用于抑制和治療非自身免疫性糖尿病的Hsp60衍生肽和肽類似物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供使用熱休克蛋白60(hsp60)的肽和類似物預(yù)防和治療2型糖尿病(T2D)，以及抑制、預(yù)防和治療T2D相關(guān)并發(fā)癥的方法。本發(fā)明利用人hsp60的肽類似物DiaPep277TM來示例。本發(fā)明還涉及可用于抑制、預(yù)防或治療T2D的治療方案。
【專利說明】用于抑制和治療非自身免疫性糖尿病的Hsp60衍生肽和肽 類似物 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及用于預(yù)防、抑制和治療非自身免疫性糖尿病的方法，包括：給藥衍生自 熱休克蛋白60(hsp60)的肽、或其類似物。本發(fā)明通過利用表示為DiaPep277DiaPep277 的hsp60肽類似物用于治療2型糖尿?。═2D)的用途來示例。本發(fā)明還涉及適于給藥 DiaP印277和其它Hsp60肽和類似物用于抑制或治療T2D的治療方案和制劑。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 2型糖尿?。═2D，也稱為非胰島素依賴型糖尿病，NIDDM或成年發(fā)病型糖尿?。┦?糖尿病的最常見形式，占糖尿病病例的90%。它是一種代謝紊亂，其特征是在相對(duì)外周胰島 素抵抗和胰島素缺乏的情況下的高血糖。糖尿病在45到64歲人群的發(fā)病率是7%，但在65 歲或更老人群中發(fā)病率顯著增加。1型糖尿?。═1D，也稱為胰島素依賴型糖尿病，IDDM)，占 糖尿病病例的約10%，是一種自身免疫性疾病，是胰腺中β細(xì)胞破壞導(dǎo)致的。
[0004] 肥胖或代謝綜合征是遺傳上易感T2D人群患該疾病的主要原因。2型糖尿病最初 通過增加鍛煉和飲食改變來管理。如果血糖不被這些措施降低，可需要藥物，如二甲雙胍或 胰島素。
[0005] 在過去50年里糖尿病的發(fā)生率與肥胖并行顯著增加。截至2010年患者約2. 85億 人，與之相比1985年約3000萬人。2型糖尿病通常是一種慢性疾病，與預(yù)期壽命縮短十年 相關(guān)。這部分是由于一些與它相關(guān)聯(lián)的并發(fā)癥，包括：二至四倍的心血管疾病和中風(fēng)風(fēng)險(xiǎn)， 下肢截肢風(fēng)險(xiǎn)增加20倍，和住院率增加。在發(fā)達(dá)國(guó)家、和越來越多的其他地方，T2D是非外 傷性失明和腎功能衰竭的最大原因。它與認(rèn)知功能障礙和疾病過程導(dǎo)致的癡呆，如阿爾茨 海默氏病和血管性癡呆的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。其他并發(fā)癥包括：黑棘皮病、性功能障礙、以及頻 繁的感染。
[0006] 熱休克蛋白（HSP)是表達(dá)于所有的原核和真核細(xì)胞中的高度保守的蛋白質(zhì)。它們 參與許多重要的細(xì)胞過程，如新合成的蛋白質(zhì)的正確折疊和亞基裝配，因此被稱為分子伴 侶（Bukau，B.，等人.2000, Cell 101，119-122)。在非生理?xiàng)l件如高溫、紫外線輻射、病毒或 細(xì)菌感染下，細(xì)胞的HSP表達(dá)被上調(diào)。HSP具有細(xì)胞保護(hù)功能，如防止變性蛋白的聚集，啟動(dòng) 其重新折疊或蛋白水解降解。根據(jù)其分子量，HSP被分為六個(gè)亞家族：小HSP、HSP40、HSP60、 批卩70、批?90和邯？100。它們位于胞質(zhì)溶膠中（批？70、批?90、批？100)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中（批？70、 HSP90)或線粒體中（HSP60)。
[0007] HSP60、HSP70和HSP90亞家族已吸引了越來越多的關(guān)注，因?yàn)樗鼈冊(cè)诿庖呦嚓P(guān)過 程中的潛在作用。幾個(gè)研究已經(jīng)確定HSP為微生物感染中免疫反應(yīng)的目標(biāo)（Zugel，U.，和 Kaufmann, S. H.，1999, Immunobiology 201，22-35)。因?yàn)槲⑸?HSP 和衍生自受損或應(yīng) 激組織的內(nèi)源性HSP之間的高序列同源性，免疫交叉反應(yīng)性被認(rèn)為導(dǎo)致自身免疫性紊亂， 包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和糖尿病的發(fā)展（Holoshitz，J.，等人.1986，Lancet 2,305-309; Elias, D.，等人，1991，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 88, 3088-3091 ;Abulafia-Lapid，R.，等 人，1999, J. Autoimmun. 12, 121-129)。
[0008] 許多出版物公開了熱休克蛋白或其片段作為免疫調(diào)節(jié)劑在診斷、治療或預(yù)防自身 免疫性疾病中的用途。這些公開內(nèi)容的大多數(shù)涉及hsp60或該蛋白的片段。人hsp60與細(xì) 菌hsp65具有高同源性，抗人Hsp60的抗體已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)存在于人類TlD初期和前糖尿病的 NOD-小鼠的循環(huán)系統(tǒng)中。Elias等（Diabetes 1997,46,758-64)證明人類hsp60的特定的 肽，指定為P277,是在自身免疫性糖尿病中的免疫顯性表位之一。因此，T細(xì)胞對(duì)P277的反 應(yīng)性已經(jīng)在NOD小鼠中在糖尿病發(fā)作時(shí)報(bào)道。p277的皮下給藥下調(diào)T細(xì)胞對(duì)β細(xì)胞抗原 的反應(yīng)性和防止NOD小鼠的糖尿病發(fā)展。處理誘導(dǎo)ρ277特異性的IgGl抗體以及ρ277特異 性IL-4和IL-10的分泌增加和γ干擾素的分泌減少，這表明Th2細(xì)胞因子途徑上調(diào)。由 于破壞胰腺中郎格漢斯胰島被認(rèn)為是Thl應(yīng)答，p277引起的Thl型轉(zhuǎn)向Th2型應(yīng)答可以是 TlD衰減的原因。
[0009] 美國(guó)專利 5, 114, 844 ;5, 671，848 ;5, 578, 303 和 5, 780, 034 披露 hsp60 在診斷和 治療TlD中的用途。還已公開（美國(guó)專利6, 180, 103和5, 993, 803和WO 96/19236、WO 97/01959和WO 98/08536)這一 hsp60蛋白的片段和肽類似物可作為治療上有用的實(shí)體用 于預(yù)防或減輕TlD和宿主抗移植物病。
[0010] 人類hsp60的肽類似物p277,本文表示為DiaP印277,在US6, 180, 103和WO 96/19236中披露為p277 (Val6, Val11)，是一種合成的類似物，其中在6位和11位的兩個(gè)天 然半胱氨酸殘基被纈氨酸殘基替換。
[0011] WO 03/070761公開了抗炎的hsp60衍生肽，包括肽P277的最小表位，它們能夠通 過T細(xì)胞上的Toll樣受體2 (Tlr2)反應(yīng)，而不需要活化這些細(xì)胞的TCR。
[0012] WO 2005/072056公開了 DiaP印277與低抗原性飲食結(jié)合用于延緩自身免疫疾病 尤其是1型糖尿病的發(fā)作的用途，以及利用口服給藥DiaPep277可用于預(yù)防、延緩、抑制或 治療自身免疫疾病的方法。
[0013] WO 2006/072946公開了 p277和其類似物調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和炎性疾病，以及特別地 治療或預(yù)防肝臟紊亂的用途。
