結(jié)合人補體c5的多肽的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及C5結(jié)合多肽，其包括C5結(jié)合基序，BM，所述基序由選自以下的氨基酸序列構(gòu)成：i)EX2X3X4A?X6X7EID?X11LPNL?X16X17X18QW?X21AFIX25X26LX28D，和ii)與i)中定義的序列具有至少86％同一性的氨基酸序列，其中多肽結(jié)合C5。本發(fā)明還涉及C5結(jié)合多肽，用于在治療中使用，例如用于在C5相關(guān)的狀況的治療中使用，以及涉及治療的方法。
【專利說明】結(jié)合人補體C5的多肽
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本公開內(nèi)容涉及結(jié)合人補體組分5(C5)的多肽，并涉及此類多肽在治療中的用 途。
[0002] 背景
[0003] 補體蛋白質(zhì)C5是補體系統(tǒng)的核心組分，所述補體系統(tǒng)是先天免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵部 分。補體系統(tǒng)是復雜的免疫生存系統(tǒng)（immune survival system),具有處于嚴格控制的、 多樣化的過程的許多任務。其功能之一是通過從細胞碎片以及凋亡和壞死細胞中識別健康 的宿主組織，作為對抗由其它生物體感染的第一道宿主防線（first line host defense)。 此外，其參與免疫復合物的清除、適應性免疫應答的調(diào)節(jié)、組織再生的促進、血管生成、干細 胞的動員和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育（Woodruff等人Mol Immunol2011, 48 (14) :1631-1642); Ricklin等人Nat Immunol2010, 11(9) :785-795)。干擾補體激活和調(diào)節(jié)的微妙平衡的任何 觸發(fā)，例如錯誤的或不受限制的激活或非足夠的調(diào)節(jié)可導致病理狀況，包括導致廣泛的組 織損傷的宿主細胞的自我攻擊。
[0004] 補體系統(tǒng)由約30種蛋白質(zhì)組成。存在三種途徑啟動補體免疫；使用Clq識別細胞 表面的免疫復合物的經(jīng)典途徑、當甘露糖結(jié)合凝集素（MBL)識別某些糖時啟動的凝集素途 徑、以及通過補體因子3(C3)的水解自發(fā)啟動的旁路途徑，所述補體因子3(C3)的水解是一 種被不在侵入病原體上存在的某些哺乳類細胞表面分子抑制的過程。旁路途徑還可作為補 體系統(tǒng)的放大回路（amplification loop)。所有三種途徑在C3水平匯合（converge)。將 C3裂解為C3a和C3b導致轉(zhuǎn)化酶的形成，其進而將補體因子5 (C5)裂解為C5a和C5b。C5a 是各種免疫細胞的非常有效的引誘劑（attractant)，而C5b與C6-9寡聚以形成稱為膜攻 擊復合物（MAC)或有時稱為末端補體復合物（TCC)的孔。補體系統(tǒng)的激活引起一些具有中 和病原體的目的的機制：細胞諸如入侵的細菌表面MAC的形成導致裂解；C3和C4裂解產(chǎn)物 C3b和C4b的積累（deposition)輔助調(diào)理作用（opsonization),導致病原體通過巨噬細胞 的吞噬作用；以及過敏毒素諸如C3a和C5a引誘單核細胞和嗜中性粒細胞至激活位點，上調(diào) 表面標志物，導致增加的免疫敏感性及細胞因子的釋放。
[0005] C5是190-kDa的糖蛋白，包括2個二硫鍵連接的多肽鏈α和β，分子量分 別為 115kDa 和 75kDa(Tack 等人 Biocheml979, 18:1490-1497)。Haviland 等人（J Immunl991, 146:362-368)構(gòu)建了人補體前-C5(pr〇-C5)的完整cDNA序列，其被預測編碼 1,676個氨基酸的前分子（pro-molecule),所述前分子包含分隔β和α鏈的18個氨基酸 的前導肽和4個氨基酸的接頭。C5裂解為C5a和C5b的阻斷阻止MAC的形成和促炎性C5a 的形成，但保持上游補體效應系統(tǒng)完整，允許C3/C4介導的調(diào)理作用。
[0006] 補體系統(tǒng)在針對病原體的防御中的關(guān)鍵作用通常使其成為藥學干預的感興趣的 靶。這通過補體的許多突變或受損的調(diào)節(jié)參與各種疾病和狀況的事實被強調(diào)。這些包括 對自身免疫性疾病例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE)的增加的易感性，其中免疫復合物的積累觸 發(fā)了經(jīng)典途徑（Manderson 等人 Annu Rev Immunol2004, 22:431-456)。此外，補體蛋白質(zhì) C1-C5的突變往往導致SLE或SLE樣癥狀。具有補體系統(tǒng)強烈參與的其它自身免疫性疾病 是類風濕關(guān)節(jié)炎（RA)，其中免疫復合物可激活RA關(guān)節(jié)中的補體；干燥綜合征、皮肌炎及其 它自身抗體驅(qū)動的疾病諸如格林-巴利綜合征（Guillain_Barr6 syndrome, GBS)、Fisher 綜合征（Kaida等人J.Neuroimmun2010, 223:5-12)不同類型的血管炎、系統(tǒng)性硬化癥、抗腎 小球基底膜（抗GBM)和抗磷脂綜合征（APS) (Chen等人J Autoimmun2010, 34:J276-J286)。
[0007] 補體系統(tǒng)還參與神經(jīng)退行性紊亂諸如阿爾茨海默氏病（AD)，其中Αβ斑塊直接激 活補體系統(tǒng)，導致C5a介導的小神經(jīng)膠質(zhì)細胞的募集。這在當C5aR拮抗劑在AD小鼠模型 中被證明是神經(jīng)保護的時被進一步證實（Fonseca等人J Immunol2009, 183:1375-1383)。 針對乙酰膽堿受體的自身抗體和隨后的補體激活是重癥肌無力的最常見原因，重癥 肌無力是一種影響神經(jīng)肌肉接頭的疾病（Toyka和Gold, Schweizer Archive Neurol Psych2007, 158:309-321)。MAC的形成涉及多發(fā)性硬化（MS)的病理生理學（Oh等 人Immunol Res2008, 40:224-234)。此外，在帕金森氏病、亨廷頓氏病和朊病毒病諸 如Creutzfeld-Jacob病中，補體激活是病理學的一部分（Bonifati和Kishore, Mol Immunol2007, 44:999-1010)。在創(chuàng)傷愈合中，炎性反應是恢復組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵組分，且補 體系統(tǒng)參與損傷組織的早期識別。然而，在例如慢性創(chuàng)傷和嚴重燒傷模型中，補體通過例 如C1抑制劑的抑制導致改善的愈合和減少的組織損傷，顯示補體。此外，各種補體缺陷，諸 如由C4敲除小鼠示例的，被發(fā)現(xiàn)保護免受由創(chuàng)傷引起的長期組織損傷（綜述于Cazender 等人Clinical and Developmental Immunology2012中，在線出版）。最近已顯示，腫瘤 的生長和增殖通過補體激活特別是通過C5a被促進，且C5a受體的阻斷減慢該過程。此 夕卜，相比野生型同窩小鼠，缺乏C3的小鼠顯示顯著較慢的腫瘤生長（Markiewski等人Nat Immunol2008, 9:1225-1235)。
[0008] 功能失調(diào)性補體調(diào)節(jié)是若干罕見至超罕見狀況諸如陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿（PNH) 和非典型性溶血尿毒綜合征（aHUS)的原因，其中溶血是病理中的關(guān)鍵特征。在PNH中，具 有突變的編碼磷脂酰肌醇N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶亞基A的PIG-A基因的造血干細胞的 克隆在血細胞庫中占優(yōu)勢（take over)。該突變導致GPI錨定蛋白質(zhì)諸如補體調(diào)節(jié)劑CD55 和⑶59的損失。表面缺乏⑶55和⑶59的紅血細胞暴露于通過MAC的補體介導的裂解。在 臨床上，PNH的表現(xiàn)為導致貧血、血栓形成和骨髓衰竭的溶血。非典型性HUS是通過主要為 旁路途徑的調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)中的突變，例如通過因子Η中的突變引起的。
[0009] 眼部被強烈指示作為補體驅(qū)動的病理的部位。視力喪失的最常見原因是年齡相關(guān) 性黃斑變性（AMD)，其中在其較為嚴重的形式（滲出性或濕性AMD)中，在視網(wǎng)膜下形成病理 性脈絡膜神經(jīng)血管膜。在美國，約10%的65-74歲的群體顯示黃斑變性的病征，并且多達 5%的群體由于AMD而患有視力障礙。這些數(shù)目隨著年齡而顯著增加，但也存在遺傳因素。 在這些基因中，與AMD最強烈相關(guān)的是補體因子H、因子B及C3和C1抑制劑（Bradley等人 Eye2011, 25:683-693)。此外，使用各種補體阻斷分子（complement blocking molecule) 的一些研究和臨床試驗已被證明是有益的，表明C5阻斷分子可幫助這些患者群體。然 而，目前晚期AMD的治療旨在通過玻璃體內(nèi)注射例如雷珠單抗（單克隆抗體片段）和貝 伐單抗（單克隆抗體）來抑制血管內(nèi)皮生長因子（VEGF)誘導的血管形成。在葡萄膜炎 的動物模型中，眼部的炎癥是由于針對眼部抗原的免疫應答引起，阻斷針對旁路途徑因子 B(Manickam 等人 J Biol Chem2011, 286:8472-8480)以及針對 C5(Copland 等人 Clin Exp Immunol2009, 159:303-314)的抗體，改善了疾病狀態(tài)。
[0010] 在實體器官移植中，存在導致移植物排斥或功能延遲/受損的兩種主要的機制 途徑：1)供體和受體之間的關(guān)于血型（ΑΒ0)和MCH類的免疫屏障，以及受體針對供體的 預先致敏作用的程度，即，導致急性抗體介導的排斥（AMR)的供體特異性抗體（DSA)的 發(fā)生；和2)移植器官的條件以及其在沒有恒定的血液灌注的情況下被保持的時間段， 即移植物的缺血損傷或缺血再灌注損傷（IRI)的程度。在AMR和IRI兩者中，補體系 統(tǒng)攻擊被識別為外來的器官，并因此，實體應被排斥。在AMR中，預先存在的抗-供體 抗體在外來器官表面快速地形成免疫復合物，導致通過Clq和后續(xù)的補體系統(tǒng)激活經(jīng)由 經(jīng)典途徑的識別。稱為超急性排斥的這一過程發(fā)生在幾分鐘內(nèi)，并因此不匹配的器官的 現(xiàn)代移植，包括移植前通過血漿除去法或血漿置換以及靜脈注射結(jié)合不同的免疫抑制劑 的IgG來消除DSA。新的治療還包括通過使用抗-CD20抗體利妥昔單抗的B-細胞耗竭 (Genberg等人Transplant2008, 85:1745-1754)。這些方案已極大地消除了超急性排斥 的發(fā)生，但在高致敏患者中，急性AMR的發(fā)病率（周-月）仍高達40 % (Burns等人Am J Transplant2008, 6:2684-2694 ;Stegall 等人Am J Transplant 早期在線出版）。關(guān)于 IRI， 大多數(shù)證據(jù)指向末端途徑，具有后續(xù)的MAC形成和裂解作為組織損傷的主要原因。因此，C5 阻斷多肽將保護免受排斥，不管病因是AMR、IRI或如經(jīng)常發(fā)生的AMR和IRI兩者的組合。 如預期的，高度灌注器官，諸如肝臟（Qin等人Cell Mol Immunol2006, 3:333-340)、心臟和 腎臟，特別容易受到補體介導的損傷的影響。
[0011] C5蛋白質(zhì)的中心位置：連接補體級聯(lián)的近端和末端部分，使得其成為藥學干預的 有吸引力的靶。既然C5是補體激活的所有途徑共有的，不管刺激如何，阻斷C5將阻止級聯(lián) 的進展，并從而阻止末端補體激活的有害性質(zhì)，而保持近端補體級聯(lián)的免疫保護和免疫調(diào) 節(jié)功能的完整。
[0012] 靶向人補體C5的抗體從例如W095/29697、W002/30985、和W02004/007553是已知 的。依庫珠單抗（Eculizumab) (Soliris?)是直接針對蛋白質(zhì)C5的人源化單克隆抗體并阻 止C5裂解成C5a和C5b。依庫珠單抗已顯示在治療PNH方面是有效的并已被批準用于該 適應癥，所述PNH是一種罕見的且有時危及生命的血液疾病，其特征為血管內(nèi)溶血性貧血、 血栓形成傾向和骨髓衰竭。依庫珠單抗最近還被FDA批準用于治療非典型性溶血綜合征 (aHUS)，一種罕見但危及生命的疾病，該疾病是由于旁路補體途徑的失控所致，導致過度激 活，表現(xiàn)為血栓性微血管病（TMA)，導致重要器官諸如腎臟、心臟和腦的損傷的恒定風險。在 aHUS中，損傷的器官的移植僅暫時地有助于患者，因為肝臟繼續(xù)產(chǎn)生突變形式的控制蛋白 質(zhì)（最常見為補體因子Η或旁路途徑的其它蛋白質(zhì)）。具有暫時性急性病理生理學的相關(guān) 疾病是HUS，所述HUS是由于志賀毒素陽性大腸桿菌（E. coli) (STEC-HUS)的感染所致，且存 在表明依庫珠單抗用于該狀況也是有效的有前景的臨床數(shù)據(jù)（Lapeyraque等人，N Engl J Med2011，364:2561-2563)。最后，C5阻斷抗體依庫珠單抗已被證明在預防高度不匹配的腎 臟受體中的 AMR方面是有效的（Stegall, M.D.等人Am J Transplant2011, 11:2405-2413)。
