一種腦神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)用藥學(xué)組成物及其生產(chǎn)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種含有以蓮子心提取物為有效成份的腦神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)用藥學(xué)組成物及食品組成物。具體講，就是所述組成物的特征在于，具有活性氧類(reactive?oxygen?species；ROS)清除活性或者所述組成物具有抗氧化活性。進(jìn)一步講，就是所述抗氧化活性的特征在于，具有DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhy?drazyl)自由基清除能力或者具有過氧化氫(H2O2)清除能力。另外,本發(fā)明利用從天然物中提取的物質(zhì)，對(duì)人體非常安全，為食品、制藥領(lǐng)域提供了一種源于天然物的基礎(chǔ)性材料。
【專利說明】一種腦神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)用藥學(xué)組成物及其生產(chǎn)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種含有以蓮子心提取物為有效成份的腦神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)用藥學(xué)組成 物。

【背景技術(shù)】
[0002] 蓮科的蓮花其所有部分在中藥配方中都具有非常突出的功能和療效，蓮堿 (roemerine)、荷葉堿（nuciferine)具有很好的鎮(zhèn)痛作用、鎮(zhèn)靜作用等。民間不僅將其用于 治療肺炎、哮喘、淋病、體虛、消化不良等病癥，而且被蛇和毒蟲咬傷時(shí)也用它來治療。研究 表明，它有助于強(qiáng)身健體、消除疲勞、安心定神，長期攝食能夠增進(jìn)健康。蓮子肉是指將蓮 的種子剝掉種皮后曬干的藥材，日本將這種植物稱作蓮肉，中國將這種植物的種子稱為蓮 子，將成熟種子內(nèi)的干燥嫩葉和幼根稱為蓮子心。蓮子肉幾乎沒有氣味，味道甘甜，如果將 其用于中藥或食品等產(chǎn)品中可以減輕反感。所述蓮子肉的長相呈橢圓形或球狀，一側(cè)圓鼓 鼓地突出，外面呈淡淡的黃褐色或紅褐色，附有灰白色的粉末，并帶有垂直細(xì)條紋和比較明 顯的脈狀花紋。種皮比較薄，呈黃褐色，不容易剝掉。種皮內(nèi)有2片子葉，呈黃白色，比較厚， 中間的空隙內(nèi)有綠色的蓮子心。
[0003] 近來，隨著人們生活水平不斷提高，平均壽命延長，老年人口所占比重日漸升高。 從韓國人的死亡原因來看，中風(fēng)、癡呆癥、精神障礙及行動(dòng)障礙等腦部疾病已經(jīng)成為繼癌 癥及循環(huán)器官疾病之后占第二高的死亡原因，從單一臟器疾病來看，它是最高的死亡原因 (韓國統(tǒng)計(jì)年鑒，按性別、年齡階層、死亡原因統(tǒng)計(jì)的死亡人數(shù)，1996)。比較具有代表性的 腦部疾病有阿爾茲海默癥(Alzheimer's disease)、多發(fā)性硬化癥(Multiple sclerosis)、 帕金森綜合癥（Parkinson's disease)、中風(fēng)（stroke)、局部貧血（ischemia)等。特別 是，以阿爾茲海默癥、帕金森綜合癥、中風(fēng)等為主的老年性腦部疾病其主要的病因就是在腦 細(xì)胞內(nèi)自由基形成過程中伴隨產(chǎn)生的氧化應(yīng)激（Smith, M. A.，J. Neurochem.，1997, Supp. Sl，69, 19)。
[0004] 氧化應(yīng)激意味著細(xì)胞或組織被毒性自由基（toxic free radical)損害。研究 表明，氧化應(yīng)激導(dǎo)致的神經(jīng)元受損（neuronal damage)與正常老化過程中發(fā)生的腦細(xì) 胞損傷及阿爾茲海默癥、帕金森綜合癥、肌肉萎縮癥、癡呆癥等腦神經(jīng)組織退行性疾病 (neurodegenerative disease)相關(guān)。因?yàn)槟X組織對(duì)自由基的攻擊特別敏感，這一因素成 了腦神經(jīng)元防御機(jī)制的致命攻擊，同時(shí)容易被氧化的長鏈多不飽和脂肪酸（long chain unsaturated fatty acids)以較高的濃度存在，而且還存在形成自由基時(shí)被用作催化 劑的金屬離子（Fe2+，Cu2+)等。報(bào)告顯示，退行性腦神經(jīng)疾病的主要病因是由于活性氧類 (reactive oxygen species, R0S)積累導(dǎo)致氧化應(yīng)激引起的（01ney，J.W.et al.，Brain Res，1974, 77, 507-512)。谷氨酸（glutamate)是一種氨基酸，作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的 興奮性神經(jīng)傳導(dǎo)物質(zhì)，過高的谷氨酸（glutamate)濃度會(huì)抑制N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl cystein)吸收從而誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)。
