具有抗腫瘤活性的新穎結(jié)合分子的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種結(jié)合分子，其特異性地結(jié)合在腫瘤細胞上表達的抗原的2個不同表位，其中所述結(jié)合分子包含：(a)第一結(jié)合(多)肽，其特異性地結(jié)合所述在腫瘤細胞上表達的抗原的第一表位，其中所述第一結(jié)合(多)肽是FynSH3衍生的多肽；和(b)第二結(jié)合(多)肽，其特異性地結(jié)合所述在腫瘤細胞上表達的抗原的第二表位。本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明的結(jié)合分子的核酸分子、包含所述核酸分子的載體以及用所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞或非人宿主。本發(fā)明還涉及一種生產(chǎn)本發(fā)明的結(jié)合分子的方法以及藥物和診斷組合物。此外，本發(fā)明也涉及用于腫瘤治療用途的本發(fā)明的結(jié)合分子、核酸分子、載體或宿主細胞。
【專利說明】具有抗腫瘤活性的新穎結(jié)合分子
[0001] 本發(fā)明涉及一種結(jié)合分子，其特異性地結(jié)合在腫瘤細胞上表達的抗原的2個不同 表位，其中所述結(jié)合分子包含：(a)第一結(jié)合（多）肽，其特異性地結(jié)合所述在腫瘤細胞上 表達的抗原的第一表位，其中所述第一結(jié)合（多）肽是Fyn SH3衍生的多肽；和（b)第二 結(jié)合（多）肽，其特異性地結(jié)合所述在腫瘤細胞上表達的抗原的第二表位。本發(fā)明還涉及 編碼本發(fā)明的結(jié)合分子的核酸分子、包含所述核酸分子的載體以及用所述載體轉(zhuǎn)化的宿主 細胞或非人宿主。本發(fā)明也涉及生產(chǎn)本發(fā)明的結(jié)合分子的方法以及藥物和診斷組合物。此 夕卜，本發(fā)明也涉及用于治療腫瘤的本發(fā)明的結(jié)合分子、核酸分子、載體或宿主細胞。
[0002] 在本說明書中，引用了許多文件，包括專利申請和生產(chǎn)商的手冊。這些文件的公開 內(nèi)容盡管不被認為與本發(fā)明的專利性有關(guān)，但是特此通過引用整體并入。更具體地，所有參 考文件通過引用并入，達到如同明確地且單獨地指出每篇單獨文件通過引用并入相同的程 度。
[0003] 已經(jīng)提議將非免疫球蛋白衍生的結(jié)合試劑（共同地命名為"支架"；參見，例如， Skerra (2000) J. Moh Recognit. 13，167-187)用作診斷和治療劑。在過去的 10-15 年中已經(jīng)提出了超過50種不同的蛋白支架，在該領域中最先進的方案是（如在Gebauer 和 Skerra (2009) Curr Opinion in Chemical Biology 13:245-255 中總結(jié)的）：親和體 (affibodies)(基于葡萄球菌蛋白A的Z-結(jié)構(gòu)域）、Kunitz型結(jié)構(gòu)域、adnectins (基于人 纖連蛋白的第10個結(jié)構(gòu)域、anticalins (衍生自脂質(zhì)運載蛋白）、DARPins (衍生自錨蛋 白重復蛋白）、親和多聚體（avimer)(基于多聚化的LDLR-A)和Fynomers (衍生自人Fyn SH3結(jié)構(gòu)域)。