[0014] DiaP印277已經(jīng)成功地完成了用于治療新發(fā)作TlD的受試者的III期臨床試驗(yàn)。 試驗(yàn)結(jié)果顯示，DiaPep277通過調(diào)節(jié)和阻滯對(duì)β細(xì)胞的自身免疫破壞在TlD中保留殘余的 β細(xì)胞。
[0015] DiaPep277從未被教導(dǎo)或建議能夠治療T2D，這是一種與體內(nèi)組織（肝臟、肌肉、月旨 肪等）中胰島素抵抗相關(guān)的疾病，并且與自身免疫病因?qū)W不相關(guān)聯(lián)。
[0016] 對(duì)于提供成分用于預(yù)防、延緩、抑制和治療非自身免疫性糖尿病即T2D的有效和 安全的組合物存在未滿足的需要。
[0017] 發(fā)明概述
[0018] 本發(fā)明提供了抑制和治療非自身免疫性糖尿病的包含DiaP印277 (SEQ ID NO :2) 和其他Hsp60衍生肽和肽類似物的藥物組合物、制劑和方法，以及其用于預(yù)防和減輕與2型 糖尿?。═2D)相關(guān)的并發(fā)癥的用途。
[0019] 意外地發(fā)現(xiàn)，通過調(diào)節(jié)和阻止β細(xì)胞被自身免疫性破壞來有效治療TlD的 DiaP印277,在治療上也有利于T2D，這種疾病沒有自身免疫病因。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，使用 DiaPep277治療TlD的方案對(duì)T2D是無效的，因此本文提供新的治療方案和制劑。根據(jù)本發(fā) 明，提供一個(gè)新的糖尿病患者群體作為hsp60肽類似物DiaPep277的靶。因此，本發(fā)明公開 了對(duì)患有T2D，和沒有明顯的自身免疫組分和遺傳上易患該疾病的患者的治療。
[0020] 根據(jù)一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種治療或減輕T2D的方法，包括向需要其的患者 給藥含有衍生自hsp60的肽或其肽類似物的組合物。
[0021] 根據(jù)一些實(shí)施方案，所述肽類似物由具有以下序列的對(duì)應(yīng)于人hsp60的氨基酸殘 基 437-460 的序列組成：Val-Leu-Gly-Gly-Gly-X1-Ala-Leu-Leu-Arg-X2-Ile-Pro-Ala-Leu -Asp-Ser-Leu-X 3-Pro-Ala-Asn-Glu-Asp (SEQ ID NO: 1)，其中 X1 是 Cys 或 Val 殘基，X2 是 Cys或Val殘基，且X3是Thr或Lys殘基。
[0022] 根據(jù)特定的實(shí)施方案，X1和X2是Val且X3是Thr且肽類似物長(zhǎng)度是24-30個(gè)氨基 酸。
[0023] 根據(jù)特定的實(shí)施方案，所述肽類似物是hsp60的殘基437-460的Val6, Val11類似 物，如在SEQ ID NO 2中所列的：
[0024] 1 6 11
[0025] Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Val-Ala-Leu-Leu-Arg-Val-Ile-Pro-Ala-Leu-Asp-Ser-L eu-Thr-Pr〇-
[0026] 24
[0027] Ala-Asn-Glu-Asp (SEQ ID NO: 2)，本文表示為 DiaP印277。
[0028] 根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，Hsp60片段肽選自以下組成的組：
[0029] 人 Hsp60 的殘基 31 - 50 :
[0030] Lys-Phe-Gly-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Leu-Met-Leu-Gln-Gly-Val-Asp-Leu-Leu-A Ia-Asp-Ala(SEQ ID NO:3)；
[0031] 人 Hsp60 的殘基 136 - 155 :
[0032] Asn-Pro-Val-Glu-Ile-Arg-Arg-Gly-Val-Met-Leu-Ala-Val-Asp-Ala-Val-Ile-A Ia-Glu-Leu(SEQ ID NO:4)；
[0033] 人 Hsp60 的殘基 151 - 170 :
[0034] Val-Ile-Ala-Glu-Leu-Lys-Lys-Gln-Ser-Lys-Pro-Val-Thr-Thr-Pro-Glu-Glu-I Ie-Ala-Gln(SEQ ID NO:5)；
[0035] 人 Hsp60 的殘基 166 - 185 ：
[0036] Glu-Glu-Ile-Ala-Gln-Val-Ala-Thr-Ile-Ser-Ala-Asn-Gly-Asp-Lys-Glu-Ile-G Iy-Asn-Ile(SEQ ID NO:6)；
[0037] 人 Hsp60 的殘基 195 - 214 :
[0038] Arg-Lys-Gly-Val-Ile-Thr-Val-Lys-Asp-Gly-Lys-Thr-Leu-Asn-Asp-Glu-Leu-G Iu-Ile-Ile(SEQ ID NO:7)；
[0039] 人 Hsp60 的殘基 255 - 274 :
[0040] Gln-Ser-Ile-Val-Pro-Ala-Leu-Glu-Ile-Ala-Asn-Ala-His-Arg-Lys-Pro-Leu-V al-Ile-Ile(SEQ ID N0:8)；
[0041] 人 Hsp60 的殘基 286 - 305 :
[0042] Leu-Val-Leu-Asn-Arg-Leu-Lys-Val-Gly-Leu-Gln-Val-Val-Ala-Val-Lys-Ala-P ro-Gly-Phe(SEQ ID NO:9)；
[0043] 人 Hsp60 的殘基 346 - 365 :
[0044] Gly-Glu-Val-Ile-Val-Thr-Lys-Asp-Asp-Ala-Met-Leu-Leu-Lys-Gly-Lys-Gly-A sp-Lys-Ala(SEQ ID NO:10)；
[0045] 人 Hsp60 的殘基 421 - 440 :
[0046] Val-Thr-Asp-Ala-Leu-Asn-Ala-Thr-Arg-Ala-Ala-Val-Glu-Glu-Gly-Ile-Val-L eu-Gly-Gly(SEQ ID NO:11)；
[0047] 人 Hsp60 的殘基 436 - 455 ：
[0048] Ile-Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Cys-Ala-Leu-Leu-Arg-Cys-Ile-Pro-Ala-Leu-Asp-S er-Leu-Thr(SEQ ID NO:12)；
[0049] 人 Hsp60 的殘基 466 - 485 ：
[0050] Glu-Ile-Ile-Lys-Arg-Thr-Leu-Lys-Ile-Pro-Ala-Met-Thr-Ile-Ala-Lys-Asn-A Ia-Gly-VaKSEQ ID NO: 13)；
[0051] 人 Hsp60 的殘基 511 - 530 :
[0052] Val-Asn-Met-Val-Glu-Lys-Gly-Ile-Ile-Asp-Pro-Thr-Lys-Val-Val-Arg-Thr-A Ia-Leu-Leu(SEQ ID NO:14)；
[0053] 人 Hsp60 的殘基 343 - 366 :
[0054] Gly-Lys-Val-Gly-Glu-Val-Ile-Val-Thr-Lys-Asp-Asp-Ala-Met(SEQ ID N0:15)。
[0055] 根據(jù)本發(fā)明，HSP60肽或肽類似物在包含至少一種可藥學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋 齊U、佐劑或鹽的藥物組合物中給藥。