[0005] 據(jù)報(bào)告，現(xiàn)在有許多天然抗氧化劑針對(duì)細(xì)胞內(nèi)生成的含氧基有很好的抗氧化保 護(hù)效果，主要涉及中藥材或食品成份的抗氧化功能，大部分用于肝組織的研究（Park，J. C. et al. , J. Korean Soc. Food Nutr. , 1996, 25, 588-592 ；Kim, M. R. et al. , J. Food. Sci. Nutr. , 1997, 2, 207 ;Kim, Mee Ree, et al. , Food Res. Inti. , 1999, 31 (5), 389-394)，目前利 用生物資源對(duì)腦組織保護(hù)的研究還不完善。
[0006] 另外，申請(qǐng)編號(hào)為10-2009-0077620的專利中記載了一種以含有蓮子肉為特征的 應(yīng)激反應(yīng)及恐慌障礙預(yù)防及治療用藥學(xué)組成物。韓國注冊(cè)專利10-0751047號(hào)記載了一種 含有蓮根或蓮子心的醉酒預(yù)防及緩解用食品組成物。韓國注冊(cè)專利10-0949926號(hào)記載了 一種含有蓮子肉提取物等中藥材復(fù)合提取物具有消炎、抗氧化及美白、抗菌效果的功能性 化妝品組成物。但是，以上這些專利均未提到蓮子心提取物具有腦神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)活性。
[0007] 因此，本發(fā)明人確認(rèn)蓮子心提取物具有腦神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)活性、活性氧類（reactive oxygen species ;R0S)清除活性及抗氧化活性，在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于，提供一種含有以蓮子心提取物為有效成份的腦神經(jīng)細(xì)胞保護(hù) 用藥學(xué)組成物。
[0009] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于，提供一種含有以蓮子心提取物為有效成份的腦神經(jīng)細(xì) 胞保護(hù)用食品組成物。
[0010] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于，提供一種以包括通過向蓮子心中添加有機(jī)溶劑萃取蓮 子心分劃物的步驟為特征的腦神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)用組成物生產(chǎn)方法。
[0011] 關(guān)于本發(fā)明的其它目的及優(yōu)點(diǎn)，可以通過下述發(fā)明的詳細(xì)說明、權(quán)利要求書及附 圖作進(jìn)一步了解。
[0012] 本發(fā)明的第1個(gè)目的在于，提供一種含有以蓮子心提取物為有效成份的腦神經(jīng)細(xì) 胞保護(hù)用藥學(xué)組成物，具體講，所述組成物的特征在于，具有活性氧類（reactive oxygen species ;R0S)清除活性或所述組成物具有抗氧化活性。進(jìn)一步講，就是所述抗氧化活性的 特征在于，具有DPPH(2, 2-diphenyl-l-picrylhydrazyl)自由基清除能力或者具有過氧化 氫（H20 2)清除能力。
[0013] 本發(fā)明說明書中的術(shù)語"抗氧化"是指抑制氧化的作用或功效。
[0014] 本發(fā)明的理想實(shí)現(xiàn)例表明，本發(fā)明具有優(yōu)秀的抗氧化活性。
[0015] 本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例表明，本發(fā)明具有活性氧類（reactive oxygen species ; R0S)清除活性、DPPH(2, 2-diphenyl-l-picrylhydrazyl)自由基清除活性、過氧化氫（H202) 清除活性。
[0016] 本發(fā)明說明書中的術(shù)語"氧化"是指使某些原子、分子、離子失去電子或者使某此 物質(zhì)與氧結(jié)合或與氫剝離的化學(xué)反應(yīng)。當(dāng)發(fā)生氧化時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生自由基，然后產(chǎn)生的自由 基又會(huì)誘發(fā)引起細(xì)胞損傷的連鎖反應(yīng)。術(shù)語"抗氧化"是指通過清除自由基使連鎖反應(yīng)終 止從而達(dá)到抑制氧化反應(yīng)的效果或功效。
[0017] 本說明書中提到蓮子心提取物時(shí)使用的術(shù)語"提取物"包括將蓮子心用萃取溶劑 處理后獲得的提取物質(zhì)。
[0018] 本說明書中的術(shù)語"藥學(xué)有效量"是指所述蓮子心提取物發(fā)揮抗氧化功效或活性 所需的充足量。
[0019] 本發(fā)明的藥學(xué)組成物含有蓮子心提取物0. 001 %?99. 999 %效果比較理想，含量 達(dá)到0. 1%至90%效果會(huì)更加理想。但是，這并不意味著所述組成必須限定于此，可以根據(jù) 患者的狀態(tài)及疾病的種類與治療程度進(jìn)行調(diào)整。
[0020] 如果將本發(fā)明的組成物制作成藥學(xué)組成物，則本發(fā)明的藥學(xué)組成物包括在藥學(xué)上 允許使用的載體。本發(fā)明的藥學(xué)組成物中包含的在藥學(xué)上允許使用的載體是一種在藥劑 生產(chǎn)中經(jīng)常用到的產(chǎn)品，包括：乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、已六醇、淀粉、洋槐膠、磷酸 鈣、藻酸鹽、明膠、硅酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、糖漿、甲基纖維素、羥 基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂及礦物油等，但是并不意味著僅限定于 此。本發(fā)明的藥學(xué)組成物中除了上述成份之外，還包括：潤滑劑、潤濕劑、甜味劑、增香劑、 乳化劑、懸浮劑、保鮮劑等。在藥劑學(xué)上允許適當(dāng)使用的載體及制劑在Remington's Pharm aceutical Sciences(19th ed.，1995)中有詳細(xì)的記載。
