用于治療流感和副流感患者的方法、化合物和組合物的制作方法
【專利摘要】一種通過向免疫功能低下患者的呼吸道施用包含治療有效量的具有唾液酸酶活性的蛋白的組合物，減少或治療該患者中的副流感或流感病毒感染的方法。
【專利說明】用于治療流感和副流感患者的方法、化合物和組合物
[0001] 背景
[0002] 人副流感病毒（PIV)是呼吸道疾病的常見原因。四種人類PIV的臨床和流行病學 特征不同。PIV-1和PIV-2感染與喉氣管支氣管炎或聲帶和上部和中部呼吸道的其他部分 周圍的腫脹相關。PIV-3通常與細支氣管炎和肺炎相關。PIV-4通常比其他類型的人p IV 導致輕的癥狀。
[0003] 流感病毒（IFV)，可導致主要影響鼻、喉、支氣管和肺部的感染。感染特征為突發(fā)性 高熱、肌肉酸痛、頭痛和嚴重不適、千咳、喉嚨痛和鼻炎。一些流感病毒很容易通過感染者咳 嗽或打噴嚏時產(chǎn)生的飛沫和小顆粒從人傳染人。大多數(shù)受感染的人一到兩周內(nèi)恢復，而無 需藥物治療。然而，在很年輕、老人和具有其他嚴重醫(yī)療狀況的那些人中，感染可導致潛在 狀況的嚴重并發(fā)癥、肺炎和死亡。此外，流感病毒的某些菌株和類型可甚至在健康的成年人 中導致嚴重的疾病。
[0004] 千粉吸入器通常被用于施用藥物至呼吸道，例如，肺部。然而，對于一些患者，例 如，兒童，特別是5歲以下的兒童，老人，免疫功能低下的患者，以及重度患者，干粉吸入器 可以是難以有效地使用。
[0005] 附圖
[0006] 圖1是一組描繪了病毒的生長和培養(yǎng)的照片。將LLCMK-2細胞在感染前24小時 播種，并且然后以〇· 〇2mL或0· 2mL的病毒培養(yǎng)物陽性樣本接種。細胞在感染之前是僅亞匯 合的。接種后3和5天記錄感染進展。接種后3天可檢測到細胞死亡和CPE，且接種5天后 具有顯著進展。〇.〇2mL和0.2mL兩者的初始接種物足以引發(fā)感染。NV=非病毒。PI二感 染后。
[0007] 圖2是描繪DFA分析的結(jié)果的照片組。細胞在蓋玻片上生長，以TFID50感染，然 后感染后固定72小時。在固定后，使用Light Diagnostics PIV3DFA法染色細胞。熒光在 顯微鏡下使用對染色特異性的通道可視化，并使用ProgRes CapturePro軟件（Jenoptik) 拍攝照片。
[0008] 圖3是描繪了使用DFA試劑的代表性噬斑的照片組。噬斑測定法在24孔板中進 行，且然后使用DFA試劑如材料和方法中描述的染色。顯示了來自每個稀釋度的代表噬斑， 且將從計數(shù)孔中的所有噬斑獲得的最終滴度顯示在圖像的右側(cè)。為了獲得滴度，將可計數(shù) 孔取平均值并乘以稀釋度。將噬斑表示為綠色，而將細胞核表示為藍色。TNTC=不計其數(shù)。 PI =感染后。
[0009] 圖4是描繪了使用DFA試劑的代表性噬斑的照片組。噬斑測定法在24孔板中進 行，且然后使用DFA試劑如材料和方法中描述的染色。顯示了來自每個稀釋度的代表噬斑， 且將從計數(shù)孔中的所有噬斑獲得的最終滴度顯示在圖像的右側(cè)。為了獲得滴度，將可計數(shù) 孔取平均值并乘以稀釋度。將噬斑表示為綠色，而將細胞核表示為藍色。TNTC=不計其數(shù)。 PI =感染后。
[0010] 圖5是描繪第6天和第7天時標準噬斑減少測定的一對圖。噬斑減少測定在6孔板 中用漸增濃度的DAS181進行，并且在感染后6天或7天固定，此時噬斑可被可視化。DAS181 在整個試驗中保持在覆蓋層中。計數(shù)噬斑，并作圖，以確定EC50值。
[0011] 圖6是使用熒光分析描繪代表性噬斑形成的一組照片。感染后48小時，將細胞固 定并用PIV3DFA試劑可視化噬斑形成。將噬斑表示為綠色，而將細胞核表示為藍色。