[0004] -般而言，SH3結(jié)構(gòu)域存在于多種參與細胞信號轉(zhuǎn)導的蛋白中（Musacchio等人 (1994) /￥〇盡沿oMf. 61; 283-297)。這些結(jié)構(gòu)域沒有占據(jù)蛋白內(nèi)的固 定位置，且可以獨立地表達和純化。目前已知所述結(jié)構(gòu)域的超過1000個出現(xiàn)，包括約300 個人 SH3 結(jié)構(gòu)域（Musacchio (2003) JoVaflce1S i/? Z7Toiei/? 61; 211-268)。 盡管在SH3結(jié)構(gòu)域之間存在巨大序列多樣性，它們都共有一個保守折疊：由2個反向平 行的 β _ 折疊形成的緊湊 β 桶（Musacchio (2003) Advances in Protein Chemistry. 61; 211-268)。通常，SH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合富含脯氨酸的肽，該肽含有PXXP核心結(jié)合基序（Ren 等人（1993) 259; 1157-1161)，但是還已經(jīng)描述了非常規(guī)SH3結(jié)合位點的例子 (Karkkainen等人（2006)萬#如TfeA 7; 186-191)。到目前為止測序的大多數(shù)SH3結(jié)構(gòu)域 具有大約60-65個氨基酸的總長度，但是它們中的一些可以表征為多達85個氨基酸，這 是由于在連接二級結(jié)構(gòu)的主要保守元件的環(huán)中的插入（Koyama等人（1993) (?// 72(6); 945-952)。不同SH3結(jié)構(gòu)域的比對揭示了負責適當結(jié)構(gòu)形成以及規(guī)范的富含脯氨酸的基序 識別的保守氨基酸殘基（Larson 等人（2000) Z7Toiei/? 5bi<9/?c<9 9; 2170-2180)。
[0005] 常規(guī)化學治療劑對腫瘤的治療依賴于以下預期：藥物將優(yōu)先殺死快速分裂的 腫瘤細胞而不是正常細胞。但是，對腫瘤細胞的選擇性的缺乏會導致在具有提高的增 殖速率的正常組織(諸如骨髓、胃腸道和毛囊）中的毒性。由于較差的血液灌注、不規(guī) 則的脈管系統(tǒng)和在腫瘤環(huán)境中的高間質(zhì)壓力，化學治療劑在腫瘤塊中表現(xiàn)出較差積累 (Bosslet等人（1998) Cancer Res 58:1195-1201)。此外，多藥物抗性蛋白可減少藥物 攝取（Ramachandran等人（1999) Mol Diagn 4:81-94)。結(jié)果，優(yōu)先祀向腫瘤細胞的治 療劑的開發(fā)代表現(xiàn)代抗癌研究的一個主要焦點。在該背景下，通過結(jié)合腫瘤相關(guān)抗原而 將治療劑靶向遞送至腫瘤部位，是現(xiàn)代抗癌研究的一個新出現(xiàn)的領域，這有希望在避開正 常組織的同時將生物活性分子集中在腫瘤病灶上（Pfaffen等人（2010) Exp Cell Res 316(5) 836-847)。例如，在乳腺癌和卵巢癌中觀察到HER2蛋白的增量調(diào)節(jié)，且與預后 不良有關(guān)（Slamon 等人（1987) Science, 235:177-182; Slamon 等人（1989) Science 244:707-712)。還已經(jīng)在許多其它腫瘤類型(包括膀胱癌、唾液腺癌、子宮內(nèi)膜癌、胰腺癌、 甲狀腺癌、腎癌、肺癌、上胃腸道癌和腸癌）中觀察到HER2的過表達（頻繁地，但是非均勻 地，由于基因擴增）（Scholl 等人（2001) AnnOncol, 12增刊 l:S81-87; Ross JS (2011) Biomark Med 3:307-318; Fukushige 等人（1986) Mol Cell Biol 3:955-958; Cohen 等 人（1989) Oncogene 1:81-88; Weiner 等人（1990) Cancer Res 50:421-425; Park 等 人（1989) Cancer Res 23:6605-6609; Zhau 等人（1990) Mol. Carcinog. 5:254-257; Aasland 等人（1988) Br J Cancer 4:358-363; Seliger 等人（2000) Int J Cancer 87(3) :349-359)。另外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)HER2在前列腺癌中過表達，盡管與乳腺癌組織相比在較 低水平（Minner 等人（2010) Clin Cancer Res 16 (5): 1553-1560)。