[0021] 本發(fā)明的藥學(xué)組成物可以通過口服和非口服兩種方式用藥。優(yōu)選地，選用口服方 式。
[0022] 本發(fā)明藥學(xué)組成物的合適用藥量可以根據(jù)制劑類型、用藥方式、患者的年齡、體 重、性別、臨床狀態(tài)、飲食、用藥時(shí)間、用藥途徑、排泄速度及反應(yīng)靈敏性等因素開具不同的 處方。另一方面，本發(fā)明藥學(xué)組成物的口服用量最好定為1日〇.〇〇l-l〇〇mg/kg(體重）。 本發(fā)明藥學(xué)組成物的一般用藥量以成人為標(biāo)準(zhǔn)在0. 001-100 mg /kg范圍內(nèi)。
[0023] 本發(fā)明的藥學(xué)組成物是按照具有該發(fā)明所屬【技術(shù)領(lǐng)域】常識(shí)的工作人員容易實(shí)施 的方法利用在藥劑學(xué)上允許使用的載體及/或者賦形劑進(jìn)行制備的，因此既可以按照單位 用量的形態(tài)制備，也可以按照一個(gè)容器內(nèi)裝有多次用量的形態(tài)制備。在這種情況下，劑型可 以是油劑或水溶性媒介中的溶劑、懸濁劑、糖漿或乳化液形態(tài)或者是浸膏劑、散劑、粉末劑、 顆粒劑、片劑或膠囊劑的形態(tài)，也可以是分散劑或穩(wěn)定劑。
[0024] 本發(fā)明的第2個(gè)目的在于，提供一種含有以蓮子心提取物為有效成份的腦神經(jīng) 細(xì)胞保護(hù)用食品組成物。具體講，就是所述組成物的特征在于，具有活性氧類（reactive oxygen species ;R0S)清除活性或者具有抗氧化活性。進(jìn)一步講，就是所述抗氧化活性的 特征在于，具有DPPH(2, 2-diphenyl-l-picrylhydrazyl)自由基清除能力或者具有過氧化 氫（H20 2)清除能力。
[0025] 更加優(yōu)選地，如果將本發(fā)明的組成物制作成食品組成物，則組成物中不僅包含所 述蓮子心提取物，還包含生產(chǎn)食品時(shí)通常添加的成份，例如：包括蛋白質(zhì)、碳水化合物、月旨 肪、營養(yǎng)素、調(diào)味料及增香劑。所述碳水化合物的例子可以使用單糖，如：葡萄糖、果糖等； 雙糖，如：麥芽糖、蔗糖、低聚糖等；多糖，如：糊精、環(huán)式糊精等普通的糖類及木糖醇、山梨 醇、赤藻糖醇等糖醇類。增香劑可以使用天然增香劑（甜味蛋白、甜葉菊提取物（例如：萊 鮑迪甙A、甘草素等）及合成增香劑（糖精、天門冬氨酰苯丙氨酸甲酯等）。例如，如果將本 發(fā)明的食品組成物制作成口服液，則其中了除了含有本發(fā)明的蓮子心提取物之外，還可以 添加檸檬酸、液態(tài)果糖、砂糖、葡萄糖、醋酸、蘋果酸、果汁、杜仲萃取液、大棗萃取液、甘草萃 取液等。
[0026] 除了上述成份外，本發(fā)明的組成物還可以添加多種營養(yǎng)劑、維生素、礦物質(zhì)（電解 質(zhì)）、合成風(fēng)味劑及天然風(fēng)味劑等風(fēng)味劑、著色劑及填充劑（奶酪、巧克力等）、果膠酸及其 鹽、褐藻酸及其鹽、有機(jī)酸、保護(hù)性膠質(zhì)增稠劑、pH調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、甘油、酒精、碳酸 飲料中使用的碳酸化劑等。此外，本發(fā)明的組成物還可以添加用于制作天然水果汁及果汁 飲料、蔬菜飲料的果肉。這些成份既可以獨(dú)立使用與可以組合使用。這些添加劑的比例雖然 并不怎么重要，不過本發(fā)明的組成物每100重量份一般控制在0至約20重量份的范圍內(nèi)。
[0027] 本發(fā)明的第3個(gè)目的在于，提供一種以包括通過向蓮子心中添加有機(jī)溶劑萃取蓮 子心分劃物的步驟為特征的腦神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)用組成物生產(chǎn)方法。
[0028] 本發(fā)明的腦神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)用組成物生產(chǎn)方法包括如下幾個(gè)步驟：(a)準(zhǔn)備蓮子心 的步驟；(b)向所述蓮子心中添加有機(jī)溶劑進(jìn)行有機(jī)溶劑萃取的步驟。
[0029] 本發(fā)明中的有機(jī)溶劑可以使用多種萃取溶劑。優(yōu)選地，可以使用極性溶劑或 非極性溶劑。比較適合的極性溶劑包括：（i)水；（ii)酒精（優(yōu)選地，甲醇、乙醇、丙 醇、丁醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、正戊醇、乙二醇單丁醚或乙二醇）醋酸；（iv) DMFO(dimethyl-formamide)及（v)DMSO(dimethyl sulfoxide)。比較適合的非極性溶劑 包括：丙酮、乙腈、乙酸乙酯、乙酸甲酯、氟代烷、戊烷、己烷、2, 2, 4-三甲基戊烷、癸烷、環(huán)己 烷、環(huán)戊烷、二異丁烯、1-戊烯、1-氯丁烷、1-氯戊烷、〇-二甲苯、二異丙醚、2-氯丙烷、甲苯、 1-氯丙烷、氯苯、苯、乙醚、二甲基硫醚、三氯甲烷、二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、苯胺、二乙胺、 乙醚、四氯化碳及THF。