[0012] 圖7是描繪以一式三份進行的噬斑減少測定的圖，且確定每個測定的EC50值。使 用這些值建立約4nM的平均EC50值。
[0013] 圖8是一組描繪了抑制TCID50的照片。將LLCMK-2細胞在感染前24小時播種， 并然后用已知的TCID50感染。感染后兩小時，將板用0.05%戊二醛固定，且然后用aPIV 抗體染色。暗斑塊表示病毒的傳播。
[0014] 圖9是一組描繪病毒傳播分析的照片。以0. 1的Μ0Ι感染細胞，且然后測定感染 后24、48和72小時用或不用DAS181處理（ΙΟηΜ)的病毒傳播。將細胞固定并然后用PIV3 特異DFA試劑染色且在顯微鏡下可視化。PIV3感染的存在以綠色來表示，而細胞核以藍色 來表示。
[0015] 圖10是描繪用10nM DAS181處理的病毒釋放的圖。感染（Μ0Ι = 0. 1)后，用ΙΟηΜ DAS1S1處理細胞（或模擬處理），并然后通過噬斑測定法測量從細胞釋放的感染病毒。將 組織培養(yǎng)上清液（有和沒有DAS181)在第1天、第2天和第3天進行測試，以及將滴度對時 間作圖。
[0016] 圖11是描繪第6天PIV3病毒釋放研究的圖。以低Μ0Ι (0. 01)感染細胞，并然后 用ΙΟηΜ DAS181處理或模擬處理。病毒釋放通過采集組織培養(yǎng)上清液來測量且傳染性病毒 通過噬斑測定來測定。
[0017] 圖12是一組描繪患者樣品的最初接種的照片。從EIND患者采集的懷疑包含PIV3 的樣品被用于接種LLCMK2細胞。監(jiān)測培養(yǎng)物的CPE和病毒感染的證據(jù)。在感染后第5天， 用0· 2mL患者樣品接種的孔展示基本上CPE和細胞死亡，指示病毒感染。從這些孔中收集病 毒用于進一步擴增。PIV3的存在由DFA測定來證實（圖13)。NV對照顯示無 PIV3抗原的 陽性染色，而受感染的PIV3樣品顯示，視野內(nèi)的所有細胞均是PIV3陽性的（以綠色表示）。 細胞核以藍色來表示。
[0018] 圖13是描繪鑒定病毒類型的照片組。測試接種的病毒培養(yǎng)物中呼吸道病毒的存 在，且具體地由DFA分析PIV 3的存在。將感染的細胞布點在載玻片上并用適當?shù)目贵w（識 別一組呼吸道病毒或?qū)IV3特異性的）染色。熒光在顯微鏡下使用對染色特異性的通道 可視化，并使用PROGRES CapturePro軟件（Jenoptik)拍攝照片。
[0019] 圖14是描繪使用DFA試劑的代表性噬斑的照片組。噬斑測定法在24孔板中進 行，且然后使用DFA試劑如材料和方法中描述的染色。顯示了來自一個稀釋度的代表性噬 斑，證明在48小時時病毒噬斑的迅速傳播。為了獲得滴度，將可計數(shù)孔取平均值并乘以稀 釋度。噬斑以綠色來表示，而視野中的所有細胞以藍色來表示。
[0020] 圖I5是描繪噬斑減少測定法（PRA)的圖。以一式三份進行噬斑減少測定，且對每 個測定確定EC50值。使用這些值建立?28nM的平均EC50值。
[0021] 圖16是一組描繪抑制TCID50的照片。將LLCMK-2細胞在感染前24小時播種，并 然后用已知的TCID50感染。感染后2小時，洗滌板以除去殘留的病毒，并然后用含連續(xù)稀釋 的045181的瓊脂糖/介質(zhì)覆蓋。感染后3天，將板用〇.〇5%戊二醛固定，且然后用 &?1乂3 抗體染色。綠色熒光指示病毒穿過單層的傳播，而所有的細胞通過藍色染色來指示。
[0022] 圖17是描繪3天PIV3病毒釋放研究的圖。以低Μ01(0·〇1)感染細胞，并然后用 100nM DAS181處理或模擬處理。病毒釋放通過采集組織培養(yǎng)上清液來測量且傳染性病毒通 過暖斑測定來測定。
[0023] 圖18是描繪病毒載量減少的圖（給藥天數(shù)以紅色指示）。
