[0053]重組肽或蛋白制備:可以使用重組蛋白或肽制備來制備肽或蛋白或其衍生物。為了促進(jìn)重組肽或蛋白的制備，優(yōu)選分離或合成至少一種編碼其的核酸。典型地，使用已知的方法，諸如例如，擴(kuò)增(例如，使用PCR)，來分離編碼所述重組蛋白或肽的核酸，或使用一種或多種限制性酶從來自生物體的核酸分離或者從核酸文庫分離。為了通過重組方式表達(dá)蛋白或肽，將編碼蛋白/肽的核酸置于與能夠在無細(xì)胞系統(tǒng)或細(xì)胞系統(tǒng)中調(diào)節(jié)表達(dá)的啟動子或其他調(diào)控序列的可操作性連接中。例如，將包含編碼肽或蛋白的序列的核酸置于與適當(dāng)?shù)膯幼拥目刹僮餍赃B接中，并且在適當(dāng)?shù)募?xì)胞中和在充分用于發(fā)生表達(dá)的條件下保持一段時間。用于體外表達(dá)、無細(xì)胞表達(dá)或基于細(xì)胞的表達(dá)的典型的表達(dá)載體已有記載并且是技術(shù)人員公知的。在這種情形中，無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)可以包括大腸桿菌(E.coli)S30級分，兔網(wǎng)狀細(xì)胞裂解物和麥芽提取物，并且細(xì)胞系統(tǒng)可以選自細(xì)菌(例如，大腸桿菌)、昆蟲、植物或哺乳動物細(xì)胞(例如，293，COS, CHO, 1T細(xì)胞，293T細(xì)胞)。
[0054]分泌信號肽:所述信號肽是這樣的序列，其典型地展現(xiàn)約15至30個氨基酸的長度并且優(yōu)選地位于所編碼的肽的N端，但并不限于此。本文定義的信號肽優(yōu)選地允許蛋白或肽轉(zhuǎn)運(yùn)到限定的細(xì)胞區(qū)室中，優(yōu)選地轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)或內(nèi)體-溶酶體區(qū)室。
[0055]載體/聚合載體:在本發(fā)明的情形中的載體典型地可以是促進(jìn)另一種化合物的轉(zhuǎn)運(yùn)和/或復(fù)合的化合物。聚合載體典型地是由聚合物形成的載體。在本發(fā)明的情形中的載體優(yōu)選適合作為核酸分子的載體，例如，用于調(diào)節(jié)在生理學(xué)可接受的液體中的溶解、核酸分子或載體的轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞攝入。因此，在本發(fā)明的情形中的載體可以是可以適合用于核酸分子或載體的儲庫和遞送的組分。例如，所述載體可以是陽離子或聚陽離子載體或可以作為轉(zhuǎn)染劑或復(fù)合劑的化合物。在這一情形中特別優(yōu)選的載體或聚合載體是陽離子或聚陽離子化合物，包括魚精蛋白，核仁蛋白，精胺或亞精胺，或其它陽離子肽或蛋白質(zhì)，諸如聚-L-賴氨酸(PLL)，聚-精氨酸，堿性多肽，細(xì)胞滲透肽(CPPs)，包括HIV結(jié)合肽，HIV-1 Tat (HIV)，Tat-衍生的肽，穿膜肽， VP22衍生的或類似的肽，HSV VP22 (單純皰疹(Herpes simplex))，MAP, KALA或蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(PTDs)，PpT620，富含脯氨酸的肽，富含精氨酸的肽，富含賴氨酸的肽，一種或多種MPG-肽，Pep-1, L-寡聚體，降鈣素肽，觸角足衍生肽(特別地來自果妮觸角足(Drosophila antennapedia)), pAntp, plsl, FGF,乳鐵蛋白，Transportan,Buforin-2, Bac715_24，SynB, SynB (I)，pVEC，hCT-衍生的肽，SAP 或組蛋白。在本發(fā)明的情形中，所述陽離子或聚陽離子載體優(yōu)選是陽離子或聚陽離子肽或蛋白，其優(yōu)選地包含或另外經(jīng)過修飾而包含至少一個能夠形成二硫鍵的結(jié)構(gòu)部分，優(yōu)選是-SH結(jié)構(gòu)部分。
[0056]陽離子組分:術(shù)語“陽離子組分”典型地是指帶電荷的分子，在典型地約1-9的pH值，優(yōu)選等于或低于9 (例如5-9)，等于或低于8 (例如5-8)、等于或低于7 (例如5_7)的pH值，最優(yōu)選在生理PH值，例如，約7.3-7.4，所述分子帶正電荷(陽離子)。因此，本發(fā)明所述的陽離子肽、蛋白或聚合物在生理條件下、特別是在體內(nèi)細(xì)胞的生理鹽條件下帶正電荷。帶負(fù)電荷的或中性氨基酸陽離子肽或蛋白包含比帶負(fù)電荷的或中性氨基酸更多數(shù)量的陽離子氨基酸，例如，更多數(shù)量的Arg，His, Lys或Orn。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的情形中的陽離子肽或蛋白包含比其他殘基更多數(shù)量的陽離子氨基酸，例如，更多數(shù)量的Arg，His,Lys或Orn。定義“陽離子”還可以是指“聚陽離子”組分。
[0057]優(yōu)選在生理條件下，例如，在約5.5-7.5的pH,優(yōu)選在約6.0-7.4的pH,諸如約
7.0，在約25°C _40°C的溫度，優(yōu)選在約35-38°C的溫度，諸如約37°C，在例如約130_160mM，優(yōu)選約137mM-150mM的生理鹽濃度，諸如約137mM，確定或評估化合物、復(fù)合物或組分的電荷，諸如本文定義的陽離子組分或聚合載體貨物復(fù)合物(A)的電荷。用于確定或評估本文定義的化合物、復(fù)合物或組分的電荷的特別優(yōu)選的條件是在25°C 100% Ringer乳酸鹽溶液中存在的條件。
[0058]ζ電位:“ ζ電位”是廣泛用于顆粒電表面電荷的參數(shù)。其典型地通過經(jīng)由電場使帶電顆粒移動而確定。在本發(fā)明的情形中，?電位是用于表征顆粒(例如，本發(fā)明所述的藥物組合物的復(fù)合物(A))的電荷的優(yōu)選參數(shù)。因此，在本發(fā)明的情形中，優(yōu)選通過由使用Zetasizer 納米儀器(Zetasizer Nano instrument, Malvern Instruments, Malvern, UK)在25°C和173°的散射角進(jìn)行的激光多普勒電泳法確定ζ電位來確定顆粒的電荷。給定顆粒的表面電荷還取決于所用的基質(zhì)(例如，含有鹽的緩沖液)的離子強(qiáng)度和溶液的pH。因此，給定復(fù)合物㈧在一定電荷比率(N/P)的實(shí)際ζ電位在不同的用于注射的緩沖液中可能略微不同。為了測量，優(yōu)選地將所述顆粒，諸如本發(fā)明所述的藥物組合物的復(fù)合物(A)懸浮在Ringer乳酸鹽溶液中。因此，本發(fā)明要求帶負(fù)電荷的復(fù)合物(A)在給定注射緩沖液的條件下，優(yōu)選在Ringer乳酸鹽溶液的條件下的應(yīng)用，所述應(yīng)用由其ζ電位評估。本發(fā)明所述的Ringer乳酸鹽溶液優(yōu)選地含有130mmol/L鈉離子，109mmol/L氯離子,28mmol/L乳酸鹽，4mmol/L鉀離子和1.5mmol/L鈣離子。所述鈉、氯、鉀和乳酸鹽典型地來自NaCl (氯化鈉)，NaC3H5O3 (乳酸鈉)，CaCl2 (氯化鈣)和KCl (氯化鉀)。Ringer乳酸鹽溶液的重量克分子滲透濃度(osmolarity)為273m0sm/L,并且pH調(diào)整至6.5。
[0059]藥物有效暈:在本發(fā)明的情形中，藥物有效量典型地理解為足以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的量。
[0060]免疫系統(tǒng):免疫系統(tǒng)可以保護(hù)生物體，例如，保護(hù)生物體免受感染。如果病原體突破生物體的物理屏障并且進(jìn)入該生物體，則先天性免疫系統(tǒng)提供即時的但非特異性的應(yīng)答。如果病原體避開該先天性應(yīng)答，脊椎動物具有第二層保護(hù)，即適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。此處，免疫系統(tǒng)在感染過程中改變其應(yīng)答以改善其對病原體的識別。然后，該改善的應(yīng)答在病原體被消除后以免疫記憶的形式保留，并且允許適應(yīng)性免疫系統(tǒng)在每次遇到該病原體時建立更快且更強(qiáng)的攻擊。根據(jù)此，免疫系統(tǒng)包括先天性和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。這兩部分的每一個包含所謂的體液和細(xì)胞成分。
[0061] 免疫應(yīng)答:免疫應(yīng)答典型地可以是適應(yīng)性免疫系統(tǒng)針對特定抗原的特異性反應(yīng)(所謂的特異性或適應(yīng)性免疫應(yīng)答)或是先天性免疫系統(tǒng)的非特異性反應(yīng)(所謂的非特異性或先天性免疫應(yīng)答)。本質(zhì)上，本發(fā)明與適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的特異性反應(yīng)(適應(yīng)性免疫應(yīng)答)相關(guān)。然而，這種特異性反應(yīng)可以得到另外的非特異性反應(yīng)(先天性免疫應(yīng)答)的支持。因此，本發(fā)明還涉及用于同時刺激先天性和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)以激發(fā)有效的適應(yīng)性免疫應(yīng)答的化合物或組合物。
[0062]適應(yīng)性免疫應(yīng)答:適應(yīng)性免疫應(yīng)答典型地理解為是抗原特異性的?？乖禺愋栽试S產(chǎn)生針對特定抗原、抗原表達(dá)系統(tǒng)、病原體或病原體感染的細(xì)胞定制的反應(yīng)。在體內(nèi)由“記憶細(xì)胞”保留建立這些定制的反應(yīng)的能力。如果病原體感染機(jī)體超過一次，則這些特異性記憶細(xì)胞通常迅速將其消滅。在這一情形中，適應(yīng)性免疫應(yīng)答的第一步是抗原呈遞細(xì)胞對幼稚(iiai've )抗原特異性T細(xì)胞或能夠誘導(dǎo)抗原特異性免疫應(yīng)答的不同的免疫細(xì)胞的激活。這發(fā)生在幼稚T細(xì)胞通常從中流過的淋巴組織和器官中。可以作為抗原呈遞細(xì)胞的細(xì)胞類型特別是樹突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞。這些細(xì)胞中的每一種在激發(fā)免疫應(yīng)答中具有不同的功能。樹突細(xì)胞通過吞噬作用和大胞飲吸收抗原并且通過與例如外源抗原接觸而被刺激以遷移到局部淋巴組織，它們在該處分化成成熟的樹突細(xì)胞。巨噬細(xì)胞攝取微粒抗原，諸如細(xì)菌，并且被傳染物或其他適當(dāng)?shù)拇碳ふT導(dǎo)來表達(dá)MHC分子。B細(xì)胞特有的通過其受體結(jié)合可溶性蛋白抗原并使其內(nèi)在化的能力對于誘導(dǎo)T細(xì)胞也是重要的。在MHC分子上呈遞抗原導(dǎo)致T細(xì)胞的激活，這誘導(dǎo)其增殖并且分化成武裝效應(yīng)T細(xì)胞。效應(yīng)T細(xì)胞最重要的功能是通過CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞殺死感染的細(xì)胞以及通過Thl細(xì)胞激活巨噬細(xì)胞，二者共同組成細(xì)胞介導(dǎo)的免疫性，以及通過Th2和Thl細(xì)胞激活B細(xì)胞，從而產(chǎn)生不同種類的抗體，由此驅(qū)動體液免疫應(yīng)答。T細(xì)胞通過其T細(xì)胞受體識別抗原，所述T細(xì)胞受體不直接識別和結(jié)合抗原，相反而是識別與在其他細(xì)胞表面上的MHC分子結(jié)合的例如病原體來源的蛋白抗原的短肽片段。
[0063]適應(yīng)性免疫系統(tǒng):適應(yīng)性免疫系統(tǒng)典型地由消除或防止病原性生長的高度專門化的、系統(tǒng)性細(xì)胞和過程組成。所述適應(yīng)性免疫應(yīng)答提供具有識別并記憶特定病原體(以產(chǎn)生免疫性)并且在每次遇到所述病原體時建立更強(qiáng)的攻擊的能力的脊椎動物免疫系統(tǒng)。由于體細(xì)胞高度突變(加速的體細(xì)胞突變過程)和V (D) J重組(抗原受體基因片段的不可逆的遺傳重組)，該系統(tǒng)是高度適應(yīng)性的。這種機(jī)制允許少量的基因產(chǎn)生巨大數(shù)量的不同的抗原受體，然后其在每種個體淋巴細(xì)胞上獨(dú)特地表達(dá)。由于基因重排導(dǎo)致每種細(xì)胞的DNA中的不可逆的改變，則該細(xì)胞的所有后代(子代)都將遺傳編碼相同受體特異性的基因，包括記憶B細(xì)胞和記憶T細(xì)胞，它們是長久的特異性免疫性的關(guān)鍵細(xì)胞。免疫網(wǎng)絡(luò)理論是關(guān)于適應(yīng)性免疫系統(tǒng)如何工作的理論，其是基于T細(xì)胞、B細(xì)胞受體的可變區(qū)與由T細(xì)胞和B細(xì)胞產(chǎn)生具有可變區(qū)域的分子的可變區(qū)之間的相互作用。
[0064] 先天性免疫系統(tǒng):典型地，先天性免疫系統(tǒng)(也稱為非特異性免疫系統(tǒng))理解為包括以非特異性方式保護(hù)宿主防御其他生物體的感染的細(xì)胞和機(jī)制。這意指先天性系統(tǒng)的細(xì)胞以一般方式識別病原體并且針對其反應(yīng)，但是與適應(yīng)性免疫系統(tǒng)不同，其不賦予宿主長久的或保護(hù)性的免疫性。例如，先天性免疫系統(tǒng)可以被病原體-相關(guān)的分子模式(PAMP)受體(例如，Toll-樣受體(TLRs))的配體或其他輔助性物質(zhì)激活，所述其他輔助性物質(zhì)如脂多糖，TNF-α，⑶40配體或細(xì)胞因子，單核因子，淋巴用腦子，白介素或趨化因子，IL-1，IL-2, IL-3, IL-4, IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-12，IL-13，IL-14，IL-15，IL-16，IL-17, IL-18, IL-19, IL-20， IL-21， IL-22， IL-23， IL-24， IL-25， IL-26， IL-27， IL-28，IL-29, IL-30, IL-31，IL-32，IL-33，IFN-a，IFN-β，IFN- y , GM-CSF, G-CSF, M-CSF, LT- β，TNF-a，生長因子和 hGH，人 Toll-樣受體 TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10 的配體，鼠 Toll-樣受體 TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12或TLR13的配體，NOD-樣受體的配體，RIG-1樣受體的配體，免疫刺激性核酸，免疫刺激性RNA (isRNA)，CpG-DNA,抗菌劑或抗病毒劑。典型地，先天性免疫系統(tǒng)的反應(yīng)包括通過產(chǎn)生化學(xué)因子招募免疫細(xì)胞至感染部位，所述化學(xué)因子包括專門的化學(xué)調(diào)節(jié)劑，稱為細(xì)胞因子；激活補(bǔ)體級聯(lián)；通過專門的白血細(xì)胞識別并且去除器官、組織、血液和淋巴中存在的外源物質(zhì)；通過已知為抗原呈遞的過程激活適應(yīng)性免疫系統(tǒng)；和/或作用為針對傳染物的物理和化學(xué)屏障。
[0065]細(xì)胞免疫性/細(xì)胞免疫應(yīng)答:細(xì)胞免疫性典型地涉及巨噬細(xì)胞、天然殺傷細(xì)胞(NK)、抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的激活以及響應(yīng)抗原的各種細(xì)胞因子的釋放。在更一般的方式中，細(xì)胞免疫性不涉及抗體而是涉及免疫系統(tǒng)細(xì)胞的激活。例如，細(xì)胞免疫應(yīng)答特征在于，激活抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，其能夠在其表面上展示抗原表位的機(jī)體細(xì)胞(如病毒感染的細(xì)胞、具有細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌的細(xì)胞)和展示腫瘤抗原的癌細(xì)胞；激活巨噬細(xì)胞和天然殺傷細(xì)胞，允許它們破壞病原體；并且刺激細(xì)胞分泌影響適應(yīng)性免疫應(yīng)答和先天性免疫應(yīng)答所涉及的其他細(xì)胞的功能的多種細(xì)胞因子。
[0066]體液免疫性/體液免疫應(yīng)答:體液免疫性典型地是指抗體產(chǎn)生和可能伴隨其的輔助過程。例如，體液免疫應(yīng)答可以典型地特征在于，Th2激活和細(xì)胞因子產(chǎn)生，生發(fā)中心形成和同種異型轉(zhuǎn)換，親和力成熟和記憶細(xì)胞產(chǎn)生。體液免疫性還典型地可以指抗體的效應(yīng)子功能，其包括病原體和毒素中和作用，經(jīng)典補(bǔ)體激活和吞噬作用及病原體消除的調(diào)理促進(jìn)。