[0056] 藥物組合物可以通過包括但不限于以下的任何給藥途徑給藥至需要其的受試者： 肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、口服、腹膜內(nèi)、皮下、局部、皮內(nèi)或經(jīng)皮遞送。
[0057] 根據(jù)一些實(shí)施方案，所述組合物由選自以下組成的組的途徑給藥：皮下注射 (SC)、腹膜內(nèi)（IP)注射、肌內(nèi)（IM)注射和靜脈內(nèi)（IV)注射。根據(jù)一個(gè)特定的實(shí)施方案，所 述組合物口服給藥（PO)。
[0058] 根據(jù)另外的其它實(shí)施方案，藥物組合物包含水性溶液中的Hsp60衍生肽或肽類似 物，所述水性溶液包括但不限于鹽水、PBS和水。每個(gè)可能性代表本發(fā)明的單獨(dú)的實(shí)施方案。
[0059] 根據(jù)一些實(shí)施方案，所述組合物包含佐劑。藥學(xué)上可接受的佐劑包括但不限于 油包水乳劑、脂質(zhì)乳劑、或亞微米水包油乳劑和脂質(zhì)體。根據(jù)具體的實(shí)施方案中，佐劑是 Intralipid'! M Lipofundin'' 〇
[0060] 在一些實(shí)施方案中，組合物被配制成用于肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、口服、腹膜內(nèi)、皮下、局部、 皮內(nèi)或經(jīng)皮遞送。
[0061] 根據(jù)一些實(shí)施方案，提供至少2mg hsp60衍生肽或肽類似物的每周劑量。根據(jù)其它 實(shí)施方案，提供包含至少5mg hsp60衍生肽或肽類似物的單獨(dú)劑量。根據(jù)特定的實(shí)施方案， 提供包含IOmg hsp60衍生肽或肽類似物的單獨(dú)劑量。根據(jù)特定實(shí)施方案，2-50mg的hsp60 肽或肽類似物按1-5每周劑量給藥。每個(gè)可能性代表本發(fā)明的單獨(dú)的實(shí)施方案。
[0062] 根據(jù)一些實(shí)施方案，hsp60衍生肽或肽類似物每月1-24次給藥到需要其的受試 者。根據(jù)另外的其它實(shí)施方案，hsp60衍生肽或肽類似物每周至少一次給藥于需要其的受 試者。根據(jù)一些具體實(shí)施方案，hsp60衍生肽或肽類似物每周2-5次給藥到需要其的受試 者。根據(jù)其它實(shí)施方案，提供每日給藥。每個(gè)可能性代表單獨(dú)的本發(fā)明的實(shí)施方案。
[0063] 根據(jù)一些特定的實(shí)施方案，包括2-10mg hsp60衍生肽或肽類似物的組合物每周至 少一次由選自以下組成的組的途徑給藥至需要其的受試者：皮下（SC)注射、腹膜內(nèi)（IP)注 射、肌內(nèi)（M)注射和靜脈內(nèi)（IV)注射。根據(jù)特定的實(shí)施方案，通過皮下注射給藥的藥物組 合物包括脂肪乳劑。每個(gè)可能性代表本發(fā)明的單獨(dú)的實(shí)施方案。
[0064] 根據(jù)其它實(shí)施方案，含50-500mg hsp60肽或類似物的組合物每月4-30次通過口 服給藥提供給需要其的受試者。根據(jù)一些實(shí)施方案，口服給藥是每周至少一次。根據(jù)其它 實(shí)施方案，口服給藥是每周2-5次。根據(jù)其它實(shí)施方案，口服給藥是每日。每個(gè)可能性代表 本發(fā)明的單獨(dú)的實(shí)施方案。
[0065] 根據(jù)一些實(shí)施方案，給藥hsp60衍生肽或肽類似物作為包括向患者給藥胰島素的 治療方案的部分。根據(jù)另一些實(shí)施方案，受試者沒有接受胰島素作為治療的一部分。
[0066] 本發(fā)明還提供了抑制、預(yù)防或治療T2D的并發(fā)癥的方法，該方法包括向需要此類 治療的患者給藥包含至少一種衍生自hsp60的肽或其類似物的藥物組合物。
[0067] 根據(jù)一個(gè)特定的實(shí)施方案，肽類似物是DiaPep277。
[0068] 根據(jù)本發(fā)明可預(yù)防、抑制或治療的T2D的并發(fā)癥包括但不限于：代謝綜合征、脂肪 肝、胰島素抵抗、癌癥、微血管并發(fā)癥，包括神經(jīng)病變（神經(jīng)損傷）、腎病（腎疾?。┖鸵曈X障 礙（如，視網(wǎng)膜病、青光眼、白內(nèi)障和角膜病變）、大血管并發(fā)癥，包括心臟疾病、中風(fēng)和外周 血管疾?。ㄆ淇梢詫?dǎo)致潰瘍、壞疽和截肢）。
[0069] 糖尿病的其他并發(fā)癥包括感染、代謝困難、陽痿、自主神經(jīng)病變和懷孕的問題。
[0070] 根據(jù)一些實(shí)施方案，所述方法還包括給藥至少一種另外的抗糖尿病藥。
[0071] 根據(jù)一些實(shí)施方案，所述至少一種另外的抗糖尿病藥選自以下組成的組：胰島素、 磺酰脲類、α -葡萄糖苷酶抑制劑、雙胍類、氯茴苯酸類、和噻唑烷二酮類。
[0072] 根據(jù)其他實(shí)施方案，所述至少一種另外的抗糖尿病藥選自以下組成的組：敏化劑 (如雙胍類和噻唑烷二酮類）；促泌素（例如磺酰脲類和非磺酰脲促泌素）；α-葡萄糖苷酶 抑制劑；肽類似物（如注射腸促胰島素類似物和注射用糊精類似物）。
[0073] 根據(jù)一些具體實(shí)施方案，所述抗糖尿病藥選自以下組成的組：二甲雙胍；羅格列 酮（Avandia);卩比格列酮（Actos);甲苯磺丁脲（Orinase);醋酸己脲（Dymelor);妥拉磺 脲（Tolinase);氯磺丙脲（Diabinese);第二代藥物；格列批嗪（Glucotrol);格列本脲 (Diabeta，Micronase，Glynase);格列美脈（Amaryl);格列齊特（Diamicron);瑞格列奈 (Prandin);那格列奈（Starlix);米格列醇（Glyset);阿卡波糖（Precose/Glucobay);艾 塞那肽；利拉魯肽；維格列?。℅alvus);西他列?。↗anuvia);沙格列?。∣nglyza);利拉利 汀（Tradjenta)〇
[0074] 根據(jù)一個(gè)特定的實(shí)施方案，hsp60衍生肽或類似物給藥到需要其的受試者，作為不 包括給藥其它抗糖尿病藥的治療方案的一部分。
[0075] 根據(jù)另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種在不具有明顯的自身免疫組分的患者和遺傳 上易患T2D疾病的患者中延遲T2D的發(fā)作的方法，包括給藥hsp60衍生肽或肽類似物。
[0076] 根據(jù)一些具體實(shí)施方案，hsp60肽類似物是DiaP印277。
[0077] 本發(fā)明還公開了用于預(yù)防T2D、延緩T2D的發(fā)作或治療T2D的hsp60衍生肽和肽類 似物。
[0078] 還公開的是hsp60衍生肽或類似物用于制備用于預(yù)防T2D、延緩T2D的發(fā)作或治療 T2D的藥物的用途。
[0079] 根據(jù)一些實(shí)施方案，hsp60肽類似物是DiaP印277,用于治療T2D。
[0080] 特別地配制用于預(yù)防T2D、延緩T2D的發(fā)作或治療T2D的含有hsp60肽或類似物的 藥物組合物，也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
[0081] 根據(jù)一些實(shí)施方案，提供包含hsp60肽或類似物的藥物組合物，所述藥物組合物 還包含另一種抗糖尿病藥。
[0082] 根據(jù)具體的實(shí)施方案，所述藥物組合物除了另一種抗糖尿病藥，包含hsp60肽類 似物 DiaPep277。
[0083] 根據(jù)另一個(gè)方面，本發(fā)明提供包含DiaPep277或其藥學(xué)上可接受的鹽的長(zhǎng)效藥物 組合物，所述長(zhǎng)效藥物組合物特別配制用于經(jīng)選自2-6天、一周、二周或更長(zhǎng)的時(shí)間段提供 所述肽的治療有效量。
[0084] 根據(jù)一些實(shí)施方案，長(zhǎng)效藥物組合物是用于治療T2D。