[0024] 圖19是描繪病毒載量的變化的圖。
[0025] 圖20是描繪作為處理日期的函數(shù)的病毒載量變化的圖。
[0026] 圖21是一組描繪潑尼松和他克莫司處理、施氧和PIV3載量的圖。
[0027] 概述
[0028] 本文描述了使用具有唾液酸酶活性的蛋白例如融合蛋白（例如，DAS1S1)的液體 (例如，霧化的）制劑治療患者的方法和制劑。方法和制劑可被用于治療 PIV或流感病毒 (IFV)感染的患者。本文還描述了，使用具有唾液酸酶活性的蛋白例如融合蛋白（例如， DAS181)治療免疫功能低下患者中PIV感染的方法。此類免疫功能低下可用干制劑或液體 (例如，霧化的）制劑進行治療。
[0029] 具有唾液酸酶活性的有用的蛋白包括DAS181，DAS181是由與將唾液酸酶錨定至 呼吸道上皮的雙調(diào)蛋白糖胺聚糖結(jié)合序列融合的唾液酸酶功能域組成的46-kDa重組融合 蛋白。通過從宿主細胞表面裂解唾液酸（SA)，DAS181滅活由PIV和IFV兩者識別的宿主細 胞受體，并由此潛在地使宿主細胞抗PIV和IFV感染。
[0030] 本文描述了用于治療患者中PIV或IFV感染的方法，方法包括：向患者的呼吸道 施用包含治療有效量的包含具有唾液酸酶活性的蛋白的液體組合物（例如，霧化的組合 物）的組合物。本文還描述了用于治療處于PIV或IFV感染風險中的受試者的方法，方 法包括：向受試者的呼吸道施用包含包含具有唾液酸酶活性的蛋白的液體組合物（例如， 霧化的組合物）或干粉制劑的組合物（例如治療有效量的組合物）。在各種情況：患者是 免疫功能低下的患者；患者患有原發(fā)性免疫缺陷；免疫功能低下的患者患有繼發(fā)性免疫缺 陷；免疫功能低下的患者正在或已經(jīng)用免疫抑制療法治療；免疫功能低下的患者正在或已 經(jīng)用化療藥物治療；免疫功能低下的患者是移植患者；蛋白包含或由與SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:2至少90% (95%、98%)同一或完全同一的氨基酸序列組成；蛋白質(zhì)是DAS181; 組合物還包含一種或更多種另外的化合物；施用是通過使用干粉吸入器；施用是通過使用 鼻腔噴霧器（nasal spray);施用是通過使用霧化器（nebulizer);施用是通過使用氣管 內(nèi)插管（ET管），和干粉吸入器；蛋白包含唾液酸酶或其活性部分。在一些情況下：唾液酸 酶或其活性部分包含與以下至少90%、95%、98%、99%或100%同一的氨基酸序列：粘性 放線菌（Actinomyces viscosus)唾液酸酶或其催化結(jié)構域，產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens)唾液酸酶或其催化結(jié)構域，產(chǎn)脲節(jié)桿菌（Arthrobacter ureafaciens)唾液 酸酶或其催化結(jié)構域，綠色小單孢菌（Micromonospora viridifaciens)唾液酸酶或其催化 結(jié)構域，人Neu2唾液酸酶或其催化結(jié)構域，或人Neu4唾液酸酶或其催化結(jié)構域；以及在其 他情況下，唾液酸酶或其活性部分與粘性放線菌唾液酸酶或其催化結(jié)構域至少90%同一。 在一些情況下：肽包含錨定結(jié)構域，其中錨定結(jié)構域是糖胺聚糖（GAG)結(jié)合域（例如，GAG 結(jié)合結(jié)構域與以下至少9〇 %、％ %、明％、99 %或100 %同一：人血小板第4因子的GAG結(jié)合 結(jié)構域、人白細胞介素8的GAG結(jié)合結(jié)構域、人抗凝血酶III的GAG結(jié)合結(jié)構域、人類載脂蛋 白E的GAG結(jié)合結(jié)構域、人血管相關遷移蛋白的GAG結(jié)合結(jié)構域、或人雙調(diào)蛋白的GAG結(jié)合 結(jié)構域）。