[0013] 除了全長抗體，祀向C5的單鏈可變區(qū)片段（scFV)、微抗體（minibody)和適 體在文獻中被描述。這些C5抑制劑可與C5分子上的不同位點（表位）結(jié)合，并可 具有不同的作用模式。例如，鑒于依庫珠單抗在轉(zhuǎn)化酶裂解位點的一段距離處與C5 相互作用，微抗體Mubodina?與C5的裂解位點相互作用。來自軟蜱非洲鈍緣蜱 (Ornithodoros moubata)的C5抑制蛋白質(zhì)非洲鈍緣蝶補體抑制劑（0mCI，Nunn，M. A.等人 J Immunol2005, 174:2084-2091)，已被推測與 CUB-C5d-MG8 超級結(jié)構(gòu)域（superdomain)的 遠端結(jié)合，其在轉(zhuǎn)化酶裂解位點附近（Fredslund等人Nat Immunol2008,9(7) :753_760)。 與以上提到的抑制C5的裂解的三種蛋白質(zhì)相反，單克隆抗體TNX-558與完整C5和 釋放的C5a兩者上存在的C5a表位結(jié)合，而不抑制C5的裂解（Fung等人Clin Exp Immunol2003, 133(2):160-169)。
[0014] 具有其大的、多結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)、12個鏈內(nèi)和4個鏈間二硫鍵和復雜糖基化模式的抗 體，具有一些與其分子結(jié)構(gòu)相關(guān)的固有的缺點。例如，依庫珠單抗的大小為約148kDa。人 血液中C5的濃度為約400nM，且為了完全阻斷C5活性，抑制劑的濃度必須至少等于或高于 其。因此，使用Soliris?的PNH標準終身治療方案是每兩周靜脈輸注900mg蛋白質(zhì)，所述 治療方案是一種主要在診所進行的治療，導致患者極大的不便和社會成本。Soliris?還被 報道引起胸痛、發(fā)熱、寒戰(zhàn)、瘙癢、蕁麻疹、面部潮紅、皮疹、頭暈、呼吸困難、或面部、舌頭和 喉嚨腫脹，雖然這些副作用的原因不清楚。此外，依庫珠單抗在任何測試動物模型包括靈長 類中是沒有活性的，使得具有活性藥物的動物研究是不可能的。如以上所提到的，目前AMD 的治療還是抗體依賴性的，并因此，基于注射或其它施用途徑的低分子量分子的治療，是非 常需要的。
[0015] 此外，抗體的生產(chǎn)相比小蛋白質(zhì)的生產(chǎn)是更加困難且更昂貴的（Kenanova等人 Expert Opin Drug Deliv2006, 3(1) :53-70)。通常與抗體相關(guān)的其它缺點由Reilly等人 (Clin Pharmacokinetl995, 28:126-142)列出，例如與正常組織的交叉反應性和非特異性 結(jié)合，注射抗體的增加的代謝，以及導致治療效果的減少或損失的人抗-人抗體（HAMA)的 形成。
[0016] 因此，具有可比的C5阻斷活性的劑的繼續(xù)提供依然是領(lǐng)域內(nèi)十分關(guān)心的問題。特 別地，對防止末端補體級聯(lián)以及促炎性分子C5a的形成的分子存在持續(xù)的需求。對提供此 類分子在疾病治療中的用途也具有極大的興趣。
[0017] 描述
[0018] 本發(fā)明的一個目的是提供新的C5結(jié)合劑。此外，本發(fā)明的一個目的是提供新的C5 結(jié)合劑用于在治療應用中使用。
[0019] 在一個方面，提供了 C5結(jié)合多肽（C5binding polypeptide)，所述C5結(jié)合多肽包 括C5結(jié)合基序（C5binding motif)，BM，所述基序由選自以下的氨基酸序列構(gòu)成
[0020] i)EX2X3X4A X6X7EID XnLPNL X16X17X18Qff X21AFIX25X26LX28D,
[0021] 其中，彼此獨立地，
[0022] X2 選自 H、Q、S、T 和 V ;
[0023] X3 選自 I、L、M和 V;
[0024] X4 選自 A、D、Ε、Η、K、L、N、Q、R、S、T 和 Y ;
[0025] X6 選自 N 和 W ;
[0026] 父7選自六、03、!1、隊〇、1?、5和1';
[0027] Xn 選自 A、E、G、Η、K、L、Q、R、S、T 和 Y ;
[0028] X16 選自 N 和 T ;
[0029] Χ17 選自 I、L 和 V;
[0030] X18 選自 A、D、Ε、Η、K、N、Q、R、S 和 T ;
[0031] X21 選自 I、L 和 V;
[0032] X25選自 D、E、G、H、N、S 和 T ;
[0033] Χ26 選自 Κ 和 S ;
[0034] Χ28選自 A、D、E、H、N、Q、S、T和 Υ;
[0035] 和
[0036] ii)與i)中定義的序列具有至少86%同一性的氨基酸序列，其中多肽結(jié)合C5。
[0037] 以上定義的具有C5結(jié)合親和力的序列相關(guān)的多肽的種類，來源于共同的親本多 肽序列。更具體地，種類的定義是基于在選擇實驗中由于其與C5的相互作用被選擇的親本 多肽的大量隨機多肽變體的分析。鑒定的C5結(jié)合基序，或"BM"，對應于親本支架的靶結(jié)合 區(qū)，該區(qū)域構(gòu)成三螺旋束蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域中的兩個α-螺旋。在親本支架中，兩個BM螺旋的 不同氨基酸殘基構(gòu)成用于與抗體的恒定Fc部分相互作用的結(jié)合表面。通過結(jié)合表面殘基 的隨機變化和隨后變體的選擇，結(jié)合表面的Fc相互作用能力已被替換為與C5相互作用的 能力。
[0038] 如在以下實施例中解釋的，C5結(jié)合多肽變體的選擇，可通過例如用于蛋白質(zhì)支架 的幼稚變體（nai_ve variant)的選擇的噬菌體展示，任選地隨后為親和力成熟，和用于親和 力成熟的C5結(jié)合變體的選擇的細胞展示實現(xiàn)。然而，被理解的是，任何選擇系統(tǒng)，無論是基 于噬菌體的、基于細菌的、基于細胞的或其它的，都可用于C5結(jié)合多肽的選擇。
[0039] 如在本說明書中使用的術(shù)語"C5結(jié)合"和"對C5的結(jié)合親和力"是指可通過例如使 用表面等離子共振技術(shù)，例如在Biacore儀器（GE Healthcare)中被測試的多肽的性質(zhì)。C5 結(jié)合親和力可例如在實驗中被測試，其中C5被固定在Biacore儀器的傳感器芯片上，并將 含有待被測試的多肽的樣品通過芯片?？蛇x地，將待被測試的多肽固定在儀器的傳感器芯 片上，并將包含C5、或其片段的樣品通過芯片。然后，技術(shù)人員可解釋通過此類實驗獲得的 結(jié)果，以建立多肽與C5結(jié)合的至少一種定性測量。如果需要定量測量，例如，以確定相互作 用的表觀平衡解離常數(shù)K D，也可以使用表面等離子共振方法。結(jié)合值可在例如Biac〇re2000 儀器（GE Healthcare)中被確定。將C5固定在測量的傳感器芯片上，并通過連續(xù)稀釋制備 其親和力待被確定的多肽的樣品，并注射在芯片上。然后，可使用例如由儀器制造商提供的 BIA評價軟件的1: lLangmuir結(jié)合模型從結(jié)果計算KD值。用于KD測定的C5或其片段可包 括例如由SEQ ID N0:760所代表的氨基酸序列。
[0040] 在根據(jù)本發(fā)明的C5結(jié)合多肽的一個實施方案中，C5結(jié)合多肽與C5結(jié)合，使得相 互作用的K D值為至多1Χ1(Γ6Μ，諸如至多1Χ1(Γ7Μ、1Χ1(Γ8Μ、*1Χ1(Γ 9Μ。
[0041] 根據(jù)本發(fā)明的C5結(jié)合多肽可被用作多種醫(yī)學、獸醫(yī)和診斷應用中常規(guī)抗體或低 分子量物質(zhì)的替代物。特別地，C5結(jié)合多肽可被用于需要試劑的對C5的親和力的任何方 法。因此，C5結(jié)合多肽可被用作此類方法中的檢測試劑、捕獲試劑、分離試劑、診斷劑、或治 療劑。
[0042] 如技術(shù)人員將意識到的，任何多肽的功能，例如如本文所定義的多肽的C5結(jié)合能 力，依賴于多肽的三級結(jié)構(gòu)。因此，對多肽的氨基酸序列進行微小的改變而沒有大幅影響其 三級結(jié)構(gòu)和功能是可能的。因此，在一個實施方案中，多肽包括i)的ΒΜ的修飾的變體，其 使得所得序列與屬于通過i)定義的種類的序列至少89%相同，諸如與屬于通過i)定義的 種類的序列至少93%相同、諸如與屬于通過i)定義的種類的序列至少96%相同。例如，屬 于特定的氨基酸殘基的功能分組（functional grouping)(例如疏水性、親水性、極性等） 的氨基酸殘基可被來自相同功能組（functional group)的另一個氨基酸殘基交換是可能 的。
[0043] 在如以上所定義的C5結(jié)合多肽的另一個實施方案中，氨基酸序列選自：i)如以上 所定義的，以及iii)在由X n表示的13個可變位置處與i)中定義的序列具有至少84%同 一性，其中 η 為 2-4、6-7、11、16-18、21、25-26 和 28,并且在位置 1、5、8-10、12-15、19-20、 22-24、27和29處與i)中定義的序列具有至少87%同一性的氨基酸序列。
[0044] 在根據(jù)本發(fā)明的多肽的一個實施方案中，X2選自H、T和V。在另一個實施方案中， X2選自T和V。在又另一個實施方案中，&是乂。
[0045] 在根據(jù)本發(fā)明的多肽的一個實施方案中，X3選自I、L和V。在另一個實施方案中， X3選自I和L。在又另一個實施方案中，\是1。在可選的實施方案中，\是匕
[0046] 在根據(jù)本發(fā)明的多肽的一個實施方案中，\選自八、03、1(、1^〇和1?。在另一個實 施方案中，X 4選自A、D、E、K和R。在又另一個相關(guān)的實施方案中，X4選自D和E。
[0047] 在根據(jù)本發(fā)明的多肽的一個實施方案中，X6是1
[0048] 在根據(jù)本發(fā)明的多肽的一個實施方案中，X7選自A、D、N和T。在另一個實施方案 中，X 7選自D和N。在又另一個相關(guān)的實施方案中，\是0。在可選的實施方案中，\是1
[0049] 在根據(jù)本發(fā)明的多肽的一個實施方案中，Xn選自A、H、K、Q、R和S。在另一個實施 方案中，X n選自A、H、K和R。在又另一個相關(guān)的實施方案中，Xn選自A、K和R。在又另一 個相關(guān)的實施方案中，選自K和R。
[0050] 在根據(jù)本發(fā)明的多肽的一個實施方案中，X16是T。
[0051] 在根據(jù)本發(fā)明的多肽的一個實施方案中，X17選自I和L。在另一個實施方案中， 父 17是1。在可選的實施方案中，乂17是1^。
[0052] 在根據(jù)本發(fā)明的多肽的一個實施方案中318選自八、03、隊〇、3和1'。在另一個 實施方案中，X 18選自A、D、E、Q和S。在又另一個相關(guān)的實施方案中，X18選自D、E和Q。在 又另一個相關(guān)的實施方案中，X 18選自D和E。在又另一個相關(guān)的實施方案中，乂18是0。在 可選的實施方案中，X18是E。
[0053] 在根據(jù)本發(fā)明的多肽的一個實施方案中，X21選自I和L。在另一個實施方案中， 父 21是1。在可選的實施方案中，父21是1。
[0054] 在根據(jù)本發(fā)明的多肽的一個實施方案中，X25選自E、H、N和T。在另一個實施方案 中，X 25選自E和N。在又另一個相關(guān)的實施方案中，&5是1
[0055] 在根據(jù)本發(fā)明的多肽的一個實施方案中，X26是1(。
[0056] 在根據(jù)本發(fā)明的多肽的一個實施方案中328選自八、03、!1、隊〇和5。在以上公 開的多肽的另一個實施方案中，x 28選自A、D、E和S。在又另一個相關(guān)的實施方案中，X28選 自A、D和E。在又另一個相關(guān)的實施方案中，X 28選自D和E。在又另一個相關(guān)的實施方案 中，X28是D。
[0057] 在根據(jù)本發(fā)明的多肽的一個實施方案中，X3X4選自LE和LD。
[0058] 在根據(jù)本發(fā)明的多肽的一個實施方案中，X17X18選自IE和LD。
[0059] 在以上第一方面的實施方案中，落入多肽種類之內(nèi)的C5結(jié)合多肽的實例被鑒定。 被預期的是，以上單個實施方案可以以所有可能的方式被組合，并仍落入本發(fā)明的范圍之 內(nèi)。單個實施方案的此類組合，與i)中的氨基酸定義相比，定義了在位置&-&8的一個或 更多個位置處被限制的氨基酸序列。
[0060] 以上C5結(jié)合多肽的實施方案可例如被組合，使得氨基酸i)滿足以下八個條件 I-VIII中的至少四個：
[0061] 1.父2是￥;
[0062] 11.父3選自1和1^;
[0063] ΙΙΙ·Χ6 是 W;
[0064] VI.X7 選自 D和Ν;
[0065] V. Χ17 選自 I 和 L ;
[0066] VI. X21 是 L ;
[0067] VII.XjN;
[0068] 乂111.父28是0。
[0069] 在根據(jù)第一方面的C5結(jié)合多肽的一些實施例中，氨基酸序列i)滿足八個條件 I-VIII中的至少五個。更具體地，氨基酸序列i)可滿足八個條件I-VIII的至少六個、諸如 八個條件I-VIII的至少七個、諸如八個條件I-VIII的全部。