[0085] 根據(jù)一些具體實(shí)施方案，長(zhǎng)效藥物組合物以適于在需要其的受試者中醫(yī)學(xué)上可接 受的位置注射或植入的儲(chǔ)庫(kù)形式提供。
[0086] 根據(jù)一些實(shí)施方案中，長(zhǎng)效藥物組合物適于從每周一次到每6個(gè)月一次的給藥方 案。
[0087] 根據(jù)特定實(shí)施方案，所述組合物適于從每2周一次至每月一次的給藥時(shí)間表。每 個(gè)可能性代表本發(fā)明的單獨(dú)的實(shí)施方案。
[0088] 長(zhǎng)效組合物的具體實(shí)例包括可生物降解的或不可生物降解的微球、任何合適的幾 何形狀的植入物、可植入的棒、可植入的膠囊、可植入的環(huán)、延長(zhǎng)釋放的凝膠和可侵蝕的基 質(zhì)。每個(gè)可能性代表了本發(fā)明的獨(dú)立實(shí)施方案。
[0089] 本發(fā)明還提供了一種治療T2D的方法，包括給藥或植入含有治療有效量的 DiaP印277的藥學(xué)上可接受的鹽的組合物。
[0090] 根據(jù)本發(fā)明的原理的長(zhǎng)效藥物組合物提供了與可商購(gòu)的注射用劑型相等或更佳 的治療效果，以及在局部和/或全身性水平降低的副作用發(fā)生率和/或嚴(yán)重程度。
[0091] 根據(jù)某些實(shí)施方案，可植入的儲(chǔ)庫(kù)適合于皮下或肌內(nèi)植入。
[0092] 根據(jù)替代性實(shí)施方案，長(zhǎng)效腸胃外藥物組合物包含藥學(xué)上可接受的可生物降解的 或不可生物降解的用于DiaPep277的載體。
[0093] 根據(jù)另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了配制為向具有T2D的患者給藥的包含DiaPep277 的至少2mg的劑型的試劑盒。根據(jù)其它實(shí)施方案，所述試劑盒包含5mgDiaPe277。該試劑 盒還可包括用于所述組合物給藥的說明書。
[0094] 附圖簡(jiǎn)述
[0095] 圖1描述了給藥DiaPep277或?qū)φ盏母鞣N計(jì)劃下，小鼠的體重隨著時(shí)間的變化。
[0096] 圖2表示給藥DiaPep277或?qū)φ盏母鞣N計(jì)劃下，血糖水平隨時(shí)間的變化。
[0097] 發(fā)明詳述
[0098] Hsp60衍生肽和肽類似物，尤其是肽類似物DiaP印277,已知有效治療T1D?，F(xiàn)在意 外地發(fā)現(xiàn)，它們也有效用于非自身免疫性糖尿病，即T2D。為了對(duì)T2D有效，治療劑需要滲透 淋巴樣器官外的脂肪組織，并影響組織中的慢性炎癥。因此，必須使用不同于TlD的劑量和 治療方案治療T2D。
[0099] 如本領(lǐng)域已知的，使用DiaPep277有效治療TlD通常是通過皮下注射給藥，每三個(gè) 月 lmg。
[0100] 現(xiàn)在首次公開，至少2mg DiaP印277劑量用于T2D，通過皮下注射、通過腹膜內(nèi) (IP)注射、肌內(nèi)（頂）注射或靜脈內(nèi)（IV)注射給藥，有效降低T2D動(dòng)物的血糖水平。
[0101] 通常情況下，對(duì)于皮下注射，DiaP印277與佐劑如脂肪乳劑一起配制，而IP和IV注 射途徑無佐劑，但其它制劑和時(shí)間表根據(jù)本發(fā)明是可能的。DiaPep277,通常無佐劑，也可口 服給藥（PO)，劑量為IOOmg或更大。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，給藥的頻率是每月一次和 每月四次之間。
[0102] 本發(fā)明還公開了包含hsp60衍生肽和類似物的藥物組合物，連同新穎制劑和治療 方案，用于預(yù)防、抑制或治療T2D的并發(fā)癥。這樣的并發(fā)癥包括但不限于：代謝綜合征、脂肪 肝、神經(jīng)病變、腎病、視網(wǎng)膜病、心臟疾病、外周血管疾病和癌癥。
[0103] 此外，在本文中首次公開，DiaPep277和其它hsp60衍生肽和類似物，可用于在不 具有明顯的自身免疫組分和遺傳上易患T2D疾病的患者中防止或延緩T2D發(fā)作。
[0104] 根據(jù)本發(fā)明，體內(nèi)動(dòng)物模型用來評(píng)估hsp60肽和肽類似物在T2D中的效果。這些 動(dòng)物模型利用遺傳修飾的耐來普汀小鼠品系（如dp/dp或ob/ob小鼠）或在本來健康的小 鼠中誘導(dǎo)的高脂飲食模型。治療效果通過葡萄糖耐量、空腹血糖和空腹胰島素水平來測(cè)量， 其中被治療的小鼠與對(duì)照動(dòng)物相比，在空腹和葡萄糖耐量試驗(yàn)中有顯著低的血糖。
[0105] 術(shù)語和定義：
[0106] 本文所使用的本發(fā)明的肽的"功能性衍生物"包括這樣的衍生物：其可通過本領(lǐng)域 中已知的方法，從殘基上作為側(cè)鏈存在的功能基團(tuán)或N-或C-端基團(tuán)制備，且被包括在本發(fā) 明中，只要它們保持藥學(xué)上可接受，即它們不破壞肽的活性，不對(duì)含有它的組合物賦予毒性 和沒有不利地影響其抗原性質(zhì)。
[0107] 這些衍生物可，例如，包括羧基的脂族酯，羧基通過與氨或與伯胺或仲胺反應(yīng)產(chǎn)生 的酰胺，氨基酸殘基的自由氨基通過與?；糠址磻?yīng)而形成的N-?；苌铮ㄈ缤轷；?碳環(huán)芳?；┗蜃杂闪u基（例如絲氨?；蛱K氨酰殘基的）通過與酰基部分反應(yīng)而形成的 〇-?；苌?。
[0108] 術(shù)語"類似物"還表示具有根據(jù)本發(fā)明的氨基酸序列、除了一個(gè)或多個(gè)氨基酸改變 的分子。根據(jù)本發(fā)明的類似物還包括擬肽（peptidomimetics)。"擬肽"是指根據(jù)本發(fā)明的 肽被修飾的方式使得它包括至少一個(gè)非編碼的殘基或非肽鍵。這樣的修飾包括，例如，一個(gè) 或多個(gè)殘基的烷基化和更具體地甲基化，天然氨基酸被非天然氨基酸插入或置換，酰胺鍵 被其他共價(jià)鍵代替。根據(jù)本發(fā)明的擬肽可任選地包括是酰胺鍵替代的至少一個(gè)鍵，諸如脲 鍵、氨基甲酸酯鍵、磺酰胺鍵、肼鍵、或任何其他的共價(jià)鍵。適當(dāng)?shù)?類似物"的設(shè)計(jì)可以是 計(jì)算機(jī)輔助的。
[0109] "有效的肽"將具有達(dá)到所期望的結(jié)果，如抑制或誘導(dǎo)細(xì)胞因子的活性?？商鎿Q地， 有效的肽將對(duì)細(xì)胞提供有益效果或治療效果，如誘導(dǎo)釋放特定介質(zhì)。因此提及特定的肽或 "類似物"包括天然存在的肽序列或與天然存在的序列具有基本上相同的活性的肽。本發(fā)明 的"有效的肽"還包括具有與野生型或未修飾的肽相同的活性的修飾的肽（具有氨基酸取 代，保守的和非保守的二者）。本發(fā)明所考慮的本發(fā)明的肽的"鹽"是生理上可接受的有機(jī) 和無機(jī)鹽。
[oho] 如本文和權(quán)利要求中使用的，短語"治療有效量"是指肽或肽類似物或包含其的組 合物給藥給宿主，以對(duì)本文所公開的適應(yīng)癥實(shí)現(xiàn)期望的結(jié)果的量。
[0111] 在本發(fā)明中使用的氨基酸是可商業(yè)購(gòu)得或可通過常規(guī)合成方法獲得的那些。某些 殘基可能需要特殊方法摻入肽中，以及任一連續(xù)的、發(fā)散或會(huì)聚的合成肽序列的方法在本 發(fā)明中是有用的。天然編碼的氨基酸和它們的衍生物是通過三字母代碼根據(jù)IUPAC慣例表 示。當(dāng)沒有說明時(shí)，使用L異構(gòu)體。對(duì)D異構(gòu)體在殘基的縮寫前標(biāo)識(shí)"D"。