[0067]抗原:根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“抗原”典型地是指可以由免疫系統(tǒng)識別并能夠，例如通過形成抗體作為適應(yīng)性免疫應(yīng)答的一部分的抗原特異性T-細(xì)胞來觸發(fā)抗原特異性免疫反應(yīng)的物質(zhì)。典型地，抗原是蛋白或肽，并且還可以是糖、脂質(zhì)、核酸等結(jié)構(gòu)。在這一情形中，適應(yīng)性免疫應(yīng)答的第一步是通過抗原呈遞細(xì)胞激活幼稚抗原特異性T細(xì)胞。這發(fā)生在幼稚T細(xì)胞通常從中流過的淋巴組織和器官中?？梢云鹂乖蔬f細(xì)胞作用的三種細(xì)胞類型是樹突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞。這些細(xì)胞中的每種在引起免疫應(yīng)答中具有不同功能。組織樹突細(xì)胞通過吞噬作用和大胞飲吸收抗原并受感染刺激移動到局部淋巴組織，它們在該處分化為成熟樹突細(xì)胞。巨噬細(xì)胞攝取微粒抗原諸如細(xì)菌并受傳染物誘導(dǎo)表達(dá)MHC II類分子。B細(xì)胞經(jīng)由其受體結(jié)合并內(nèi)在化可溶性蛋白抗原的獨(dú)特能力對于誘導(dǎo)T細(xì)胞可能是重要的。通過在MHC分子上呈遞抗原，導(dǎo)致T細(xì)胞的活化，這誘導(dǎo)其增殖和分化為武裝效應(yīng)T細(xì)胞。效應(yīng)T細(xì)胞的最重要功能是通過CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞殺死被感染的細(xì)胞和通過THl細(xì)胞激活巨噬細(xì)胞，它們共同組成細(xì)胞介導(dǎo)的免疫性，和通過TH2和THl細(xì)胞二者激活B細(xì)胞以產(chǎn)生不同類型的抗體，由此驅(qū)動體液免疫應(yīng)答。T細(xì)胞通過其T細(xì)胞受體識別抗原，所述T細(xì)胞受體不直接識別和結(jié)合抗原，相反而是識別與在其他細(xì)胞表面上的MHC分子結(jié)合的例如病原體蛋白抗原的短肽片段。
[0068]T細(xì)胞屬于兩種具有不同效應(yīng)子功能的主要類型。這兩類通過細(xì)胞表面蛋白CD4和CD8的表達(dá)來區(qū)分。這兩種T細(xì)胞類型的不同之處在于它們識別的MHC分子類型。存在兩種MHC分子類型-MHC I類和MHC II類分子-其區(qū)別在于它們的結(jié)構(gòu)和在身體組織上的表達(dá)模式。CD4+T細(xì)胞結(jié)合MHC II類分子且CD8+T細(xì)胞結(jié)合MHC I類分子。MHC I類和MHCII類分子在細(xì)胞之間具有不同的分布，這反映識別它們的T細(xì)胞的不同效應(yīng)子功能。MHC I類分子將來自病原體，常見地，來自病毒的肽呈遞到CD8+T細(xì)胞，其分化為細(xì)胞毒性T細(xì)胞，所述細(xì)胞毒性T細(xì)胞特化為殺死它們特異性識別的任何細(xì)胞。幾乎所有細(xì)胞都表達(dá)MHC I類分子，盡管組成型表達(dá)的水平從一種細(xì)胞類型到下一種而變化。但是不僅來自病毒的致病性肽由MHC I類分子呈遞，而且自身-抗原樣腫瘤抗原也由它們呈遞。MHC I類分子結(jié)合來自在細(xì)胞溶膠中降解和在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中運(yùn)輸?shù)牡鞍椎碾?。由此，受病毒或其他胞質(zhì)病原體感染的細(xì)胞表面上的MHC I類分子展示來自這些病原體的肽。識別MHC I類:肽復(fù)合物的CD8+T細(xì)胞被特化為殺死展示外源肽的任何細(xì)胞并因此除去受病毒和其他胞質(zhì)病原體感染的細(xì)胞體。識別MHC II類分子的CD4+T細(xì)胞(CD4+輔助性T細(xì)胞)的主要功能是激活免疫系統(tǒng)的其他效應(yīng)細(xì)胞。因此MHC II類分子通常存在于參與免疫應(yīng)答的B淋巴細(xì)胞、樹突細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上，而不在其他組織細(xì)胞上。例如，激活巨噬細(xì)胞，從而殺死它們包埋的小泡內(nèi)病原體，并且激活B細(xì)胞，從而分泌針對外源分子的免疫球蛋白。抑制MHC II類分子與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的肽結(jié)合，并且由此MHC II類分子結(jié)合來自在內(nèi)體中降解的蛋白的肽。它們可以捕獲來自已經(jīng)進(jìn)入巨噬細(xì)胞小泡系統(tǒng)的病原體的肽，或來自通過未成熟樹突細(xì)胞或B細(xì)胞免疫球蛋白受體內(nèi)在化的抗原的肽。在巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞小泡內(nèi)部大量積聚的病原體傾向于刺激THl細(xì)胞的分化，而胞外抗原傾向于刺激TH2細(xì)胞生成。THl細(xì)胞激活巨噬細(xì)胞的殺微生物性質(zhì)并誘導(dǎo)B細(xì)胞產(chǎn)生IgG抗體，所述IgG抗體非常有效地調(diào)理胞外病原體，從而被吞噬細(xì)胞攝取，而TH2細(xì)胞通過激活幼稚B細(xì)胞分泌IgM而起始體液應(yīng)答，并誘導(dǎo)弱調(diào)理抗體諸如IgGl和IgG3 (小鼠)和IgG2和IgG4 (人)以及IgA和IgE (小鼠和人)的生成。
[0069]疫苗:疫苗典型地理解為提供至少一種抗原或抗原功能的預(yù)防性或治療性物質(zhì)。所述抗原或抗原功能可以刺激機(jī)體的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)提供適應(yīng)性免疫應(yīng)答。
[0070]免疫刺激劑:術(shù)語“免疫刺激劑”典型地理解為不包括激發(fā)適應(yīng)性/細(xì)胞毒性免疫應(yīng)答(例如，“體液”或“細(xì)胞”免疫應(yīng)答，換言之，激發(fā)特征在于針對被免疫活性細(xì)胞識別為外源的抗原的結(jié)構(gòu)特性的特異性的反應(yīng))的試劑，諸如例如抗原(無論何種化學(xué)結(jié)構(gòu)的)。相反，“免疫刺激劑”典型地理解為意指這樣的試劑/化合物/復(fù)合物，其本身不引發(fā)任意適應(yīng)性/細(xì)胞毒性免疫應(yīng)答，但是其可以特殊地以非特異性方式增強(qiáng)所述適應(yīng)性/細(xì)胞毒性免疫應(yīng)答，例如，通過激活“PAMP”受體并且由此引發(fā)支持實(shí)際的適應(yīng)性/細(xì)胞毒性免疫應(yīng)答的細(xì)胞因子的釋放而增強(qiáng)。由此，短語“免疫刺激劑”典型地排除由本身激發(fā)適應(yīng)性和/或細(xì)胞毒性免疫應(yīng)答(本身直接或間接地賦予免疫性)的試劑(例如抗原)的任意免疫刺激。
[0071] 佐劑:術(shù)語“佐劑”典型地理解為不包括本身賦予免疫件的試劑。因此,佐劑典型地可以本身不賦予免疫性，但是以多種方式輔助免疫系統(tǒng)以增強(qiáng)抗原-特異性的免疫應(yīng)答，例如，通過促使抗原向免疫系統(tǒng)的呈遞而增強(qiáng)。由此，例如，佐劑可以優(yōu)選地調(diào)節(jié)抗原特異性免疫應(yīng)答，例如，通過將主要的基于Thl的抗原特異性應(yīng)答轉(zhuǎn)換為更多基于Th2的抗原特異性應(yīng)答或反之亦然進(jìn)行調(diào)節(jié)。因此，術(shù)語“免疫刺激劑”和“佐劑”在本發(fā)明的情形中典型地理解為意指這樣的試劑、化合物或復(fù)合物，其本身不賦予免疫性，但是特殊地以非特異性方式(與抗原特異性免疫應(yīng)答相反)通過各種作用支持免疫應(yīng)答，其通過非特異性方式，例如細(xì)胞因子表達(dá)/分泌、改善的抗原呈遞、轉(zhuǎn)換免疫應(yīng)答的分支(arm)的性質(zhì)等而調(diào)節(jié)抗原特異性(適應(yīng)性細(xì)胞和/或體液免疫應(yīng)答)。因此，術(shù)語“佐劑”或“免疫刺激劑”典型地排除本身激發(fā)免疫性的任意試劑。
[0072]免疫刺激件RNA:在本發(fā)明的情形中，免疫刺激性RNA(isRNA)可以典型地是本身能夠誘導(dǎo)天性免疫應(yīng)答的RNA。其通常不具有開放閱讀框，并且由此不提供肽-抗原而是激發(fā)先天性免疫應(yīng)答，例如，通過與特定種類的病原體相關(guān)的分子模式(PAMP)受體(例如，Toll-樣受體(TLR)或其他適當(dāng)?shù)氖荏w)結(jié)合而激發(fā)。然而，具有開放閱讀框并且編碼肽/蛋白(例如，抗原功能)的mRNAs當(dāng)然也可以誘導(dǎo)先天性免疫應(yīng)答。
[0073]序列的片段:序列的片段典型地是例如核酸序列或氨基酸序列的全長序列的較短的部分。因此，序列的片段典型地由與全長序列內(nèi)相對應(yīng)的一條片段或相對應(yīng)的多條片段相同的序列組成。在本發(fā)明的情形中，優(yōu)選的序列片段由連續(xù)的實(shí)體(諸如核苷酸或氨基酸)的片段組成，其對應(yīng)于所述片段所來源于的分子中的連續(xù)的實(shí)體片段，其代表所述片段所來源于的完整(即，全長)分子的至少5%、優(yōu)選至少20%、優(yōu)選至少30%、更優(yōu)選至少40 %、更優(yōu)選至少50 %、甚至更優(yōu)選至少60 %、甚至更優(yōu)選至少70 %并且最優(yōu)選至少80 %。因此，例如，蛋白或肽抗原的片段優(yōu)選地對應(yīng)于所述片段所來源的蛋白或肽抗原中的連續(xù)的實(shí)體片段，其代表所述片段所來源于的完整(即，全長)蛋白或肽抗原的至少5%、優(yōu)選至少20%、優(yōu)選至少30%、更優(yōu)選至少40%、更優(yōu)選至少50%、甚至更優(yōu)選至少60%、甚至更優(yōu)選至少70%并且最優(yōu)選至少80%。特別優(yōu)選的是序列的片段是功能片段，即，所述片段完成由所述片段所來源于的序列所完成的一種或多種功能。例如，蛋白或肽抗原的片段優(yōu)選地展現(xiàn)出所述片段所來源于的蛋白或肽抗原的至少一種抗原功能(例如，能夠激發(fā)針對所述蛋白或肽抗原中的至少一種抗原決定簇的特異性的免疫反應(yīng))。
[0074]蛋白的片段:在本發(fā)明的情形中，蛋白或肽的“片段”，即，氨基酸序列片段，可以典型地包括本文所定義的蛋白或肽的序列，關(guān)于其氨基酸序列(或其編碼核酸分子)，與原始(天然)蛋白(或其編碼核酸分子)相比，其在N端、C端和/或序列內(nèi)部被截短。因此，所述截短可以發(fā)生在氨基酸水平上或者相應(yīng)地發(fā)生在核酸水平上。故而，關(guān)于本文定義的所述片段的序列同一性可以優(yōu)選地指本文定義的完整的蛋白或肽或指所述蛋白或肽的完整的(編碼)核酸分子。
[0075]同樣地，在本發(fā)明的情形中，核酸序列的“片段”可以包括本文定義的核酸的序列，關(guān)于其核酸分子，與原始(天然的)核酸分子相比，其是5’-、3’_和/或序列內(nèi)截短的。因此，關(guān)于本文定義的所述片段的序列同一性可以優(yōu)選地指本文定義的完整的核酸。
[0076]在本發(fā)明的情形中，優(yōu)選的蛋白或肽的片段還可以包括本文定義的蛋白或肽的序列，其具有約6-約20個或甚至更多個氨基酸的長度，例如，通過I類MHC分子加工和呈遞的片段，優(yōu)選具有約8-約10個氨基酸的長度，例如，8，9，或10個氨基酸(或甚至6，7，11，或12個氨基酸)，或通過II類MHC分子加工和呈遞的片段，優(yōu)選具有約13個以上氨基酸的長度，例如，13，14，15，16，17，18，19,20個或甚至更多個氨基酸，其中這些片段可以選白氨基酸序列的任意部分。這些優(yōu)選的片段典型地以由所述肽片段和MHC分子組成的復(fù)合物的形式被T細(xì)胞識別，即，所述片段典型地不以其天然形式被識別。蛋白或肽的片段可以包括那些蛋白或肽的至少一個表位。此外，蛋白的結(jié)構(gòu)域，如胞外結(jié)構(gòu)域、胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域或跨膜結(jié)構(gòu)域以及蛋白的縮短或截短版本，也可以理解為蛋白的片段。
[0077]表位:(還稱為“抗原決定簇”):在本發(fā)明的情形中，蛋白的T細(xì)胞表位或部分可以包括優(yōu)選具有約6至約20個或甚至更多個氨基酸的長度的片段，例如，由I類MHC分子加工和呈遞的片段，優(yōu)選具有約8-約10個氨基酸的長度，例如，8，9，或10個氨基酸(或甚至11，或12個氨基酸)，或通過II類MHC分子加工和呈遞的片段，優(yōu)選具有約13個以上氨基酸的長度，例如，13，14，15，16，17，18，19，20個或甚至更多個氨基酸，其中這些片段可以選自氨基酸序列的任意部分。這些片段典型地以由所述肽片段和MHC分子組成的復(fù)合物的形式被T細(xì)胞識別，即，所述片段典型地不以其天然形式被識別，即，所述片段典型地不以其天然形式被識別。
[0078]B細(xì)胞表位典型地是位于本文定義的(天然)蛋白或肽抗原外表面上的片段，優(yōu)選地具有5至15個氨基酸，更優(yōu)選地具有5至12個氨基酸，甚至更優(yōu)選地具有6至9個氨基酸，其可以被抗體識別，即，以其天然形式被抗體識別。
[0079]蛋白或肽的此類表位還可以選自本文提及的所述蛋白或肽的變體中的任一種。在這一情形中，抗原決定簇可以是構(gòu)象或不連續(xù)的表位，其由本文定義的蛋白或肽的片段構(gòu)成，所述片段在本文定義的蛋白或肽的氨基酸序列上是不連續(xù)的，但是在三維結(jié)構(gòu)上聚在一起；或者是由單一多肽鏈組成的連續(xù)或線性的表位。
[0080]變體:實(shí)體的變體，諸如序列的變體，例如，核苷酸或氨基酸序列的變體，是指修飾的實(shí)體，諸如修飾的序列，例如，修飾的核苷酸或氨基酸序列。例如，與變體所來源的序列相t匕，序列的變體可以展現(xiàn)出一個或多個核苷酸或氨基酸缺失、插入、添加和/或取代。優(yōu)選地，在本發(fā)明的情形中，序列的變體與所述變體所來源的序列至少40%、優(yōu)選至少50%、更優(yōu)選至少60%、更優(yōu)選至少70%、甚至更優(yōu)選至少80%、甚至更優(yōu)選至少90%、最優(yōu)選至少95%相同。因此，在本發(fā)明的情形中，肽或蛋白抗原的變體優(yōu)選與所述變體所來源的蛋白或肽抗原的序列至少40%、優(yōu)選至少50%、更優(yōu)選至少60%、更優(yōu)選至少70%、甚至更優(yōu)選至少80 %、甚至更優(yōu)選至少90 %、最優(yōu)選至少95 %相同。優(yōu)選地，所述變體是功能性變體，即，所述變體實(shí)現(xiàn)所述變體所來源的序列所實(shí)現(xiàn)的一種或多種功能。例如，蛋白或肽抗原的變體優(yōu)選地展現(xiàn)出所述變體所來源的蛋白或肽抗原的至少一種抗原功能(例如，能夠引發(fā)針對所述蛋白或肽抗原中的至少一種抗原決定簇的特異性的免疫反應(yīng))。
[0081] 可以產(chǎn)生本發(fā)明的情形中所定義的蛋白或肽的“變體”，其具有與原始序列在一個或多個突變處不同的氨基酸序列，所述突變諸如一個或多個取代的、插入的和/或缺失的氨基酸。優(yōu)選地，與全長天然蛋白相比，這些片段和/或變體具有相同的生物功能或特定的活性，例如，其抗原特性。例如，本發(fā)明的情形中所定義的蛋白或肽的“變體”與其天然序列(即，未突變的生理序列)相比可以包含保守氨基酸取代。這些氨基酸序列及其編碼核苷酸序列特別都在本文定義的術(shù)語變體的涵蓋下。其中來源于同一類的氨基酸彼此交換的取代稱為保守取代。具體地，這些是具有脂族側(cè)鏈、帶正電荷或負(fù)電荷的側(cè)鏈、在側(cè)鏈中有芳香基團(tuán)的氨基酸或是這樣的氨基酸，即所述氨基酸的側(cè)鏈可以參與氫鍵，例如，具有羥基官能的側(cè)鏈。這意味著，例如，具有極性側(cè)鏈的氨基酸被具有相似極性側(cè)鏈的另一種氨基酸替代，或者例如，以疏水側(cè)鏈為特征的氨基酸被另一種具有類似的疏水側(cè)鏈的氨基酸取代(例如，絲氨酸(蘇氨酸)被蘇氨酸(絲氨酸)取代，或亮氨酸(異亮氨酸)被異亮氨酸(亮氨酸)取代)。特別地，插入和取代可能在不引起三維結(jié)構(gòu)改變或不影響結(jié)合區(qū)的那些序列位置。例如，使用CD光譜(圓二色譜)可以容易地確定插入或缺失對三維結(jié)構(gòu)的改變(Urry, 1985,Absorpt1n,Circular Dichroism and ORD of Polypeptides(多妝的吸光度、圓二色性和 ORD),在:Modern Physical Methods in B1chemistry (生物化學(xué)中的現(xiàn)代物理方法)，Neuberger 等人，(編)，Elsevier, Amsterdam)。
[0082]另外，蛋白或肽的變體可以包含本文定義的肽類似物。此外，本文定義的可以由核酸分子編碼的蛋白或肽的變體還可以包含那些序列，其中所述核酸的核苷酸按照遺傳密碼的簡并性交換而不導(dǎo)致蛋白或肽相應(yīng)的氨基酸序列改變，即，所述氨基酸序列或其至少部分在上述意義內(nèi)的一個或多個突變處與原始序列沒有區(qū)別。