[0070] 如以下實施例中描述的，C5結(jié)合變體的選擇已導致單個C5結(jié)合基序（BM)序列 的鑒定。這些序列構(gòu)成根據(jù)該方面的C5結(jié)合多肽的單獨的實施方案。單個C5結(jié)合基序 的序列示于圖1并展示為SEQ ID N0:1-248。在該方面的一些實施方案中，BM序列i)選 自以下的任一個：SEQ ID N0:1-12、SEQ ID N0:20、SEQ ID N0:23-24、SEQ ID N0:26-28、 SEQ ID N0:32-35、SEQ ID N0:38-39、SEQ ID N0:41、SEQ ID N0:46、SEQ ID N0:49、SEQ ID N0:56-57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:78-79、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:92、 SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:141、SEQ ID N0:151、SEQ ID N0:161、SEQ ID N0:166、SEQ ID N0:187、SEQ ID N0:197、SEQ ID N0:203、 SEQ ID N0:205、SEQ ID N0:215 和 SEQ ID N0:243。更具體地，BM 序列 i)選自 SEQ ID N0:1-12中的任一個、諸如選自SEQIDN0:1、SEQIDN0:2、SEQIDN0:3、SEQIDN0:4和 SEQ ID NO: 5。特別地，BM 序列 i)可選自 SEQ ID NO: 1 和 SEQ ID NO:4。
[0071] 在特定的實施方案中，C5結(jié)合基序（BM)形成三螺旋束蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的部分。例 如，BM可基本上構(gòu)成所述三螺旋束蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域中具有互連環(huán)（interconnecting loop) 的兩個α -螺旋。
[0072] 在另一個實施方案中，三螺旋束蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域選自細菌受體蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域。此 類結(jié)構(gòu)域的非限制性實例為來自金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)的蛋白質(zhì)Α的 五個不同的三螺旋結(jié)構(gòu)域，諸如結(jié)構(gòu)域B，及其衍生物。在一些實施方案中，三螺旋束蛋白質(zhì) 結(jié)構(gòu)域是來源于金黃色葡萄球菌蛋白質(zhì)A的所述結(jié)構(gòu)域B的蛋白質(zhì)Z的變體。
[0073] 在其中本發(fā)明的C5結(jié)合多肽形成三螺旋束蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的部分的實施方案中， C5結(jié)合多肽可包括選自以下的氨基酸序列：
[0074] i)K-[BM]-DPSQS XaXbLLXc EAKKL NDXdQ ;
[0075] 其中
[0076] [BM]是如以上所定義的C5結(jié)合基序；
[0077] Xa 選自 A 和 S ;
[0078] Xb 選自 N 和 E ;
[0079] X。選自 A、S 和 C ;
[0080] Xd 選自 A 和 S ;
[0081] 以及
[0082] ii)與以上定義的任一序列具有至少79%同一性的氨基酸序列。所述氨基酸序列 可與以上定義的任一序列具有至少81 %、諸如至少83%、諸如至少85%、諸如至少87%、諸 如至少89%、諸如至少91 %、諸如至少93%、諸如至少95%、諸如至少97%的同一性。
[0083] 在如以上定義的C5結(jié)合多肽的一個實施方案中，乂3是八。在如以上定義的C5結(jié) 合多肽的可選的實施方案中，X a是S。
[0084] 在如以上定義的C5結(jié)合多肽的一個實施方案中，Xb是N。在可選的實施方案中， Xb 是 E。
[0085] 在如以上定義的C5結(jié)合多肽的一個實施方案中，X。是A。在可選的實施方案中， X。為S。在又另一個可選的實施方案中，X。是C。
[0086] 在如以上定義的C5結(jié)合多肽的一個實施方案中，乂(1是4。在可選的實施方案中， Xd 是 S。
[0087] 在如以上定義的C5結(jié)合多肽的一個實施方案中，Xa是A ;Xb是N ;X。是A且Xd是 A〇
[0088] 在如以上定義的C5結(jié)合多肽的另外的實施方案中，Xa是A ;Xb是N ;X。是C且Xd是 A〇
[0089] 在如以上定義的C5結(jié)合多肽的另外的實施方案中，\是3 ;Xb是E ;X。是S且Xd是 S〇
[0090] 在如以上定義的C5結(jié)合多肽的另外的實施方案中，\是3 ;Xb是E ;X。是C且Xd是 S〇
[0091] 在又另外的實施方案中，如以上定義的C5結(jié)合多肽的氨基酸序列選自SEQ ID N0:249-496，特別地選自SEQIDN0:249-260、SEQIDN0:268、SEQIDN0:271-272、SEQID NO:274-276, SEQ ID NO:280-283, SEQ ID NO:286-287, SEQ ID N0:289, SEQ ID N0:294, SEQ ID NO:297,SEQ ID NO:304-305,SEQ ID NO:307,SEQ ID NO:314,SEQ ID NO:326-327, SEQ ID NO:335、SEQ ID NO:340、SEQ ID NO:354、SEQ ID NO:358、SEQ ID NO:367、SEQ ID NO:373、SEQ ID NO:389、SEQ ID NO:399、SEQ ID NO:409、SEQ ID NO:414、SEQ ID NO:435、 SEQ ID NO:445、SEQ ID NO:451、SEQ ID NO:453、SEQ ID NO:463 和 SEQ ID NO:491，諸如 選自SEQ ID NO:249-260。在另外的實施方案中，氨基酸序列選自SEQ ID NO:249、SEQ ID NO: 250、SEQ ID NO: 251、SEQ ID NO:252 和 SEQ ID NO: 253,諸如選自 SEQ ID NO:249 和 SEQ ID NO:252。
[0092] 因此，在另外的實施方案中，提供了 C5結(jié)合多肽，其包括選自以下的氨基酸序列：
[0093] i)YAK-[BM]-DPSQS SELLXC EAKKL NDSQA P；
[0094] 其中[BM]是如以上定義的C5結(jié)合基序，且
[0095] X。選自 S 和 C ;
[0096] 以及
[0097] ii)與以上i)中定義的任一序列具有至少81%同一性的氨基酸序列。
[0098] 可選地，提供了 C5結(jié)合多肽，其包括選自以下的氨基酸序列：
[0099] i)FNK-[BM]-DPSQS ANLLXC EAKKL NDAQA P ；
[0100] 其中[BM]是如以上定義的C5結(jié)合基序，且
[0101] X。選自 A 和 C;
[0102] 以及
[0103] ii)與以上i)中定義的任一序列具有至少81%同一性的氨基酸序列。
[0104] 如以上討論的，與以上氨基酸序列相比包括微小的改變而沒有大幅影響其三級結(jié) 構(gòu)和功能的多肽也在本申請的范圍之內(nèi)。因此，在一些實施方案中，如以上定義的C5結(jié)合 多肽可具有例如與i)中定義的序列具有至少83%、至少84%、至少86%、至少88%、至少 90 %、至少92 %、至少94 %、至少96 %或至少98 %相同的序列。
[0105] 在一些實施方案中以及如以下實施例中公開的，C5結(jié)合基序可形成58或60個氨 基酸的多肽的部分。此類多肽可包括例如選自SEQ ID N0:497-757中的任一個的序列，特別 地選自以下的任一個的序列：SEQ ID N0:497-508、SEQ ID N0:516、SEQ ID NO:519-520、SEQ ID N0:522-524、SEQ ID N0:528-531、SEQ ID N0:534-535、SEQ ID N0:537、SEQ ID N0:542、 SEQ ID NO:545,SEQ ID NO:552-553,SEQ ID NO:555,SEQ ID NO:562,SEQ ID NO:574-575, SEQ ID NO:583、SEQ ID NO:588、SEQ ID NO:602、SEQ ID NO:606、SEQ ID NO:615、SEQ ID N0:621、SEQ ID NO:637、SEQ ID NO:647、SEQ ID NO:657、SEQ ID NO:662、SEQ ID NO:683、 SEQ ID N0:693、SEQ ID N0:699、SEQ ID N0:701、SEQ ID N0:711、SEQ ID N0:739和SEQ ID N0:745-757,諸如選自 SEQ ID N0:497-508 和 SEQ ID N0:745-757 的序列。在另一個實施 方案中，氨基酸序列選自 SEQ ID NO:497、SEQ ID NO:498、SEQ ID NO:499、SEQ ID NO:500、 SEQ ID NO:501、SEQ ID NO:746、SEQ ID NO:747、SEQ ID NO:748、SEQ ID NO:750和SEQ ID NO: 753,諸如選自 SEQ ID NO:497、SEQ ID NO: 500、SEQ ID NO:748 和 SEQ ID NO:753 中的 任一個。
[0106] 分子與C5的結(jié)合并不一定抑制C5的裂解。抑制依賴于結(jié)合位點，且由于與C5的 特定區(qū)域的相互作用具有什么作用不完全清楚，一些C5結(jié)合分子可與C5相互作用而不抑 制其裂解為C5a和C5b。在本發(fā)明的一個實施方案中，當例如施用至哺乳類受試者時，C5結(jié) 合多肽抑制C5的裂解。當施用至人受試者時，根據(jù)本發(fā)明的C5結(jié)合多肽可更特異性地抑 制人C5的裂解。
[0107] C5的結(jié)構(gòu)在物種之間有所不同，并且因此，被發(fā)現(xiàn)結(jié)合一個物種C5的C5結(jié)合劑在 另一個物種中可能是無活性的。例如，人源化抗體依庫珠單抗與通常被稱為MG7的C5的結(jié) 構(gòu)域結(jié)合。該區(qū)域在物種之間是高度可變的，并因此，依庫珠單抗局限于與人C5結(jié)合。然 而，本發(fā)明的C5結(jié)合多肽并不局限于人C5,而在動物模型中也表現(xiàn)出活性，如在所附實施 例中展示的。
[0108] 技術(shù)人員將理解，可對根據(jù)本文所公開的任一方面的C5結(jié)合多肽進行各種修飾 和/或添加，以調(diào)整多肽適于特定的應用而不偏離本發(fā)明的范圍。例如，根據(jù)任一方面的C5 結(jié)合多肽還可包括C末端和/或N末端的氨基酸。此類多肽應被理解為在多肽鏈的第一個 和/或最后一個位置處，即在N-和/或C-末端具有另外的氨基酸殘基的多肽。因此，C5結(jié) 合多肽可包括任何合適數(shù)目的另外的氨基酸殘基，例如至少一個另外的氨基酸殘基。每個 另外的氨基酸殘基可單獨地或共同地被添加，以例如改善多肽的制備、純化、體內(nèi)或體外穩(wěn) 定性、偶聯(lián)、或檢測。此類另外的氨基酸殘基可包括被添加用于化學偶聯(lián)目的的一個或更多 個氨基酸殘基。這方面的一個實例是添加半胱氨酸殘基。此類另外的氨基酸殘基還可提供 用于多肽純化或檢測的"標簽"，例如His 6標簽或"myc"（c-myc)標簽或"FLAG"標簽，用于 與標簽特異性抗體相互作用，或在His6-標簽的情況下用于固定化金屬親和層析（IMAC)。 [0109] 如以上討論的另外的氨基酸可通過化學綴合（使用已知的有機化學方法）或通過 任何其它手段諸如表達C5結(jié)合多肽作為融合蛋白，被偶聯(lián)至C5結(jié)合多肽。
[0110] 如以上討論的另外的氨基酸可構(gòu)成例如一個或更多個多肽結(jié)構(gòu)域。另外的多肽結(jié) 構(gòu)域可提供具有另一種功能的C5結(jié)合多肽，諸如例如另一種結(jié)合功能、或酶促功能、或毒 性功能（例如，免疫毒素）、或熒光信號傳導功能，或其組合。
[0111] 另外的多肽結(jié)構(gòu)域可另外提供具有相同結(jié)合功能的C5結(jié)合多肽。因此，在另外的 實施方案中，提供了 C5結(jié)合多肽，其包括至少2個C5結(jié)合多肽的單體單元，其氨基酸序列 可以是相同的或不同的。多肽的多聚體形式可包括合適數(shù)目的結(jié)構(gòu)域，每個都具有C5結(jié)合 基序，且每個都形成多聚體中的"單體"。這些結(jié)構(gòu)域可全部具有相同的氨基酸序列，但可選 地，它們可具有不同的氨基酸序列。特別地，本發(fā)明的C5結(jié)合多肽可形成同源或異源二聚 體。
[0112] 如以上描述的另外的多肽結(jié)構(gòu)域可使用已知的有機化學方法通過共價偶聯(lián)連接 到C5結(jié)合多肽?？蛇x地，包括另外的多肽結(jié)構(gòu)域的C5結(jié)合多肽可在例如用于多肽重組表 達的系統(tǒng)中被表達為一個或更多個融合多肽，或以任何其它形式直接地或經(jīng)由接頭例如氨 基酸接頭連接。