[0112] 如本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的氨基酸的保守取代是在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。保守氨基酸 取代包括將一個(gè)氨基酸替換成另一個(gè)具有相同類型的官能團(tuán)或側(cè)鏈的氨基酸，例如脂族、 芳族的、帶正電荷的、帶負(fù)電荷。這些取代可以提高口服生物利用度、向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的滲 透、靶向特定的細(xì)胞群體等等。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，對(duì)肽、多肽或蛋白序列的單獨(dú)取 代、缺失或添加，其改變、添加或缺失編碼序列中的單個(gè)氨基酸或氨基酸的小百分比，是"保 守修飾的變體"，其中改變導(dǎo)致一個(gè)氨基酸被另一個(gè)化學(xué)上相似的氨基酸取代。提供功能相 似氨基酸的保守取換表是本領(lǐng)域公知的。
[0113] 以下六個(gè)組各自含有為彼此保守取代物的氨基酸：
[0114] 1)丙氨酸（A)，絲氨酸（S)，蘇氨酸⑴；
[0115] 2)天冬氨酸（D)，谷氨酸（E);
[0116] 3)天冬酰胺（N)，谷氨酰胺（Q);
[0117] 4)精氨酸（R)，賴氨酸⑷；
[0118] 5)異亮氨酸（I)，亮氨酸（L)，甲硫氨酸（M)，纈氨酸（V);和
[0119] 6)苯丙氨酸（F)，酪氨酸（Y)，色氨酸（W)。
[0120] 藥物學(xué)
[0121] 除了其它方面的考慮，本發(fā)明的新穎的活性成分為肽、肽類似物或擬肽的事實(shí)，決 定了適合遞送這些類型化合物的制劑。一般來說，肽由于對(duì)胃酸或腸道酶消化敏感，不太適 合于口服給藥，但現(xiàn)在公開，根據(jù)本發(fā)明的組合物也適合于口服給藥。根據(jù)本發(fā)明的其他給 藥途徑是關(guān)節(jié)內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、皮內(nèi)或鞘內(nèi)。
[0122] 本發(fā)明的藥物組合物可以通過本領(lǐng)域中公知的方法來制造，例如，通過常規(guī)的混 合、溶解、?；?、研磨、粉碎、制糖衣、磨細(xì)、乳化、包封、包埋或凍干或脂質(zhì)體捕獲方法。
[0123] 如此，根據(jù)本發(fā)明使用的藥物組合物可以使用一種或多種生理學(xué)上可接受的載體 以常規(guī)方式配制，所述載體包括賦形劑和助劑，其促進(jìn)活性化合物加工成可藥學(xué)上使用的 制劑。適當(dāng)?shù)闹苿┤Q于所選擇的給藥途徑。
[0124] 對(duì)于注射，本發(fā)明的化合物可在水溶液中，優(yōu)選在生理相容的緩沖液如Hank氏溶 液、林格氏溶液或生理鹽水緩沖液中配制。對(duì)于經(jīng)粘膜給藥，在制劑中使用適于待滲透的屏 障的滲透劑。這樣的滲透劑例如聚乙二醇是本領(lǐng)域通常已知的。
[0125] 對(duì)糖衣丸核提供合適的包衣。為了這個(gè)目的，可使用濃縮的糖溶液，其可任選含有 阿拉伯膠、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝膠、聚乙二醇、二氧化鈦、漆溶液和合適的有機(jī) 溶劑或溶劑混合物。染料或顏料可以加入片劑或糖衣丸包衣用于辨識(shí)或表征活性化合物劑 量的不同組合。
[0126] 可口服使用的藥物組合物，包括由明膠制成的推入配合膠囊以及由明膠和增塑劑 如甘油或山梨糖醇制成的軟的、密封的膠囊劑。推入配合膠囊可含有混合的活性成分與填 充劑例如乳糖，粘合劑如淀粉，潤(rùn)滑劑如滑石或硬脂酸鎂和任選的穩(wěn)定劑。在軟膠囊中，活 性化合物可以溶解或懸浮在合適的液體中，例如脂肪油、液體石蠟或液體聚乙二醇。另外， 可以加入穩(wěn)定劑。所有口服給藥制劑應(yīng)是以適合于所選擇的給藥途徑的劑量。對(duì)于口腔給 藥，組合物可以采取以常規(guī)方式配制的片劑或錠劑的形式。
[0127] 對(duì)于吸入給藥，根據(jù)本發(fā)明的用途的變化形式，方便地以氣霧劑噴霧呈現(xiàn)的形式 從加壓包裝或霧化器使用合適的推進(jìn)劑，如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或二 氧化碳遞送。在加壓氣霧劑的情況下，劑量單位可通過提供閥門以遞送計(jì)量的量來確定。例 如，吸入器或吹入器使用的明膠的膠囊和藥筒可被配制為包含肽的粉末混合物和合適的粉 末基質(zhì)如乳糖或淀粉。
[0128] 用于腸胃外給藥的藥物組合物包括水溶性形式的活性成分的水溶液。此外，活性 化合物的懸浮液可適當(dāng)?shù)刂苽涑捎托宰⑸鋺腋∫骸：线m的天然或合成的載體是本領(lǐng)域熟知 的（Pillai等，Curr. Opin. Chem. Biol. 5, 447, 2001)。任選地，懸浮液還可含有合適的穩(wěn)定 劑或藥劑，其增加化合物的溶解度，以允許高度濃縮溶液的制備。可選地，活性成分可以是 粉末形式，用于在使用之前與合適的媒介物例如無菌、無熱原的水重構(gòu)。
[0129] 本發(fā)明的化合物還可配制成直腸組合物如栓劑或利用例如，傳統(tǒng)的栓劑基質(zhì)如可 可脂或其它甘油酯保留灌腸。
[0130] 適合于在本發(fā)明的上下文中使用的藥物組合物包括其中活性成分以有效達(dá)到預(yù) 期的目的的劑量包含的組合物。更具體地，治療有效量是指有效地阻止、延遲、減輕或改善 被治療的受試者的疾病的癥狀的化合物的量。治療有效量的確定完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的 能力范圍內(nèi)。
[0131] 本文描述的片段和類似物的毒性和治療功效可以通過標(biāo)準(zhǔn)的藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方案在 細(xì)胞培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中確定，例如，通過確定本發(fā)明化合物的IC 50(提供50%抑制的濃 度）和LD 50 (在50%受試動(dòng)物中導(dǎo)致死亡的致死劑量）。從這些細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)和動(dòng)物研究 獲得的數(shù)據(jù)可以用于配制人類使用的劑量范圍。該劑量可以根據(jù)所采用的劑型和所利用的 給藥途徑而變化。確切的制劑、給藥途徑和劑量可以由個(gè)別醫(yī)師考慮患者的狀況選擇（例 如,Fingl,等，1975，于〃The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. I p. I 中）。
[0132] 根據(jù)待治療的狀況的嚴(yán)重程度和響應(yīng)性，給藥也可以是緩釋組合物的單次給藥， 治療過程持續(xù)數(shù)天至數(shù)周，或直到實(shí)現(xiàn)治愈或?qū)崿F(xiàn)疾病狀態(tài)的降低。當(dāng)然，待給藥的組合物 的量將取決于被治療的受試者、痛苦的嚴(yán)重程度、給藥方式、處方醫(yī)師的判斷、以及所有其 他相關(guān)因素。
[0133] 在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述肽口服給藥（例如作為糖漿、 膠囊或片劑）。
[0134] 在某些實(shí)施方案中，肽的遞送可以通過使用保護(hù)性賦形劑來增強(qiáng)。這通常是通過 將肽與組合物絡(luò)合使其耐受酸性和酶水解，或通過在適當(dāng)?shù)目剐暂d體如脂質(zhì)體中封裝該多 肽來實(shí)現(xiàn)。保護(hù)多肽用于口服遞送的嘗試已公布（例如，美國(guó)專利號(hào)8, 093, 207、7, 666, 446 和 7, 316, 819)。