[0006] 在過去，已經(jīng)描述了幾種HER2結(jié)合蛋白，諸如親和體（affibodies)和DARPins (Wikman 等人（2004) Protein Eng Des Sel 17(5): 455-462; Zahnd 等人（2007) 369(4) :1015-1028)。此外，Hudziak等人描述了一組使用人乳腺腫瘤細胞系表征的鼠 抗-HER2抗體（包括抗體4D5和2C4)的制備（Hudziak等人（1989) Mol Cell Biol 9(3) :1165-1172 ;也參見美國專利號5, 677, 171)。確定了細胞暴露于抗體以后的相對細胞 增殖。作者證實，抗體4D5最有效地抑制了細胞增殖。美國食品和藥品管理局于1998年批 準重組人源化形式的鼠抗-HER2抗體4D5 (huMAb4D5-8，曲妥珠單抗，赫賽汀?，也參見 美國專利號5, 821，337)用于與化學療法聯(lián)合處理HER2-陽性的轉(zhuǎn)移性乳腺癌（MBC)。目 前，曲妥珠單抗被推薦為具有轉(zhuǎn)移性HER2-陽性腫瘤的患者的一線治療，無論是作為單一 試劑（有限的患者群體）還是與內(nèi)分泌療法或化學療法聯(lián)合，以及在佐劑場合中（Awada 等人（2012) Cancer Treat Rev, 106(1):6-13)。但是，在用曲妥珠單抗治療過程中，經(jīng)常 遇到原發(fā)性（固有的）或繼發(fā)性（在治療下獲得）抗性（Tsang等人（2012) Br J Cancer 106:6-13)。例如，已經(jīng)觀察到，過表達HER2的轉(zhuǎn)移性乳腺癌對單一試劑曲妥珠單抗的原發(fā) 性抗性率為66 - 89%。另外，對基于曲妥珠單抗的方案實現(xiàn)最初應答的大多數(shù)患者在1年 內(nèi)形成抗性（Nahta 等人（2006) Nat Clin Pract Oncol 3(5) :269-280)。在文獻中已經(jīng)描 述了克服對曲妥珠單抗療法的抗性的幾個策略（參見綜述Tsang等人（2012) Br J Cancer 106:6-13; Awada 等人（2012) Cancer Treat Rev 106(1) :6_13)。
[0007] -種有吸引力的克服抗性的途徑以使用HER2結(jié)合劑的組合為代表。在該背景下， 幾個組證實,2種抗-HER2抗體的組合會比任一種單獨的單一抗體治療更好地在體外和/ 或在體內(nèi)抑制人腫瘤細胞系的生長（Yamashita-Kashima等人（2011) Clin Cancer Res 17(15):5060-5070; Scheuer等人（2009) Cancer Res 69(24):9330-9336; Lee-Hoeflich 等人（2008) Cancer Res 68(14):5878-5887; Kasprzyk 等人（1992) Cancer Res 52:2771-2776; Ben-Kasus 等人（2009) Proc Natl Acad Sci U S A 106(9) :3294-3299)。 值得注意的是，在其中將曲妥珠單抗與培妥珠單抗（培妥珠單抗是在Hudziak等人 (Hudziak 等人（1989) Mol Cell Biol 9(3):1165-1172;美國專利號 5,677,171) ;Adams C.W.等人（2006) Cancer Immunol Immunother, 55:717-727; W02001/00245)中描述 的人源化形式的小鼠抗體2C4)組合的臨床前研究中觀察到增加的效力，并且2期臨床試 驗表明，曲妥珠單抗和培妥珠單抗的共同施用會在患者中產(chǎn)生抗腫瘤應答，所述患者先前 在接受基于曲妥珠單抗的療法時已經(jīng)經(jīng)歷疾病進展（Baselga等人（2010) J Clin Oncol 28:1138-1144)。