[0030] 更加優(yōu)選地，本發(fā)明中使用的萃取有機(jī)溶劑包括：(a)水；(b)帶有1-4個(gè)碳原子 的無水或含水低級(jí)酒精（甲醇、乙醇、丙醇、丁醇等）；（c)所述低級(jí)酒精與水的混合溶劑； (d)丙酮；（e)乙酸乙酯；（f)三氯甲烷；（g)乙酸丁酯；(h)l，3-丁二醇；（i)正己烷及（j) 二乙醚。最優(yōu)選地，本發(fā)明中使用的萃取有機(jī)溶劑為乙酸乙酯。
[0031] 本發(fā)明中使用的術(shù)語"分劃物"不僅包括利用萃取有機(jī)溶劑獲得的物質(zhì)而且還包 括在提純過程中獲得的物質(zhì)。
[0032] 更加優(yōu)選地，依據(jù)本發(fā)明的腦神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)用組成物生產(chǎn)方法包括以下幾個(gè)步 驟：(a)準(zhǔn)備蓮子心的步驟；(b)添加甲醇的步驟；（c)利用超聲波處理的步驟；(d)將甲醇 分劃物分離提純的步驟；（e)向所述分離提純的甲醇分劃物中添加乙酸乙酯的步驟；（f)將 乙酸乙酯分劃物分離提純的步驟。
[0033] 本發(fā)明的特征及優(yōu)點(diǎn)歸納如下：
[0034] (i)本發(fā)明含有天然物特別是蓮子心提取物，具有優(yōu)秀的腦神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)活性。
[0035] (ii)本發(fā)明具有優(yōu)秀的活性氧類（reactive oxygen species ;R0S)清除活性及 抗氧化活性。
[0036] (iii)本發(fā)明的有效成份從天然物中提取對(duì)人體非常安全。
[0037] (iv)另外，本發(fā)明具有優(yōu)秀的腦神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)功效，因此為食品、制藥領(lǐng)域提供了 一種源于天然物的基礎(chǔ)性材料。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0038] 圖1為顯示蓮花不同部位提取物的腦神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)活性效果示意圖；
[0039] 圖2為顯示蓮子心各分劃層的腦神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)活性效果示意圖；
[0040] 圖3為顯示腦神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)活性試驗(yàn)中HT22細(xì)胞狀態(tài)的示意圖。A:對(duì)照組；B:僅 用谷氨酸處理的細(xì)胞；C:陽性對(duì)照組；D:用蓮子心乙酸乙酯（EtOAc)提取物處理的細(xì)胞。
[0041] 圖4為顯示HT22細(xì)胞系（line)的培養(yǎng)及細(xì)胞狀態(tài)的示意圖；
[0042] 圖5為顯示蓮子心乙酸乙酯（EtOAc)提取物的活性氧類（reactive oxygen species ;R0S)清除活性效果示意圖；
[0043] 圖6為顯示測(cè)定蓮子心乙酸乙酯（EtOAc)提取物的DPPH自由基清除活性結(jié)果示 意圖；
[0044] 圖7為顯示測(cè)定蓮子心乙酸乙酯（EtoAc)提取物的過氧化氫（H202)清除活性結(jié)果 示意圖；
[0045] 圖8為顯示將雄性ICR通過口服用藥后不同個(gè)體呈現(xiàn)狀態(tài)的示意圖；
[0046] 圖9為顯示Morris Water Maze實(shí)驗(yàn)狀態(tài)的示意圖；
[0047] 圖10為顯示記憶力測(cè)試平均移動(dòng)時(shí)間結(jié)果示意圖。a.比較組，b.對(duì)照組，C.陽 性對(duì)照組，d.蓮子心提取物 3mg/kg, e. 10mg/kg，f. 30mg/kg, g. 100mg/kg h. 200mg/kg。
[0048] 圖11為顯示記憶力測(cè)試平均移動(dòng)距離結(jié)果示意圖。

【具體實(shí)施方式】
[0049] 下面，將通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更加詳細(xì)的說明。列舉這些實(shí)施例僅為了對(duì)本 發(fā)明進(jìn)行更加具體的說明，并不意味著本發(fā)明的范圍僅限定于這些實(shí)施例，具有本行業(yè)常 識(shí)的人對(duì)此是不目而喻的。
[0050] 實(shí)施例1:蓮花分劃層的萃取方法
[0051] 對(duì)蓮花各個(gè)部位中的蓮子、種皮、蓮子心、子葉實(shí)施超聲波萃取。萃取溶劑使用 80%甲醇同，溶劑的量按每100g樣本中添加溶劑1L。萃取時(shí)間按每份樣本1次90分鐘，總 共萃取3次，超聲波Frequency為42kHz。各部位的萃取收率為蓮子4. 15 %、種皮9. 25%、 蓮子心44. 06%、子葉19. 76%。
[0052] 蓮子心按溶劑極性由低到高的順序利用hexane，CHC13, EtOAc，η-BuOH的溶劑實(shí)施 分劃。各層分劃的量為 hexane 層 0· 76g、CHCl3 層 1. 00g、Et0Ac 層 0· 41g、n-BuOH 層 2. 65g。
[0053] 實(shí)施例2:蓮花各部位的腦神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)活性