[0113] 在一些實施方案中，另外的多肽結(jié)構(gòu)域可包括半衰期延長部分（half life extending moiety),其增加了 C5結(jié)合多肽的體內(nèi)半衰期。如技術(shù)人員理解的，增加的或延 長的半衰期是指特定分子從血液中較慢的清除。存在一些已知的策略用于延長特定多肽的 體內(nèi)半衰期，諸如偶聯(lián)至抗體的Fc結(jié)構(gòu)域（Fc綴合）或偶聯(lián)至白蛋白。另一個實例是偶聯(lián) 至半衰期延長部分，例如將在體內(nèi)與血清白蛋白締合的肽或蛋白質(zhì)。特別地，半衰期延長部 分可以是白蛋白結(jié)合部分（albumin binding moiety)。白蛋白結(jié)合部分可例如由天然存在 的多肽、或其白蛋白結(jié)合片段、或工程化的多肽組成。工程化的多肽可通過使天然存在的起 始多肽經(jīng)受蛋白質(zhì)工程技術(shù)諸如以定點或隨機化的方式的突變和改變而源自天然存在的 起始多肽，目的在于創(chuàng)建新的或增強的性質(zhì)，諸如對分子諸如白蛋白的結(jié)合親和力。此類工 程化的白蛋白結(jié)合多肽可以是例如蛋白質(zhì)支架的變體，其變體已針對其對白蛋白的特異性 結(jié)合親和力被選擇。在一個具體的實施方案中，蛋白質(zhì)支架可選自鏈球菌蛋白質(zhì)G或其衍 生物的結(jié)構(gòu)域，諸如例如選自鏈球菌菌株G148的蛋白質(zhì)G的結(jié)構(gòu)域GA1、結(jié)構(gòu)域GA2和結(jié)構(gòu) 域GA3,特別是結(jié)構(gòu)域GA3。
[0114] 因此，在C5結(jié)合多肽的一個實施方案中，另外的氨基酸改善了體內(nèi)或體外穩(wěn)定性 且構(gòu)成鏈球菌蛋白質(zhì)G的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域（albumin binding domain, ABD)，或其衍生 物?？杀话ㄔ诒景l(fā)明的C5結(jié)合多肽中作為另外的多肽結(jié)構(gòu)域的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的 一個實例列于SEQ ID N0:759。適合的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的其它實例在W02009/016043 和TO2012/004384中公開。此類ABD延長的多肽與體內(nèi)血清白蛋白結(jié)合，并受益于其較 長的半衰期，這增加了多肽本身的凈半衰期（參見，例如W091/01743)。因此，當施用至例 如哺乳類受試者時，如以上定義的包括白蛋白結(jié)合部分的C5結(jié)合多肽的藥代動力學特征 (pharmacokinetic profile)類似于血清白蛋白的藥代動力學特征。ABD和其衍生物與人血 清白蛋白（HSA)以及來自其它物種諸如小鼠和大鼠的血清白蛋白非常強烈地結(jié)合。
[0115] 鏈球菌蛋白質(zhì)G的ABD長度為46個氨基酸，并因此，當根據(jù)本發(fā)明的C5結(jié)合多肽 包括ABD部分或其衍生物時，C5結(jié)合多肽的整體大小是相對小的。當施用至例如哺乳類受 試者例如人受試者時，C5結(jié)合多肽的白蛋白結(jié)合部分將與血清白蛋白非共價地締合，且多 肽可從而受益于減少的腎清除和在上皮細胞中增加的再循環(huán)。但是，由于血清白蛋白的外 滲性質(zhì)，組織滲透可仍然是快的。此外，相比缺乏相應的半衰期延長部分的多肽，包括半衰 期延長部分的C5結(jié)合多肽不僅可展示延長的體內(nèi)半衰期，也可展示降低的體內(nèi)免疫應答 (參見，例如 W02005/097202)。
[0116] 在相關(guān)的方面，提供了 C5結(jié)合化合物（C5binding compound)，包括至少一種根據(jù) 任一前述權(quán)利要求所述的C5結(jié)合多肽；至少一種鏈球菌蛋白質(zhì)G的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域、或 其衍生物，和至少一種連接部分，所述連接部分用于將所述至少一種結(jié)構(gòu)域或其衍生物連 接至所述至少一種C5結(jié)合多肽的C或N末端。如在以下實施例中展示的，當施用至例如哺 乳類受試者時，此類C5結(jié)合化合物具有對C5以及對體內(nèi)血清白蛋白的高親和力，并且與血 清白蛋白的結(jié)合不干擾與C5的相互作用。
[0117] 在一個實施方案中，C5結(jié)合化合物具有選自以下的結(jié)構(gòu)：
[0118] [CBP1]-[L1]-[ALBD]；
[0119] [CBP1]-[CBP2]-[L1]-[ALBD]；
[0120] [CBP1]-[L1]-[ALBD]-[L2]-[CBP2]；
[0121] [ALBD]-[L1]-[CBP1]；
[0122] [ALBD]-[L1]-[CBP1]-[CBP2]；
[0123] [CBP1]-[L1]-[CBP2]-[L2]_[ALBD];和
[0124] [ALBD] - [LI] - [CBP1] - [L2] - [CBP2]
[0125] 其中，彼此獨立地，
[0126] [CBP1]和[CBP2]是C5結(jié)合多肽，其可以是相同的或不同的；
[0127] [L1]和[L2]是連接部分，其可以是相同的或不同的；和
[0128] [ALBD]是鏈球菌蛋白質(zhì)G的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，或其衍生物。
[0129] 優(yōu)選的C5結(jié)合化合物具有選自以下的結(jié)構(gòu)：
[0130] [CBP1]-[CBP2]-[L1]-[ALBD]；
[0131] [CBP1]-[L1]_[ALBD] -[L2] -[CBP2];且最優(yōu)選地，
[0132] [CBP1]-[L1]-[ALBD]。
[0133] 可被用于此類C5結(jié)合化合物的連接部分的實例選自G、GS ;[G2S]n;[G3S]n;[G4S] n; GS[G4S]n，其中 η 是 0-7 (優(yōu)選地，η 是 0-2) ; [S2G]m ; [S3G]m ; [S4G]m ;其中 m 是 0-7,及 VDGS。 優(yōu)選的接頭是GS和GS[G4S]2。
[0134] 可被包括在C5結(jié)合化合物中的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域或其衍生物的實例是如以上所 描述的。特別地，白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的一個實例列于SEQ ID N0:759。
[0135] 特別優(yōu)選的C5結(jié)合化合物具有結(jié)構(gòu)[CBP1]-[L1]-[ALBD]，其中[CBP1]是選自SEQ ID NO: 748 和 SEQ ID NO: 753 的多肽，[L1]是 GS，且[ALBD]是如 SEQ ID NO: 759 所示的多 肽。
[0136] 在一個實施方案中，包括在C5結(jié)合多肽中的C5結(jié)合多肽獨立地選自如前所述的 58-mer或60-mer C5結(jié)合多肽。特別地，C5結(jié)合化合物可包括獨立地選自以下的任一個的 一個或更多個 C5 結(jié)合多肽：SEQ ID N0:497-508、SEQ ID N0:516、SEQ ID N0:519-520、SEQ ID N0:522-524、SEQ ID N0:528-531、SEQ ID N0:534-535、SEQ ID N0:537、SEQ ID N0:542、 SEQ ID NO:545,SEQ ID NO:552-553,SEQ ID NO:555,SEQ ID NO:562,SEQ ID NO:574-575, SEQ ID NO:583、SEQ ID NO:588、SEQ ID NO:602、SEQ ID NO:606、SEQ ID NO:615、SEQ ID N0:621、SEQ ID N0:637、SEQ ID N0:647、SEQ ID N0:657、SEQ ID N0:662、SEQ ID N0:683、 SEQ ID N0:693、SEQ ID N0:699、SEQ ID N0:701、SEQ ID N0:711、SEQ ID N0:739和SEQ ID N0:746-757,諸如選自 SEQ ID N0:497-508 和 SEQ ID N0:746-757 的序列。在另一個實施 方案中，氨基酸序列選自 SEQ ID NO:497、SEQ ID NO:498、SEQ ID NO:499、SEQ ID NO:500、 SEQ ID NO:501、SEQ ID NO:746、SEQ ID NO:747、SEQ ID NO:748、SEQ ID NO:750和SEQ ID NO: 753,諸如選自 SEQ ID NO:497、SEQ ID NO: 500、SEQ ID NO:748 和 SEQ ID NO:753 中的 任一個。
[0137] 在另外的方面，提供了編碼如以上所述的C5結(jié)合多肽或化合物的多核苷酸。包括 此類多核苷酸的表達載體可通過例如在宿主細胞中的表達使得C5結(jié)合多肽或C5結(jié)合化合 物的生產(chǎn)成為可能。
[0138] 應當理解的是，根據(jù)本發(fā)明的C5結(jié)合多肽其自身可作為治療劑或診斷劑或作為 靶向其它治療劑或診斷劑的手段是有用的，具有對例如補體蛋白質(zhì)C5的直接或間接的作 用。直接的治療作用可例如通過抑制C5裂解實現(xiàn)。因此，在一個實施方案中，提供了根據(jù) 本發(fā)明的C5結(jié)合多肽或C5結(jié)合化合物與治療劑的組合?？勺C明在此類組合中是有用的治 療劑的非限制性實例為免疫刺激劑和放射性核素。
[0139] 因此，在一個實施方案中，提供了根據(jù)本發(fā)明的原樣的C5結(jié)合多肽或如包括在C5 結(jié)合化合物或組合中的C5結(jié)合多肽，用于在治療中使用，例如用于治療C5相關(guān)的狀況，諸 如在哺乳類諸如人受試者中的C5相關(guān)的狀況。在一個實施方案中，所述C5相關(guān)的狀況選 自炎性疾病，諸如抗原誘導的關(guān)節(jié)炎、敗血癥、滑膜炎、血管炎和哮喘；自身免疫性疾病，諸 如系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE)、冷凝集素病、類風濕關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥（MS)、干燥綜合征、皮 肌炎、重癥肌無力、及其它自身抗體驅(qū)動的疾病，諸如如格林-巴利綜合征（GBS)、Fisher綜 合征、系統(tǒng)性硬化癥、抗腎小球基底膜（抗-GBM)和抗磷脂綜合征（APS);傳染病，諸如溶血 尿毒癥綜合征（HUS)、病毒感染、細菌感染和真菌感染；心血管疾病，諸如（急性）心肌梗塞 (通過纖維蛋白溶解或經(jīng)皮冠狀動脈介入（PCI)經(jīng)受血管重建）；神經(jīng)退行性紊亂諸如阿 爾茨海默氏?。ˋD)、亨廷頓氏病、Creutzfeld-Jacob病和帕金森氏病；癌癥；創(chuàng)傷；移植物 損傷，諸如缺血再灌注損傷（IRI)和急性抗體介導的排斥（AMR);眼部疾病，諸如年齡相關(guān) 性黃斑變性（AMD)、葡萄膜炎、糖尿病性眼部疾病和紊亂、及早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變；腎臟疾病， 諸如膜性腎小球腎炎、膜性腎炎、免疫球蛋白A腎病（immunoglobulin A nephropathy)、狼 瘡性腎炎、肺出血性腎炎綜合征和鏈球菌感染后腎小球腎炎；肺部疾病，諸如成人呼吸窘迫 綜合征、慢性阻塞性肺疾病和囊性纖維化；血液疾病，諸如溶血性貧血、陣發(fā)性冷血紅蛋白 尿、非典型性溶血尿毒綜合征（aHUS)和陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿（PNH);變應性疾病，諸如過 敏性休克、變態(tài)反應和哮喘；以及皮膚病，諸如天皰瘡、大皰性類天皰瘡、光毒性反應和銀屑 病。在一個更具體的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的C5結(jié)合多肽、化合物或組合被用于治療陣 發(fā)性夜間血紅蛋白尿（PNH)。
[0140] 如當在以上背景部分中討論器官移植時所提到的，供體和受體（例如，ABO血型和 MCH類）之間的差異以及移植的器官的狀況可導致功能延遲或甚至移植的器官的排斥。因 此，處理可以是必要的，以消除盡管是陽性供體-受體交叉配型的抗-供體抗體，或消除當 移植針對ΑΒ0血型屏障進行時的ΑΒ0血型抗體。此類處理通常包括在移植或血漿除去法之 前以及之后通過例如使用親和層析技術(shù)的免疫吸附。但是，此類程序冒著消除存在于循環(huán) 中的幾乎所有抗體因此包括治療性抗體的風險。然而，本發(fā)明的C5結(jié)合多肽或化合物不會 受到任何抗體去除程序的影響，并因此可在這些處理中被利用。
[0141] 在其中更為局部的急性病理而不是全身性病理在易于接近的組織諸如肺和血流 中占主導地位的一些C5相關(guān)的狀況中，具有非常短的半衰期的藥物相對于具有緩慢消除 的藥物可以是有利的。因此，在此類C5相關(guān)的狀況中，不具有半衰期延長部分的C5結(jié)合 多肽可以是有利的。如先前解釋的，根據(jù)本發(fā)明的C5結(jié)合多肽，當施用于哺乳類諸如人時， 由于其相對小的大小，將表現(xiàn)出相對快的藥代動力學特征。根據(jù)本發(fā)明的C5結(jié)合多肽在 C5 相關(guān)的狀況諸如哮喘（Zhang 等人 Expert Rev Clin Immunol2010, 6:269-277)、敗血癥 (Ward等人The Sci World J2010, 10:2395-2402)、以及超敏綜合征包括C激活相關(guān)的假性 過敏（CARPA，對特定的治療性脂質(zhì)體和基于脂質(zhì)賦形劑的藥物的反應，其在極少數(shù)情況下 可導致危及生命的心肺痛苦（Szebeni 等人 Adv Drug Delivery Rev2011, 63:1020-1030)) 的治療中可潛在地是有活性的。此外，當輸血的受體已接受了不相容類型的血液時 (一種在美國以約1:14000輸血單位發(fā)生的情況，其與高死亡率相關(guān)，Goodnough等人 Lancet2003, 361:161-169)，根據(jù)本發(fā)明的C5結(jié)合多肽可被用于補體抑制。