[0083]序列同一性:為了確定兩個序列相同的百分?jǐn)?shù),所述序列例如，本文定義的核酸序列或氨基酸序列，諸如由所述聚合載體貨物復(fù)合物的核酸序列編碼的氨基酸序列或本文定義的抗原的核酸序列或氨基酸序列，貨物核酸序列或氨基酸序列本身，可以比對所述序列，以隨后彼此比較。因此，例如，第一序列的位置可以與第二序列的相應(yīng)位置進(jìn)行比較。如果第一序列中的位置被與第二序列中某位置相同的成分占據(jù)，則這兩個序列在該位置是相同的。如果這不是這樣的情形，則所述序列在該位置是不同的。如果與第一序列相比，在第二序列中存在插入，則可以在第一序列中插入缺口以允許進(jìn)一步的比對。如果與第一序列相t匕，在第二序列中存在缺失，則可以在第二序列中插入缺口以允許進(jìn)一步的比對。然后，兩個序列相同的百分?jǐn)?shù)是相同位置的數(shù)目除以位置總數(shù)(包括僅在一個序列中占據(jù)的那些位置)的函數(shù)。兩個序列相同的百分?jǐn)?shù)可以使用數(shù)學(xué)算法確定?？梢允褂玫囊环N優(yōu)選的但非限制性的數(shù)學(xué)算法的實(shí)例是Karlin等人，(1993)，PNAS USA, 90:5873-5877或Altschul等人，(1997)，Nucleic Acids Res.(核酸研究)，25:3389-3402的算法。這樣的算法整合在BLAST程序中。通過該程序能夠鑒定與本發(fā)明的序列在某種程度上相同的序列。蛋白或肽的“變體”可以與所述蛋白或肽的10，20，30，50，75或100個氨基酸的片段、優(yōu)選與其全長序列具有例如至少70 %，75 %，80 %，85 %，90 %，95 %，98 %或99 %的氨基酸同一性。類似地，核酸序列的“變體 ”可以與所述核酸序列的10，20，30，50，75或100個核苷酸的片段、優(yōu)選與其全長序列具有例如至少70 %，75 %，80 %，85 %，90 %，95 %，98 %或99 %的核苷酸同一I"生。
[0084]蛋白或肽的衍生物:蛋白或肽的衍生物典型地理解為來源于來源于另一種分子(如所述肽或蛋白)的分子。肽或蛋白的“衍生物”還包括包含用在本發(fā)明中的肽或蛋白。例如，融合網(wǎng)包含標(biāo)記，諸如例如，表位，例如，F(xiàn)LAG表位或V5表位或HA表位。例如，所述表位是FLAG表位。諸如標(biāo)簽有效用于例如純化融合蛋白。術(shù)語肽或蛋白的“衍生物”還包括衍生的肽或蛋白，諸如例如，被修飾而包含除氨基酸外的一個或多個化學(xué)結(jié)構(gòu)部分的肽或蛋白。所述化學(xué)結(jié)構(gòu)部分可以與所述肽或蛋白共價連接，例如，通過氨基端氨基酸殘基、羧基端氨基酸殘基或在內(nèi)部氨基酸殘基處共價連接。所述修飾包括在所述肽或蛋白中的反應(yīng)性結(jié)構(gòu)部分上添加保護(hù)性基團(tuán)或帽基團(tuán)，添加可檢測的標(biāo)記，和其他沒有不利地破壞所述肽或蛋白化合物的活性的改變。例如，衍生物可以包含PEG結(jié)構(gòu)部分、放射性核素、有色膠乳等。衍生物通常具有或展現(xiàn)出改善的特征，例如，相對于增強(qiáng)的蛋白酶抗性和/或更長的半衰期和/或在人或動物體的細(xì)胞或組織之間增強(qiáng)的轉(zhuǎn)運(yùn)性和/或減少的副作用和/或增強(qiáng)的親和性或免疫原性。WO 2010/003193描述了多種提供肽或蛋白衍生物的方法，其可以單獨(dú)使用或使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)程序組合使用，包括通過例如PEG化、HES化或糖基化衍生蛋白或肽。
[0085]按照第一方面，本發(fā)明潛在的一個或多個目的通過藥物組合物解決，所述藥物組合物包含:
[0086](A)聚合載體貨物復(fù)合物，其包含:
[0087]a)包含二硫化物交聯(lián)的陽離子組分的聚合載體，其優(yōu)選由二硫化物交聯(lián)的陽離子組分形成；和
[0088]b)至少一種核酸分子，
[0089]和
[0090](B)至少一種抗原,所述抗原選自由下述組成的組:
[0091](i)來自與傳染病相關(guān)的病原體的抗原；
[0092](ii)與變態(tài)反應(yīng)或變應(yīng)性疾病相關(guān)的抗原；
[0093](iii)與自身免疫病相關(guān)的抗原；和
[0094](iv)與癌癥或腫瘤疾病相關(guān)的抗原，
[0095]或所述抗原的片段、變體和/或衍生物。
[0096]優(yōu)選地，組分(B)不與組分(A)共價連接，特別不是通過二硫鍵連接。因此，組分(B)優(yōu)選地不與所述聚合載體和/或所述至少一種核酸分子共價連接，諸如通過二硫鍵連接。優(yōu)選地，所述至少一種抗原不與所述聚合載體貨物復(fù)合物共價連接，特別是不與所述聚合載體貨物復(fù)合物的聚合載體共價連接。例如，優(yōu)選地，所述至少一種抗原，諸如蛋白或肽抗原，不與所述聚合載體貨物復(fù)合物，諸如與所述聚合載體通過二硫鍵共價連接。然而，在一個實(shí)施方案中，其中組分(A)和組分(B)通過二硫鍵連接，所述連接優(yōu)選地不通過交聯(lián)劑實(shí)現(xiàn)，諸如不通過3，6-二氧雜-1，8-辛二硫醇(DODT)交聯(lián)劑實(shí)現(xiàn)。此外，在一個實(shí)施方案中，其中組分(A)和組分(B)通過二硫鍵連接，組分(B)優(yōu)選不是卵清蛋白或卵清蛋白的片段。
[0097]不與聚合載體共價連接的組分(B)(例如，蛋白抗原)的優(yōu)點(diǎn)在于抗原(例如，所述蛋白抗原)的結(jié)構(gòu)不被破壞并且將保留其免疫原性。如果所述抗原(例如，蛋白抗原)與所述聚合載體共價連接(例如，通過二硫鍵連接)，則所述抗原的三級結(jié)構(gòu)可能被改變，或者甚至被變性，這可能破壞構(gòu)象表位的結(jié)構(gòu)并且可能使得所述蛋白免疫原性變低或沒有免疫原性。由免疫系統(tǒng)識別的表位可以是由連續(xù)的氨基酸片段組成的線性表位或具有特異性的由來自蛋白不同部分的氨基酸組成的三維形狀的構(gòu)象表位。
[0098]此外，優(yōu)選地，聚合載體，特別是聚合載體的陽離子組分，與所述聚合載體貨物復(fù)合物的所述至少一種核酸分子不是共價連接，但是優(yōu)選地通過除共價鍵之外的其他鍵締合，諸如通過離子鍵和/或范德華鍵締合。因此，優(yōu)選的是，在所述聚合載體貨物復(fù)合物中，僅陽離子組分彼此共價連接，但是核酸分子與聚合載體非共價締合。
[0099]此外，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，組分(A)和(B)不一起形成膠束結(jié)構(gòu)，特別地，所述聚合載體優(yōu)選地不形成膠束結(jié)構(gòu)。
[0100]在本發(fā)明所有方面的特定的實(shí)施方案中，所述聚合載體貨物復(fù)合物用作佐劑。例如，其用作佐劑和/或具有佐劑特性，這可以由普通技術(shù)人員容易地利用常規(guī)方法(包括本文所述的方法)確定。
[0101]本發(fā)明的藥物組合物包含(例如，作為佐劑)至少一種聚合載體貨物復(fù)合物作為第一成分，其包含:
[0102] a)包含(作為載體)二硫化物交聯(lián)的陽離子組分的聚合載體，其優(yōu)選地由二硫化物交聯(lián)的陽離子組分形成，和
[0103]b)(作為貨物)至少一種核酸分子。
[0104]包含在本發(fā)明的藥物組合物中的聚合載體貨物復(fù)合物允許提供用于接種目的的更有效的和/或更安全的佐劑。有利地，所述聚合載體貨物復(fù)合物適于體內(nèi)遞送核酸，特別是用于壓縮和穩(wěn)定用于核酸轉(zhuǎn)染目的的核酸，諸如展現(xiàn)出上文所討論的高分子量聚合物的一種或多種減少的不利的副作用，諸如低生物降解性或高毒性、團(tuán)聚性、低體內(nèi)轉(zhuǎn)染活性等。所述聚合載體貨物復(fù)合物還提供改善的體內(nèi)核酸轉(zhuǎn)運(yùn)，特別是通過皮內(nèi)或肌內(nèi)途徑的轉(zhuǎn)運(yùn)，包括血清穩(wěn)定性、鹽穩(wěn)定性、攝入效率、減少的補(bǔ)體活化、核酸釋放等。所述聚合載體貨物復(fù)合物還可以通過起始或加強(qiáng)平行的先天性免疫應(yīng)答而支持適應(yīng)性免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)和維持。另外地，所述聚合載體貨物復(fù)合物可以展現(xiàn)出改善的儲存穩(wěn)定性，特別是在凍干過程中。
[0105]如上文定義的聚合載體貨物復(fù)合物包含由二硫化物交聯(lián)的陽離子組分形成的聚合載體作為一種組分。術(shù)語“陽離子組分”典型地是指帶電荷的分子，其在約1-9的pH值，優(yōu)選等于或低于9，等于或低于8、等于或低于7的pH值，最優(yōu)選在生理pH值，例如約7.3-7.4，是帶正電荷的(陽離子)。因此，本發(fā)明所述的陽離子肽、蛋白或聚合物在生理條件下，特別是在細(xì)胞體內(nèi)的生理鹽條件下帶正電荷。定義“陽離子”還可以是指“聚陽離子”組分。
[0106]在這一情形中，通過二硫化物交聯(lián)形成所述聚合載體貨物復(fù)合物的聚合載體的基礎(chǔ)的陽離子組分典型地選自任意適于該目的的適當(dāng)?shù)年栯x子或聚陽離子肽、蛋白或聚合物，特別是能夠復(fù)合如本發(fā)明定義的核酸并且由此優(yōu)選地縮合所述核酸的任意陽離子或聚陽離子肽、蛋白或聚合物。所述陽離子或聚陽離子肽、蛋白或聚合物優(yōu)選是線性分子，然而，也可以使用支鏈陽離子或聚陽離子肽、蛋白或聚合物。
[0107]所述聚合載體的每個陽離子或聚陽離子蛋白、肽或聚合物包含至少一個-SH結(jié)構(gòu)部分，最優(yōu)選地至少一個半胱氨酸殘基或任意其他展現(xiàn)-SH結(jié)構(gòu)部分的化學(xué)基團(tuán)，其在與作為本文提及的聚合載體的陽離子組分的至少另一種陽離子或聚陽離子蛋白、肽或聚合物縮合時能夠形成二硫鍵。
[0108]所述聚合載體的每個陽離子或聚陽離子蛋白、肽或聚合物或任意其他組分優(yōu)選與其相鄰的組分(陽離子蛋白、肽、聚合物或其他組分)通過二硫化物交聯(lián)連接。優(yōu)選地，所述二硫化物交聯(lián)是在所述聚合載體的至少一種陽離子或聚陽離子蛋白、肽或聚合物與至少一種其他陽離子或聚陽離子蛋白、肽或聚合物之間的(可逆的)二硫鍵(-S-S-)。所述二硫化物交聯(lián)典型地通過所述聚合載體的組分(特別是陽離子組分)的-SH-結(jié)構(gòu)部分的縮合形成。所述-SH-結(jié)構(gòu)部分可以是所述聚合載體的陽離子或聚陽離子蛋白、肽或聚合物或任意其他組分在二硫化物交聯(lián)之前的結(jié)構(gòu)或者可以通過下文定義的修飾在二硫化物交聯(lián)之前添加。在這一情形中，提供二硫鍵所需要的鄰近所述聚合載體的一種組分的硫可以由該組分自身提供，例如，通過本文定義的-SH結(jié)構(gòu)部分提供，或者可以通過相應(yīng)地修飾所述組分使其展示-SH結(jié)構(gòu)部分而提供。這些-SH-結(jié)構(gòu)部分典型地由每種組分提供，例如，通過所述組分的半胱氨酸或任意其他(修飾的)氨基酸或化合物提供，這些攜帶-SH結(jié)構(gòu)部分。在所述聚合載體的陽離子組分或任意其他組分是肽或蛋白的情形中，優(yōu)選所述-SH結(jié)構(gòu)部分由至少一個半胱氨酸殘基提供。備選地，所述聚合載體的組分可以相應(yīng)地用-SH結(jié)構(gòu)部分修飾，優(yōu)選地通過與攜帶-SH結(jié)構(gòu)部分的化合物的化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行修飾，以使所述聚合載體的每種組分都攜帶至少一個這樣的-SH結(jié)構(gòu)部分。所述攜帶-SH結(jié)構(gòu)部分的化合物可以是，例如，所述聚合載體的組分的(另外的)半胱氨酸或任意其他(修飾的)氨基酸或化合物，它們攜帶-SH結(jié)構(gòu)部分。所述化合物還可以是任意非氨基化合物或結(jié)構(gòu)部分，諸如含有或允許向本文定義的組分中引入-SH結(jié)構(gòu)部分的非氨基酸化合物或結(jié)構(gòu)部分。所述非氨基化合物，例如，非氨基酸化合物，可以通過化學(xué)反應(yīng)或化合物結(jié)合與本發(fā)明所述的聚合載體的組分連接，例如，通過3-硫代丙酸或2-亞氨基硫雜環(huán)戍燒(2-1minoth1lane) (Traut's試劑)的結(jié)合，通過酰胺形成(例如，羧酸、硫磺酸、胺等)，通過邁克爾加成(例如，順丁烯二酰亞胺結(jié)構(gòu)部分，α，β不飽和的羰基等)，通過click化學(xué)(click chemistry)(例如,疊氮化物或炔)，通過烯/炔methatesis (alkene/alkine methatesis)(例如,烯或炔)，亞胺或腙形成(醛或酮，肼，羥胺，胺)，絡(luò)合反應(yīng)(抗生物素蛋白，生物素，蛋白G)或允許Sn-型取代反應(yīng)的組分(例如，鹵代燒，硫醇，醇，胺，肼，酰肼，硫磺酸酯，氧鱗鹽(oxyphosphonium
salts)或其他可以用于連接其他組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)部分。在一些情形中，在與所述組分化學(xué)連接的過程中，所述-SH結(jié)構(gòu)部分可以由保護(hù)基團(tuán)掩蔽。此類保護(hù)基團(tuán)在本領(lǐng)域中是已知的并且可以在化學(xué)偶聯(lián)后去除。在每種情形中，所述-SH結(jié)構(gòu)部分，例如，半胱氨酸或任意其他(修飾的)氨基酸或化合物的-SH結(jié)構(gòu)部分，可以存在在所述聚合載體的組分的末端或內(nèi)部的任意位置。如本文定義，所述聚合載體的每種組分，優(yōu)選地所述聚合載體的每種陽離子組分典型地展現(xiàn)出至少一個-SH-結(jié)構(gòu)部分，但是也可以包含兩個、三個、四個、五個或甚至更多個-SH-結(jié)構(gòu)部分。
[0109]在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述聚合載體、貨物核酸分子和/或抗原，諸如蛋白或肽抗原，不通過引入用于形成二硫鍵的新偶聯(lián)位點(diǎn)(諸如通過引入新的-SH-結(jié)構(gòu)部分)而修飾，特別是所述聚合載體、貨物核酸分子和/或抗原，諸如蛋白或肽抗原，優(yōu)選地不通過二硫代吡啶修飾。因此，在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述聚合載體、貨物核酸分子和/或抗原不包含二硫代吡啶。
[0110]在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述聚合載體不包含聚乙二醇(PEG)結(jié)構(gòu)部分，特別優(yōu)選地，所述聚合載體的陽離子組分優(yōu)選地不包含PEG結(jié)構(gòu)部分。然而，如果所述聚合載體包含PEG結(jié)構(gòu)部分，則所述陽離子組分優(yōu)選不是聚-L-賴氨酸。
[0111]另外，為了結(jié)合陽離子組分，可以利用-SH結(jié)構(gòu)部分將其他組分連接到本文定義的聚合載體上，特別是氨基酸組分，例如，抗原表位、抗原、抗體、細(xì)胞滲透肽(例如TAT)、配體等。如果所述聚合載體除陽離子組分之外還包含其他組分，則優(yōu)選地所述另外的組分不是卵清蛋白或卵清蛋白的片段，特別地，如果所述另外的組分是氨基酸組分。
[0112]如上文定義，所述聚合載體貨物復(fù)合物的聚合載體由二硫化物交聯(lián)的陽離子(或聚陽離子)組分形成。
[0113] 按照一個第一備選方案，所述聚合載體的至少一種陽離子或(聚陽離子)組分可以選自陽離子或聚陽離子肽或蛋白。所述陽離子或聚陽離子肽或蛋白優(yōu)選地展現(xiàn)出約3至100個氨基酸的長度，優(yōu)選約3至50個氨基酸的長度，更優(yōu)選約3至25個氨基酸的長度，例如，約 3 至 10 ;5 至 20 ;5 至 15 ；8 至 15，16 或 17 ；10 至 15，16，17，18，19，或 20 ;或 15 至 25個氨基酸的長度。備選地或另外地，所述陽離子或聚陽離子肽或蛋白可以展現(xiàn)出約0.01kDa至約10kDa的分子量，包括約0.5kDa至約10kDa的分子量，優(yōu)選約1kDa至約50kDa，甚至更優(yōu)選約1kDa至約30kDa的分子量。在這一情形中，也明確包括本文定義的蛋白或肽的類似物和衍生物。
[0114]在所述聚合載體的陽離子組分包含陽離子或聚陽離子肽或蛋白或由陽離子或聚陽離子肽或蛋白組成的具體的情形中，所述陽離子或聚陽離子肽或蛋白的特性或整個聚合載體(如果所述聚合載體由陽離子或聚陽離子肽或蛋白組成)的特性可以基于其陽離子氨基酸的含量確定，特別是基于其相對于陰離子或中性氨基酸過量的陽離子氨基酸的含量，并且由此基于其凈正電荷來確定。優(yōu)選地，所述陽離子或聚陽離子肽或蛋白和/或所述聚合載體中陽離子氨基酸的含量為至少10%，20%，或30%，優(yōu)選至少40%，更優(yōu)選至少50%，60%或 70%，而且優(yōu)選 80%，90%，或者甚至 95%，96%，97%，98%，99%或 100%，最優(yōu)選至少 30 %，40 %，50 %，60 %，70 %，80 %，90 %，95 %，96 %，97 %，98 %，99 % 或 100 %，或者可以在約10%至90%的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在約15%至75%的范圍內(nèi)，甚至更優(yōu)選在約20%至50%的范圍內(nèi)，例如20%，30%，40%或50%，或者在由前述數(shù)值中任意兩個數(shù)值形成的范圍內(nèi)，條件是，則在所述陽離子或聚陽離子肽或蛋白中或在整個聚合載體(如果所述聚合載體完全由陽離子或聚陽離子肽或蛋白組成)中，所有氨基酸(例如陽離子、親脂性、親水性、芳香族和其他氨基酸)的含量為100%。
[0115]在這一情形中，陽離子氨基酸優(yōu)選是天然存在的氨基酸Arg (精氨酸)，Lys (賴氨酸)，His(組氨酸)和0rn(鳥氨酸)。然而，在較廣泛意義上，在其側(cè)鏈上攜帶陽離子電荷的任意(非天然)氨基酸也可以考慮用來實(shí)施本發(fā)明。然而，優(yōu)選包含在生理PH條件下帶正電荷的側(cè)鏈的那些陽離子氨基酸。在一個更優(yōu)選的實(shí)施方案中，這些氨基酸是Arg、Lys和 Orn。