[0054] 腦神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)活性利用老鼠的源于海馬細(xì)胞株即HT22細(xì)胞測(cè)定。HT22細(xì)胞 的生存率通過MTT assay測(cè)定。為了準(zhǔn)備MTT assay，將HT22細(xì)胞在48well plate上 按3X104cell/well進(jìn)行播種（seeding)后，在37°C條件下培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)后利用谷 氨酸（glutamate)處理之前分別按不同的濃度添加樣本，再培養(yǎng)1小時(shí)后，利用谷氨酸 (glutamate)進(jìn)行處理。然后，在37°C條件下培養(yǎng)24小時(shí)后添加 MTT溶液，經(jīng)過3小時(shí)后 利用DMS0進(jìn)行溶解，然后利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay; ELISA)判讀器（reader)測(cè)定在570nm處的吸光度，其結(jié)果表明，通過測(cè)定蓮花各部位的腦 神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)活性，蓮子心部位在l〇〇ug/ml條件下顯示出90. 84%的細(xì)胞保護(hù)活性（圖 1)。
[0055] 實(shí)施例3:蓮子心各分劃層的腦神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)活性
[0056] 為了測(cè)定蓮花各部位的腦神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)活性，先將活性最強(qiáng)的蓮子心進(jìn)行分 劃，然后再測(cè)定各分劃層的細(xì)胞保護(hù)活性。測(cè)定結(jié)果表明，蓮子心乙酸乙酯（EtoAc)層在 100ug/ml條件下的細(xì)胞保護(hù)活性最強(qiáng)，達(dá)到131. 82% (圖2、圖3)。
[0057] 實(shí)施例4: HT22細(xì)胞培養(yǎng)及MTT分析
[0058] 為了對(duì)蓮子心分劃物的抗癡呆癥活性進(jìn)行評(píng)估，將利用80%甲醇萃取的提取物進(jìn) 行減壓濃縮腦冷凍干燥后用于實(shí)驗(yàn)中。老鼠的源于海馬細(xì)胞株即HT22細(xì)胞培養(yǎng)使用添加 了 10%小牛血清和1%青霉素/鏈霉素（P/S)的杜爾貝科改性培養(yǎng)基（Dulbecco' s modified Eagle's medium ;DMEM)在37°C培養(yǎng)器中不斷為其供給空氣（95% )與C02(5% )的混合氣 體的情況下進(jìn)行。當(dāng)細(xì)胞長到一定程度之后利用〇. 25%胰蛋白酶維持繼代培養(yǎng)，HT22細(xì) 胞的生存率通過MTT分析進(jìn)行測(cè)定。為了進(jìn)行MTT分析，將HT22細(xì)胞在48well plate上 按3X104細(xì)胞/well進(jìn)行播種（seeding)后，在37°C條件下培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，在 利用谷氨酸（glutamate)處理之前分別按不同的濃度添加樣本，再培養(yǎng)1小時(shí)，然后利用 谷氨酸（glutamate)進(jìn)行處理。在37°C條件下培養(yǎng)24小時(shí)后，添加 MTT溶液，經(jīng)過3小 時(shí)后利用DMS0進(jìn)行溶解，然后利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunoso rbent assay ;ELISA)判讀器測(cè)定在570nm處的吸光度，陽性對(duì)照藥物使用維生素 E誘導(dǎo)體即奎 諾二甲基丙烯酸酯（Trolox)。另外，所有的實(shí)驗(yàn)值都用平均值表示相對(duì)于對(duì)照組的細(xì)胞保 護(hù)率，分別反復(fù)3次利用實(shí)驗(yàn)值進(jìn)行計(jì)算（圖4)。
[0059] 實(shí)施例 5:活性氧類（reactive oxygen species ;R0S)測(cè)定
[0060] 在HT22細(xì)胞中因谷氨酸（glutamate)導(dǎo)致細(xì)胞死亡的之一就是因氧化應(yīng)激反應(yīng) 導(dǎo)致細(xì)胞死亡的，并由此產(chǎn)生活性氧類（R0S)。通過測(cè)定HT22細(xì)胞的生存率就能夠以具 有活性的蓮子心乙酸乙酯（EtOAc)提取物為對(duì)象測(cè)定活性氧類（R0S)清除能力，從而研究 HT22細(xì)胞與保護(hù)作用相關(guān)的作用機(jī)理。
[0061] 將HT22細(xì)胞樣本利用奎諾二甲基丙烯酸酯（trolox)、谷氨酸（glutamate) 處理后在37 °C條件下培養(yǎng)8小時(shí)。培養(yǎng)后添加10uM的2, 7-雙氯熒光黃乙酸乙酯 (dichlorofluorescin diacetate ;DCF_DA)再培養(yǎng) 1 小時(shí)。與 DCF-DA 發(fā)生反應(yīng)后，除去培 養(yǎng)基，利用溶于PBS中的1. 0%三硝基甲苯（Triton)X-lOO在37°C條件下溶解10分鐘，然 后，測(cè)量激發(fā)波長（excitation wavelength)為 490nm，發(fā)射波長（emission wavelength) 為525nm處的熒光強(qiáng)度。