[0135] 升高的血清半衰期可通過使用緩釋蛋白"包裝"系統(tǒng)來維持。這種緩釋系統(tǒng)是 本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于蛋白和肽的ProLease可生 物降解微球遞送系統(tǒng)（Tracy, 1998, Biotechnol. Prog. 14, 108 ;Johnson 等，1996, Nature Med. 2, 795 ;Herbert 等，1998, Pharmaceut. Res. 15, 357) -種由在多聚基質(zhì)中含蛋白質(zhì)、可 生物降解的多聚微球組成的干燥粉末，可以被復(fù)合為帶有或不帶有其他劑的干制劑。
[0136] 前述的制劑和給藥方法都旨在是說明性的，而不是限制性的。將理解的是，使用本 文提供的教導(dǎo)，其他合適的制劑和給藥模式可以容易地設(shè)計(jì)出來。
[0137] 適于口服給藥的本發(fā)明的制劑可作為離散單位存在，例如在調(diào)味基質(zhì)，通常為蔗 糖和阿拉伯膠和黃蓍膠中包含肽的膠囊、扁囊劑、片劑、錠劑；在惰性基質(zhì)如明膠和甘油，或 蔗糖和阿拉伯膠中包含活性成分的糖錠劑；和在適宜液體載體中含有活性成分的漱口劑。 每種制劑一般含有預(yù)定量的活性肽；作為粉末或顆粒；或含水或不含水的液體中的溶液或 懸浮液，例如糖漿、酏劑、乳劑或頓服劑等。
[0138] 片劑可以通過壓制或模制來制備，任選地以一種或多種輔助成分。壓制的片劑可 以通過在合適的機(jī)器中將自由流動(dòng)形式諸如粉末或顆粒的活性肽壓制來制備，任選地與粘 合劑（例如聚維酮、明膠、羥丙基甲基纖維素）、潤(rùn)滑齊?、惰性稀釋劑、防腐劑、崩解劑（如淀 粉羥乙酸鈉、交聯(lián)聚維酮、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉）、表面活性或分散劑混合。模制片劑可通過 在合適的機(jī)器中將用惰性液體稀釋劑潤(rùn)濕的粉末狀的肽的混合物進(jìn)行模制來制備。片劑可 任選被包衣或刻痕，并可被配制以不同的比例利用例如，羥丙基甲基纖維素以便提供其中 的活性成分的緩慢或控制釋放，以提供所需的釋放曲線。
[0139] 糖漿劑可通過將活性肽添加到糖例如蔗糖的濃縮水溶液制成，向其中可加入任何 必要的成分。這樣的輔助成分）可以包括調(diào)味劑、延緩糖結(jié)晶的劑、或提高其他任何成分溶 解度的劑，如多元醇，例如甘油或山梨糖醇。
[0140] 除了上述成分外，本發(fā)明的制劑可以進(jìn)一步包括選自以下的一種或更多種輔助成 分：稀釋劑、緩沖劑、矯味劑、粘合劑、表面活性劑、增稠劑、潤(rùn)滑劑、防腐劑（包括抗氧化劑） 和等等。
[0141] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，hsp片段或類似物的治療有效量是在從約(λ 02mg/ kg至約10mg/kg的范圍的劑量。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的hsp片段或類似物的劑量在約 0. 05mg/kg至約2mg/kg的范圍，更優(yōu)選地，hsp片段或類似物的劑量在約0. lmg/kg至約 lmg/kg的范圍。應(yīng)當(dāng)理解的是，該劑量可以是逐步升高的劑量，從而可以首先給藥低劑量， 隨后可給藥更高的劑量，直到達(dá)到適當(dāng)?shù)捻憫?yīng)。此外，該組合物的劑量可以在治療階段過程 中分多次給藥給藥于患者，其中每次給藥時(shí)給藥部分劑量。
[0142] 儲(chǔ)庫(kù)系統(tǒng)
[0143] 通過靜脈內(nèi)（IV)、肌內(nèi)（IM)或皮下（SC)注射的腸胃外途徑是用于小以及大分子 量藥物遞送的最常見和有效的方式。然而，由于針刺的疼痛、不適和不便使這一藥物遞送方 式成為最不受患者喜歡的方式。因此，可以最低限度減少注射總次數(shù)的任何藥物遞送技術(shù) 是偏好的。這種操作上藥物給藥頻率的減少可以通過使用可注射的儲(chǔ)庫(kù)制劑來實(shí)現(xiàn)，可注 射的儲(chǔ)庫(kù)制劑能夠以緩慢的但可預(yù)測(cè)的方式釋放藥物并因而改進(jìn)順應(yīng)性。對(duì)于大多數(shù)藥 物，取決于劑量，減少注射頻率從每天到每月或更長(zhǎng)的時(shí)間出個(gè)月）一次或兩次可以是可 能的。除了改善患者的舒適度，以儲(chǔ)庫(kù)制劑的形式較不頻繁的注射藥物使血漿濃度-時(shí)間 曲線平滑，通過消除了波峰和波谷。這種血漿曲線的平滑具有不僅在大多數(shù)情況下促進(jìn)治 療益處，而且也減少經(jīng)常與大分子量的藥物有關(guān)的任何不需要的事件，如免疫原性等的潛 力。
[0144] 微粒、植入物和凝膠是在實(shí)踐中最常見的用于在體內(nèi)延長(zhǎng)藥物釋放的可生物降解 的聚合物裝置。微粒注射前被懸浮在合適的含水介質(zhì)中，且懸浮液中可加載多達(dá)40%的固 體。植入物/桿制劑在特殊的針的輔助下以干燥狀態(tài)的形式遞送至SC/IM組織，而不需要 水性介質(zhì)。桿/植入物的這種特性允許制劑以及待遞送的藥物含量的更高量。另外，在桿 /植入物中，最初爆發(fā)的問題被最小化，是由于植入物的面積比微粒小得多。除了可生物降 解的系統(tǒng)，還有非生物降解的植入物和輸注泵，可以被穿戴在體外。非生物降解的植入物需 要醫(yī)生的訪問，不僅為了將設(shè)備植SC/頂組織，還為了在藥物的釋放時(shí)間段之后將其去除。
[0145] 包含微粒制品的可注射的組合物特別容易有問題。與其它類型的可注射的懸浮液 中0. 5-5%固體相比，微粒的懸浮液可含有高達(dá)40%的固體。另外，可注射的儲(chǔ)庫(kù)產(chǎn)品中使 用的微粒，尺寸范圍高達(dá)約250 μ m(平均，60-100 μ m)，與之相比推薦用于頂或SC給藥的 顆粒尺寸小于5 μ m。較高濃度的固體，以及較大的固體顆粒尺寸需要較大尺寸的針頭（約 18-21號(hào)）用于注射?？傮w而言，盡管低頻率使用更大和不舒服的針頭，相比每天用小針頭 注射藥物，患者仍然偏好低頻率給藥的劑型。
[0146] 聚（乳酸）（PLA)和丙交酯乙交酯共聚物，稱為聚（丙交酯-共-乙交酯）（PLGA) 的可生物降解聚酯，是可生物降解的劑型中使用的最常見的聚合物。PLA為疏水性分子， PLGA比PLA降解更快，因?yàn)榇嬖诟H水的乙交酯基團(tuán)。這些生物相容的聚合物經(jīng)受隨機(jī)、非 酶的酯鍵的水解裂解，形成乳酸和羥基乙酸，它們是在體內(nèi)正常代謝的化合物。可吸收的縫 線、夾子和植入物是這些聚合物的最早的應(yīng)用。Southern Research Institute在1970年 研制出第一個(gè)合成的、可吸收的縫線（Dexon? )。描述在緩釋劑型中使用PLGA聚合物的 第一個(gè)專利出現(xiàn)在1973年（美國(guó)3, 773, 919)。
[0147] 今天，PLGA聚合物可購(gòu)自多個(gè)供應(yīng)商；Alkermes (Medisorb polymers), Absorbable Polymers International [原 Birmingham Polymers (Durect 的一個(gè)部門）]， Purac和Boehringer Ingelheim。除了 PLGA和PLA，天然的纖維素聚合物，如淀粉、淀粉衍 生物、葡聚糖和非PLGA的合成聚合物也正在被開發(fā)作為這種系統(tǒng)中的可生物降解聚合物。
[0148] 以下實(shí)施例旨在說明如何制造和使用本發(fā)明的化合物和方法，并不以任何方式被 解釋為限制。雖然本發(fā)明現(xiàn)在將結(jié)合其具體實(shí)施方案來說明，但很明顯，許多修改和變化對(duì) 于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是明顯的。因此，意圖是包括落入修改的權(quán)利要求的精神和廣義范圍 內(nèi)的所有這些修改和變化。 實(shí)施例
[0149] 實(shí)施例I :T2D實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型