[0142] 在相關(guān)的方面，提供了一種治療C5相關(guān)的狀況的方法，包括將以上所述的C5結(jié)合 多肽、或組合施用至有相應需要的哺乳類受試者。因此，在治療方法中，受試者以根據(jù)本發(fā) 明的C5結(jié)合多肽、C5結(jié)合化合物或組合治療。在所述方法的更具體的實施方案中，C5結(jié)合 多肽或組合與受試者中細胞表面表達的C5的結(jié)合，抑制了 C5裂解。在治療方法的一個實 施方案中，C5相關(guān)的狀況選自炎性疾?。蛔陨砻庖咝约膊?；傳染??；心血管疾??；神經(jīng)退行 性紊亂；癌癥；創(chuàng)傷；移植物損傷；眼部疾?。荒I臟疾??；肺部疾?。谎杭膊?；變應性疾病 和皮膚病。特別地，在關(guān)于根據(jù)本發(fā)明的C5結(jié)合多肽、化合物或組合的治療用途中，C5相 關(guān)的狀況可以是如以上定義的。C5相關(guān)的狀況可以是例如陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿（PNH)。 在治療方法的一個實施方案中，所述C5結(jié)合多肽被靜脈內(nèi)、皮下、通過吸入、經(jīng)鼻、口服、玻 璃體內(nèi)、或局部施用。
[0143] 現(xiàn)在，本發(fā)明將通過以下非限制性實施例進一步被闡述。
[0144] 附圖簡述
[0145] 圖1是包含在本發(fā)明的C5結(jié)合多肽中的C5結(jié)合基序的實例（SEQ ID N0:1-248)、 根據(jù)本發(fā)明的49-mer C5結(jié)合多肽的實例（SEQ ID N0:249-496)、根據(jù)本發(fā)明的58-mer C5結(jié)合多肽的實例（SEQ ID N0:497-744)、和根據(jù)本發(fā)明的60-mer C5結(jié)合多肽的實例 (SEQ ID N0:745-757)的氨基酸序列、以及蛋白質(zhì)Z(SEQ ID N0:758)、白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域 (ABD094，SEQ ID N0:759)、人 C5 的 Swiss-Prot 條目 P01031(氨基酸殘基 1-1676，SEQ ID NO:760;其中α-鏈對應于氨基酸殘基678-1676且β-鏈對應于氨基酸殘基19-673)的 氨基酸序列，本文使用的His 6-加標簽的蜱蛋白質(zhì)OmCI的序列（SEQ ID Ν0:761)和使用人 C5作為模板來源于基因組序列（在www. ebi. ac. uk/ena在線公布；Ebeling等人（2001) Genome Res. 21(10):1746-1756)的食蟹猴 C5 的序列（SEQ ID NO: 762)的列表。序列在位 置63和1346處包含兩個未知的氨基酸"X"。
[0146] 圖2顯示了如實施例2中所述的在Biacore儀器上進行的典型的結(jié)合分析的結(jié) 果。通過分別將人C5(hC5 ;黑色實曲線）、食蟹猴C5(cC5 ;黑色短虛曲線）、大鼠 C5(rC5 ;黑 色長虛曲線）、人MG7結(jié)構(gòu)域（hMG7 ;灰色點曲線）、和人免疫球蛋白G(hIgG ;灰色實曲線） 注射于固定的二聚體Z變體（Z05477，SEQ ID N0:509)上，獲得傳感圖。
[0147] 圖3是顯示在ELISA中選擇的成熟的Z變體分別針對hC5和rC5的響應的柱狀圖。 如實施例4中所述的，黑色柱對應于每個Z變體的使用0. 05 μ g/ml hC5在450nm處獲得的 吸光度（每組中的左側(cè)柱），以及使用4 μ g/ml rC5在450nm處獲得的吸光度（每組中的右 側(cè)柱）。Z變體Z05363(SEQ ID N0:510)的響應被繪制作為陽性對照。
[0148] 圖4示意性地顯示了包含一個或多個選自SEQ ID N0:745-757的任選地與 ABD094(SEQ ID N0:759)連接的C5結(jié)合Z變體的不同的構(gòu)建體。
[0149] 圖5顯示了如實施例6中所述的通過Instant Blue可視化的純化的C5結(jié)合Z 變體（還原條件）的SDS-PAGE分析。A)表示相比不同的Z-ABD融合蛋白（其中，Z等于 SEQIDN0:745(泳道2)、SEQIDN0:748-757(泳道4-13)，通過GS接頭與ABD094(SEQID N0:759)融合），二聚體Z-Z-ABD的一個實例（泳道1，其中Z等于SEQ ID勵:745且八80等 于SEQ ID N0:759) ;B)表示在不同構(gòu)建體中一個C5結(jié)合Z變體（SEQ ID N0:753);及C) 表示呈單體形式（泳道6-7)和經(jīng)由GS(G4S)2接頭與ABD094(SEQ ID N0:759)融合（泳道 2-5)的兩個不同的C5結(jié)合Z變體（SEQ ID NO: 748,泳道2-3和6及SEQ ID NO: 753,泳道 4-5 和 7)。
[0150] 圖6A和6B是顯示實施例6中描述的如在溶血測定中所見的不同的C5結(jié)合Z變 體抑制補體激活的效力的劑量-響應特征的示例性數(shù)據(jù)的圖形。C5缺乏的血清被稀釋63 倍，并補充〇. InM hC5。A)顯示了不同Z-ABD融合蛋白（Z變體對應于SEQ ID N0:745、SEQ ID N0:748-753 和 SEQ ID N0:756,通過 GS 接頭與 ABD094(SEQ ID N0:759)融合）對 hC5 的作用，而B)顯示了相比于C5結(jié)合蜱蛋白質(zhì)0mCI(SEQ ID N0:761)，不同C5結(jié)合構(gòu)建體的 作用，所述C5結(jié)合構(gòu)建體包括相同的C5結(jié)合Z變體（Z06175a，SEQ ID N0:753)作為單體 或二聚體與ABD094(SEQ ID N0:759)融合、或具有His6-標簽（6個組氨酸殘基）。
[0151] 圖7A和7B是顯示實施例6中所描述的基于位移ECL技術(shù)（displacement ECL technique)的平衡結(jié)合的示例性數(shù)據(jù)的圖形。圖7A顯示了相比蝶蛋白質(zhì)OmCI (SEQ ID NO: 761)的 C5 結(jié)合，與 ABD094 (SEQ ID NO: 759)融合的不同 Z 變體（SEQ ID NO: 745, SEQ ID NO: 748-757)的C5結(jié)合。圖7B顯示了不同的C5結(jié)合構(gòu)建體的結(jié)合，所述C5結(jié)合構(gòu)建體包 括相同的C5結(jié)合Z變體（SEQ ID N0:753)作為單體或二聚體與ABD094(SEQ ID N0:759) 融合或具有Hi s6-標簽。
[0152] 圖8A和8B顯示了如實施例7中描述的研究的Z-ABD變體與人血清白蛋白（HSA) 之間的相互作用。A)尺寸排阻色譜法（SEC)，其中Z-ABD(Z06175a(SEQ ID NO:753)通過GS 接頭與ABD094 (SEQ ID NO: 759)融合）與等摩爾量的HSA預溫育（1)。作為比較，對單獨的 HSA(2)和單獨的Z-ABD(3)的色譜分析也示于圖中。B)注射在HSA包被的表面的Z-ABD和 Z-ABD-Z(Z06175a(SEQ ID N0:753)通過圖4中說明的接頭分別以構(gòu)建體2和構(gòu)建體5的方 式與ABD094(SEQ ID N0:759)融合）的Biacore傳感圖。兩個構(gòu)建體各自以25nM、100nM 和400nM的濃度被注射。
[0153] 圖9是顯示如實施例8中所述的，靜脈內(nèi)（i. v.，0. 25 μ mol/kg)和皮下 (s. c.，0· 5 μ mol/kg)施用后，雄性Sprague Dawley大鼠中C5結(jié)合化合物Z-ABD和 Z-ABD-Z(Z06175a(SEQ ID N0:753)通過圖4中說明的接頭分別以構(gòu)建體2和構(gòu)建體5的方 式與ABD094(SEQ ID N0:759)融合）隨時間的推移的藥代動力學特征的圖形。每個數(shù)據(jù)點 代表來自i.v.給藥的動物給藥后五分鐘至兩周以及s.c.給藥的動物給藥后15分鐘至兩 周范圍的特定時間點的3個個體動物的平均值。
[0154] 圖10顯示了如實施例8中描述的，暴露于1:5稀釋的來自動物樣品的血清 之后，綿羊紅細胞的離體溶血，所述動物樣品取自靜脈內(nèi)（i.v. ;〇. 25 μ mol/kg)施用 Z-ABD(Z06175a(SEQ ID N0:753)通過 GS接頭與 ABD094(SEQ ID N0:759)融合）后的 Sprague Dawley大鼠。每個點表示在給藥后五分鐘至兩周范圍的特定時間點的一個個體動 物。
[0155] 圖11顯示了如實施例8中描述的，暴露于1:5稀釋的來自動物樣品的血 清之后，綿羊紅細胞的離體溶血，所述動物樣品取自皮下（s. c. ;0. 5 μ mol/kg)施用 Z-ABD(Z06175a(SEQ ID N0:753)通過 GS接頭與 ABD094(SEQ ID N0:759)融合）后的 Sprague Dawley大鼠。每個點表示在15分鐘至兩周范圍的特定時間點的個體動物。
[0156] 圖12顯示了如實施例8中描述的，i. v.和s. c.施用至雄性Sprague Dawley大鼠 之后，溶血對 Z-ABD(Z06175a(SEQ ID N0:753)通過 GS 接頭與 ABD094(SEQ ID N0:759)融 合）血清濃度。
[0157] 圖13顯示了如實施例8中描述的，i. V.和s. c.施用至雄性Sprague Dawley大 鼠之后，綿羊紅細胞中的溶血對Z-ABD-Z(Z06175a(SEQ ID N0:753)通過在圖4中說明的接 頭與ABD094(SEQ ID N0:759)融合，構(gòu)建體5)血清濃度。
[0158] 圖 14 顯示了如實施例 9 所述的，i. v. (415nmol/kg)和 s. c. (1250nmol/kg)施用之 后，雄性食蟹猴中 Z-ABD(Z06175a(SEQ ID N0:753)通過GS接頭與ABD094(SEQ ID N0:759) 融合）的血清暴露。每個數(shù)據(jù)點代表三個個體動物的平均值。
[0159] 圖15是顯示如實施例10中描述的，分析的單獨的促炎性分子酵母聚糖（40mg/kg i.P.)以及與 C5 結(jié)合Z-ABD 融合分子（Z06175a(SEQ ID N0:753)通過GS接頭與ABD094(SEQ ID N0:759)融合）或0mCI(SEQ ID N0:761)組合的作用（灌洗中C5a的濃度）的圖形。在 以酵母聚糖誘導前 18h，s. c.施用 20nmol/kg(LD)、100nmol/kg(MD)和 500nmol/kg(HD)的 Z-ABD。在酵母聚糖處理前l(fā)h，i. p.施用OmCI (30nmol/kg)且在酵母聚糖誘導后lh采集樣 品。
[0160] 圖16A和16B顯不了如實施例11中描述的，在氣管內(nèi)施用500nmol/kg至雌性 C57bl小鼠中之后，Z-ABD(Z06175a(SEQIDN0:753)通過GS接頭與ABD094(SEQIDN0:759) 融合）的藥代動力學特征。A)每只動物中的血清濃度（每個時間點η = 3,共27只動物）， 以及Β)暴露于1:5稀釋的這些血清樣品的綿羊紅細胞中的溶血。 實施例
[0161] 除非另有說明，下列材料觀察該研究工作被使用。
[0162] ?大腸桿菌（Escherichia coli)菌株 RR1 Δ M15 (Riither, Nucleic Acids ReslO:5765 - 5772, 1982)。
[0163] ?大腸桿菌菌株 XLl-Blue (Agilent Technologies,目錄號 200268)。
[0164] ?人補體蛋白質(zhì)C5(hC5)。完整的1676個氨基酸的前蛋白質(zhì)（pro-protein)具 有GenBank登錄號：NP_001726(SEQ ID N0:760)，其中氨基酸19-673是β鏈且氨基酸 678-1676是α鏈。本文所用的人C5購自Quidel (目錄號Α403)。
[0165] ?食蟹猴補體蛋白質(zhì)C5(cC5, SEQ ID N0:762)。cC5序列源自食蟹猴（食蟹猴 (Macaca fascicularis))基因組序列（www. ebi.ac.uk/ena ;Ebeling 等人（2001)Genome Res. 21 (10) : 1746-1756)。人 C5 的編碼區(qū)從 www. ensembl. org 檢索，且 C5 基因定位于 15 號染色體。含有基因的區(qū)域為約110000個堿基長，并包含在重疊群（contig)CAECOl 154150 至CAEC01154178中。將重疊群手動地加入到單個文件，并用作sim軟件的基因組環(huán)境 (genomic context)以匹配人C5的編碼區(qū)至原始食蟹猴基因組材料（genomic material)。 使用以下的三步程序從血清中內(nèi)部（in-house)純化本文使用的食蟹猴C5:PEG6000沉淀、 離子交換和OmCI親和色譜。