[0116]優(yōu)選地，所述聚合載體的此類陽離子或聚陽離子肽或蛋白(其包含或另外被修飾而包含至少一個-SH結(jié)構(gòu)部分)選自，但不限于此，陽離子肽或蛋白，諸如魚精蛋白，核仁蛋白，精胺或亞精胺，寡聚-或聚-L-賴氨酸(PLL)，堿性多肽，寡聚或聚-精氨酸，細(xì)胞滲透肽(CPPs)，嵌合 CPPs， 諸如 Transportan,或 MPG 肽，HIV-結(jié)合肽，Tat, HIV-1 Tat (HIV)，Tat-衍生的肽,穿膜肽(penetratin)家族成員，例如穿膜肽,觸角足-衍生的肽(特別是來自果蜆觸角足(Drosophila antennapedia)), pAntp, plsl等,抗微生物衍生的CPPs,例如 Buforin-2, Bac715_24，SynB, SynB(I)，pVEC, hCT-衍生的肽，SAP, MAP, KALA, PpTG20,Loligomere，F(xiàn)GF，乳鐵蛋白，組蛋白，VP22衍生的或類似的肽，HSV，VP22 (單純皰疹(Herpessimplex)), MAP, KALA或蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(PTDs，PpT620，富含脯氨酸的肽，富含精氨酸的肽，富含賴氨酸的肽，Pep-1, L-寡聚物，降鈣素肽等。
[0117]備選地或另外地，所述聚合載體的此類陽離子或聚陽離子肽或蛋白(其包含或另外被修飾而包含至少一個-SH結(jié)構(gòu)部分)選自，但不限于此，下述具有下述總式(I)的陽離子肽:
[0118]{(Arg)! ； (Lys)m ； (Hi s) n ； (Orn)。； (Xaa) J ；
[0119]其中1+m+n+o+x = 3-100,并且 I, m, η 或 ο 彼此獨(dú)立地是選自 0,1,2,3,4,5,6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21-30，31-40，41-50，51-60，61-70，71-80，81-90和91-100中的任意數(shù)字，條件是Arg (精氨酸)、Lys (賴氨酸)、His (組氨酸)和Orn(鳥氨酸)的總含量占所述寡肽全部氨基酸的至少10% ;并且Xaa是選自除Arg、Lys、His或Orn之外的天然(=天然存在的)或非天然氨基酸中的任一種氨基酸；X 是選自 0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21-30，31-40,41-50,51-60,61-70,71-80,81-90中的任意數(shù)字，條件是Xaa的總含量不超過所述寡肽的全部氨基酸的90 %。氨基酸Arg、Lys、His、Orn和Xaa中的任一種可以位于所述肽的任意位置。在這一情形中，特別優(yōu)選7-30個氨基酸范圍內(nèi)的陽離子肽或蛋白。該式甚至更優(yōu)選的肽是寡聚精氨酸，諸如例如Arg7, Arg8, Arg9, Arg12, His3Arg9,Arg9His3, His3Arg9His3, His6Arg9His6, His3Arg4His3, His6Arg4His6, TyrSer2Arg9Ser2Tyr,(ArgLysHis) 4，Tyr (ArgLysHis) 2Arg 等。
[0120]按照一個特別優(yōu)選的實(shí)施方案，所述聚合載體具有上文所示的經(jīng)驗總式(I)的所述陽離子或聚陽離子肽或蛋白可以(但不限于此)包含下式的小組中的至少一個:
[0121]Arg7, Arg8, Arg9, Arg10, Arg11, Arg12, Arg13, Arg14, Arg15^30 ;
[0122]Lys7, Lys8, Lys9, Lys10, Lys11, Lys12, Lys13, Lys14, Lys15^30 ;
[0123]His7, His8, His9, His10, His11, His12, His13, His14, His15_30 ；
[0124]Orn7, Orn8, Orn9, Orn10, Orn11, Orn12, Orn13, Orn14, 0rn15_3(|O
[0125]按照另一個特別優(yōu)選的實(shí)施方案，所述聚合載體具有上文所示的經(jīng)驗總式(I)的所述陽離子或聚陽離子肽或蛋白(其包含或另外被修飾從而包含至少一個-SH結(jié)構(gòu)部分)可以優(yōu)選地選自，但不限于此，至少一個下式的小組。下式(與經(jīng)驗式(I))不指定任意氨基酸順序，但是意欲通過專門指明作為各種肽的組分的氨基酸(數(shù)目)而反映經(jīng)驗式。因此，例如，經(jīng)驗式Arg(P29)Lys1意欲意指該式所涵蓋的肽包含任意順序的7_19個Arg殘基和I個Lys殘基。如果所述肽包含7個Arg殘基和I個Lys殘基,則包括所有具有7個Arg殘基和I個Lys殘基的變體。因此，例如，Lys殘基可以位于由7個Arg殘基和I個Lys殘基組成的8個氨基酸長的序列中的任意位置。所述小組優(yōu)選地包括:
[0126]Arg(^29)Lys1, Arg(^29)His1, Arg^29Orn1, Lys(^29)His1, LyS(^29)Orn1, HiS(^29)Orn1,
[0127]Arg(3-28)Lys2, Arg(3_28)His2, Arg(3_28)0rn2，Lys(3_28)His2, Lys(3_28)0rn2, His(3_28) Orn2,
[0128]Arg(2_27)Lys3, Arg(2_27)His3, Arg(2_27)0rn3, Lys(2_27)His3, Lys(2_27)Orn3, His(2_27)0rn3,
[0129]Arg(1_26)Lys4, Arg(1_26)His4, Arg(1_26)0rn4, Lys(1_26)His4, Lys(1_26)Orn4, His(1_26)0rn4,
[0130]Arg(P28)Lys1His1, Arg(3_28)Lys1Orn1, Arg(3_28)HiS1Orn1, Arg1Lys^2aHis1, Arg1Lys^28)Orn1, Lys(3_28)HiS1Orn1, Arg1Lys1His(3_28), Arg1His(3_28)Orn1, Lys1His^28) Orn1 ；
[0131]Arg(^27)Lys2His1, Arg(^27)Lys1His2, Arg(^27)Lys2Orn1, Arg(^27)Lys1Orn2, Arg(2_27)HiS2Orn1, Arg(2_27)HiS1Orn2, Arg2Lys(2_27)His1, Arg1Lys(^27)His2, Arg2LyS(^27)Orn1, Arg1Lyste^27)Orn2, Lys(^27)His2Orn1, Lys(^27)His1Orn2, Arg2Lys1His^27), Arg1Lys2His^27), Arg2His(2_27)Orn1, Arg1HiS(^27)Orn2, Lys2His(^27)Orn1, Lys1Hisc^27) Orn2 ；
[0132]Arg(^26)Lys3His1, Arg(1_26)Lys2His2, Arg(^6)Lys1His3, Arg(^6)Lys3Orn1, Arg(1_26)Lys2Orn2, Arg(^26)Lys1Orn3, Arg(^26)His3Orn1, Arg(1_26)HiS2Orn2, Arg(^26)His1Orn3,Arg3Lys(^26)His1, Arg2Lys(1_26)His2, Arg1Lys(^6)His3, Arg3Lys(^6)Orn1, Arg2Lys(1_26)Orn2,Arg1LyS(^26)Orn3, Lys(卜^His3Orn1, Lys(1_26)His20rn2, Lys(卜^His1Orn3, Arg3Lys1Hisa^26),Arg2Lys2His(1_26), Arg1Lys3His(^26), Arg3HiS(^26)Orn1, Arg2His(1_26)Orn2, Arg1HiS(^26)Orn3,Lys3Hisa^260Orn1, Lys2Hi s(1_26) Orn2, Lys1His(^26)Orn3 ；
[0133] Arg (2 _2 ^Lys1Hi S1Orn1, Arg1Lys (2_2 ^His1Orn1, Arg1Lys1Hi s(2_2 ^Orn1,Arg1Lys1His1Orri(^27) !Arg(^6)Lys2His1Orn1, Arg(^26)Lys1His2Orn1, Arg(^26)Lys1His1Orn2,Arg2Lys(^26)His1Orn1, Arg1Lys(^6)His2Orn1, Arg1Lys(^6)His1Orn2, Arg2Lys1His(^26)Orn1,Arg1Lys2His(^26)Orn1, Arg1Lys1His(^26)Orn2, Arg2Lys1His1Orna^26), Arg1Lys2His1Orna^26),Arg1Lys1His2Orna^26)；
[0134]按照另一個特別優(yōu)選的實(shí)施方案，所述聚合載體具有上文所示的經(jīng)驗總式(I)的所述陽離子或聚陽離子肽或蛋白(其包含或另外被修飾從而包含至少一個-SH結(jié)構(gòu)部分)可以選自，但不限于此，由通式Arg7 (也叫作R7)、Arg9 (也叫作R9)、Arg12 (也叫作R12)組成的小組。
[0135]按照另一個特別優(yōu)選的實(shí)施方案，所述聚合載體的陽離子或聚陽離子肽或蛋白，在按照上文所示的式((Arg)1 ; (Lys)m ; (His)n ; (Orn)。； (Xaa) J (式(I))定義并且包含或另外被修飾從而包含至少一個-SH結(jié)構(gòu)部分時，可以選自分式(la、)，但不限于此:
[0136]((Arg)1 ; (Lys)m ; (His)n ; (Orn)。； (Xaa' )x (Cys)y)式(Ia)
[0137]其中(Arg)1; (Lys)m ; (His)n ; (Orn)。；和 X 如本文定義，Xaa’ 是選自除 Arg, Lys,His, Orn或Cys之外的天然(=天然存在的)或非天然氨基酸中的任意氨基酸，并且y是選自 0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21—30，31—40，41—50，51-60，61-70，71-80和81-90的任意數(shù)字，條件是Arg (精氨酸)、Lys (賴氨酸)、His (組氨酸)和Orn (鳥氨酸)的總含量占所述寡肽全部氨基酸的至少10%。
[0138]這一實(shí)施方案可以適用于這樣的情形，其中所述聚合載體的陽離子或聚陽離子肽或蛋白，例如，當(dāng)按照上文所示的經(jīng)驗式(Arg)i ； (Lys)m ； (His)n ； (Orn)。； (Xaa)x(式(I))定義時，包含或已經(jīng)被至少一個半胱氨酸修飾以包含上述意思的-SH結(jié)構(gòu)部分，使得作為陽離子組分的所述陽離子或聚陽離子肽攜帶至少一個半胱氨酸，其能夠與所述聚合載體的其他組分形成二硫鍵。
[0139]按照另一個特別優(yōu)選的實(shí)施方案，所述聚合載體的陽離子或聚陽離子肽或蛋白，當(dāng)按照上文所示的式((Arg)1 ; (Lys)m ; (His)n ; (Orn)。； (Xaa)J (式(I))定義時,可以選自分式(Ib)，但不限于此:
[0140]CysJ(Arg)1 ; (Lys)m ; (His)n ; (Orn)0 ; (Xaa)x)CyS2 (分式(Ib))
[0141]其中經(jīng)驗式((Arg)1; (Lys)m ; (His)n ; (Orn)。； (Xaa)J (式(I))如本文定義,并且形成(半經(jīng)驗)式(I)所述的氨基酸序列的核心，并且其中Cys1和Cys2是接近或在(Arg)
I； (Lys)ffl ； (His)n ； (Orn)0 ； (Xaa)x末端的半胱氨酸。示例性的實(shí)例可以包含兩側(cè)為兩個Cys的任一上述序列和下述序列:
[0142]Cys (Arg7)Cys, Cys(Arg8)Cys, Cys(Arg9)Cys, Cys (Arg10) Cys, Cys (Arg11)Cys,Cys(Arg12)Cys, Cys(Arg13) Cys, Cys(Arg14) Cys, Cys(Arg15) Cys, Cys(Arg16) Cys, Cys (Arg17)Cys, Cys (Arg18) Cys, Cys (Arg19) Cys, Cys (Arg20) Cys (SEQ ID NOs: 1-14):
[0143]CysArg7Cys Cys-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Cys(SEQ ID N0.1)
[0144]CysArg8Cys Cys-Arg-Ar g-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Cys(SEQ ID N0.2)
[0145]CysArg9Cys: Cys-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Cys(SEQ ID N0.3)
[0146]CysArg10Cys Cys-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Cys(SEQ ID N0.4)
[0147]CysArg11Cys Cys-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Cys (SEQ ID N0.5)
[0148]CysArg12Cys: Cys-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Cys(SEQ ID N0.6)
[0149]CysArg13Cys: Cys-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Cys (SEQ ID N0.7)
[0150]CysArg14Cys: Cys-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Cys (SEQ ID N0.8)
[0151]CysArg15Cys: Cys-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Cys(SEQ ID N0.9)
[0152]CysArg16Cys: Cys-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Cys(SEQ ID N0.10)
[0153]CysArg17Cys: Cys-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Cys(SEQ ID N0.11)
[0154]CysArg18Cys: Cys-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Cys(SEQ ID N0.12)
[0155]CysArg19Cys: Cys-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Cys(SEQ ID N0.13)
[0156]CysArg20Cys: Cys-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg Cys (SEQ ID N0.14)
[0157] 這一實(shí)施方案可以適用于這樣的情形，其中所述聚合載體的陽離子或聚陽離子肽或蛋白，例如，當(dāng)按照上文所示的經(jīng)驗式(Arg)i ； (Lys)m ； (His)n ； (Orn)。； (Xaa)x(式(I))定義時，已經(jīng)被至少兩個半胱氨酸修飾以包含上述意思的-SH結(jié)構(gòu)部分，使得所述聚合載體貨物復(fù)合物作為陽離子組分的所述陽離子或聚陽離子肽攜帶至少兩個(末端)半胱氨酸，其能夠與所述聚合載體的其他組分形成二硫鍵。
[0158]按照第二備選方案，所述聚合載體的至少一個陽離子(或聚陽離子)組分可以選自，例如，適于這一情形的任意(非肽)陽離子或聚陽離子聚合物，條件是該(非肽)陽離子或聚陽離子聚合物展現(xiàn)出或被修飾從而展現(xiàn)出至少一個-SH-結(jié)構(gòu)部分，其提供連接所述陽離子或聚陽離子聚合物與本文定義的所述聚合載體的另一種組分的二硫鍵。因此，同樣如本文定義，所述聚合載體可以包含相同的或不同的陽離子或聚陽離子聚合物。
[0159]在所述聚合載體的陽離子組分包含(非肽)陽離子或聚陽離子聚合物的具體的情形中，所述(非肽)陽離子或聚陽離子聚合物的陽離子特性可以基于其與所述陽離子聚合物各組分的總電荷相比較的陽離子電荷含量而確定。優(yōu)選地，在本文定義的(生理)pH下，所述陽離子聚合物中陽離子電荷的含量，優(yōu)選凈陽離子電荷(即，減去陰離子和中性電荷)為至少10%，20%，或30%，優(yōu)選至少40%，更優(yōu)選至少50%，60%或70%，還優(yōu)選至少 80%，90%，或甚至 95%，96%，97%，98%，99%或 100%，最優(yōu)選至少 30%，40%，50%，60 %，70 %，80 %，90 %，95 %，96 %，97 %，98 %，99 % 或 100 %，或者可以在約 10 % -90 % 的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在約30% -100%的范圍內(nèi)，甚至優(yōu)選在約50% -100%的范圍內(nèi)，例如，50，60，70，80%，90%或100%，或者在由前述數(shù)值中任意兩個數(shù)值形成的范圍內(nèi)，條件是，在整個陽離子聚合物中的總電荷含量，例如在本文定義的(生理)pH的正電荷和負(fù)電荷含量為100%。
[0160]優(yōu)選地，所述聚合載體的(非肽)陽離子組分表現(xiàn)為陽離子或聚陽離子聚合物，典型地展現(xiàn)出約0.1或0.5kDa至約10kDa的分子量,優(yōu)選約IkDa至約75kDa,更優(yōu)選約5kDa至約50kDa,甚至更優(yōu)選約5kDa至約30kDa的分子量，或者約1kDa至約50kDa,甚至更優(yōu)選約1kDa至約30kDa的分子量。另外地，所述(非肽)陽離子或聚陽離子聚合物典型地展現(xiàn)出至少一個-SH-結(jié)構(gòu)部分，其能夠在與本文定義的所述聚合載體的其他陽離子組分或其他組分縮合時形成二硫鍵。