[0031] 在某些情況下，患者具有的肺功能不足以有效地使用干粉吸入器或完全不能使用 千粉吸入器，例如依賴機械通風設備的患者。在一些情況下，患者是感染了 PIV的免疫功能 低下的患者并用液體制劑治療（例如，使用霧化器）或用干燥制劑治療（例如，使用千粉吸 入器）。
[0032] 在一些情況下，免疫功能低下的患者可以包括患有以下的患者：惡性腫瘤、白血 病、膠原血管疾病、先天性或獲得性免疫缺陷，包括AIDS、接受免疫抑制治療的器官移植接 受者、以及接受免疫抑制治療的其他患者。
[0033] 本發(fā)明的其他特征和優(yōu)勢從以下詳細說明書和附圖、以及權利要求書將是明顯 的。
[0034] 詳述
[0035] 以下描述顯示，DAS181，具有唾液酸酶活性的融合蛋白有效對抗PIV和PIV感染 患者中的臨床分離株的研究。具有唾液酸酶活性的各種蛋白描述于美國專利號8, 084, 036 中；且DAS181描述于美國專利號7, 807, 174中，其兩者通過引用以其整體并入本文。
[0036] DAS181是包括唾液酸酶的催化結(jié)構域、和錨定域的融合蛋白。在一些情況下，分離 的DAS181具有氨基末端甲硫氨酸（Met)且在一些情況下其沒有。本文中，術語DAS181是 指本文以SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2提供的序列的任一形式或兩種形式的混合物。本文 描述的數(shù)個實例使用DAS181或包含DAS181的組合物。
[0037] DAS181和具有唾液酸酶活性的其他蛋白，例如在美國專利號8, 084, 036或美國專 利號7, 807, 174中描述的蛋白可被包括在以液體制劑或干制劑被遞送至呼吸道的藥物組 合物中。
[0038] 本文描述的蛋白可配制成包含各種賦形劑的藥物組合物。在一些情況下，制劑可 包括提供另外的有益效應的另外的活性成分。
[0039] 本發(fā)明包括使用包含至少一種唾液酸酶活性的治療化合物和組合物的方法。與 SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:2至少90%、95%、98%、或99%同一的蛋白是可用的那些蛋白 中的。在一些情況下，不同于SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:2中那些氨基酸的氨基酸是保守 性取代。保守性取代可定義為以下五組之一中的交換：
[0040] I.小的、脂肪族、非極性或弱極性殘基：Ala、Ser、Thr、Pro、Gly
[0041] II.極性的、帶負電荷的殘基和其酰胺：Asp、Asn、Glu、Gln
[0042] III.極性、帶正電荷的殘基：His、Arg、Lys
[0043] IV.大的、脂肪族非極性殘基：Met、Leu、lie、Val、Cys
[0044] V.大的芳香族殘基：Phe、Try、Trp
[0045] 在上述各組中，以下取代被認為是"高度保守的":Asp/Glu、His/Arg/Lys、Phe/ Tyr/Trp、和Met/Leu/Ile/Val。半保守取代定義為以上組（I )_(IV)的兩個之間的交換， 其限于包含以上（I)、（II)和（III)的大組（A),或包含以上（IV)和（V)的大組（B)。另 夕卜，當本申請中指定疏水性氨基酸時，其是指氨基酸Ala、Gly、Pro、Met、Leu、11 e、Val、Cys、 Phe、和 Trp，而親水性氨基酸是指 Ser、Thr、Asp、Asn、Glu、Gln、His、Arg、Lys、和 Tyr。