[0166] ?大鼠補體蛋白質(zhì)C5(rC5 ;GenBank登錄號：XP_001079130)。使用以下的三步程 序從血清中內(nèi)部純化本文使用的大鼠 C5 :PEG6000沉淀、離子交換和OmCI親和色譜。
[0167] ?補體蛋白質(zhì)C5的人MG7(hMG7)結(jié)構(gòu)域，對應于人C5的氨基酸殘基822-931 (SEQ ID N0:760;Fredslund 等人（2008)Nature Immunology9:753-760)，在 Freestyle HEK293 細胞中內(nèi)部產(chǎn)生。
[0168] · hMG7結(jié)合蛋白質(zhì)。
[0169] ?來自軟蜱非洲鈍緣蜱OmCI的在C-末端具有His6標簽的OmCI (SEQ ID N0:761) (AF2999, Nunn, Μ. A.等人，同上）在大腸桿菌菌株Origami (DE3)中內(nèi)部產(chǎn)生，并在 HisTrapl柱上純化。
[0170] 實施例1 :補體蛋白質(zhì)C5結(jié)合多狀的詵擇與篩詵
[0171] 材料和方法
[0172] 靶蛋白hC5的牛物素化：桉照制誥商的律議，#用10倍（10x)摩爾過量的 No-Weigh EZ-Link Sulf〇-NHS-LC-Biotin(Pierce,目錄號 21327)在室溫（RT)下持續(xù) 40min 生物素化 hC5。根據(jù)制造商的說明，使用 Protein Desalting Spin Columns (Pierce, 目錄號89849)進行隨手的緩沖液交換至PBS(10mM磷酸鹽、137mM NaCl、2.68mM KC1、 ρΗ7· 4)。
[0173] C5結(jié)合多妝的n策菌體展示選擇:基本上如Gr0nwall 等人J Biotechnol2007, 128:162-183 中所述的構(gòu)建于噬菌粒 pAffil/pAY00065/pAY02947/ PAY02592中的展示在噬菌體上的蛋白質(zhì)Z的隨機變體的文庫，被用于選擇C5結(jié)合多肽。使 用三種不同的文庫載體。其中的兩種利用白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域（ABD，來自鏈球菌菌株G148 的蛋白質(zhì)G的GA3)作為Z變體的融合伴侶（fusion partner),產(chǎn)生文庫Zlib003Naive. I和Zlib006Naive. II。第三文庫，Zlib004Naive. I利用Taq DNA聚合酶結(jié)合分子 Z03639(在 Gunneriusson 等人 Protein Engl999, 12:873-878 中指定為 Ζτ_η)作為融合伴 侶。文庫具有以下實際大小：3\109(汾讓003恥"&1) ;1.5父101°(21讓006恥"&11);和 1. 4Χ 101Q(Zlib004NaiVe· I)，數(shù)值指變體的數(shù)量。
[0174] 如在前的Gr0nwall等人所描述的在搖瓶中（Zlib003Naive. I)或在201發(fā)酵 罐中（Zlib006Naive. II和Zlib004Naive. I)制備噬菌體原液（stock)。將來自含有噬 菌粒文庫Zlib004Naive. I的甘油原液（glycreol stock)的細胞接種于201補充有2% 葡萄糖和100 μ g/ml氨節(jié)青霉素的TSB-YE(胰蛋白酶大豆肉湯-酵母提取物（Tryptic Soy Broth-Yeast Extract) ;30g/l TSB、5g/l酵母提取物）中。將來自含有噬菌粒文庫 Zlib006Naive. II的甘油原液的細胞接種于201補充有100μ g/ml氨芐青霉素的定義的無 脯氨酸培養(yǎng)基[磷酸氫二鉀7g/l、檸檬酸三鈉二水合物lg/Ι、尿嘧啶0. 02g/l、YNB(DifC0? 不含氨基酸的酵母氮源基礎，Becton Dickinson)6. 7g/l、葡萄糖一水合物5. 5g/l、L-丙氨 酸0. 3g/l、L-精氨酸單鹽酸鹽0. 24g/l、L-天冬酰胺一水合物0. llg/l、L-半胱氨酸0. lg/ 1、L-谷氨酸0. 3g/l、L-谷氨酰胺0. lg/1、甘氨酸0. 2g/l、L-組氨酸0. 05g/l、L-異亮氨 酸0. lg/1、L-亮氨酸0. lg/1、L-賴氨酸單鹽酸鹽0. 25g/l、L-甲硫氨酸0. lg/1、L-苯丙 氨酸0· 2g/l、L-絲氨酸(λ 3g/l、L-蘇氨酸(λ 2g/l、L-色氨酸(λ lg/1、L-酪氨酸(λ 05g/ 1、L_ 繳氨酸 0.1g/l]中。培養(yǎng)物（cultivation)于 37°C在發(fā)酵罐（Belach Bioteknik, BR20)中生長。當細胞達到0. 7-0. 8的光密度（0D)時，使用10x摩爾過量的M13K07輔助 噬菌體（New England Biolabs#N0315S)感染約2. 61的培養(yǎng)物。將細胞溫育30分鐘，屆時 (whereupon)發(fā)酵罐充滿至201的補充有100 μ M IPTG (異丙基-β -D-1-硫代半乳糖苷， 用于誘導表達）、25μ g/ml卡那霉素和12. 5μ g/ml羧芐青霉素的TSB-YE，并在30°C生長 22小時。培養(yǎng)物中的細胞通過在15900g的離心沉淀，且其后保留在培養(yǎng)基中的噬菌體顆 粒在PEG/NaCl (聚乙二醇/氯化鈉）中沉淀兩次、過濾、并溶解于PBS和甘油中，如在前的 Gr0nwa11等人所描述的。使用之前，噬菌體原液被保存在_80°C。
[0175] 在四個循環(huán)中針對生物素化的hC5進行選擇。噬菌體原液制備、選擇程序和選 擇循環(huán)之間噬菌體的擴增，基本上如在冊2009/077175中描述的進行。補充有3%牛血 清白蛋白（BSA)和0. 1 %吐溫20的PBS被用作選擇緩沖液，且靶-噬菌體復合物通過 Dyiiabeads? M-280鏈霉親和素（Dynal，目錄號112. 06)被直接捕獲。每10yg補體蛋 白質(zhì)C5使用lmg珠子。大腸桿菌菌株RR1AM15被用于噬菌體擴增。在選擇的循環(huán)1中， 使用100nM hC5并進行用PBST0. 1 % (補充有0. 1 %吐溫-20的PBS)的兩次洗滌。在隨后 的3個循環(huán)中，應用了使用降低的靶濃度和增加的洗滌次數(shù)的增加嚴格性。在循環(huán)2、3和 4中，使用50或33nM hC5、25或llnMhC5和12. 5或3. 7nM hC5。在循環(huán)2、3和4中，使用 在所有循環(huán)中的PBST0. 1%或循環(huán)2、3和4中的PBST0. 2%、0. 3%和0. 4%進行4、6和8次 洗漆。
[0176] Z變體的ELISA篩詵：為了測定詵擇的Z變體分子是否確實能夠與人補體蛋白 質(zhì)C5相互作用，進行了 ELISA測定。通過將來自選擇物（selections)的單菌落接種到深 孔平板（Nunc,目錄號278752)中的補充有100 μ g/ml氨芐青霉素和0. ImM IPTG的lml TSB-YE培養(yǎng)基中制備Z變體。平板在37°C溫育18-24h。細胞通過離心沉淀，重懸于300 μ 1 PBST0. 05%中并于-80°C冷凍，以釋放細胞的周質(zhì)部分。冷凍的樣品在水浴中解凍，并通過 離心沉淀細胞。周質(zhì)上清液包含與白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域（來自鏈球菌菌株G148的蛋白質(zhì)G 的 GA3)融合的 Z 變體，表示為 AQHDEALE-[Z#####]-VDYV-[ABD]-YVPG( Gronwall等人，同 上），或與Taq DNA聚合酶結(jié)合分子Z03639融合的Z變體，表示為AQHDEALE-[Z#####]-VDY V-[Z03639]-YVPG。Z#####是指單獨的58個氨基酸殘基的Z變體。
[0177] 半?yún)^(qū)96孔ELISA平板（Costar，目錄號3690)以50 μ 1/孔的含有4 μ g/ml的Z變 體特異性的抗體（Affibody，目錄號20. 1000. 01. 0005)的包被緩沖液（50mM碳酸鈉，ρΗ9· 6) 包被并在4°C溫育過夜。將抗體溶液倒出，并將孔以100μ 1的PBSC(PBS補充以0. 5%酪蛋 白（Sigma，目錄號C8654))于RT封閉l-2h。將封閉溶液丟棄，并加入50 μ 1周質(zhì)溶液至孔 中，并于RT在緩慢搖動下溫育lh。將上清液倒出，并將孔以PBST0. 05%洗滌4次。然后，向 每個孔加入50 μ 1的PBSC中5 μ g/ml濃度的生物素化的補體蛋白質(zhì)hC5。將平板在RT溫 育1. 5h，隨后如上所述的洗滌。鏈霉親和素 -HRP (辣根過氧化物酶；Dako,目錄號P0397)在 PBSC中1:10, 000稀釋，加入孔中，然后將其溫育45min。如以上描述的洗滌之后，將50 μ 1 ImmunoPure ΤΜΒ底物（Thermo Scientific,目錄號34021)加入孔中，并將平板按照制造商 的建議處理。使用多孔平板讀取器Victor3 (Perkin Elmer)，在450nm處測量孔的吸光度。
[0178] 作為陽性對照，還包含表示為 AQHDEALE-[Z03938]-VDYV-[Z03639]-YVPG 的 PSMA 結(jié)合分子Z03938的周質(zhì)部分，針對5 μ g/ml生物素化的PSMA蛋白質(zhì)被測定。作為陰性對 照；相同的周質(zhì)制品針對補體蛋白質(zhì)hC5被測定。針對具有針對hC5的陽性吸光度的克隆 進行測序。
[0179] 測序：使用標準 PCR 程序和引物 AFFI-21 (5' -tgcttccggctcgtatgttgtgtg)和 A FFI_22(5' -cggaaccagagccaccaccgg)從單菌落擴增PCR片段。使用生物素化的寡核苷酸 AFFI-72 (5' -生物素-cggaaccagagccaccaccgg)和按照制造商的方案使用的BigDye? Terminator v3.1Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems)進行擴增片段的測序。測序 反應物通過使用Magnatrix8000 (Magnetic Biosolution)結(jié)合至磁性鏈霉親和素包被的珠 子（Detach Streptavidin Beads，Nordiag，目錄號 2012-01)來純化，并在 ABI. PRISM? 3100Genetic Analyzer (PE Applied Biosystems)上分析。
[0180] 陽斷ELISA :將在ELISA篩選中發(fā)現(xiàn)對hC5陽性的克隆經(jīng)受ELISA阻斷測定，以闡 明它們的靶結(jié)合是否受hC5結(jié)合蛋白質(zhì)OmCI和/或hMG7結(jié)合蛋白質(zhì)存在的影響。如以上 ELISA篩選部分描述的，但設置5ml培養(yǎng)物于12ml圓底管中并使用2ml PBST0. 05%用于沉 淀物溶解，使用在周質(zhì)部分表達的Z變體進行阻斷ELISA。ELISA阻斷測定如ELISA篩選測 定進行，具有在靶步驟引入的修改的方案：在加入測定平板之前OmCI或hMG7結(jié)合蛋白質(zhì)與 靶蛋白質(zhì)混合。5 μ g/ml生物素化的hC5分別與5倍或20倍摩爾過量的OmCI或hMG7結(jié)合 蛋白質(zhì)混合，然后在RT下溫育lh以允許在加入平板之前復合物的形成。如下分別獲得每 個克隆的參考（1)、陰性對照（2)和背景（3)的響應/信號：在靶步驟，僅將hC5加入Z變 體（如在篩選ELISA中的）（1);將不相關(guān)的蛋白質(zhì)PSMA(內(nèi)部制備）代替OmCI或hMG7結(jié) 合蛋白質(zhì)加入補體蛋白hC5 (2);只向Z變體加入緩沖液（3)。
[0181] 結(jié)果
[0182] 補體蛋白質(zhì)C5結(jié)合多狀的噬菌體展示詵擇:在針對生物素化的hC5的2-4個循環(huán) 的噬菌體展示選擇之后獲得單個克隆。
[0183] Z奪體的ELISA篩詵:4個循環(huán)的選擇后獲得的克隆在96孔板中制備，并在ELISA 中篩選補體蛋白質(zhì)C5的結(jié)合活性?？傆嫿?00個克隆被篩選。吸光度測量顯示許多明確 的hC5陽性克隆。來自克隆的選擇的結(jié)果展示在表1中；Z05363(SEQ ID N0:510)變體以 ABD加標簽，而其它列出的Z變體以Taq結(jié)合分子Z03639加標簽，如在方法部分描述的。用 作陰性對照的PSMA特異性分子Z03938,給出了針對PSMA的陽性信號，而沒有獲得針對hC5 的信號。
[0184] 陽斷ELISA :hC5陽性的克隆經(jīng)受使用hC5結(jié)合蛋白質(zhì)OmCI和hMG7結(jié)合蛋白質(zhì)的 阻斷測定。對于5個克隆，對補體蛋白質(zhì)C5的結(jié)合信號通過OmCI的存在被完全消除，達到 與背景相同的水平（表1)。還測試了這些克隆中的一個，即Z05363變體（SEQ ID N0:510)， 以確認其在hMG7結(jié)合蛋白質(zhì)的存在下結(jié)合hC5的能力。hMG7結(jié)合蛋白質(zhì)不抑制Z05363與 hC5的結(jié)合。
[0185] 表1. ELISA中具有或不具有一些Z變體的阻斷分子的情況下對靶的響應。
[0186]
【權(quán)利要求】