[0161]所述陽離子或聚陽離子肽或蛋白可以通過普通技術(shù)人員已知的所有方法或通過重組肽或蛋白生產(chǎn)或通過本文所述的肽合成制備。
[0162]在上述情形中，所述聚合載體的(非肽)陽離子組分可以選自丙烯酸酯，改性的丙烯酸酯，如pDMAEMA (聚(丙烯酸二甲基氨基乙基甲酯))，殼聚糖，氮丙啶或2-乙基-2- --唑啉(形成低聚乙烯亞胺或改性的低聚乙烯亞胺)，通過二丙烯酸酯與胺類反應(yīng)形成低聚β氨基酯或聚酰胺基胺(poly ami do amines)而得到的聚合物,或其他聚合物,如聚酯、聚碳酸酯等。這些(非肽)陽離子或聚陽離子聚合物中的每種分子典型地展現(xiàn)出至少一個-SH-結(jié)構(gòu)部分，其中這些至少一個-SH-結(jié)構(gòu)部分可以通過化學(xué)修飾，例如使用、3-硫代丙酸或引入含有-SH-結(jié)構(gòu)部分的氨基酸(如半胱氨酸或任意其他(修飾的)氨基酸)而引入到所述(非肽)陽離子或聚陽離子聚合物中。所述-SH-結(jié)構(gòu)部分優(yōu)選地如上文所定義的。
[0163]在所述聚合載體的情形中，通過二硫化物交聯(lián)形成所述聚合載體的基礎(chǔ)的陽離子組分可以彼此相同或不同。還特別優(yōu)選的是本發(fā)明的聚合載體包含陽離子肽、蛋白或聚合物以及任選地本文定義的其他組分的混合物，它們通過本文所述的二硫鍵交聯(lián)。在本發(fā)明的情形中，所述聚合載體的特別優(yōu)選的陽離子組分是陽離子肽或蛋白。
[0164]在這一情形中，所述聚合載體貨物復(fù)合物由于其可變的聚合載體有利地允許組合不同的(短)陽離子或聚陽離子肽、蛋白或聚合物或其他組分的需要的特性。例如，所述聚合載體允許有效的壓縮核酸而不損失活性，以用于有效轉(zhuǎn)染核酸的目的、用于輔助療法、用于基因治療的目的、用于基因敲降或其他策略，特別展現(xiàn)出在體外有效地將核酸轉(zhuǎn)染到不同細(xì)胞系中以及特別的體內(nèi)轉(zhuǎn)染。此外，所述聚合載體以及由此所述聚合載體貨物復(fù)合物對細(xì)胞無毒，提供其核酸貨物的有效釋放，在凍干過程中穩(wěn)定并且適合作用為免疫刺激劑或佐劑。優(yōu)選地，所述聚合載體貨物復(fù)合物可以誘導(dǎo)抗病毒細(xì)胞因子IFN-α。
[0165]特別地，由二硫化物連接的陽離子組分形成的聚合載體極大地允許改變其肽或聚合物內(nèi)容物，由此非常容易且快速地調(diào)控其生物物理/生物化學(xué)特性，特別是所述聚合載體的陽離子特性，例如，通過結(jié)合相同的或不同的陽離子(肽)或聚合物作為陽離子組分并且任選地向所述聚合載體中添加其他組分進(jìn)行調(diào)控。盡管由非常小的無毒單體單位組成，所述聚合載體形成長的陽離子結(jié)合序列，提供核酸貨物的強(qiáng)縮合作用和復(fù)合物穩(wěn)定性。在胞質(zhì)的還原條件(例如胞質(zhì)GSH)下，復(fù)合物迅速降解成其(陽離子)組分，其再進(jìn)一步降解(例如，降解成寡肽)。這支持核酸貨物在胞質(zhì)中的釋放。由于在胞質(zhì)中降解成小的寡肽或聚合物，沒有觀察到如對于高分子寡肽或聚合物已知的毒性，例如來自高分子聚精氨酸的毒性。
[0166]因此，所述聚合載體貨物復(fù)合物的聚合載體可以包含選自上文定義的陽離子或聚陽離子肽、蛋白或(非肽)聚合物的不同的(短)陽離子或聚陽離子肽、蛋白或聚合物，任選地以及上文定義的其他組分。
[0167]另外，優(yōu)選在二硫化物交聯(lián)之前，上文定義的聚合載體貨物復(fù)合物的聚合載體，更優(yōu)選地通過二硫化物交聯(lián)形成所述聚合載體的基礎(chǔ)的不同的(短)陽離子或聚陽離子肽或(非肽)聚合物中的至少一種，可以用至少一種其他組分進(jìn)行修飾。備選地，所述聚合載體因此可以用至少一種其他組分修飾。其還可以任選地包含至少一種其他組分，所述其他組分典型地與上文定義的其他(短)陽離子或聚陽離子肽一起通過二硫化物交聯(lián)而形成聚合載體二硫化物。
[0168]為了允許上文定義的陽離子或聚陽離子肽或(非肽)聚合物的修飾，所述聚合載體的每種組分(優(yōu)選地已經(jīng)在二硫化物交聯(lián)之前)還可以包含至少一種其他官能結(jié)構(gòu)部分，所述官能結(jié)構(gòu)部分允許連接本文定義的所述其他的組分。所述官能結(jié)構(gòu)部分可以選自允許其他組分連接的官能性，例如，本文定義的官能性，例如，通過形成酰胺(例如，羧酸、硫磺酸、胺等)，通過邁克爾加成(例如，順丁烯二酰亞胺結(jié)構(gòu)部分，α，β不飽和的羰基等)，通過click化學(xué)(例如,疊氮化物或炔)，通過烯/炔methatesis(例如,烯或炔)，亞胺或腙形成(醛或酮，肼，羥胺，胺)，絡(luò)合反應(yīng)(抗生物素蛋白，生物素，蛋白G)或允許Sn-型取代反應(yīng)的組分(例如，鹵代烷，硫醇，醇，胺，肼，酰肼，硫磺酸酯，氧銷鹽)或其他可以用于連接其他組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)部分。
[0169]按照一個特別優(yōu)選的實(shí)施方案，可以包含在所述聚合載體中的或可以用來修飾形成所述聚合載體貨物復(fù)合物的聚合載體的基礎(chǔ)的不同的(短)陽離子或聚陽離子肽或(非肽)聚合物的所述其他組分是氨基酸組分(AA)，例如，其可以修飾本文定義的聚合載體的生物物理/生物化學(xué)特性。按照本發(fā)明，所述氨基酸組分(AA)包含優(yōu)選在約1-100個范圍內(nèi)、優(yōu)選在約1-50個范圍內(nèi)的氨基酸數(shù)目，更優(yōu)選選自包括1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15-20的數(shù)目，或者可以選自由上述數(shù)值中的任意兩個形成的范圍。在這一情形中，氨基酸組分(AA)的氨基酸可以彼此獨(dú)立地選擇。例如，如果在所述聚合載體中存在兩個以上的(AA)組分，則它們可以是相同的或可以彼此不同。
[0170]所述氨基酸組分(AA)可以包含或者可以側(cè)連含有-SH的結(jié)構(gòu)部分，其允許通過二硫鍵將該組分(AA)引入到本文定義的聚合載體中。在所述含有-SH的結(jié)構(gòu)部分表現(xiàn)為半胱氨酸的具體的情形中，所述氨基酸組分(AA)還可以讀作-Cys-(AA)-Cys-,其中Cys表示半胱氨酸，并且提供二硫鍵必需的-SH-結(jié)構(gòu)部分。也可以使用上文所示的用于陽離子組分或其任意組分的任一種修飾或反應(yīng)而將所述含有-SH的結(jié)構(gòu)部分引入到氨基酸組分(AA)中。
[0171]此外，所述氨基酸組分(AA)可以提供有兩個-SH-結(jié)構(gòu)部分(或者甚至更多個)，例如，以式HS-(AA)-SH所示的形式，以允許通過二硫鍵與兩個官能性結(jié)合，例如，當(dāng)所述氨基酸組分(AA)用作兩個其他組分之間的接頭時(例如，作為兩個陽離子聚合物之間的接頭)。在這一情形中，在第一步中，一個-SH結(jié)構(gòu)部分優(yōu)選地用本領(lǐng)域已知的保護(hù)基團(tuán)進(jìn)行保護(hù)，形成式HS-(AA)-S-保護(hù)基團(tuán)的氨基酸組分(AA)。然后，所述氨基酸組分(AA)可以與所述聚合載體的其他組分結(jié)合，從而通過未保護(hù)的-SH結(jié)構(gòu)部分形成第一個二硫鍵。然后，典型地將所保護(hù)的-SH-結(jié)構(gòu)部分去保護(hù)，并且結(jié)合到所述聚合載體的其他組分的另一個游離的-SH-結(jié)構(gòu)部分上，從而形成第二個二硫鍵。
[0172]備選地，所述氨基酸組分(AA)可以提供有如上文已經(jīng)關(guān)于所述聚合載體的其他組分所述的其他官能性，其允許所述氨基酸組分(AA)與所述聚合載體的任一種組分結(jié)合。
[0173]在其中所述氨基酸組分(AA)通過二硫鍵與所述聚合載體連接的實(shí)施方案中，優(yōu)選的是，所述二硫鍵不通過交聯(lián)劑實(shí)現(xiàn)，諸如不通過3，6_ 二氧雜-1，8-辛二硫醇(DODT)交聯(lián)劑實(shí)現(xiàn)。
[0174]因此，所述氨基酸組分(AA)可以利用或不利用二硫鍵結(jié)合到所述聚合載體的其他組分上。不利用二硫鍵的結(jié)合可以通過任意上述反應(yīng)實(shí)現(xiàn)，優(yōu)選地通過利用本文定義的酰胺-化學(xué)(amid-chemistry)將所述氨基酸組分(AA)結(jié)合到所述聚合載體的其他組分上。如果需要或必需，氨基酸組分(AA)的另一個末端，例如，N或C端，可以用于偶聯(lián)另一個組分，如配體L。為了這一目的，氨基酸組分(AA)的另一個末端優(yōu)選地包含或通過修飾而包含其它官能性，例如，炔烴-種類(見上文)，其可以用來通過例如click化學(xué)加合另一組分。如果配體是通過酸敏感性鍵結(jié)合的，則該鍵優(yōu)選地在內(nèi)體中被切割，并且所述聚合載體在其表面上呈遞氨基酸組分(AA)。
[0175]所述氨基酸組分(AA)可以存在作為上文定義的聚合載體的另一種組分，例如，作為陽離子組分之間的接頭，例如，作為一個陽離子肽與另一個陽離子肽之間的接頭，作為一個陽離子聚合物與另一個陽離子聚合物之間的接頭，作為一個陽離子肽與陽離子聚合物之間的接頭，全部優(yōu)選地如本文定義，或者作為所述聚合載體的另外的組分，例如通過使所述氨基酸組分(AA)與所述聚合載體或其組分結(jié)合，例如通過側(cè)鏈、SH-結(jié)構(gòu)部分或通過本文定義的其他結(jié)構(gòu)部分結(jié)合，其中所述氨基酸組分(AA)優(yōu)選地進(jìn)行相應(yīng)的修飾。
[0176]按照另一個且特別優(yōu)選的備選方案，所述氨基酸組分(AA)可以用來修飾所述聚合載體，特別是在上文定義的聚合載體中的陽離子組分的含量。
[0177]在這一情形中，優(yōu)選地，所述聚合載體中陽離子組分的含量為至少10 %，20 %，或30 %，優(yōu)選至少40 %，更優(yōu)選至少50 %，60 %或70 %，還優(yōu)選至少80 %，90 %，或甚至95 %，96 %，97 %，98 %，99 % 或 100 %，更優(yōu)選至少 30 %，40 %，50 %，60 %，70 %，80 %，90 %，95%，96%，97%，98%，99%或100%，或者可以在約30%至100 %的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在約50%至100%的范圍內(nèi)，甚至優(yōu)選在約70%至100%的范圍內(nèi)，例如，70，80，90或100%，或者在由上述數(shù)值中的任意兩個形成的范圍內(nèi)，條件是，所述聚合載體中所有組分的含量為100%。
[0178]在本發(fā)明的情形中，所述氨基酸組分(AA)可以選自下述的備選方案。
[0179]按照第一備選方案，所述氨基酸組分(AA)可以是芳香氨基酸組分(AA)。由于芳香氨基酸與核酸貨物的堿基的相互作用，將芳香氨基酸或序列作為芳香氨基酸組分(AA)結(jié)合在本發(fā)明的聚合載體中能夠允許所述聚合載體與核酸的不同(第二)結(jié)合，這與其通過所述聚合載體分子的陽離子電荷序列與磷酸骨架的結(jié)合相反。例如，這種相互作用可以通過插入或通過次要的或主要的溝槽結(jié)合而發(fā)生。這種類型的相互作用不傾向于被陰離子復(fù)合配偶體(例如，肝素、透明質(zhì)酸)解壓縮(decompact1n),所述陰離子復(fù)合配偶體在體內(nèi)主要存在于胞外基質(zhì)中，并且對鹽作用的敏感性也較差。
[0180]對于這一目的，芳香氨基酸組分(AA)中的氨基酸可以選自相同的或不同的芳香氨基酸，例如，選自Trp, Tyr或Phe0
[0181]另外，芳香氨基酸組分(AA)可以包含或可以側(cè)連含有-SH的結(jié)構(gòu)部分，其允許通過二硫鍵引入該組分作為上文定義的聚合載體的另一部分，例如，作為接頭。所述含有-SH的結(jié)構(gòu)部分可以是本文定義的適合將本文定義的一種組分偶聯(lián)到本文定義的另一組分上的任意結(jié)構(gòu)部分。例如，所述含有-SH的結(jié)構(gòu)部分可以是半胱氨酸。
[0182]另外，芳香氨基酸組分(AA)可以包含或展現(xiàn)至少一個脯氨酸，其可以作為所述芳香氨基酸組分(AA)中較長的Trp、Tyr和Phe序列的結(jié)構(gòu)中斷劑,優(yōu)選包含兩個、三個或更多個脯氨酸。
[0183]按照第二備選方案，氨基酸組分(AA)可以是親水性(且優(yōu)選是不帶電荷的極性)氨基酸組分(AA)。將親水性(且優(yōu)選是不帶電荷的極性)氨基酸或序列作為親水性(且優(yōu)選是不帶電荷的極性)氨基酸組分(AA)結(jié)合在本發(fā)明的聚合載體中允許與核酸貨物的結(jié)合更加柔性。這導(dǎo)致更有效地壓縮核酸貨物，并且因此獲得更好的針對核酸酶和不需要的解壓縮的保護(hù)。還允許提供(長)聚合載體，其相對于完整載體展現(xiàn)出減少的陽離子電荷，并且在這一情形中，如果需要或必需的話，更好地調(diào)節(jié)結(jié)合特性。
[0184]對于這一目的，親水性(且優(yōu)選是不帶電荷的極性)氨基酸組分(AA)中的氨基酸可以選自相同的或不同的親水性(且優(yōu)選是不帶電荷的極性)氨基酸，例如，選自Thr，Ser，Asn 或 Gln0
[0185]另外，親水性(且優(yōu)選是不帶電荷的極性)氨基酸組分(AA)可以包含或可以側(cè)連含有-SH的結(jié)構(gòu)部分，其允許通過二硫鍵引入該組分作為上述通式(I)的另一部分，例如，作為接頭。所述含有-SH的結(jié)構(gòu)部分可以是本文定義的適合將本文定義的一種組分偶聯(lián)到本文定義的另一組分上的任意結(jié)構(gòu)部分。例如，所述含有-SH的結(jié)構(gòu)部分可以是半胱氨酸。
[0186]另外，親水性(且優(yōu)選是不帶電荷的極性)氨基酸組分(AA)可以包含至少一個脯氨酸，其可以作為親水性(且優(yōu)選是不帶電荷的極性)氨基酸組分(AA)中較長的Ser、Thr和Asn序列的結(jié)構(gòu)中斷劑，優(yōu)選包含兩個、三個或更多個脯氨酸。
[0187]按照第三備選方案，氨基酸組分(AA)可以是親脂性氨基酸組分(AA)。在本發(fā)明的聚合載體中結(jié)合親脂性氨基酸或序列作為氨基親脂性氨基酸組分(AA)能夠允許更強(qiáng)地壓縮核酸貨物和/或在形成復(fù)合物時更強(qiáng)地壓縮所述聚合載體及其核酸貨物。這特別是由于聚合載體的一條或多條聚合物鏈(特別是親脂性氨基酸組分(AA)的親脂性部分)與核酸貨物的相互作用導(dǎo)致。這種相互作用優(yōu)選地將為所述聚合載體及其核酸貨物之間的復(fù)合物增加另外的穩(wěn)定性。這種穩(wěn)定作用在某種程度上可以比得上一類在不同聚合物鏈之間的非共價交聯(lián)。尤其是在水性環(huán)境中，這種相互作用典型地很強(qiáng)，并且提供顯著的影響。
[0188]對于這一目的，親脂性氨基酸組分(AA)中的氨基酸可以選自相同的或不同的親脂性氨基酸，例如，選自Leu,Val, lie，Ala，Met。
[0189]另外，親脂性氨基酸組分(AA)可以包含或可以側(cè)連含有-SH的結(jié)構(gòu)部分，其允許通過二硫鍵引入該組分作為上述聚合載體的另一部分，例如，作為接頭。所述含有-SH的結(jié)構(gòu)部分可以是本文定義的適合將本文定義的一種組分偶聯(lián)到本文定義的另一組分上的任意結(jié)構(gòu)部分。例如，所述含有-SH的結(jié)構(gòu)部分可以是半胱氨酸。
[0190]另外，親脂性氨基酸組分(AA)可以包含至少一個脯氨酸，其可以作為親脂性氨基酸組分(AA)中較長的Leu、Val、Ile、Ala和Met序列的結(jié)構(gòu)中斷劑,優(yōu)選包含兩個、三個或更多個脯氨酸。
[0191]最后，按照第四備選方案，氨基酸組分(AA)可以是弱堿性氨基酸組分(AA)。在本發(fā)明的聚合載體中結(jié)合弱堿性氨基酸或序列作為弱堿性氨基酸組分(AA)可以作為質(zhì)子海綿，并且促進(jìn)內(nèi)體逃逸(也稱為內(nèi)體釋放)(質(zhì)子海綿效應(yīng))。結(jié)合所述弱堿性氨基酸組分(AA)優(yōu)選地提高轉(zhuǎn)染效率。
[0192]對于這一目的，弱堿性氨基酸組分(AA)中的氨基酸可以選自相同的或不同的弱氨基酸，例如，選自組氨酸或天冬氨酸鹽(aspartate)(天冬氨酸)。
[0193]另外，弱堿性氨基酸組分(AA)可以包含或可以側(cè)連含有-SH的結(jié)構(gòu)部分，其允許通過二硫鍵引入該組分作為上述通式(I)的另一部分，例如，作為接頭。所述含有-SH的結(jié)構(gòu)部分可以是本文定義的適合將本文定義的一種組分偶聯(lián)到本文定義的另一組分上的任意結(jié)構(gòu)部分。
[0194]另外，弱堿性氨基酸組分(AA)可以包含至少一個脯氨酸，其可以作為弱堿性氨基酸組分(AA)中較長的組氨酸或天冬氨酸鹽(aspartate)(天冬氨酸)序列的結(jié)構(gòu)中斷劑，優(yōu)選包含兩個、三個或更多個脯氨酸。