[0046] 通過霧化器施用的劑型除活性成分外通常包含大量的水。還可存在少量的其他 成分諸如pH調(diào)節(jié)劑、乳化劑或分散劑、防腐劑、表面活性劑、或緩沖劑和其他穩(wěn)定劑和增溶 劑。
[0047] 鼻腔制劑可作為滴劑、噴霧劑、氣霧劑或任何其他鼻內(nèi)劑型施用。任選地，遞送系 統(tǒng)可以是單位劑量遞送系統(tǒng)。每劑量遞送的溶液或懸浮液的體積可為從約5至約2000微 升，從約10至約1000微升，或從約50至約500微升的任何體積。用于這些不同劑型的遞 送系統(tǒng)可以是以單位劑量或多劑量包裝的滴瓶、塑料擠壓裝置、原子化器（atomizer)，霧化 器或藥物氣霧劑。
[0048] 本發(fā)明的液體制劑可以包括以下而被改變：⑴其他酸和堿以調(diào)節(jié)pH值；（2)其 他張力賦予劑諸如山梨糖醇、甘油和右旋糖；(3)其他抗微生物防腐劑，諸如其他對羥基苯 甲酸酯類、山梨酸酯、苯甲酸酯，丙酸酯、氯丁醇、苯乙醇、苯扎氯銨、和汞制劑；(4)其他粘 度賦予劑諸如羧甲基纖維素鈉、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇和其他的膠；（5) 合適的吸收促進劑；(6)穩(wěn)定劑，諸如抗氧化劑，諸如亞硫酸氫鹽和抗壞血酸鹽、金屬螯合 劑諸如依地酸鈉和藥物溶解度增強劑諸如聚乙二醇；和（7)其他劑諸如氨基酸。
[0049] 本發(fā)明的一個實施方案包括以各種劑量水平，諸如在約.Olmg至約lOOmg之間的 DAS181 (或具有唾液酸酶活性的另一種多肽）的劑量水平的液體藥物組合物。這樣的劑量 水平的實例可包括約.05mg、· 〇6mg、0. lmg、0. 5mg、lmg、5mg、10mg、20mg、50mg 或 lOOmg/ 天 的劑量水平。前述劑量可每天施用一次或更多次，持續(xù)一天、二天、三天、四天、五天、六天、 七天、八天、九天，十天、十一天、十二天、十三天、或十四天或更多天。還可施用更高劑量或 更低劑量。通常，劑量可在約lng/kg和約10mg/kg之間、在約10ng/kg和約lmg/kg之間、 以及在約l〇〇ng/kg和約100微克/kg之間。在本文描述的各種實例中，用本文描述的各種 劑量的組合物處理小鼠，所述劑量包括0. 0008mg/kg、0. 004mg/kg、0. 02mg/kg、0. 06mg/kg、 0· lmg/kg、0_ 3mg/kg、0. 6mg/kg、l· 〇gm/kg、2_ 0mg/kg、3_ 0mg/kg、4_ Omg/kg 和 5. Omg/kg 的劑 旦 -?. ο
[0050] "唾液酸酶"是可從底物分子除去唾液酸殘基的酶。唾液酸酶（Ν-乙酰神經(jīng)氨酰 糖基水解酶，EC3· 2. 1· I8)是一組從唾液酸-糖綴合物（sialo-glycoconjugates)中水 解除去唾液酸殘基的酶。唾液酸是具有9碳骨架的α-酮酸，其常見于附著于糖蛋白和 糖脂的寡糖鏈的最外位置。一個主要類型的唾液酸是為大多數(shù)其他類型的生物合成前體 的Ν-乙酰神經(jīng)氨酸（NeuMc)。底物分子可以是，作為非限定性實例，寡糖、多糖、糖蛋白、 神經(jīng)節(jié)苷脂或合成的分子。例如，唾液酸酶可裂解在唾液酸殘基和底物分子剩余部分之間 具有a (2,3)-Gal、a (2,6)-Gal或者a (2,8)_Gal連接的鍵。唾液酸酶還可裂解在唾液 酸殘基和底物分子剩余部分之間的任何的或者所有的連接。在自然界中發(fā)現(xiàn)了在Neu5Ac 與碳水化合物側(cè)鏈的倒數(shù)第二個半乳糖殘基之間兩種主要的連接，Neu5ACa (2,3)_Gal和 Neu5Ac α (2, 6) -Gal。