[0150] 遺傳易感T2D的小鼠（dp/dp或ob/ob品系，耐來普?。⒑?或由高脂飲食誘 導(dǎo)發(fā)展T2D的健康C57BL/6小鼠，被用于體內(nèi)評(píng)價(jià)hsp60肽和類似物針對(duì)T2D提供保護(hù) 或治療 T2D 的活性。db/db 模型被描述在，如 Dray 等，Am. J. Physiol. Endocrinol Metab 2010, 298, El 161-El 169中。在高脂飲食模型中，飲食（例如Harlan?的TD. 0811或Research Diets Inc.的D12492,分別含21%和34. 9%的脂肪）在斷奶后開始，小鼠10周齡前表現(xiàn) T2D。這些，以及其它用于T2D的動(dòng)物模型，由Srinivasan和Ramarao綜述（Indian J Med Res 2007, 125, 451-472)。
[0151] 在一個(gè)典型的試驗(yàn)中，T2D小鼠組（每組10只）在疾病早期接受處理（約7-10周 齡）。陰性對(duì)照組由健康小鼠組成，陽性對(duì)照小鼠是用安慰劑處理的T2D。
[0152] 使用DiaPep277或其他hsp60肽或類似物處理，每周進(jìn)行一次或幾次，劑量為 100-500微克皮下注射（含佐劑如intralipid)或IP、IM或IV(不含佐劑）。葡萄糖耐量、 空腹血糖和空腹胰島素水平于開始處理1-2個(gè)月后測(cè)量。
[0153] 在一個(gè)具體的體內(nèi)試驗(yàn)中，對(duì)70只雄性C57BL/N小鼠稱重，測(cè)量血糖水平，并分為 7組，10只小鼠/組，如下：
[0154] 1.常規(guī)飲食，無處理；
[0155] 2.高脂（60%)飲食；
[0156] 3.高脂（60% )飲食+皮下注射intralipid，每周一次；
[0157] 4.高脂（60% )飲食 + 皮下注射 intralipid 中 100 μ g DiaPep277,每處理一次；
[0158] 5.高脂（60% )飲食 + 皮下注射 intralipid 中 200 μ g DiaPep277,每周一次；
[0159] 6.高脂（60% )飲食 + 皮下注射 intralipid 中 500 μ g DiaPep277,每周一次；
[0160] 7.高脂（60% )飲食+腹腔注射PBS中100 μ g DiaP印277,每周三次。
[0161] 對(duì)2-7組的動(dòng)物喂食含60%脂肪的飲食，從5周齡直至試驗(yàn)終止?？崭寡撬?每周測(cè)定一次。約16周后試驗(yàn)終止，血紅蛋白AlC和C-肽水平使用本領(lǐng)域已知的方法測(cè) 量。
[0162] 證明了，盡管動(dòng)物食欲和體重沒有響應(yīng)于任何的DiaPep277處理而改變（圖1)， 空腹血糖水平響應(yīng)于某些處理方案而降低。與未處理組相比，血糖水平的降低在PBS中 100 μ g DiaP印277腹腔注射、每周三次處理的組中特別顯著（p = 0· 0178)。
[0163] 雖然本發(fā)明已被具體地描述，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解，可進(jìn)行許多變化和修改。 因此，本發(fā)明不應(yīng)當(dāng)被解釋為限制于具體描述的實(shí)施方案，而是，參考下面的權(quán)利要求將更 容易地理解本發(fā)明的范圍、精神和概念。
【權(quán)利要求】
1. 一種治療或緩解2型糖尿病（T2D)的方法，所述方法包括向需要其的受試者給藥包 含衍生自hsp60的肽或其肽類似物的組合物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述肽類似物包含具有以下序列的對(duì)應(yīng)于人 hsp60 的氨基酸殘基437-460 的序列 iVal-Leu-Gly-Gly-Gly-XfAla-Leu-Leu-Arg-^-Ile-Pr〇-Ala-Leu-Asp-Ser-Leu-X 3-P;r〇-Ala-Asn-Glu-Asp (SEQ ID NO: 1)，其中父丨是 Cys 或 Val 殘基，X2是Cys或Val殘基，X3是Thr或Lys殘基。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述肽類似物是hsp60的殘基437-460的Val6， Val11類似物，如SEQ ID NO:2中所列的： 1 6 11 Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Val-Ala-Leu-Leu-Arg-Val-Ile-Pr〇-Ala-Leu-Asp-Ser-Leu-T hr-Pr〇- 24 Ala-Asn-Glu-Asp(SEQ ID 勵(lì)：2)，本文表示為0丨&卩6卩277。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述hsp60片段肽選自以下組成的組： 人hsp60的殘基31-50 : Lys-Phe-Gly-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Leu-Met-Leu-Gln-Gly-Val-Asp-Leu-Leu-Ala-A sp-Ala(SEQ ID NO:3)； 人 hsp60 的殘基 136-155 : Asn-Pr〇-Val-Glu-Ile-Arg-Arg-Gly-Val-Met-Leu-Ala-Val-Asp-Ala-Val-Ile-Ala-G lu-Leu(SEQ ID NO :4)； 人 hsp60 的殘基 151-170 : Val-Ile-Ala-Glu-Leu-Lys-Lys-Gln-Ser-Lys-Pr〇-Val-Thr-Thr-Pr〇-Glu-Glu-Ile-A la-Gln(SEQ ID NO:5)； 人 hsp60 的殘基 166-185 : Glu-Glu-Ile-Ala-Gln-Val-Ala-Thr-Ile-Ser-Ala-Asn-Gly-Asp-Lys-Glu-Ile-Gly-A sn-Ile(SEQ ID N0:6)； 人 hsp60 的殘基 195-214 : Arg-Lys-Gly-Val-Ile-Thr-Val-Lys-Asp-Gly-Lys-Thr-Leu-Asn-Asp-Glu-Leu-Glu-I le-Ile(SEQ ID NO:7)； 人 hsp60 的殘基 255-274 : Gln-Ser-Ile-Val-Pr〇-Ala-Leu-Glu-Ile-Ala-Asn-Ala-His-Arg-Lys-Pr〇-Leu-Val-I le-Ile(SEQ ID N0:8)； 人 hsp60 的殘基 286-305 : Leu-Val-Leu-Asn-Arg-Leu-Lys-Val-Gly-Leu-Gln-Val-Val-Ala-Val-Lys-Ala-Pr〇-G ly-Phe(SEQ ID NO:9)； 人 hsp60 的殘基 346-365 : Gly-Glu-Val-Ile-Val-Thr-Lys-Asp-Asp-Ala-Met-Leu-Leu-Lys-Gly-Lys-Gly-Asp-L ys-Ala(SEQ ID NO:10)； 人 hsp60 的殘基 421-440 : Val-Thr-Asp-Ala-Leu-Asn-Ala-Thr-Arg-Ala-Ala-Val-Glu-Glu-Gly-Ile-Val-Leu-G ly-Gly(SEQ ID NO:11)； 人 hsp60 的殘基 436-455 : Ile-Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Cys-Ala-Leu-Leu-Arg-Cys-Ile-Pr〇-Ala-Leu-Asp-Ser-L eu-Thr(SEQ ID NO:12)； 人 hsp60 的殘基 466-485 : Glu-Ile-Ile-Lys-Arg-Thr-Leu-Lys-Ile-Pr〇-Ala-Met-Thr-Ile-Ala-Lys-Asn-Ala-G ly-Val(SEQ ID NO:13)； 人 hsp60 的殘基 511-530 : Val-Asn-Met-Val-Glu-Lys-Gly-Ile-Ile-Asp-Pr〇-Thr-Lys-Val-Val-Arg-Thr-Ala-L eu-Leu(SEQ ID NO:14)； 人 hsp60 的殘基 343-366 : Gly-Lys-Val-Gly-Glu-Val-Ile-Val-Th;r-Lys-Asp-Asp-Ala-Met(SEQ ID N0:15)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1中任一項(xiàng)所述的方法，其中給藥是通過選自以下組成的組的途徑： 肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、口服、腹膜內(nèi)、皮下、局部、皮內(nèi)或經(jīng)皮遞送。