[0195]按照第五備選方案，氨基酸組分(AA)可以是信號肽或信號序列、定位信號或序列、核定位信號或序列(NLS)、抗體、細(xì)胞滲透肽(例如TAT)等。優(yōu)選地，所述氨基酸組分(AA)通過(可逆的)二硫鍵結(jié)合在所述聚合載體上或者結(jié)合在所述聚合載體的另一組分上。在這一情形中，所述信號肽或信號序列、定位信號或序列、核定位信號或序列(NLS)、抗體、細(xì)胞滲透肽(例如TAT)等另外包含至少一個-SH-結(jié)構(gòu)部分。在這一情形中，信號肽、定位信號或序列或核定位信號或序列(NLS)可以用于引導(dǎo)本發(fā)明的聚合載體貨物復(fù)合物到達(dá)特定的靶細(xì)胞(例如，肝細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞)，并且優(yōu)選地允許所述聚合載體易位(translocalizat1n)到特定的祀標(biāo),例如，易位到細(xì)胞中，到細(xì)胞核中，到內(nèi)體區(qū)室中，關(guān)于線粒體基質(zhì)的序列，關(guān)于質(zhì)I吳的定位序列，關(guān)于聞爾基體、細(xì)胞核、胞質(zhì)和細(xì)胞骨架(cytosceleton)等的定位序列。所述信號肽、定位信號或序列或核定位信號可以用于轉(zhuǎn)運(yùn)任何本文定義的核酸，優(yōu)選RNA或DNA，更優(yōu)選shRNA或pDNA，例如，將其轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核中。不限于此，所述信號肽、定位信號或序列或核定位信號可以包含，例如，關(guān)于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的定位序列。本文定義的分泌信號肽的實(shí)例包括，但不限于此，經(jīng)典或非經(jīng)典MHC-分子的信號肽(例如，I和II類MHC分子的信號序列，例如，I類MHC分子HLA_A*0201的信號序列)，本文定義的細(xì)胞因子或免疫球蛋白的信號肽，本文定義的免疫球蛋白或抗體的不變鏈的信號肽,Lampl、Tapasin、Erp57、Calretikulin、|丐聯(lián)接蛋白(Calnexin)和其它膜相關(guān)蛋白或與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)或內(nèi)體-溶酶體區(qū)室相關(guān)的蛋白的信號肽。特別優(yōu)選地，按照本發(fā)明可以使用I類MHC分子HLA-A*0201的信號肽。所述另外的組分可以例如結(jié)合到本文定義的聚合載體的陽離子聚合物上或任意其他組分上。優(yōu)選地，該信號肽、定位信號或序列或核定位信號或序列(NLS)通過(可逆的)二硫鍵結(jié)合到所述聚合載體上或結(jié)合到所述聚合載體的另一組分上。對于這一目的，所述(AA)組分另外包含至少一個部分定義的-SH結(jié)構(gòu)部分。與所述聚合載體的任意組分的結(jié)合還可以使用酸不穩(wěn)定鍵實(shí)現(xiàn)，優(yōu)選通過所述聚合載體的任意組分的側(cè)鏈實(shí)現(xiàn)，其允許在較低PH值(例如，在本文定義的生理pH值)分開或釋放所述另外的組分。
[0196]另外，按照另一備選方案，所述氨基酸組分(AA)可以是功能肽或蛋白，其可以相應(yīng)地調(diào)節(jié)所述聚合載體的官能性。作為氨基酸組分(AA)的所述功能肽或蛋白優(yōu)選地包括本文定義的肽或蛋白，例如，下文定義的治療活性蛋白。按照一個備選方案，所述其他功能肽或蛋白可以包括所謂的用于轉(zhuǎn)運(yùn)的細(xì)胞滲透肽(CPPs)或陽離子肽。特別優(yōu)選的是CPPs，其在內(nèi)體中誘導(dǎo)PH-介導(dǎo)的構(gòu)象變化，并且通過插入到脂質(zhì)體的脂質(zhì)層而導(dǎo)致聚合載體(其與核酸復(fù)合)從內(nèi)體的釋放提高。這些用于轉(zhuǎn)運(yùn)的細(xì)胞滲透肽(CPPs)或陽離子肽可以包括，但不限于此，魚精蛋白，核仁蛋白，精胺或亞精胺，寡聚-或聚-L-賴氨酸(PLL)，堿性多肽，寡聚或聚-精氨酸，細(xì)胞滲透肽(CPPs)，嵌合CPPs，如Transportan，或MPG肽，HIV-結(jié)合肽，Tat，HIV-1 Tat (HIV)，Tat-衍生的肽，穿膜肽家族成員，例如穿膜肽，觸角足_衍生的肽(特別是來自果蠅觸角足)，pAntp, plsl等,抗微生物-衍生的CPPs,例如Buforin-2,Bac715-24, SynB, SynB (I)，pVEC, hCT-衍生的肽，SAP, MAP, KALA, PpTG20, Loligomers, FGF,乳鐵蛋白，組蛋白，VP22衍生的或類似的肽，HSV, VP22(單純皰疹)，MAP，KALA或蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(PTDs)，PpT620，富含脯氨酸的肽，富含精氨酸的肽，富含賴氨酸的肽，Pep-1, L-寡聚體，降鈣素肽等。所述氨基酸組分(AA)還可以結(jié)合到本文定義的聚合載體的任意組分上。優(yōu)選地，其通過(可逆的)二硫鍵結(jié)合到所述聚合載體或所述聚合載體的另一組分上。對于上述目的，所述氨基酸組分(AA)優(yōu)選地包含至少一個本文定義的-SH結(jié)構(gòu)部分。對所述聚合載體的任意組分的結(jié)合也可以利用SH-結(jié)構(gòu)部分或酸不穩(wěn)定鍵實(shí)現(xiàn)，優(yōu)選地通過聚合載體的任意成分的側(cè)鏈實(shí)現(xiàn)，其允許在較低PH值(例如，在本文定義的生理pH值)下分開或釋放所述另外的組分。
[0197]按照最后的備選方案，氨基酸組分(AA)可以包含可以在細(xì)胞中發(fā)揮任意有利作用的任意肽或蛋白。特別優(yōu)選的是選自下列的肽或蛋白:治療活性蛋白或肽，抗原，例如腫瘤抗原，致病性抗原(動物抗原，病毒抗原，原生動物抗原，細(xì)菌抗原，變應(yīng)性抗原)，自體免疫抗原，或其它抗原，變應(yīng)原，抗體，免疫刺激性蛋白或肽，抗原特異性T-細(xì)胞受體，或如下文關(guān)于編碼核酸定義的適于特定(治療性)應(yīng)用的任意其他的蛋白或肽。特別優(yōu)選的是來自至少一種本文定義的抗原(來自與傳染病相關(guān)的病原體的抗原；與變態(tài)反應(yīng)或變應(yīng)性疾病相關(guān)的抗原；與自身免疫病相關(guān)的抗原；或與癌癥或腫瘤病相關(guān)的抗原)的肽表位。
[0198]在該情形中，所述氨基酸組分(AA)共價連接到所述聚合載體貨物復(fù)合物上，特別是聚合載體上，所述氨基酸組分(AA)優(yōu)選地不是卵清蛋白或卵清蛋白的片段。優(yōu)選地，所述氨基酸組分不是卵清蛋白或卵清蛋白的片段。
[0199]由于所述氨基酸組分的肽性質(zhì)，肽、蛋白或其片段、變體和衍生物的定義也相應(yīng)地適用并且明確地包含在其中。
[0200]此外，所述(AA)組分可以通過普通技術(shù)人員已知的所有方法或通過重組肽或蛋白生產(chǎn)或通過本文所述的肽合成制備。
[0201]所述聚合載體可以包含上文提及的陽離子或聚陽離子肽、蛋白或聚合物或其他組分(例如(AA))中的至少一種，其中任意上述備選方案可以彼此組合，并且可以在通過其-SH-結(jié)構(gòu)部分的聚合縮合反應(yīng)中使其聚合而形成。
[0202]按照另一個實(shí)施方案，所述聚合載體貨物復(fù)合物的聚合載體或其單一組分，例如，上文提及的陽離子或聚陽離子肽、蛋白或聚合物或其他組分，例如(AA)，可以用配體進(jìn)一步修飾，優(yōu)選用碳水化合物(carbohydrate),更優(yōu)選用糖,甚至更優(yōu)選用甘露糖修飾。優(yōu)選地，所述配體通過(可逆的)二硫鍵或通過邁克爾加成結(jié)合到所述聚合載體上或所述聚合載體的組分上。在配體通過二硫鍵結(jié)合的情形中，所述配體另外包含至少一個-SH-結(jié)構(gòu)部分。這些配體可以用來引導(dǎo)聚合載體貨物復(fù)合物到達(dá)特定的靶細(xì)胞(例如，肝細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞)。在這一情形中，特別優(yōu)選的是甘露糖作為配體，在該情形中，樹突細(xì)胞是特別用于接種或輔助目的的靶標(biāo)。
[0203]按照本發(fā)明的另一個實(shí)施方案，所述聚合載體貨物復(fù)合物可以包含上文定義不包含-SH結(jié)構(gòu)部分的(AA)組分。這些(AA)組分可以在至少一種核酸分子的復(fù)合之前或復(fù)合過程中加入。由此，所述(AA)組分(非共價)結(jié)合到所述聚合載體貨物復(fù)合物中，在通過(共價)聚合作用形成的聚合載體本身中不包含所述(AA)組分。
[0204]按照一個具體的實(shí)施方案，整個聚合載體貨物復(fù)合物可以在第一步中由上文提及的陽離子或聚陽離子肽、蛋白或聚合物或其他組分(例如(AA))(中的至少一種)，通過其-SH-結(jié)構(gòu)部分的聚合縮合以及在第二步中將核酸與所述聚合載體復(fù)合而形成。因此，所述聚合載體可以包含多個相同的或不同的上文定義的陽離子或聚陽離子肽、蛋白或聚合物或其他組分(例如(AA))中的至少一種或甚至多種，數(shù)目優(yōu)選由上述范圍確定。
[0205]按照一個備選的具體實(shí)施方案，聚合載體貨物復(fù)合物通過進(jìn)行上文提及的陽離子或聚陽離子肽、蛋白或聚合物或其他組分(例如(AA))中的至少一種通過其-SH-結(jié)構(gòu)部分的聚合縮合反應(yīng)同時將核酸貨物復(fù)合在(原位制備的)聚合載體上而形成。同樣地，因此，此處聚合載體還包含多個相同的或不同的上文定義的陽離子或聚陽離子肽、蛋白或聚合物或其他組分(例如(AA))中的至少一種或甚至多種，數(shù)目優(yōu)選由上述范圍確定。
[0206]所述聚合載體貨物復(fù)合物另外包含至少一種核酸(分子)作為貨物。在本發(fā)明的情形中，所述核酸分子可以是任意的核酸，例如，選自任意(單鏈或雙鏈的)DNA,優(yōu)選地，但不限于此，例如，基因組DNA，單鏈DNA分子，雙鏈DNA分子，編碼DNA，DNA引物，DNA探針，免疫刺激性DNA，(短)DNA寡核苷酸((短)寡脫氧核糖核苷酸)，或者可以選自，例如，任意PNA(肽核酸)或者可以選自，例如，任意(單鏈或雙鏈的)RNA，優(yōu)選地，但不限于此，(短)RNA寡核苷酸((短)寡核糖核苷酸)，編碼RNA，信使RNA (mRNA)，免疫刺激性RNA，小干擾 RNA(siRNA),反義 RNA,微小 RNA,小核 RNA(snRNA),小發(fā)夾(sh)RNA 或 riboswitches,核酶或適體；等等。所述聚合載體貨物復(fù)合物的核酸分子也可以是核糖體RNA(rRNA)，轉(zhuǎn)運(yùn)RNA (tRNA)，信使RN A (mRNA)或病毒RNA (vRNA)。優(yōu)選地，所述聚合載體貨物復(fù)合物的核酸分子是RNA。更優(yōu)選地，所述聚合載體貨物復(fù)合物的核酸分子是(線性)單鏈RNA，甚至更優(yōu)選地是mRNA或免疫刺激性RNA。在本發(fā)明的情形中，mRNA典型地是RNA，其由一些結(jié)構(gòu)元件組成，例如，可選的5’ -CAP結(jié)構(gòu)，可選的5’ -UTR區(qū)，位于上游的核糖體結(jié)合位點(diǎn)，接著是編碼區(qū)，可選的3’ -UTR區(qū)，其后可以接著聚-A尾(和/或聚-C尾)。mRNA可以作為單順反子、雙順反子或甚至多順反子RNA存在，即為攜帶一種、兩種或更多種蛋白或肽的編碼序列的RNA。在雙順反子或甚至多順反子mRNA中的所述編碼序列可以被至少一個IRES (例如，如本文定義)序列隔開。
[0207]此外，所述聚合載體貨物復(fù)合物的核酸可以是單鏈的或雙鏈的核酸(分子)(由于兩條單鏈核酸(分子)的非共價締合，其也可以視為核酸(分子))或部分雙鏈或部分單鏈的核酸，其至少部分自我互補(bǔ)(這些部分雙鏈的或部分單鏈的核酸分子二者典型地由較長的和較短的單鏈核酸分子形成或由兩條長度大約相同的單鏈核酸分子形成，其中一條單鏈核酸分子與另一條單鏈核酸分子部分互補(bǔ)，并且二者由此在該區(qū)域中形成雙鏈核酸分子，即，部分雙鏈或部分單鏈的核酸(分子))。優(yōu)選地，所述核酸(分子)可以是單鏈核酸分子。此外，所述核酸(分子)可以是環(huán)形或線性核酸分子，優(yōu)選是線性核酸分子。
[0208]按照一個備選方案，所述聚合載體貨物復(fù)合物的核酸分子可以是編碼核酸，例如DNA或RNA。所述編碼DNA或RNA可以是任意本文定義的DNA或RNA。優(yōu)選地，所述編碼DNA或RNA可以是單鏈的或雙鏈的DNA或RNA，更優(yōu)選地是單鏈的DNA或RNA，和/或環(huán)形或線性DNA或RNA，更優(yōu)選地是線性DNA或RNA。甚至更優(yōu)選地，所述編碼DNA或RNA可以是(線性)單鏈DNA或RNA。最優(yōu)選地，本發(fā)明所述的核酸分子可以是((線性)單鏈的)信使RNA (mRNA)。所述mRNA可以作為單順反子、雙順反子或甚至多順反子RNA存在，即為攜帶一種、兩種或更多種蛋白或肽的編碼序列的RNA。在雙順反子或甚至多順反子mRNA中的所述編碼序列可以被至少一個IRES(例如，如本文定義)序列隔開。
[0209]編碼核酸:
[0210]所述聚合載體貨物復(fù)合物的核酸分子可以編碼蛋白或肽，其可以選自，但不限于此，例如，治療活性蛋白或肽，包括輔助蛋白(adjuvant protein),抗原,例如腫瘤抗原,致病性抗原(例如選自動物抗原，病毒抗原，原生動物抗原，細(xì)菌抗原)，變應(yīng)性抗原，自體免疫抗原，或其它抗原，變應(yīng)原，抗體，免疫刺激性蛋白或肽，抗原特異性T-細(xì)胞受體，或適于特定(治療性)應(yīng)用的任意其他蛋白或肽，其中可以將編碼核酸轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞、組織或生物體中，并且隨后可以在該細(xì)胞、組織或生物體中表達(dá)該蛋白。在這一情形中，編碼核酸可以另外編碼本文定義的信號肽。
[0211]a)治療活性蛋白
[0212]在本發(fā)明的情形中，治療活性蛋白或肽可以由本文定義的聚合載體貨物復(fù)合物的核酸分子所編碼。治療活性蛋白在本文中定義為對治愈有作用、預(yù)防性防止或治療性治療疾病(優(yōu)選如本文定義的疾病)的蛋白，或是個體需要的蛋白。這些可以選自技術(shù)人員從現(xiàn)有技術(shù)中已知的任何天然的或合成設(shè)計存在的重組或分離的蛋白。不限于此，治療活性蛋白可以包括能夠刺激或抑制細(xì)胞中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白，例如，細(xì)胞因子，淋巴因子，單核因子，生長因子，受體，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，轉(zhuǎn)錄因子等；抗凝劑；抗凝血酶；抗變應(yīng)性蛋白；凋亡因子或凋亡相關(guān)的蛋白，治療活性酶和與任何獲得性疾病或任何遺傳性疾病相聯(lián)系或有利于任何獲得性疾病或任何遺傳性疾病的治療的任何蛋白或肽。
[0213]治療活性蛋白，其可以由本文定義的聚合載體貨物復(fù)合物的核酸分子編碼，也可以是輔助蛋白。在這一情形中，輔助蛋白優(yōu)選理解為能夠引發(fā)本文定義的先天性免疫應(yīng)答的任何蛋白。優(yōu)選地，所述先天性免疫應(yīng)答包括模式識別受體的激活，所述受體諸如例如，選自Toll-樣受體(TLR)家族的受體，包括，例如，選自人TLRl至TLRlO或選自鼠Toll樣受體TLRl至TLR13的Toll樣受體。更優(yōu)選地，所述輔助蛋白選自人輔助蛋白或選自致病性輔助蛋白，選自由下列組成的組，但不限于此，細(xì)菌蛋白，原生動物蛋白，病毒蛋白，或真菌蛋白，動物蛋白，特別是選自細(xì)菌輔助蛋白。另外，還可以使用編碼參與輔助作用的人蛋白(例如，模式識別受體的配體、模式識別受體、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的蛋白、轉(zhuǎn)錄因子或細(xì)胞因子)的核酸。
[0214]b)杭原
[0215] 本文定義的聚合載體貨物復(fù)合物的核酸分子可以備選地編碼抗原。在本發(fā)明的情形中，由本文定義的聚合載體貨物復(fù)合物的核酸分子編碼的抗原典型地包括落入上述定義中的任何抗原、抗原性表位或抗原性肽，更優(yōu)選是蛋白和肽抗原，例如，腫瘤抗原，變應(yīng)性抗原，自體免疫自身抗原，致病性抗原等。特別地，由本文定義的聚合載體貨物復(fù)合物的核酸分子編碼的抗原可以是在細(xì)胞外產(chǎn)生的抗原，更典型地是不是來源于宿主生物體(例如，人)本身(即非自身抗原)而是來源于宿主生物體之外的宿主細(xì)胞的抗原，例如，病毒抗原，細(xì)菌抗原，真菌抗原，原生動物抗原，動物抗原，變應(yīng)性抗原等。變應(yīng)性抗原(變態(tài)反應(yīng)抗原)典型地是在人中引起變態(tài)反應(yīng)的抗原，并且可以來源于人或其它來源。另外，由本文定義的聚合載體貨物復(fù)合物的核酸分子編碼的抗原還可以是在細(xì)胞、組織或身體內(nèi)產(chǎn)生的抗原。所述抗原包括來源于宿主生物體(例如，人)自身的抗原，例如，腫瘤抗原，自身抗原或自體抗原，諸如自體免疫自身抗原等，以及本文定義的(非自身)抗原，其最初來源于宿主生物體外的宿主細(xì)胞，但是其在身體、組織或細(xì)胞內(nèi)分解或降解，例如，通過(蛋白酶)降解、代謝機(jī)制等分解或降解。在這一情形中，由包含在所述聚合載體貨物復(fù)合物中的核酸貨物編碼的抗原如下文關(guān)于本發(fā)明的藥物組合物的至少一種抗原、第二成分所述那樣定義。
[0216]在這一情形中，特別優(yōu)選的是由核酸貨物編碼的抗原或其片段、變體和/或衍生物是與本文定義的包含在本發(fā)明的藥物組合物中作為第二成分的至少一種抗原相同的抗原。然而，在備選的實(shí)施方案中，由核酸貨物編碼的抗原或其片段、變體和/或衍生物是與本文定義的包含在本發(fā)明的藥物組合物中作為第二成分的至少一種抗原不同的抗原。在抗原由核酸貨物編碼的具體情形中，所述核酸分子連同所述聚合載體一起作為佐劑或免疫刺激劑來誘導(dǎo)非特異性的先天性免疫應(yīng)答，而由所述核酸貨物表達(dá)的所編碼的蛋白或肽抗原作為抗原來誘導(dǎo)抗原特異性的適應(yīng)性免疫應(yīng)答。