Neu5Ac α (2, 3) -Gal 和 Neu5Ac α (2, 6) -Gal 兩者分子都可被流感病毒 識別為受體，雖然人類病毒表現(xiàn)為偏好NeuSAca (2,6)Gal，而禽類和馬科的病毒主要識別 Neu5Aca (2,3)-Gal。唾液酸酶可以是天然存在的唾液酸酶、工程化唾液酸酶（諸如，但不 限于，其氨基酸序列基于天然存在的唾液酸酶的序列，包括與天然存在的唾液酸酶序列是 實質(zhì)上同源的序列的唾液酸酶）。如本文所用的，"唾液酸酶"還可意指天然存在的唾液酸 酶的活性部分，或包含基于天然存在的唾液酸酶活性部分的序列的肽或蛋白。
[0051] "融合蛋白"是包含來自至少兩個不同來源的氨基酸序列的蛋白。融合蛋白可包括 源自天然存在的蛋白或與自天然存在的蛋白的全部或部分基本上同源的氨基酸序列，并且 另外可包括，從一至很大數(shù)目的源自天然存在的蛋白或與天然存在的蛋白的全部或部分基 本上同源的氨基酸?？商娲?，融合蛋白可包括源自天然存在的蛋白或與自天然存在的蛋 白的全部或部分基本上同源的氨基酸序列，并且另外可包括，從-至很大數(shù)目的為合成序 列的氨基酸。 j
[0052] "唾液酸酶催化結(jié)構域蛋白"是包括唾液酸酶的催化結(jié)構域，或與唾液酸酶的催化 結(jié)構域基本上同源的氨基酸序列的蛋白，但不包括催化結(jié)構域所源自的唾液酸酶的全部氨 基酸序列，其中唾液酸酶催化域蛋白保留與催化結(jié)構域所源自的完整唾液酸酶基本上相同 的活性。唾液酸酶催化結(jié)構域蛋白可包括不源自唾液酸酶的氨基酸序列，但這不是必須的。 唾液酸酶催化結(jié)構域蛋白可包含源自一種或更多種其他己知的蛋白的氨基酸序列或與一 種或更多種其他已知的蛋白的氨基酸序列基本上同源的氨基酸序列，或可包含非源自其他 已知的蛋白的氨基酸序列或與其他已知的蛋白的氨基酸序列基本上同源的一種或更多種 氨基酸。
[0053] "治療有效量"意指，當向受試者以單一劑型施用組合物或化合物時，期望的治療、 預防、或其他生物效應或響應所需的組合物或化合物的量。根據(jù)條件諸如組合物或化合物 的性質(zhì)、被治療的狀況的性質(zhì)、受試者的年齡和尺寸，組合物或化合物的特定量將有很大的 不同。
[0054] "治療"意指改善或以其他方式有益地改變病癥、疾患或疾病的一個或更多個癥狀 的任何方式。治療還涵蓋本文的組合物或化合物的任何藥物用途，諸如用于減少呼吸道中 的粘液。
[0055] "呼吸道"意指從鼻子到肺泡的空氣通道，包括鼻、咽喉、咽、喉、氣管、支氣管，并且 其還包括肺部，并有時被醫(yī)師稱為呼吸系統(tǒng)。
[0056] "吸入器"意指用于以通過鼻子或嘴被吸入（自然或機械地推動入肺中）的噴霧或 千粉的形式給予藥劑的裝置，并且包括但不限于，被動或主動通風器（帶有或不帶有氣管 內(nèi)插管的機械）、霧化器、干粉吸入器、定量吸入器、和加壓定量吸入器。
[0057] "吸入劑"是通過鼻子或嘴吸入的任何物質(zhì)。
[0058] 如本文所用的"賦形劑"意指單獨或組合被用作藥劑的活性成分的載體的一種或 更多種無活性物質(zhì)或化合物。如本文所使用的"賦形劑"還可指被包含在藥物組合物中以 改進其有益效果或與活性成分具有協(xié)同作用的一種或更多種物質(zhì)或化合物。 實施例
[0059] 實施例1-臨床分離秩
[0060] 以下描述了體外研究，顯示DAS181可抑制PIV的臨床分離株。研究是有意義的， 因為PIV的臨床分離株比PIV的實驗室菌株更接近類似感染患者的PIV。對這種病毒建立 的5〇% (EC5〇)抑制病毒復制需要的有效濃度為?4nM DAS181。