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中給藥是通過選自以下組成的組的途徑：皮下注射、 腹膜內(nèi)（IP)注射、肌內(nèi)（IM)注射和靜脈內(nèi)（IV)注射。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述組合物口服給藥（P0)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，還包括選自以下組成的組的至少一種佐劑：脂質(zhì)乳劑、 亞微米水包油乳劑、油包水乳劑和脂質(zhì)體。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述組合物包含至少2mg的所述hsp60衍生肽或 肽類似物。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述組合物包含至少5mg的所述hsp60衍生肽或 肽類似物。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述組合物包含l〇mg的所述hsp60衍生肽或肽 類似物。
12. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述組合物包含2-50mg的所述hsp60衍生肽或 肽類似物。
13. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述hsp60衍生肽或肽類似物每月2-24次向需 要其的受試者給藥。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述hsp60衍生肽或肽類似物每周2-5次向需要 其的受試者給藥。
15. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中每周至少一次由選自以下組成的組的途徑給藥 包含2-10mg的所述hsp60衍生肽或肽類似物的組合物：皮下注射、腹膜內(nèi)（IP)注射、肌內(nèi) (IM)注射和靜脈內(nèi)（IV)注射。
16. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中每月1-4次口服給藥包含50-500mg的hsp60肽 或類似物的組合物。
17. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中給藥所述hsp60衍生肽或肽類似物作為包括向所 述患者給藥胰島素的治療方案的一部分。
18. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述受試者不接收胰島素作為其治療的一部分。
19. 一種抑制、預(yù)防或治療T2D的至少一種并發(fā)癥的方法，所述方法包括向需要此類治 療的患者給藥包含至少一種衍生自hsp60的肽或其類似物的藥物組合物。
20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述肽類似物是DiaPep277。
21. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述T2D的并發(fā)癥選自以下組成的組：代謝綜 合征、脂肪肝、神經(jīng)病變、腎病、心臟疾病、外周血管疾病和癌癥。
22. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述方法還包括給藥至少一種另外的抗糖尿病 藥。
23. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述至少一種抗糖尿病藥選自以下組成的組： 胰島素、磺酰脲類、α -葡萄糖苷酶抑制劑、雙胍類、氯茴苯酸類、和噻唑烷二酮類。
24. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中將所述hsp60肽或類似物給藥于需要其的受試 者，作為不包括抗糖尿病藥的給藥的治療方案的一部分。
25. -種在不具有明顯的自身免疫組分的患者和遺傳上易患T2D疾病的患者中延緩 T2D發(fā)作的方法，所述方法包括給藥hsp60衍生肽或肽類似物。
26. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述hsp60肽類似物是DiaP印277。 27. hsp60衍生肽或肽類似物用于制備用于預(yù)防T2D、延緩T2D的發(fā)作或治療T2D的藥 物的用途。
28. -種藥物組合物，所述藥物組合物包含hsp60衍生肽或肽類似物，所述藥物組合物 被特別地配制用于預(yù)防T2D、延緩T2D的發(fā)作或治療T2D。
29. 根據(jù)權(quán)利要求28所述的藥物組合物，其中所述hsp60衍生肽類似物是DiaPep277。
30. -種長(zhǎng)效藥物組合物，所述長(zhǎng)效藥物組合物包含DiaPep277或其藥學(xué)上可接受的 鹽，所述長(zhǎng)效藥物組合物被特別配制用于經(jīng)選自2-6天、一周、二周或更長(zhǎng)的時(shí)間段提供所 述肽的治療有效量。
31. 根據(jù)權(quán)利要求30所述的長(zhǎng)效藥物組合物，所述長(zhǎng)效藥物組合物用于治療T2D。
32. 根據(jù)權(quán)利要求30所述的長(zhǎng)效藥物組合物，所述長(zhǎng)效藥物組合物是以適于在需要其 的受試者中醫(yī)學(xué)上可接受的位置注射或植入的儲(chǔ)庫(kù)形式。
33. 根據(jù)權(quán)利要求30所述的藥物組合物，所述藥物組合物還包含藥學(xué)上可接受的可生 物降解的或不可生物降解的載體。
34. 根據(jù)權(quán)利要求30所述的藥物組合物，所述藥物組合物適于從每周一次到每6個(gè)月 一次的給藥方案。
35. 根據(jù)權(quán)利要求30所述的藥物組合物，所述藥物組合物適于從每2周一次至每月一 次的給藥方案。
36. 根據(jù)權(quán)利要求30-35中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，所述藥物組合物是以以下形式： 可生物降解的微球、不可生物降解的微球、任何合適的幾何形狀的植入物、可植入的棒、可 植入的膠囊、可植入的環(huán)、或延長(zhǎng)釋放的凝膠或可侵蝕的基質(zhì)。
【文檔編號(hào)】A61K38/17GK104244967SQ201380011731
【公開日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2013年2月28日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月1日
【發(fā)明者】艾潤(rùn)·R·科恩, 拉阿南·馬加利特 申請(qǐng)人:耶達(dá)研究與發(fā)展有限公司