1. C5結(jié)合多肽，所述C5結(jié)合多肽包括C5結(jié)合基序，BM，所述基序由選自以下的氨基酸 序列構(gòu)成： i) EX2X3X4A X6X7EID XnLPNL X16X17X18Qff X21AFIX25X26LX28D, 其中，彼此獨立地， X2 選自 H、Q、S、T和 V; X3選自I、L、M和V ; X4 選自 A、D、Ε、Η、K、L、N、Q、R、S、T 和 Y ; X6選自N和W ; 父7選自六、03、!1、隊〇、1?、3和1'; Xn 選自 A、E、G、Η、K、L、Q、R、S、T 和 Y ; X16選自N和T ; Χ17選自I、L和V; X18 選自 A、D、Ε、Η、K、N、Q、R、S 和 T ; X21選自I、L和V; 乂25選自〇3、6、!1、隊3和1'; X26選自K和S ; X28 選自 A、D、E、Η、N、Q、S、T 和 Y ; 以及 ii) 與i)中定義的序列具有至少86%同一性的氨基酸序列， 其中所述多肽結(jié)合C5。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的C5結(jié)合多肽，其中X2選自Η、T和V。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的C5結(jié)合多肽，其中X2選自T和V。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的C5結(jié)合多肽，其中X2是V。
5. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的C5結(jié)合多肽，其中X3選自I、L和V。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的C5結(jié)合多肽，其中X3選自I和L。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的C5結(jié)合多肽，其中X3是I。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的C5結(jié)合多肽，其中X3是L。
9. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的C5結(jié)合多肽，其中X4選自A、D、E、K、L、Q和R。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的C5結(jié)合多肽，其中X4選自A、D、E、K、和R。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的C5結(jié)合多肽，其中X4選自D和E。
12. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的C5結(jié)合多肽，其中X6是W。
13. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的C5結(jié)合多肽，其中X7選自A、D、N和T。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的C5結(jié)合多肽，其中X7選自D和N。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的C5結(jié)合多肽，其中X7是D。
16. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的C5結(jié)合多肽，其中X7是N。
17. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的C5結(jié)合多肽，其中Xn選自A、Η、K、Q、R和S。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的C5結(jié)合多肽，其中Xn選自A、Η、K和R。
19. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的C5結(jié)合多肽，其中Xn選自A、K和R。
20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的C5結(jié)合多肽，其中Xn選自K和R。
21. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的C5結(jié)合多肽，其中X16是T。
22. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的C5結(jié)合多肽，其中Χ17選自I和L。
23. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的C5結(jié)合多肽，其中Χ17是I。
24. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的C5結(jié)合多肽，其中Χ17是L。
25. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的C5結(jié)合多肽，其中Χ18選自
26. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的C5結(jié)合多肽，其中Χ18選自A、D、E、Q和S。
27. 根據(jù)權(quán)利要求26所述的C5結(jié)合多肽，其中Χ18選自D、Ε和Q。
28. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的C5結(jié)合多肽，其中Χ18選自D和Ε。
29. 根據(jù)權(quán)利要求28所述的C5結(jié)合多肽，其中Χ18是D。
30. 根據(jù)權(quán)利要求28所述的C5結(jié)合多肽，其中Χ18是Ε。
31. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的C5結(jié)合多肽，其中X21選自I和L。
32. 根據(jù)權(quán)利要求31所述的C5結(jié)合多肽，其中X21是I。
33. 根據(jù)權(quán)利要求31所述的C5結(jié)合多肽，其中X21是L。
34. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的C5結(jié)合多肽，其中X25選自Ε、Η、N和T。
35. 根據(jù)權(quán)利要求34所述的C5結(jié)合多肽，其中X25選自E和N。
36. 根據(jù)權(quán)利要求35所述的C5結(jié)合多肽，其中X25是N。
37. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的C5結(jié)合多肽，其中X26是K。
38. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的C5結(jié)合多肽，其中X28選自八、04、!1、隊〇和5。
39. 根據(jù)權(quán)利要求38所述的C5結(jié)合多肽，其中X28選自A、D、E和S。
40. 根據(jù)權(quán)利要求39所述的C5結(jié)合多肽，其中X28選自A、D和E。
41. 根據(jù)權(quán)利要求40所述的C5結(jié)合多肽，其中X28選自D和E。
42. 根據(jù)權(quán)利要求41所述的C5結(jié)合多肽，其中X28是D。
43. 根據(jù)權(quán)利要求8-11中任一項所述的C5結(jié)合多肽，其中X3X4選自LE和LD。
44. 根據(jù)權(quán)利要求22-30中任一項所述的C5結(jié)合多肽，其中X17X18選自IE和LD。
45. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的C5結(jié)合多肽，其中所述氨基酸i)滿足以下八個 條件I-VIII中的至少四個： I. X2 是 V ; Π .Χ3選自I和L ; ΙΙΙ·Χ6是W; VI.X7選自D和Ν; V. X17選自I和L ; VI. X^L; VII. XjN; VIII. X28 是0。
46. 根據(jù)權(quán)利要求45所述的C5結(jié)合多肽，其中所述氨基酸序列i)滿足所述八個條件 I-VIII中的至少五個。
47. 根據(jù)權(quán)利要求46所述的C5結(jié)合多肽，其中所述氨基酸序列i)滿足所述八個條件 I-VIII中的至少六個。
48. 根據(jù)權(quán)利要求47所述的C5結(jié)合多肽，其中所述氨基酸序列i)滿足所述八個條件 I-VIII中的至少七個。
49. 根據(jù)權(quán)利要求48所述的C5結(jié)合多肽，其中所述氨基酸序列i)滿足所述八個條件 I-VIII的全部。
50. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的C5結(jié)合多肽，其中所述氨基酸序列選自SEQ ID NO: 1-248中的任一個。
51. 根據(jù)權(quán)利要求50所述的C5結(jié)合多肽，其中所述氨基酸序列選自以下的任一個：SEQ ID NO:1-12,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:23-24,SEQ ID NO:26-28,SEQ ID NO:32-35,SEQ ID N0:38-39、SEQ ID N0:41、SEQ ID N0:46、SEQ ID N0:49、SEQ ID N0:56-57、SEQ ID N0:59、 SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:78-79、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO: 106、SEQ ID N0:110、SEQ ID N0:119、SEQ ID N0:125、SEQ ID N0:141、SEQ ID N0:151、SEQ ID N0:161、 SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:197、SEQ ID NO:203、SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:215 和 SEQ ID NO:243。
52. 根據(jù)權(quán)利要求51所述的C5結(jié)合多肽，其中所述氨基酸序列選自SEQ ID NO: 1-12 中的任一個。
53. 根據(jù)權(quán)利要求52所述的C5結(jié)合多肽，其中所述氨基酸序列選自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO:4 和 SEQ ID NO: 5 中的任一個。
54. 根據(jù)權(quán)利要求53所述的C5結(jié)合多肽，其中所述氨基酸序列選自SEQ ID NO: 1和 SEQ ID NO:4。
55. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的C5結(jié)合多肽，其中所述C5結(jié)合基序形成三螺旋 束蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的部分。
56. 根據(jù)權(quán)利要求55所述的C5結(jié)合多肽，其中所述C5結(jié)合基序基本上形成所述三螺 旋束蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域中具有互連環(huán)（interconnecting loop)的兩個α-螺旋的部分。
57. 根據(jù)權(quán)利要求55或56所述的C5結(jié)合多肽，其中所述三螺旋束蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域選自 來自金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)的蛋白質(zhì)Α的結(jié)構(gòu)域及其衍生物。
58. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的C5結(jié)合多肽，所述C5結(jié)合多肽包括選自以下的 氨基酸序列： i) K-[BM]-DPSQS XaXbLLXe EAKKL NDXdQ; 其中 [BM]是如權(quán)利要求1-54中任一項定義的C5結(jié)合基序； Xa選自A和S ; Xb選自N和E ; X。選自A、S和C ; Xd選自A和S ; 以及 ii) 與以上定義的任一序列具有至少79%同一性的氨基酸序列。
59. 根據(jù)權(quán)利要求58所述的C5結(jié)合多肽，其中Xa是A。
60. 根據(jù)權(quán)利要求58所述的C5結(jié)合多肽，其中Xa是S。
61. 根據(jù)權(quán)利要求58-60中任一項所述的C5結(jié)合多肽，其中Xb是N。
62. 根據(jù)權(quán)利要求58-60中任一項所述的C5結(jié)合多肽，其中Xb是E。
63. 根據(jù)權(quán)利要求58-62中任一項所述的C5結(jié)合多肽，其中X。是A。
64. 根據(jù)權(quán)利要求58-62中任一項所述的C5結(jié)合多肽，其中X。是S。
65. 根據(jù)權(quán)利要求58-62中任一項所述的C5結(jié)合多肽，其中X。是C。
66. 根據(jù)權(quán)利要求58-65中任一項所述的C5結(jié)合多肽，其中Xd是A。
67. 根據(jù)權(quán)利要求58-65中任一項所述的C5結(jié)合多肽，其中Xd是S。
68. 根據(jù)權(quán)利要求58所述的C5結(jié)合多肽，其中Xa是A ;Xb是N ;X。是A且Xd是A。
69. 根據(jù)權(quán)利要求58所述的C5結(jié)合多肽，其中Xa是A ;Xb是N ;X。是C且Xd是A。