[0061] 病毒生長分析還顯示，沒有DAS181時，無論以0· 01或0. 1的Μ0Ι感染，病毒進展 迅速$過細胞培養(yǎng)物單層。在這兩種情況下，沒有用DAS181處理時，在感染后第3天，觀察 到顯著細胞病變效應（CPE)和細胞死亡。然而，在l〇nM的DAS181的存在下，細胞層在整個 感染的過程中保持完整，并通過噬斑法測量的病毒的釋放顯著減少?？傊@些數(shù)據(jù)指示， DAS181有效對抗PIV3的這一臨床分離株，并且保護不受病毒誘導的細胞毒性和細胞死亡。
[0062] 研究設計和結(jié)果
[0063] 將在千冰上收集的標本保存于-8(TC，直到分析。當準備進行分析時，將樣品使用 LLC-MK2細胞進行病毒測試，并評估病毒感染（病毒類型和毒株）。當確認感染時，將病毒 傳代2次，直到病毒儲備的擴增是足夠的。建立了病毒的生長特性和DAS181的有效抑制劑 量的表征。
[0064]
【權利要求】
1. 一種治療患者的方法，所述方法包括向所述患者的呼吸道施用包含治療有效量的具 有唾液酸酶活性的多肽的液體組合物。
2. 如權利要求1所述的方法，其中所述患者感染了流感病毒或副流感病毒。
3. 如權利要求1所述的方法，其中所述患者患有減少的呼吸功能。
4. 如權利要求1所述的方法，其中所述液體組合物為水性組合物。
5. 如權利要求1所述的方法，其中所述患者的呼吸功能不適于使用千粉吸入器。
6. 如權利要求1所述的方法，其中所述液體使用霧化器、蒸發(fā)器、氣管內(nèi)插管、鼻腔噴 霧器、加壓定量吸入器或呼吸啟動的加壓定量吸入器來施用。
7. 如權利要求1所述的方法，其中所述液體組合物中的多肽的濃度為〇. 1-10. 〇mg/mL。
8. 如權利要求6所述的方法，其中所述液體組合物中的多肽的濃度在〇.5nig/mL和 2· Omg/mL 之間。
9. 如權利要求1所述的方法，其中所述多肽與SEQ ID NO: 1至少90%同一。
10. 如權利要求1所述的方法，其中所述蛋白包括SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:2。
11. 如權利要求1所述的方法，其中向所述患者施用〇· 001_5mg/kg的所述多肽/齊幢。
12. 如權利要求1所述的方法，其中在30天或更少時間內(nèi)向所述患者施用 〇· lmg-100mg的所述肽。
13. 如權利要求11所述的方法，其中所述施用為每日的，持續(xù)1-3〇天。
14. 如權利要求1所述的方法，其中一天施用〇· 1呢_1〇呢多肽。
15. 如權利要求1所述的方法，其中一天施用〇· 1呢_1〇呢多肽的有效劑量。
16. 如權利要求1所述的方法，其中所述施用包括施用具有微米的MMAD的液體組 合物的氣霧劑顆粒。
17. 如權利要求1所述的方法，其中所述患者需要呼吸輔助。
18. 如權利要求17所述的方法，其中所述患者被插管。
19. 一種減少或治療免疫功能低下患者中的副流感或流感病毒感染的方法，所述方法 包括向所述患者的呼吸道施用包含治療有效量的具有唾液酸酶活性的蛋白的組合物。
20. -種治療處在感染副流感或流感病毒的風險中的免疫功能低下患者的方法，所述 方法包括向所述患者的呼吸道施用治療有效量的具有唾液酸酶活性的蛋白。
21. 如權利要求19或權利要求20所述的方法，其中所述免疫功能低下患者患有原發(fā)性 免疫缺陷。
22. 如權利要求19或權利要求20所述的方法，其中所述免疫功能低下患者患有繼發(fā)性 免疫缺陷。
23. 如權利要求19或權利要求20所述的方法，其中所述免疫功能低下患者正在或已經(jīng) 用免疫抑制療法來治療。
24. 如權利要求19或權利要求20所述的方法，其中所述免疫功能低下患者正在或已經(jīng) 用化學治療劑來治療。
25. 如權利要求23所述的方法,其中所述免疫功能低下患者是移植患者。