培妥珠單抗結(jié)合HER2的細胞外部分的結(jié)構(gòu)域II，而曲妥珠單抗結(jié)合HER2 的結(jié)構(gòu)域IV中的位點，該位點鄰近膜。由于它的結(jié)合特異性，證實了培妥珠單抗會阻止 HER2與其它HER受體（諸如HER1、HER3和HER4)形成有活性的異源二聚體（Agus等人 (2002) Cancer Cell 2:127-137; Fendly 等人（1990) Cancer Res 50(5): 1550-1558)。
[0008] 近年來，在III期臨床研究中已經(jīng)證實，與安慰劑+曲妥珠單抗+多西他賽相比， 培妥珠單抗+曲妥珠單抗+多西他賽的組合當用作HER2-陽性的轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的一 線治療時會顯著延長無進展存活（Baselga等人（2012) N Engl J Med 366 (2): 109-119)。 但是，獨立地評估的無進展存活中位值僅延長了 6. 1個月（從對照組中的12. 4個月至培妥 珠單抗組中的18. 5個月）。此外，2種或更多種生物化合物的組合需要2種分子的給藥，這 經(jīng)常使得管理操作和臨床操作更加困難。此外，藥代動力學的差異和組織濃度的差異可以 降低2種抗體的效力。
[0009] 基于靶向HER2或EGFR (HERl)上的不同表位的抗體組合的改善的治療效果 (Perera等人（2005) Clin. CancerRes. 11:6390-6399)，已經(jīng)進行努力來工程改造多特 異性的EGFR和HER2靶向蛋白，它們結(jié)合EGFR (W02011/020033)或HER2上的不同表位（口 頭介紹，Woisetschljiger M.，Bispecific Antibody Summit 2011，2011 年 9 月 27 日， Boston, USA ;幻燈片編號5和15)。
[0010] 在W02011/020033中，分離出基于纖連蛋白結(jié)構(gòu)域的EGFR結(jié)合蛋白，并將其與 抗-EGFR單克隆抗體225 (也被稱作西妥昔單抗（愛必妥?))的重鏈和/或輕鏈的C-或 N-端融合。證實了結(jié)合EGFR的纖連蛋白結(jié)構(gòu)域會識別與抗體225識別的表位不同的表位。 發(fā)現(xiàn)得到的纖連蛋白-抗體融合體中的一些會比抗體225本身更有效地誘導EGFR聚簇和 減量調(diào)節(jié)。
[0011] 在 Woisetschljiger M.的介導（口頭介紹，Woisetschljiger M.，Bispecific Antibody Summit 2011，2011 年9 月 27 日，Boston, USA;幻燈片編號 5和 15)中，描述 了雙特異性的基于曲妥珠單抗的靶向HER2的抗體曲妥珠單抗-Her2-1，其結(jié)合HER2上的2 個不同表位。但是，與未修飾的曲妥珠單抗相比，沒有觀察到雙特異性的基于曲妥珠單抗的 抗體的增強活性。
[0012] 因而，盡管事實上已經(jīng)將大量努力投入改善抗腫瘤療法，仍然需要鑒別克服了上 述缺點的用于改善的癌癥治療的新穎治療性化合物。
[0013] 通過提供在權(quán)利要求中表征的實施方案，滿足了該需要。
[0014] 因此，本發(fā)明涉及一種結(jié)合分子，其特異性地結(jié)合在腫瘤細胞上表達的抗原的2 個不同表位，其中所述結(jié)合分子包含：(a)第一結(jié)合（多）肽，其特異性地結(jié)合所述在腫瘤 細胞上表達的抗原的第一表位，其中所述第一結(jié)合（多）肽是Fyn SH3衍生的多肽；和（b) 第二結(jié)合（多）肽，其特異性地結(jié)合所述在腫瘤細胞上表達的抗原的第二表位。