70. 根據(jù)權(quán)利要求58所述的C5結(jié)合多肽，其中Xa是S ;Xb是E ;X。是S且Xd是S。
71. 根據(jù)權(quán)利要求58所述的C5結(jié)合多肽，其中Xa是S ;Xb是E ;X。是C且Xd是S。
72. 根據(jù)權(quán)利要求58-71中任一項所述的C5結(jié)合多肽，其中所述氨基酸序列選自SEQ ID NO :249-496 中的任一個。
73. 根據(jù)權(quán)利要求72所述的C5結(jié)合多肽，其中所述氨基酸序列選自以下的任一個： SEQ ID NO:249-260, SEQ ID N0:268, SEQ ID NO:271-272, SEQ ID NO:274-276, SEQ ID NO:280-283、SEQ ID NO:286-287、SEQ ID NO:289、SEQ ID NO:294、SEQ ID NO:297、SEQ ID NO:304-305、SEQ ID NO:307、SEQ ID NO:314、SEQ ID NO:326-327、SEQ ID NO:335、SEQ ID NO:340、SEQ ID NO:354、SEQ ID NO:358、SEQ ID NO:367、SEQ ID NO:373、SEQ ID NO:389、 SEQ ID NO:399、SEQ ID NO:409、SEQ ID NO:414、SEQ ID NO:435、SEQ ID NO:445、SEQ ID N0:451、SEQ ID N0:453、SEQ ID N0:463 和 SEQ ID N0:491。
74. 根據(jù)權(quán)利要求73所述的C5結(jié)合多肽，其中所述氨基酸序列選自SEQ ID NO :249-260中的任一個。
75. 根據(jù)權(quán)利要求74所述的C5結(jié)合多肽，其中所述氨基酸序列選自SEQ ID NO:249、 SEQ ID NO: 250、SEQ ID NO: 251、SEQ ID NO:252 和 SEQ ID NO:253 中的任一個。
76. 根據(jù)權(quán)利要求75所述的C5結(jié)合多肽，其中所述氨基酸序列選自SEQ ID NO: 249和 SEQ ID NO :252 中的任一個。
77. 根據(jù)權(quán)利要求1-57中任一項所述的C5結(jié)合多肽，所述C5結(jié)合多肽包括選自以下 的氨基酸序列： i) YAK-[BM]-DPSQS SELLX。EAKKL NDSQA P; 其中[BM]是如權(quán)利要求1-54中任一項定義的C5結(jié)合基序，且X。選自S和C ;以及 ii) 與以上定義的任一序列具有至少81%同一性的氨基酸序列。
78. 根據(jù)權(quán)利要求1-57中任一項所述的C5結(jié)合多肽，所述C5結(jié)合多肽包括選自以下 的氨基酸序列： i) FNK-[BM]-DPSQS ANLLX。EAKKL NDAQA P ; 其中[BM]是如權(quán)利要求1-54中任一項定義的C5結(jié)合基序，且X。選自A和C ;以及 ii) 與以上定義的任一序列具有至少81%同一性的氨基酸序列。
79. 根據(jù)權(quán)利要求1-57中任一項所述的C5結(jié)合多肽，其中所述氨基酸序列選自SEQ ID NO :497-757中的任一個。
80. 根據(jù)權(quán)利要求79所述的C5結(jié)合多肽，其中所述氨基酸序列選自以下的任一個： SEQ ID NO:497-508, SEQ ID N0:516, SEQ ID NO:519-520, SEQ ID NO:522-524, SEQ ID NO:528-531、SEQ ID NO:534-535、SEQ ID NO:537、SEQ ID NO:542、SEQ ID NO:545、SEQ ID N0:552-553、SEQ ID N0:555、SEQ ID N0:562、SEQ ID N0:574-575、SEQ ID N0:583、SEQ ID N0:588、SEQ ID N0:602、SEQ ID N0:606、SEQ ID N0:615、SEQ ID N0:621、SEQ ID N0:637、 SEQ ID N0:647、SEQ ID N0:657、SEQ ID N0:662、SEQ ID N0:683、SEQ ID N0:693、SEQ ID N0:699、SEQ ID N0:701、SEQ ID N0:711、SEQ ID N0:739 和 SEQ ID N0:746-757。
81. 根據(jù)權(quán)利要求80所述的C5結(jié)合多肽，其中所述氨基酸序列選自SEQ ID NO :497-508 和 SEQ ID NO :746-757 中的任一個。
82. 根據(jù)權(quán)利要求81所述的C5結(jié)合多肽，其中所述氨基酸序列選自以下的任一個： SEQ ID NO:497、SEQ ID NO:498、SEQ ID NO:499、SEQ ID NO:500、SEQ ID NO:501、SEQ ID NO:746、SEQ ID NO:747、SEQ ID NO:748、SEQ ID NO:750 和 SEQ ID NO:753。
83. 根據(jù)權(quán)利要求82所述的C5結(jié)合多肽，其中所述氨基酸序列選自SEQ ID N0:497和 SEQ ID NO: 500、SEQ ID NO:748 和 SEQ ID NO:753 中的任一個。
84. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的C5結(jié)合多肽，所述C5結(jié)合多肽抑制C5的裂解。
85. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的C5結(jié)合多肽，其中所述C5結(jié)合多肽與C5結(jié) 合使得相互作用的KD值為至多1 X 10_6M，諸如至多1 X 10_7M、諸如至多1 X 10_8M、諸如至多 1 X 1(Γ9Μ。
86. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的C5結(jié)合多肽，其中所述C5結(jié)合多肽還包括改善 所述多肽的制備、純化、體內(nèi)或體外穩(wěn)定性、偶聯(lián)、或檢測的C末端和/或Ν末端氨基酸。
87. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的C5結(jié)合多肽，所述C5結(jié)合多肽呈多聚體形式， 所述多聚體形式包括至少兩個C5結(jié)合多肽的單體單元，所述C5結(jié)合多肽的單體單元的氨 基酸序列可以是相同的或不同的。
88. 根據(jù)權(quán)利要求87所述的C5結(jié)合多肽，其中所述C5結(jié)合多肽單體單元被表達為融 合蛋白。
89. 根據(jù)權(quán)利要求87或88所述的C5結(jié)合多肽，所述C5結(jié)合多肽呈二聚體形式。 90. C5結(jié)合化合物，所述C5結(jié)合化合物包括至少一種根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述 的C5結(jié)合多肽；至少一種鏈球菌蛋白質(zhì)G的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，或其衍生物；以及至少一 種連接部分，所述連接部分用于將所述至少一種結(jié)構(gòu)域或其衍生物連接至所述至少一種C5 結(jié)合多肽的C末端或Ν末端。
91. 根據(jù)權(quán)利要求90所述的C5結(jié)合化合物，具有選自以下的結(jié)構(gòu)： [CBP1]-[L1]-[ALBD]； [CBP1]-[CBP2]-[L1]-[ALBD]； [CBP1]-[L1]-[ALBD]-[L2]-[CBP2]； [ALBD]-[L1]-[CBP1]； [ALBD]-[L1]-[CBP1]-[CBP2]； [CBP1]-[L1]-[CBP2]-[L2]-[ALBD];和 [ALBD]-[LI]-[CBP1]-[L2]-[CBP2] 其中，彼此獨立地， [CBP1]和[CBP2]是C5結(jié)合多肽，其可以是相同的或不同的； [L1]和[L2]是連接部分，其可以是相同的或不同的；和 [ALBD]是鏈球菌蛋白質(zhì)G的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，或其衍生物。
92. 根據(jù)權(quán)利要求91所述的C5結(jié)合化合物，具有選自以下的結(jié)構(gòu)： [CBP1]-[L1]-[ALBD]； [CBP1]-[CBP2]-[L1]-[ALBD];和 [CBP1]-[LI]-[ALBD]-[L2]-[CBP2]。
93. 根據(jù)權(quán)利要求91所述的C5結(jié)合化合物，其中所述連接部分選自G、GS ; [G2S]n ; [G3S]n ; [G4S]n ;GS[G4S]n，其中 η 是 0-7 ; [S2G]m ; [S3G]m ; [S4G]m ;其中 m 是 0-7,以及 VDGS。
94. 根據(jù)權(quán)利要求93所述的C5結(jié)合化合物，其中所述連接部分選自GS和GS[G4S]2。
95. 根據(jù)權(quán)利要求90-94中任一項所述的C5結(jié)合化合物，其中所述白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域 如SEQ ID NO:759中所列。
96. 根據(jù)權(quán)利要求90-95中任一項所述的C5結(jié)合化合物，其中所述C5結(jié)合多肽的每一 個獨立地選自如權(quán)利要求79-83中任一項定義的多肽。
97. 根據(jù)權(quán)利要求96所述的C5結(jié)合化合物，其中所述C5結(jié)合多肽的每一個獨立地選 自如權(quán)利要求83中定義的多肽。
98. 多核苷酸，所述多核苷酸編碼根據(jù)權(quán)利要求1-89中任一項所述的多肽或根據(jù)權(quán)利 要求90-97中任一項所述的化合物。
99. 表達載體，所述表達載體包括根據(jù)權(quán)利要求98所述的多核苷酸。
100. 宿主細胞，所述宿主細胞包括根據(jù)權(quán)利要求99所述的表達載體。
101. 根據(jù)權(quán)利要求1-89中任一項所述的C5結(jié)合多肽或根據(jù)權(quán)利要求90-97中任一項 所述的C5結(jié)合化合物與治療劑的組合。
102. 根據(jù)權(quán)利要求1-89中任一項所述的C5結(jié)合多肽、根據(jù)權(quán)利要求90-97中任一項 所述的C5結(jié)合化合物、或根據(jù)權(quán)利要求101所述的組合，用于在治療中使用。
103. 根據(jù)權(quán)利要求1-89中任一項所述的C5結(jié)合多肽、根據(jù)權(quán)利要求90-97中任一項 所述的C5結(jié)合化合物、或根據(jù)權(quán)利要求101所述的組合，用于治療C5相關(guān)的狀況。
104. 根據(jù)權(quán)利要求1-89中任一項所述的C5結(jié)合多肽、根據(jù)權(quán)利要求90-97中任一項 所述的C5結(jié)合化合物、或根據(jù)權(quán)利要求101所述的組合，用于治療選自以下的C5相關(guān)的 狀況：炎性疾病；自身免疫性疾??；傳染病；心血管疾??；神經(jīng)退行性紊亂；癌癥；移植物損 傷；創(chuàng)傷；眼部疾??；腎臟疾病；肺部疾病；血液疾??；變應性疾病和皮膚病。
105. 根據(jù)權(quán)利要求1-89中任一項所述的C5結(jié)合多肽、根據(jù)權(quán)利要求90-97中任一項 所述的C5結(jié)合化合物、或根據(jù)權(quán)利要求101所述的組合，用于治療陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿 (PNH)。 106. C5相關(guān)的狀況的治療方法，所述治療方法包括將根據(jù)權(quán)利要求1-89中任一項所 述的C5結(jié)合多肽、根據(jù)權(quán)利要求90-97中任一項所述的C5結(jié)合化合物、或根據(jù)權(quán)利要求 101所述的組合施用至有相應需要的哺乳類受試者。
107. 根據(jù)權(quán)利要求106所述的治療方法，其中所述C5結(jié)合多肽、所述C5結(jié)合化合物、 或所述組合與C5的結(jié)合抑制C5的裂解。
108. 根據(jù)權(quán)利要求106或107所述的治療方法，其中所述C5相關(guān)的狀況選自炎性疾 ??；自身免疫性疾?。粋魅静?；心血管疾??；神經(jīng)退行性紊亂；癌癥；移植物損傷；創(chuàng)傷；眼 部疾??；腎臟疾??；肺部疾??；血液疾病；變應性疾病和皮膚病。
109. 根據(jù)權(quán)利要求108所述的治療方法，其中所述C5相關(guān)的狀況是陣發(fā)性夜間血紅蛋 白尿（PNH)。
110.根據(jù)權(quán)利要求106至109中任一項所述的治療方法，其中所述C5結(jié)合多肽被靜脈 內(nèi)、皮下、通過吸入、經(jīng)鼻、口服、玻璃體內(nèi)、或局部施用。
【文檔編號】A61P9/00GK104114574SQ201380009789
【公開日】2014年10月22日 申請日期:2013年2月19日 優(yōu)先權(quán)日:2012年2月20日
【發(fā)明者】夏洛塔·伯格哈德, 馬格納斯·伯格倫德, 帕特里克·斯托姆博格, 馬林·林德堡, 埃琳·貢內(nèi)里烏松, 約阿希姆·菲爾德維什 申請人:瑞典孤兒比奧維特魯姆有限公司