[0062] 測(cè)定蓮子心乙酸乙酯（EtOAc)層的R0S清除活性，結(jié)果顯示，在100ug/ml與 1000ug/ml條件下分別為59. 19%與45. 55%。由此表明，蓮子心乙酸乙酯（EtOAc)的腦細(xì) 胞保護(hù)活性與R0S清除活性相關(guān)（圖5)。
[0063] 實(shí)施例 6:測(cè)定 DPPH(2, 2-diphenyl-l-picrylhydrazyl)自由基清除活性
[0064] 測(cè)定樣本的重量后，將其充分溶解于甲醇（methanol)或乙醇（ethanol)中，然 后利用0. 45 μ m過濾器進(jìn)行過濾。將制作的樣本按步驟進(jìn)行稀釋，再按照不同的濃度向 96-well micro plate 分別注入 150μ1，然后再注入 DPPH。將 96-wellmicro plate 放入暗 室內(nèi)等待30分鐘，測(cè)定在517nm處的吸光度。測(cè)定結(jié)果顯示，蓮子心乙酸乙酯（EtOAc)的 IC5(I 值為 90. 89ug/ml，用作陽性對(duì)照組（positive control)的維生素 C(ascorbic acid; Vit C)為 27. 73ug/ml。
[0065] 細(xì)胞保護(hù)活性度較高的蓮子心乙酸乙酯（EtOAc)分劃物的DPPH自由基清除能力 測(cè)定結(jié)果為IC5090ug/ml (圖6)。這表明與腦神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)率相比，其活性度稍微偏低，由 此可以推測(cè)是酚類化合物含量太低所致。
[0066] 實(shí)施例7:測(cè)定過氧化氫（H202)清除活性
[0067] 過氧化氫（Hydrogen peroxide)清除活性利用馬勒（Muller)的方法即通過 2, 2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）-過氧化物酶（2, 2-azinobis (3-ethylbenz thiazolin)-6_sulfonicacid(ABTS)-peroxidase)系統(tǒng)測(cè)定過氧化氫（H20 2)清除活性。將 各個(gè)樣本按不同濃度進(jìn)行稀釋，在96well plate上放入樣本溶液80 μ L，10mM Η20220 μ L， 磷酸鹽緩沖液（phospha te buffer) (pH 5· 0, 0· 1Μ) 100μ L，在37°C條件下使其反應(yīng)5分 鐘，再放入1.25mM ABTS 30yL和lU/mL過氧化物酶（peroxidase) 30yL進(jìn)行混合后， 在37°C條件下使其反應(yīng)10分鐘，利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay ;ELISA)判讀器（reader)測(cè)定在405nm處的吸光度。測(cè)定結(jié)果顯示，蓮子心乙 酸乙酯（EtOAc)層的IC 5(I值為639. 67ug/ml，用作陽性對(duì)照組（positive control)的 BHA(Butylated Hydroxy Anisole)為 160. 58ug/ml (圖 7)。
[0068] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，蓮花部位中蓮子心的腦神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)活性最高，蓮子心的分劃層 中乙酸乙酯（EtOAc)層的活性最高。為了研究蓮子心乙酸乙酯（EtOAc)層的腦神經(jīng)細(xì)胞保 護(hù)活性的作用機(jī)理，對(duì)R0S清除活性及抗氧化活性（DPPH自由基與過氧化氫清除活性）進(jìn) 行測(cè)定，從其結(jié)果可以判斷，在谷氨酸（glutamate)作用下出現(xiàn)細(xì)胞死亡的HT22細(xì)胞中蓮 子心乙酸乙酯（EtOAc)層的腦神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)活性是由防止氧化應(yīng)激反應(yīng)的抗氧化活性引 起的。
[0069] 實(shí)施例 8:水迷宮實(shí)驗(yàn)（Morris Water Maze Test)
[0070] 為了通過水迷宮實(shí)驗(yàn)（Morris Water Maze Test)觀察關(guān)于蓮子心提取物的細(xì) 胞保護(hù)效果及認(rèn)知能力改善的活體實(shí)驗(yàn)，購買國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（International Cancer Research ;ICR)培養(yǎng)的平均體重約30g的雄性鼷鼠，放在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下使其適應(yīng)1周后 再用于實(shí)驗(yàn)中。動(dòng)物飼養(yǎng)室的條件按傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)保持室溫達(dá)到22±2°C，按照200?300勒 克斯的照度1日內(nèi)照射12小時(shí)，在12小時(shí)內(nèi)除了照射光之外阻斷其它所有的光線。關(guān) 于飼料，為其供給充足的固體飼料（粗蛋白質(zhì)22. 1 %以上、粗脂肪8. 0%以下、鈣0. 6% 以上、磷0.4%以上，韓國三洋公司）和水。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為兩組，一組是不注射東莨菪 堿（scopolamine ;Sigma Aldrich)而注射等量注射用生理鹽水的試驗(yàn)組（control),另 一組是東莨菪堿注射組。東莨菪堿注射組使用蓮子心80%甲醇提取物，一般將其分為 3mg，10mg，30mg，100mg，200mg/kg 等幾種濃度使用。陽性對(duì)照組（positive control)使用 多奈哌齊（donepezil)，它是食藥廳許可生產(chǎn)的藥劑，屬于膽堿酯酶抑制劑系列，是一種用 于治療阿爾茲海默癥類型的輕度、中度乃至重度癡呆癥病狀的藥物，常被用于改善血管性 癡呆癥（伴隨腦血管疾病引發(fā)的癡呆癥）病狀。