26. 如權利要求1或權利要求2所述的方法，其中所述蛋白與SEQ ID NO: 1至少90% 同一。
27. 如權利要求19或權利要求2〇所述的方法，其中所述蛋白包括SEQ ID N0:l或SEQ ID NO:2。
28. 如權利要求19或權利要求20所述的方法，其中所述組合物包含一種或更多種另外 的化合物。
29. 如權利要求19-28所述的方法，其中所述施用為通過使用鼻噴霧器。
30. 如權利要求19-28所述的方法，其中所述施用為通過使用吸入器。
31. 如權利要求19或權利要求20所述的方法，其中所述蛋白包含唾液酸酶或其活性部 分。
32. 如權利要求31所述的方法，其中所述唾液酸酶或其活性部分包含與以下至少 90%同一的氨基酸序列：產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens)唾液酸酶或其催 化結(jié)構域、粘性放線菌（Actinomyces viscosus)唾液酸酶或其催化結(jié)構域、產(chǎn)脲節(jié)桿菌 (Arthrobacter ureafaciens)唾液酸酶或其催化結(jié)構域、綠色小單抱菌（Micromonospora viridifaciens)唾液酸酶或其催化結(jié)構域、人Neu2唾液酸酶或其催化結(jié)構域、或人Neu4唾 液酸酶或其催化結(jié)構域。
33. 如權利要求32所述的方法，其中所述唾液酸酶或其活性部分與粘性放線菌唾液酸 酶或其催化結(jié)構域至少90%同一。
34. 如權利要求31所述的方法，其中所述肽包含錨定域，其中所述錨定域是糖胺聚糖 (GAG)結(jié)合結(jié)構域。
35. 如權利要求34所述的方法，其中所述GAG結(jié)合結(jié)構域包含與以下至少9〇%同一的 氨基酸序列：人血小板第4因子的GAG結(jié)合結(jié)構域、人白細胞介素 8的GAG結(jié)合結(jié)構域、人 抗凝血酶III的GAG結(jié)合結(jié)構域、人類載脂蛋白E的GAG結(jié)合結(jié)構域、人血管相關遷移蛋白的 GAG結(jié)構結(jié)合域、或人雙調(diào)蛋白的GAG結(jié)合結(jié)構域。
36. 如權利要求19-28所述的方法，其中所述施用為通過霧化器、蒸發(fā)器、氣管內(nèi)插管、 鼻腔噴霧器、干粉吸入器、加壓定量吸入器或呼吸啟動的加壓定量吸入器。
37. 如權利要求19或權利要求20所述的方法，其中所述組合物是液體形式。
38. 如權利要求19或權利要求20所述的方法，其中所述組合物是干粉形式。
39. -種用于減少患有PIV感染的患者中的PIV的病毒載量的方法，所述方法包括向所 述患者施用包含DAS181的組合物。
40. 如權利要求39所述的方法，其中向所述患者的呼吸道施用所述組合物。
41. 如權利要求40所述的方法，其中使用霧化器或干粉吸入器施用所述組合物。
42. 如權利要求39所述的方法，其中所述患者為免疫功能低下的。
43. -種用于改善患有PIV感染的患者中的肺功能的方法，所述方法包括向所述患者 施用包含DAS181的組合物。
44. 如權利要求43所述的方法，其中向所述患者的呼吸道施用所述組合物。
45. 如權利要求44所述的方法，其中使用霧化器或千粉吸入器施用所述組合物。
46. 如權利要求43所述的方法，其中所述患者為免疫功能低下的。
【文檔編號】A61K31/16GK104203267SQ201380009763
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2013年2月19日 優(yōu)先權日:2012年2月17日
【發(fā)明者】朗·莫斯, 李鐵軍 申請人:安迅生物制藥公司