[0217]c)杭體
[0218]按照另一個備選方案，本文定義的聚合載體貨物復(fù)合物的核酸分子可以編碼抗體或抗體片段。按照本發(fā)明，所述抗體可以選自本領(lǐng)域已知的任何抗體，例如，任何重組生產(chǎn)或天然存在的抗體，特別是適用于治療、診斷或科學(xué)目的的抗體，或已經(jīng)鑒定與特定癌癥疾病相關(guān)的抗體。本文中，術(shù)語“抗體”以其最廣泛意義使用，并且特別涵蓋單克隆和多克隆抗體(包括激動劑、拮抗劑、和阻斷或中和抗體)和具有多表位特異性的抗體種類。按照本發(fā)明，術(shù)語“抗體”典型地包括本領(lǐng)域已知的任何抗體(例如IgM，IgD, IgG, IgA和IgE抗體)，諸如天然存在的抗體，通過免疫在宿主生物體中產(chǎn)生的抗體，由天然存在的抗體分離和鑒定的抗體或通過免疫在宿主生物體中產(chǎn)生的抗體和通過本領(lǐng)域已知的生物分子方法重組產(chǎn)生的抗體，以及嵌合抗體，人抗體，人源化抗體，雙特異性抗體，細(xì)胞內(nèi)抗體，即在細(xì)胞中表達(dá)并且任選地定位在特定細(xì)胞區(qū)室中的抗體，以及前述抗體的片段和變體。一般地，抗體由輕鏈和重鏈組成，所述輕鏈和重鏈均具有可變結(jié)構(gòu)域和恒定結(jié)構(gòu)域。輕鏈由N-端可變結(jié)構(gòu)域\和C-端恒定結(jié)構(gòu)域Q組成。相比之下，IgG抗體的重鏈，例如，由N-端可變結(jié)構(gòu)域Vh和三個恒定結(jié)構(gòu)域CH1、Ch2和Ch3組成。
[0219]在本發(fā)明的情形中，由本文定義的聚合載體貨物復(fù)合物的核酸分子編碼的抗體可以優(yōu)選地包括全長抗體，即由完全重鏈和完全輕鏈組成的抗體，如前文所述。然而，抗體的衍生物，諸如抗體片段、變體或加合物，也可以由本文定義的聚合載體貨物復(fù)合物的核酸分子編碼。抗體片段優(yōu)選地選自前述(全長)抗體的Fab, Fab，，F(xiàn)(ab，)2, Fe, Facb, pFc，，F(xiàn)d和Fv片段。一般地，抗體片段在本領(lǐng)域中是已知的。例如，F(xiàn)ab(“片段、抗原結(jié)合”)片段由每條重鏈和輕鏈的一個恒定結(jié)構(gòu)域和一個可變結(jié)構(gòu)域組成。兩個可變結(jié)構(gòu)域結(jié)合特定抗原上的表位。兩條鏈通過二硫鍵連接。scFv( “單鏈可變片段”)片段，例如，典型地由輕鏈和重鏈的可變結(jié)構(gòu)域組成。所述結(jié)構(gòu)域通過人工連接鍵連接，通常是多肽連接，諸如由15-25個甘氨酸、脯氨酸和/或絲氨酸殘基組成的肽。
[0220]在所述情形中，優(yōu)選的是抗體或抗體片段的不同鏈由多順反子核酸分子編碼。備選地，抗體或抗體片段的不同鏈由數(shù)個單順反子核酸(序列)編碼。
[0221]siRNA:
[0222]按照另一個備選方案，本文定義的聚合載體貨物復(fù)合物的核酸分子可以采用dsRNA的形式，優(yōu)選是siRNA的形式。聯(lián)系RNA干擾現(xiàn)象，特別感興趣的是dsRNA或siRNA。體外RNA干擾(RNAi)技術(shù)基于雙鏈RNA分子(dsRNA)，其引發(fā)序列特異性的基因表達(dá)抑制(Zamore (2001) Nat.Struct.B1l.(自然結(jié)構(gòu)生物學(xué))9:746-750 ;Sharp (2001) GenesDev.(基因發(fā)育)5:485-490 =Hannon (2002) Nature (自然)41:244-251)。在用長 dsRNA轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞時，蛋白激酶R和RNA酶L的激活導(dǎo)致非特異性作用，諸如例如，干擾素應(yīng)答(Stark 等人，(1998) Annu.Rev.B1chem.(生物化學(xué)年度綜述)67 =227-264 ；He 和Katze (2002) Viral Immunol.(病毒免疫學(xué))15:95-119)。當(dāng)使用較短的，例如21-至23-mer的所謂siRNA(小干擾RNA)時，避免了這些非特異性作用，因為短于30 bp的siRNA不引發(fā)非特異性作用(Elbashir 等人，(2001)Nature (自然)411:494-498)。
[0223]本文定義的聚合載體貨物復(fù)合物的核酸分子因此可以是長度為17-29、優(yōu)選19-25的雙鏈RNA(dsRNA)，并且(dsRNA的核苷酸)優(yōu)選與前述(治療相關(guān))蛋白或抗原(作為活性成分)或本文所述的任意其他蛋白的核酸序列的一部分(編碼部分或非編碼部分，優(yōu)選編碼部分)有至少90%、更優(yōu)選95%、特別是100%的互補(bǔ)性。所述核酸分子(的一部分)在本文中可以稱為“靶序列”，并且可以是本文定義的任意核酸分子，優(yōu)選是基因組DNA, cDNA, RNA,例如mRNA等。90%的互補(bǔ)性意指，對于本文所述的dsRNA的長度，例如20個核苷酸，該dsRNA包含的不具有與靶序列相對應(yīng)部分的互補(bǔ)性的核苷酸不多于2個。然而，按照本發(fā)明使用的雙鏈RNA的序列優(yōu)選地在其通用結(jié)構(gòu)上與靶序列的一部分完全互補(bǔ)。在這一情形中，所述聚合載體貨物復(fù)合物的核酸分子可以是具有通用結(jié)構(gòu)5' -(N17_29)-3,的dsRNA，優(yōu)選具有通用結(jié)構(gòu)5' -(N19_25)-3'，更優(yōu)選具有通用結(jié)構(gòu)5' -(N19_24) ，或更優(yōu)選具有通用結(jié)構(gòu)5' -(N21_23)-3,，其中對于每種通用結(jié)構(gòu)，每個N是所述靶序列的一部分的(優(yōu)選不同的)核苷酸，優(yōu)選選自所述靶序列部分的連續(xù)17-29個數(shù)目的核苷酸，并且以其天然順序存在于通用結(jié)構(gòu)5' -(N17_29)-Si中。原則上，所有具有17-29、優(yōu)選19-25個存在于靶序列中的堿基對的長度的部分可以作為本文定義的dsRNA的制劑。同等地，用作所述聚合載體貨物復(fù)合物的核酸的dsRNAs還可以針對前述(治療相關(guān))蛋白或抗原(作為活性成分)的不位于靶序列的編碼區(qū)、特別是5'非編碼區(qū)的核苷酸序列，例如，因此，針對靶序列具有調(diào)節(jié)功能的非編碼區(qū)。因此，用作所述聚合載體貨物復(fù)合物的核酸分子的dsRNA的靶序列可以位于靶序列的翻譯區(qū)和不翻譯區(qū)和/或位于前述蛋白或抗原的控制元件區(qū)。用作所述聚合載體貨物復(fù)合物的核酸分子的dsRNA的靶序列還可以位于不翻譯和翻譯序列的重疊區(qū)；特別地，所述靶序列可以包含編碼區(qū)(例如，基因組DNA、cDNA、RNA或mRNA等的編碼區(qū))起始三聯(lián)體上游的至少一個核苷酸。
[0224]免疫刺激性核酸:
[0225]a)免疫刺激性CpG核酸:
[0226]按照另一個備選方案，本文定義的聚合載體貨物復(fù)合物的核酸分子可以采用(免疫刺激性) CpG核酸的形式，特別是CpG-RNA或CpG-DNA的形式，其優(yōu)選誘導(dǎo)先天性免疫應(yīng)答。按照本發(fā)明使用的CpG-RNA或CpG-DNA可以是單鏈CpG-DNA (ss CpG-DNA)，雙鏈CpG-DNA (dsDNA)，單鏈 CpG-RNA (ss CpG-RNA)或雙鏈 CpG-RNA (ds CpG-RNA)。按照本發(fā)明使用的CpG核酸優(yōu)選采用CpG-RNA的形式，更優(yōu)選采用單鏈CpG-RNA (ss CpG-RNA)的形式。還優(yōu)選地，所述CpG核酸具有上述長度。優(yōu)選地，所述CpG基序未甲基化。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述CpG核酸不是由序列5’ TCCATGACGTTCCTGACGTT-3’ (SEQ ID NO:123)組成的CpG-DNA，特別當(dāng)所述蛋白或肽抗原是卵清蛋白或卵清蛋白的片段時。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述CpG核酸不是包含SEQ ID NO:123的序列。優(yōu)選地，所述CpG核酸不是CpG-DNA。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述聚合載體貨物復(fù)合物不包含CpG-DNA，優(yōu)選地不包含CpG核酸。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述藥物組合物不包含CpG-DNA，優(yōu)選不包含CpG核酸。
[0227]b)免瘡刺激件 RNA(isRNA):
[0228]同樣地，按照另一個備選方案，本文定義的聚合載體貨物復(fù)合物的(免疫刺激性)核酸分子可以采用免疫刺激性RNA(isRNA)的形式，其優(yōu)選地引發(fā)先天性免疫應(yīng)答。所述免疫刺激性RNA可以是任意(雙鏈或單鏈)RNA,例如編碼RNA，如本文定義。優(yōu)選地，所述免疫刺激性RNA可以是單鏈的、雙鏈的或部分雙鏈的RNA，更優(yōu)選是單鏈RNA，和/或環(huán)形或線性RNA，更優(yōu)選線性RNA。更優(yōu)選地，所述免疫刺激性RNA可以是(線性)單鏈RNA。甚至更優(yōu)選地，所述免疫刺激性RNA可以是(長)(線性)單鏈非編碼RNA。在這種情形中，特別優(yōu)選的是，所述isRNA在其5’-端攜帶三磷酸，對于體外轉(zhuǎn)錄的RNA是這種情形。免疫刺激性RNA還可以作為本文定義的短RNA寡核苷酸存在。本文所用的免疫刺激性RNA還可以選自任何種類的RNA分子，天然存在的或合成制備的，并且其可以誘導(dǎo)先天性免疫應(yīng)答并且可以支持由抗原誘導(dǎo)的適應(yīng)性免疫應(yīng)答。在這種情形中，免疫應(yīng)答可以以多種方式發(fā)生。關(guān)于適當(dāng)?shù)?適應(yīng)性)免疫應(yīng)答的基本因素是不同T細(xì)胞亞群的刺激。T淋巴細(xì)胞典型地分成兩個亞群，T輔助I (Thl)細(xì)胞和T輔助2(Th2)細(xì)胞，利用其免疫系統(tǒng)能夠破壞細(xì)胞內(nèi)(Thl)和細(xì)胞外(Th2)病原體(例如，抗原)。這兩種Th細(xì)胞群在它們所產(chǎn)生的效應(yīng)子蛋白(細(xì)胞因子)的模式方面不同。因此，Thl細(xì)胞通過激活巨噬細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞而輔助細(xì)胞免疫應(yīng)答。在另一方面，Th2細(xì)胞通過刺激B細(xì)胞轉(zhuǎn)化為漿細(xì)胞和通過形成抗體(例如，針對抗原的抗體)而促進(jìn)體液免疫應(yīng)答。因此，在誘導(dǎo)和維持適應(yīng)性免疫應(yīng)答方面，Thl/Th2比率非常重要。與本發(fā)明相聯(lián)系的，(適應(yīng)性)免疫應(yīng)答的Thl/Th2比率優(yōu)選向細(xì)胞應(yīng)答(Thl應(yīng)答)方向轉(zhuǎn)變，并且由此誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答。按照一個實(shí)例，可以通過Toll樣受體(TLRs)的配體激活可能支持適應(yīng)性免疫應(yīng)答的先天性免疫系統(tǒng)。TLRs是高度保守的模式識別受體(PRR)多肽家族，其識別病原體相關(guān)的分子模式(PAMPs)并且在哺乳動物的先天免疫性中起關(guān)鍵作用。目前，已經(jīng)鑒定了至少十三個家族成員，稱為TLRl-TLR13(Toll-樣受體:TLR1, TLR2，TLR3，TLR4，TLR5，TLR6，TLR7，TLR8，TLR9，TLRlO，TLRl I，TLRl2 或 TLRl3)。此外，已經(jīng)鑒定了多個特異性TLR配體。例如，發(fā)現(xiàn)未甲基化的細(xì)菌DNA及其合成的類似物(CpG DNA)是關(guān)于TLR9 的配體(Hemmi H等人，(2000)Nature (自然)408:740-5 ；Bauer S等A, (2001)Proc Natl Acad Sci USA(美國國家科學(xué)院學(xué)報)98，9237_42)。此外，已經(jīng)報道，關(guān)于某些TLRs的配體包括某些核酸分子，并且某些類型的RNA以序列不依賴性或序列依賴性方式是免疫刺激性的，其中這些不同的免疫刺激性RNAs可以，例如，刺激TLR3，TLR7，或TLR8，或細(xì)胞內(nèi)受體，諸如RIG-1，MDA-5等。例如，Lipford等人確定某些含有G，U的寡核糖核苷酸通過TLR7和TLR8作用是免疫刺激性的(參見WO 03/086280)。相信由Lipford等人所述的免疫刺激性含有G，U的寡核糖核苷酸可來源于包括核糖體RNA、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA、信使RNA和病毒RNA的RNA來源。
[0229]用作本文定義的聚合載體貨物復(fù)合物的核酸分子的免疫刺激性RNA(isRNA)因此可以包括已知是免疫刺激性的任何RNA序列，包括但不限于此，代表和/或編碼TLRs的配體的RNA序列，優(yōu)選選自人家族成員TLR1-TLR10或鼠家族成員TLR1-TLR13，更優(yōu)選選自(人)家族成員TLR1-TLR10，甚至更優(yōu)選選自TLR7和TLR8，關(guān)于RNA的細(xì)胞內(nèi)受體的配體(諸如 RIG-1 或 MDA-5 等)(參見例如.Meylan, E.，Tschopp, J.(2006).Toll-like receptors and RNA helicases:two parallel ways to trigger antiviralresponses (Toll樣受體和RNA解旋酶:引發(fā)抗病毒反應(yīng)的兩種平行方式).Mol.Cell (分子細(xì)胞)22，561-569)，或任意其它免疫刺激性RNA序列。此外，用作所述聚合載體貨物復(fù)合物的核酸分子的免疫刺激性RNA分子(種類)可以包括能夠引發(fā)先天性免疫應(yīng)答的任何其它RNA。不限于此，所述免疫刺激性RNA可以包括核糖體RNA (rRNA)，轉(zhuǎn)運(yùn)RNA (tRNA)，信使RNA (mRNA)和病毒RNA (vRNA)，優(yōu)選地，所述免疫刺激性RNA是非編碼的RNA。所述免疫刺激性 RNA 可以包括 1000-5000，500-5000，5-5000，或 5-1000，5-500，5-250，5-100，5-50 或5-30個核苷酸的長度。
[0230]按照一個特別優(yōu)選的實(shí)施方案，所述免疫刺激性核酸序列優(yōu)選是優(yōu)選由式(II)或(III)的核酸序列組成或包含式(II)或(III)的核酸序列的RNA:
[0231]G1XmGn, (式(II))
[0232]其中:
[0233]G是鳥苷、尿嘧啶或是鳥苷或尿嘧啶的類似物；
[0234]X是鳥苷、尿嘧啶、腺苷、胸苷、胞嘧啶或上述核苷酸的類似物；
[0235]I是1-40的整數(shù)，
[0236]其中
[0237]當(dāng)I = I時，G是鳥苷或其類似物，
[0238]當(dāng)I > I時，至少50%的核苷酸是鳥苷或其類似物；
[0239]m是整數(shù)且至少為3 ；
[0240]其中
[0241]當(dāng)m = 3時，X是尿嘧啶或其類似物，
[0242]當(dāng)m > 3時，存在至少3個連續(xù)的尿嘧啶或尿嘧啶類似物；
[0243]η是1-40的整數(shù)，
[0244]其中
[0245]當(dāng)η = I時，G是鳥苷或其類似物，
[0246]當(dāng)η > I時，至少50%的核苷酸是鳥苷或其類似物。
[0247]C1XmCn, (式(III))
[0248]其中:
[0249]C是胞嘧啶、尿嘧啶或是胞嘧啶或尿嘧啶的類似物；
[0250]X是鳥苷、尿嘧啶、腺苷、胸苷、胞嘧啶或上述核苷酸的類似物；
[0251]I是1-40的整數(shù)，
[0252]其中
[0253]當(dāng)I = I時，C是胞嘧啶或其類似物，
[0254]當(dāng)I > I時，至少50%的核苷酸是胞嘧啶或其類似物；
[0255]m是整數(shù)且至少為3 ；
[0256]其中
[0257]當(dāng)m = 3時，X是尿嘧啶或其類似物，
[0258]當(dāng)m > 3時，存在至少3個連續(xù)的尿嘧啶或尿嘧啶類似物；
[0259]η是1-40的整數(shù)，
[0260]其中
[0261]當(dāng)η = I時，C是胞嘧啶或其類似物，
[0262]當(dāng)η > I時，至少50%的核苷酸是胞嘧啶或其類似物。