[0071] 陽性對(duì)照組分別將試驗(yàn)藥劑及陽性對(duì)照藥劑懸浮于注射用滅菌水中進(jìn)行調(diào)配，1 次的注射量均以l〇ml/kg為基準(zhǔn)。東莨菪堿（lmg/kg)注射4天，每天通過腹腔注射，試驗(yàn) 藥劑及陽性對(duì)照藥劑（positive control)則采用口服方式（圖8)。
[0072] 水迷宮實(shí)驗(yàn)在注射提取物的前一天經(jīng)過學(xué)習(xí)訓(xùn)練（learning trial)之后再反復(fù) 進(jìn)行記憶力測(cè)試（memory acquisition test),共進(jìn)行4天。學(xué)習(xí)訓(xùn)練是在水池 （water pool: 0 200 cm)指定的4個(gè)釋放點(diǎn)（release point)中的一處將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物放入水池里， 使其通過60秒的自由游泳尋找平臺(tái)（0 200 cm)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物找到平臺(tái)后讓其在平臺(tái)上休 息約10秒，即使在60秒內(nèi)無法找到平臺(tái)也讓其在平臺(tái)上休息10秒鐘。所有的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 都寫成一次學(xué)習(xí)訓(xùn)練（learning trial)之后，再采用相同的方法進(jìn)行學(xué)習(xí)訓(xùn)練（learning trial)，每天進(jìn)行2次，反復(fù)進(jìn)行4天，釋放點(diǎn)不能重疊，每天的釋放點(diǎn)都不一樣。
[0073] 在進(jìn)行記憶力測(cè)試的試驗(yàn)過程中，將東莨菪堿按lmg/kg的標(biāo)準(zhǔn)每日注射1次共注 射4天，在注射蓮子心提取物60分鐘后通過腹腔注射，從注射東莨菪堿30分鐘后開始進(jìn)行 記憶力測(cè)試。關(guān)于認(rèn)知能力改善效果，測(cè)定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物找到平臺(tái)所需的平均移動(dòng)時(shí)間（sec) 將其作為評(píng)價(jià)指標(biāo)（圖9)。
[0074] 經(jīng)過1天的學(xué)習(xí)訓(xùn)練后，注射scopolamine誘發(fā)認(rèn)知能力（記憶力）受損，然后再 進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)（Morris Water Maze Test)以檢驗(yàn)認(rèn)知能力改善功效。分別將在4天的 記憶力測(cè)試（memory acquisition test)試驗(yàn)中找到平臺(tái)所需的平均移動(dòng)時(shí)間（swimming time)和平均移動(dòng)距離（swimming distance)減少的量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)認(rèn)知能力的改善效 果進(jìn)行評(píng)估。在試驗(yàn)過程中觀察不到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物因注射蓮子心提取物而導(dǎo)致的死亡現(xiàn)象及體 重變化異?，F(xiàn)象。
[0075] 4天的記憶力測(cè)試結(jié)果表明，對(duì)于未注射試驗(yàn)藥劑及東莨菪堿的比較組 (control)來說，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物找到平臺(tái)所需的平均移動(dòng)時(shí)間（swimming time)及平均移動(dòng)距 離（swimming distance)均顯著縮短。相反，對(duì)于注射了東莨菪堿的對(duì)照組（negative control)來說，雖然不同的個(gè)體表現(xiàn)出一定的差異，但總體上時(shí)間及距離不但一點(diǎn)也沒縮 短反而還增加了（圖1〇、11)。
[0076] 上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果喻示著給用作實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的鼷鼠注射東莨菪堿可以極大地誘發(fā)其認(rèn) 知能力（記憶力）受損。