[0263]可以用作所述聚合載體貨物復(fù)合物的核酸貨物的式(II)或(III)的核酸可以是相對短的核酸分子，典型的長度約為5-100 (但是，對于特定的實(shí)施方案，也可以長于100個核苷酸，例如，至多200個核苷酸)>5-90或5-80個核苷酸，優(yōu)選長度約為5_70，更優(yōu)選長度約為8-60，更優(yōu)選長度約為15-60個核苷酸，更優(yōu)選20-60，最優(yōu)選30-60個核苷酸。如果核酸貨物復(fù)合物的核酸具有例如100個核苷酸的最大長度，則m典型地<=98。式(II)的核酸中核苷酸G的數(shù)目由I或η確定。I和η，彼此獨(dú)立，分別是1_40的整數(shù)，其中當(dāng)I或η=I時，G是鳥苷或其類似物，當(dāng)I或η > I時，至少50%的核苷酸是鳥苷或其類似物。例如，不暗示任何限制，當(dāng)I或η = 4時，G1或Gn可以是，例如，GUGU, GGUU, UGUG, UUGG, GUUG,GGGU, GGUG, GUGG, UGGG 或 GGGG 等；當(dāng) I 或 η = 5 時，G1 或6? 可以是，例如，GGGUU, GGUGU,GUGGU, UGGGU, UGGUG, UGUGG, UUGGG，GUGUG, GGGGU, GGGUG, GGUGG, GUGGG, UGGGG 或 GGGGG 等；等等。在本發(fā)明式(II)的核酸中與Xm相鄰的核苷酸優(yōu)選不是尿嘧啶。類似地，在本發(fā)明式(III)的核酸中核苷酸C的數(shù)目由I或η確定。I和η，彼此獨(dú)立，分別是1-40的整數(shù)，其中當(dāng)I或η=1時，C是胞嘧啶或其類似物，當(dāng)I或η > I時，至少50%的核苷酸是胞嘧啶或其類似物。例如，不暗示任何限制，當(dāng)I或η = 4時，(^或匕可以是，例如，⑶⑶，CCUU，UCUC，UUCC, CUUC, CCCU，CCUC，CUCC，UCCC 或 CCCC 等；當(dāng) I 或 η = 5 時，C1 或 Cn 可以是，例如，CCCUU，CCUCU，CUCCU，UCCCU，UCCUC，UCUCC，UUCCC，CUCUC，CCCCU，CCCUC，CCUCC，CUCCC，UCCCC或CCCCC等；等等。在本發(fā)明式(V)的核酸中與Xm相鄰的核苷酸優(yōu)選不是尿嘧啶。優(yōu)選地，對于式(II)，當(dāng)I或η > I時，至少60 %，70 %，80 %，90 %或甚至100 %的核苷酸是鳥苷或其類似物，如上文定義。在側(cè)連序列G1和/或6?中至100%的其余的核苷酸(當(dāng)鳥苷組成少于100%的核苷酸時)是尿嘧啶或其類似物，如前文定義。還優(yōu)選地，I和η，彼此獨(dú)立，分別是2-30的整數(shù)，更優(yōu)選是2-20的整數(shù)，更優(yōu)選是2-15的整數(shù)。如果有必要，I或η的下限可以變化，并且至少為1，優(yōu)選至少為2，更優(yōu)選至少為3，4，5，6，7，8，9或10。這一定義相應(yīng)地應(yīng)用于式(III)。
[0264]按照一個特別優(yōu)選的實(shí)施方案，可以用作所述聚合載體貨物復(fù)合物的核酸的任意式(II)或(III)的核酸可以選自由任意下述序列組成或包含任意下述序列的序列:
[0265]
【權(quán)利要求】
1.一種藥物組合物,其包含: (A)聚合載體貨物復(fù)合物，所述聚合載體貨物復(fù)合物包含: a)作為載體的聚合載體，其包含二硫化物交聯(lián)的陽離子組分，優(yōu)選由二硫化物交聯(lián)的陽離子組分形成；和 b)作為貨物的至少一種核酸分子， 和 (B)至少一種蛋白或肽抗原，其選自由下述組成的組: (i)來自與傳染病相關(guān)的病原體的抗原； (ii)與變態(tài)反應(yīng)或變應(yīng)性疾病相關(guān)的抗原； (iii)與自身免疫病相關(guān)的抗原；和 (iv)與癌癥或腫瘤疾病相關(guān)的抗原， 或所述蛋白或肽抗原的片段、變體和/或衍生物。
2.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中組分(B)不與組分(A)共價連接。
3.權(quán)利要求1或2的藥物組合物，其中所述蛋白或肽抗原來自選自由下述組成的列表的病原體:狂犬病病毒，乙型肝炎病毒，人乳頭瘤病毒(hPV)，炭疽芽孢桿菌(Bacillusanthracis)，呼吸道合胞病毒(RSV)，單純皰疹病毒(HSV)，流感病毒和結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)。
4.權(quán)利要求1-3中任一項的藥物組合物，其中所述蛋白或肽抗原選自由下述組成的列表: ?流感病毒的:血凝素(HA)，神經(jīng)氨酸酶(NA)，核蛋白(NP)，Ml蛋白，M2蛋白，NSl蛋白，NS2蛋白(NEP蛋白:核輸出蛋白)，PA蛋白，PBl蛋白(聚合酶堿性I蛋白)，PB1-F2蛋白和PB2蛋白； ?在狂犬病病毒的每種情形中:核蛋白(N),憐蛋白(P)，基質(zhì)蛋白(M),糖蛋白(G),和病毒RNA聚合酶(L)； ?在乙型肝炎病毒的每種情形中:乙型肝炎表面抗原(HBsAg)，乙型肝炎核心抗原(HbcAg)，乙型肝炎病毒DNA聚合酶，HBx蛋白，preS2中表面蛋白，大S蛋白，病毒蛋白VPl，病毒蛋白VP2，病毒蛋白VP3和病毒蛋白VP4 ； ?在人乳頭瘤病毒(hPV)的每種情形中:E1蛋白，E2蛋白，E3蛋白，E4蛋白，E5蛋白，E6蛋白，E7蛋白，E8蛋白，LI蛋白和L2蛋白； ?在炭疽芽孢桿菌的每種情形中:保護(hù)性抗原(PA)，水腫因子(EF)，致死因子(LF)和S-層同源蛋白(SLH)； 籲在呼吸道合胞病毒(RSV)的每種情形中:融合(F)蛋白，核殼(N)蛋白，憐蛋白(P)，基質(zhì)(M)蛋白，糖蛋白(G)，大蛋白(L ;RNA聚合酶)，非結(jié)構(gòu)蛋白l(NSl)，非結(jié)構(gòu)蛋白2(NS2)，小疏水(SH)蛋白，延伸因子M2-1和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白M2-2; ?在單純皰疹病毒(HSV)的每種情形中:糖蛋白L(ULl)，尿嘧啶-DNA糖基化酶UL2，UL3蛋白，UL4蛋白，DNA復(fù)制蛋白UL5，門蛋白UL6，病毒體成熟蛋白UL7，DNA解旋酶UL8，復(fù)制起點(diǎn)-結(jié)合蛋白UL9，糖蛋白M(ULlO)，ULll蛋白，堿性核酸外切酶UL12，絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶UL13，間層蛋白UL14，末端酶(UL15)，間層蛋白UL16，UL17蛋白，衣殼蛋白VP23(UL18)，主要衣殼蛋白VP5(UL19)，膜蛋白UL20,間層蛋白UL21，糖蛋白H(UL22)，胸苷激酶 UL23，UL24 蛋白，UL25 蛋白，衣殼蛋白 P40 (UL26，VP24，VP22A)，糖蛋白 B (UL27)，ICP18.5蛋白(UL28)，主要DNA-結(jié)合蛋白ICP8 (UL29)，DNA聚合酶UL30，核基質(zhì)蛋白UL31，包膜糖蛋白UL32，UL33蛋白，內(nèi)核膜蛋白UL34，衣殼蛋白VP26 (UL35)，大間層蛋白UL36，衣殼組裝蛋白UL37，VP19C蛋白(UL38)，核糖核苷酸還原酶(大亞基)UL39，核糖核苷酸還原酶(小亞基)UL40，間層蛋白/病毒體宿主關(guān)閉VHS蛋白(UL41)，DNA聚合酶持續(xù)合成因子UL42，膜蛋白UL43，糖蛋白C(UL44)，膜蛋白UL45，間層蛋白VP11/12 (UL46)，間層蛋白VP13/14(UL47)，病毒體成熟蛋白VP16(UL48，a-TIF)，包膜蛋白UL49，dUTP 二磷酸酶UL50，間層蛋白UL51，DNA解旋酶/引物酶復(fù)合蛋白UL52，糖蛋白K (UL53)，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白IE63(ICP27，UL54)，UL55 蛋白，UL56 蛋白，病毒復(fù)制蛋白 ICP22 (IE68，USl)，US2 蛋白，絲氨酸/蘇氨酸-蛋白激酶US3，糖蛋白G (US4)，糖蛋白J (US5)，糖蛋白D (US6)，糖蛋白I (US7)，糖蛋白E(US8)，間層蛋白US9，衣殼/間層蛋白US10，Vmw21蛋白(USll)，ICP47蛋白(IE12，US12)，主要轉(zhuǎn)錄激活因子ICP4(IE175，RSI)，E3泛素連接酶ICPO (IEllO)，潛伏相關(guān)的蛋白I (LRPl)，潛伏相關(guān)的蛋白2(LRP2)，神經(jīng)毒力因子RLl (ICP34.5)，和潛伏相關(guān)的轉(zhuǎn)錄物(LAT);或 ?在結(jié)核分枝桿菌的每種情形中:ESAT-6蛋白，ESX-1蛋白，CFPlO蛋白，TB10.4蛋白，MPT63蛋白，MPT64蛋白，MPT83蛋白，MTB12蛋白，MTB8蛋白，AG85A蛋白，AG85B蛋白，Rpf-樣蛋白，KATG蛋白，PPE18蛋白，MTB32蛋白，MTB39蛋白，晶體蛋白，HSP65蛋白，PST-S蛋白，和HBHA蛋白，1kDa濾出物抗原EsxB，絲氨酸蛋白酶P印A，纖連蛋白-結(jié)合蛋白D FbpD，分泌的蛋白MPT51，周質(zhì)磷酸-結(jié)合脂蛋白PSTSl (PBP-1)，周質(zhì)磷酸-結(jié)合脂蛋白PSTS3 (PBP-3,Phos-1)，PPE家族蛋白PPE14，PPE家族蛋白PPE68，蛋白MTB72F，分子伴侶DnaK，細(xì)胞表面脂蛋白MPT83，脂蛋白P23，磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)通透酶蛋白PstA，14 kDa抗原，纖連蛋白-結(jié)合蛋白C FbpCl，丙氨酸脫氫酶TB43和谷氨酰胺合酶I。
5.權(quán)利要求1或2的藥物組合物，其中所述蛋白或肽抗原與變態(tài)反應(yīng)或變應(yīng)性疾病相關(guān)，并且來源于選自由下述組成的列表的來源:草花粉，樹花粉，花的花粉，草本花粉，粉塵螨，霉菌，動物，食物和昆蟲毒液。
6.權(quán)利要求1或2的藥物組合物，其中所述蛋白或肽抗原與自身免疫病相關(guān)，并且選自由下述組成的列表: ?在與多發(fā)性硬化(MS)相關(guān)的每種情形中:髓鞘堿蛋白(MBP)，蛋白脂蛋白(PLP)，和髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(MOG)； ?在與I型糖尿病相關(guān)的每種情形中:CD44，前胰島素原，胰島素原，胰島素，谷氨酸脫羧酶(GAD65)，酪氨酸磷酸酶-樣胰島素瘤抗原2 (IA2)，鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白((ZnT8)，和熱休克蛋白.60 (HSP60)； ?與自身免疫性葡萄膜炎相關(guān)的光感受器間類視黃醇-結(jié)合蛋白(IRBP)； ?在與重癥肌無力相關(guān)的每種情形中:乙酰膽堿受體AchR和胰島素樣生長因子-1受體(IGF-1R)； 籲來自與風(fēng)濕熱相關(guān)的β_溶血鏈球菌(streptocci)的M蛋白(假自身抗原)； ?與關(guān)節(jié)炎相關(guān)的巨噬細(xì)胞遷移抑制因子； ?在與舍格倫綜合征相關(guān)的每種情形中:Ro/La RNP復(fù)合物，α-和β-胞襯蛋白，胰島細(xì)胞自身抗原，聚(ADP)核糖聚合酶(PARP)，NuMA, N0R-90, Ro60自身抗原和p27抗原；?在與紅斑狼瘡相關(guān)的每種情形中:Ro60自身抗原，低密度脂蛋白，U-1小核核糖核蛋白復(fù)合物的Sm抗原(B/B,，Dl, D2，D3，E，F(xiàn)，G)，和RNP核糖核蛋白； ?在與動脈粥樣硬化相關(guān)的每種情形中:oxLDL，β (2)GPI，HSP60/65和oxLDL/β (2)GPI ； ?與特發(fā)性擴(kuò)張型心肌病(DCM)相關(guān)的心臟β (I) -腎上腺素能受體； ?與肌炎相關(guān)的組氨酰-tRNA合酶(HisRS)； ?與硬皮病相關(guān)的拓?fù)洚悩?gòu)酶I ;
? IL-17 ;或
熱休克蛋白。
7.權(quán)利要求1或2的藥物組合物，其中所述蛋白或肽抗原與癌癥或腫瘤疾病相關(guān)，并且選自由下述組成的列表:p53，CA125, EGFR, Her2/neu, hTERT, PAP, MAGE-Al, MAGE-A3,間皮素，MUC-1，NY-ESO-1, GP100, MART-1，酪氨酸酶，PSA, PSCA, PSMA VEGF, VEGFRl，VEGFR2,Ras，CEA 和 WTI。
8.權(quán)利要求1-7中任一項的藥物組合物，其中所述聚合載體貨物復(fù)合物用作佐劑。
9.權(quán)利要求1-8中任一項的藥物組合物，其中所述核酸分子貨物是免疫刺激性核酸。
10.權(quán)利要求1-9中任一項的藥物組合物，其中所述核酸分子貨物是RNA;優(yōu)選其中所述核酸分子貨物是免疫刺激性RNA(isRNA)。
11.權(quán)利要求ι-?ο中任一項的藥物組合物，其中包含在所述聚合載體貨物復(fù)合物中的所述聚合載體的陽離子組分與所述核酸分子貨物以0.1-20范圍內(nèi)、或0.1-5范圍內(nèi)、或.0.1-1范圍內(nèi)或0.5-0.9范圍內(nèi)的N/P比率提供。
12.權(quán)利要求1-11中任一項的藥物組合物，其中包含在所述聚合載體貨物復(fù)合物中的所述聚合載體的陽離子組分是陽離子肽。
13.權(quán)利要求12的藥物組合物，其中所述陽離子肽選自下述式(I)的肽:
(Arg)1；(Lys)m；(His)n；(Orn)0；(Xaa)x, 其中 1+m+n+o+x = 3-100,并且 .1，111，11或0 =彼此獨(dú)立地選自 .0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，.19,20,21-30,31-40,41-50,51-60,61-70,71-80,81-90 和 91-100 中的任意數(shù)字，條件是Arg, Lys, His和Orn的總含量占所述陽離子肽全部氨基酸的至少10% ;并且Xaa是選自除Arg、Lys、His或Orn之外的天然(=天然存在的)或非天然氨基酸中的任一種氨基酸；和X =選自 0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21—30，31—40，.41-50，51-60，61-70，71-80，81-90中的任意數(shù)字，條件是Xaa的總含量不超過所述陽離子肽的全部氨基酸的90%， 或所述陽離子肽選自下述分式(IIIa)的肽:
{(Arg)? ； (Lys)m ； (His)n ； (Orn)0 ； (Xaa，)x(Cys)yI
或所述陽離子肽選自下述分式(Ib)的肽:
Cys1 {(Arg)x ；(Lys)m；(His)n；(Orn)。；(Xaa) J Cys2
其中(Arg)1 ； (Lys)m ； (His)n ； (Orn)0 ；x 如上文定義;Xaa，是選自除 Arg, Lys, His, Orn或Cys之外的天然(=天然存在的)或非天然氨基酸中的任意氨基酸，并且I是選自0，I，2，.3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21—30，31—40，41—50，51—.60，61—70，71-80和81-90的任意數(shù)字，條件是Arg (精氨酸)、Lys (賴氨酸)、His (組氨酸)和Orn (鳥氨酸)的總含量占寡肽全部氨基酸的至少10%,并且其中CysJP Cys2是接近(Arg)1 ； (Lys)m ； (His)n ； (Orn)0 ； (Xaa)x 的半胱氨酸或在(Arg)1 ； (Lys)m ； (His)n ； (Orn)0 ； (Xaa)x 末端的半胱氨酸。
14.權(quán)利要求1-13中任一項的藥物組合物，其中所述聚合載體貨物復(fù)合物不包括所述蛋白或肽抗原。
15.試劑盒或部件的試劑盒，其包含: a)權(quán)利要求1、2或權(quán)利要求8-14中任一項所限定的聚合載體貨物復(fù)合物；和 b)權(quán)利要求1-7中任一項所限定的至少一種蛋白或肽抗原或其片段、變體和/或衍生物。
16.權(quán)利要求1-14中任一項的藥物組合物,或權(quán)利要求15的試劑盒或部件的試劑盒，其用作疫苗。
17.權(quán)利要求 1、2或權(quán)利要求8-14中任一項所限定的聚合載體貨物復(fù)合物，其與權(quán)利要求1-7中任一項所限定的至少一種蛋白或肽抗原或其片段、變體和/或衍生物組合用于治療。
18.權(quán)利要求1-7中任一項所限定的蛋白或肽抗原或其片段、變體和/或衍生物，其與權(quán)利要求1、2或權(quán)利要求8-14中任一項所限定的聚合載體貨物復(fù)合物組合用于治療。
19.權(quán)利要求17的聚合載體貨物復(fù)合物，其用于治療下述；或權(quán)利要求18的蛋白或肽抗原或其片段、變體和/或衍生物，其用于治療下述: ⑴傳染病； (ii)變態(tài)反應(yīng)或變應(yīng)性疾??； (iii)自身免疫??；或 (iv)癌癥或腫瘤疾病。
20.—種藥物包裝，其包括: (A)權(quán)利要求1、2或權(quán)利要求8-14中任一項所限定的聚合載體貨物復(fù)合物；和 (B)描述所述聚合載體貨物復(fù)合物與權(quán)利要求1-7中任一項所限定的至少一種蛋白或肽抗原或其片段、變體和/或衍生物組合用于治療的應(yīng)用的使用說明書。
21.一種藥物包裝，其包括: (A)權(quán)利要求1-7中任一項所限定的至少一種蛋白或肽抗原或其片段、變體和/或衍生物；和 (B)描述所述蛋白或肽抗原或其片段、變體和/或衍生物與權(quán)利要求1、2或權(quán)利要求8-14中任一項所限定的聚合載體貨物復(fù)合物組合用于治療的應(yīng)用的使用說明書。
22.權(quán)利要求20或21的藥物包裝，其中所述使用說明書還描述在下述疾病的治療中的應(yīng)用: ⑴傳染?。? (ii)變態(tài)反應(yīng)或變應(yīng)性疾??； (iii)自身免疫病；或 (iv)癌癥或腫瘤疾病。
【文檔編號】A61P35/00GK104080481SQ201380007095
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2013年1月31日 優(yōu)先權(quán)日:2012年1月31日
【發(fā)明者】帕特里克·鮑姆霍夫, 托馬斯·克蘭普斯, 索渥克·福斯, 卡爾-約瑟夫·卡倫, 馬里奧啦·福廷-姆萊澤科 申請人:庫瑞瓦格有限責(zé)任公司