[0077] 在東莨菪堿e注射1小時(shí)30分鐘之前注射提取物的注射組 3mg, 10mg，30mg, lOOmg, 200mg/kg及注射陽性對(duì)照藥物即donepezil的對(duì)照組與未注射試 驗(yàn)藥劑的對(duì)照組相比，找到platform所需的平均移動(dòng)時(shí)間（swimming time)及平均移動(dòng)距 離（swimming distance)均表現(xiàn)出逐漸減小的趨勢(shì)。特別是，上述結(jié)果顯示，與主要依靠濃 度變化而產(chǎn)生不同效果的天然物不同，低濃度（3mg/kg)的提取物的功效可以與高濃度提 取物相媲美。
[0078] 綜合分析研究結(jié)果可知，對(duì)于用作實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的鼷鼠來說，意味著通過口服蓮子心 提取物能夠有效改善因注射scopolamine而誘發(fā)的認(rèn)知能力（記憶力）受傷。另外，蓮子 心提取物不僅能夠有效改善細(xì)胞單位的癡呆癥，而且在細(xì)胞外（in vivo test)也具有與 治療癡呆癥相關(guān)的明顯功效。
【權(quán)利要求】
1. 一種腦神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)用藥學(xué)組成物，其特征在于：其有效成份含有蓮子心提取物。
2. 如權(quán)利要求項(xiàng)1所述的腦神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)用藥學(xué)組成物，其特征在于：所述組成物具 有活性氧類（reactive oxygen species ;ROS)清除活性。
3. 如權(quán)利要求項(xiàng)1所述的腦神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)用藥學(xué)組成物，其特征在于：所述組成物具 有抗氧化活性。
4. 如權(quán)利要求項(xiàng)3所述的腦神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)用藥學(xué)組成物，其特征在于：所述抗氧化活 性 DPPH(2, 2_diphenyl-l-picrylhydrazyl)自由基清除能力。
5. 如權(quán)利要求項(xiàng)3所述的腦神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)用藥學(xué)組成物，其特征在于：所述抗氧化活 性具有過氧化氫（H20 2)清除能力。
6. -種腦神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)用食品組成物，其特征在于：其有效成份含有蓮子心提取物。
7. 如權(quán)利要求項(xiàng)6所述的腦神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)用食品組成物，其特征在于：所述組成物具 有活性氧類（reactive oxygen species ;R0S)清除活性。
8. 如權(quán)利要求項(xiàng)6所述的腦神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)用食品組成物，其特征在于：所述組成物具 有抗氧化活性。
9. 如權(quán)利要求項(xiàng)8所述的腦神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)用食品組成物，其特征在于：所述抗氧化活 性具有 DPPH(2, 2-diphenyl-l-picrylhydrazyl)自由基清除能力。
10. 如權(quán)利要求項(xiàng)8所述的腦神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)用食品組成物，其特征在于：所述抗氧化活 性具有過氧化氫（H20 2)清除能力。
11. 一種腦神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)用藥學(xué)組成物的生產(chǎn)方法，其特征在于，包括如下幾個(gè)步驟： (a) 準(zhǔn)備蓮子心的步驟； (b) 向所述蓮子心中添加有機(jī)溶劑進(jìn)行有機(jī)溶劑萃取的步驟。
12. 如權(quán)利要求項(xiàng)11所述的腦神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)用組成物的生產(chǎn)方法，其特征在于：所述 有機(jī)溶劑可以從由正己烷、CHC13、乙酸乙酯、n-BuOH構(gòu)成的組中任意選擇一種有機(jī)溶劑。
13. 如權(quán)利要求項(xiàng)11所述的腦神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)用組成物的生產(chǎn)方法，其特征在于：所述 有機(jī)溶劑為乙酸乙酯。
14. 一種腦神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)用藥學(xué)組成物的生產(chǎn)方法，其特征在于，包括以下幾個(gè)步驟： (a) 準(zhǔn)備蓮子心的步驟； (b) 添加甲醇的步驟； (c) 利用超聲波處理的步驟； (d) 將甲醇分劃物分離提純的步驟； (e) 向所述分離提純的甲醇分劃物中添加乙酸乙酯的步驟； (f) 將乙酸乙酯分劃物分離提純的步驟。
【文檔編號(hào)】A61K36/62GK104144694SQ201380010148
【公開日】2014年11月12日 申請(qǐng)日期:2013年1月18日 優(yōu)先權(quán)日:2012年2月27日
【發(fā)明者】金銀實(shí), 馬忠制, 吳庚姬 申請(qǐng)人:國立生物資源研究所