[0015] 術(shù)語"特異性地結(jié)合抗原的2個不同表位的結(jié)合分子"是指這樣的結(jié)合分子：其對 在腫瘤細胞上表達的一種抗原具有2種不同的結(jié)合特異性。換言之，本發(fā)明的結(jié)合分子能 夠特異性地結(jié)合所述一種抗原內(nèi)的2個不同結(jié)合位點（即表位）。此外，本發(fā)明的雙特異性 的結(jié)合分子能夠同時結(jié)合所述2個不同表位。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明，當各個分子不會或基本上不會與類似結(jié)構(gòu)的表位交叉反應時，認為 所述分子特異性地結(jié)合（在本文中也被稱作特異性地相互作用）?？梢栽囼炘谘芯肯碌姆?子的組的交叉反應性，例如，通過評估所述分子的組在常規(guī)條件下與目標表位以及與許多 大致上（在結(jié)構(gòu)上和/或在功能上）緊密相關(guān)的表位的結(jié)合。僅在它的有關(guān)背景下結(jié)合目 標表位（例如蛋白結(jié)構(gòu)中的特定基序）、但是不會或基本上不會結(jié)合任何其它表位的那些 分子被認為是對目標表位特異性的。對應的方法描述在例如Harlow和Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988 或Harlow和Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999中。本文中使用的術(shù)語"基本上不會與類似結(jié)構(gòu)的表位交叉反應的分子"表示這樣的 分子：其結(jié)合靶抗原比結(jié)合類似結(jié)構(gòu)的表位具有高至少5倍的親和力，更優(yōu)選地高至少10 倍的親和力，例如高至少50倍的親和力，更優(yōu)選地高至少100倍的親和力，例如高至少500 倍的親和力。甚至更優(yōu)選地，它結(jié)合靶抗原比結(jié)合類似結(jié)構(gòu)的表位具有高至少1，〇〇〇倍的 親和力，例如高至少10, 〇〇〇倍的親和力，且最優(yōu)選地高至少100, 〇〇〇倍的親和力。
[0017] 術(shù)語"在腫瘤細胞上表達的抗原"表示這樣的抗原：其不在非腫瘤細胞上表達，或 在腫瘤細胞上的表達量高于在非腫瘤細胞上的表達量。優(yōu)選地，所述抗原在腫瘤細胞上的 表達以比在非腫瘤細胞上的表達高至少2倍的量，更優(yōu)選高至少5倍的量，例如高至少10 倍的量，甚至更優(yōu)選高至少100倍的量，例如高至少1000倍的量，最優(yōu)選高至少10, 〇〇〇倍 的量。合適的靶抗原包括在腫瘤細胞上更強烈地表達的任意這樣的抗原，優(yōu)選地，所述抗原 是下文定義的抗原之一。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明使用的術(shù)語"（多）肽"描述了氨基酸的線性分子鏈，包括單鏈蛋白或 它們的片段。該術(shù)語表示這樣的分子組：其包含由至多30個氨基酸組成的肽的組，以及由 超過30個氨基酸組成的多肽（在本文中也被稱作蛋白）的組。
[0019] 此外，本發(fā)明也包括這樣的（多）肽的肽擬似物，其中一個或多個氨基酸和/或一 個或多個肽鍵可以被功能類似物替換。這樣的功能類似物包括除了 20種基因編碼的氨基 酸以外的所有已知氨基酸，諸如硒代半胱氨酸。術(shù)語（多）肽也表示天然修飾的（多）肽， 其中所述修飾通過例如糖基化、乙?；?、磷酸化和本領域眾所周知的類似修飾來實現(xiàn)。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明，所述結(jié)合分子包含在（a)和（b)中定義的2個結(jié)合（多）肽。
[0021] 第一結(jié)合（多）肽特異性地結(jié)合所述在腫瘤細胞上表達的抗原的第一表位，且是 Fyn SH3衍生的多肽。應當理解，所述第一結(jié)合（多）肽的一個或多個拷貝可以存在于本發(fā) 明的結(jié)合分子中，例如所述第一結(jié)合（多）肽的2個、3個或4個拷貝。
[0022] 表位可以是構(gòu)象表位或連續(xù)表位。在多肽抗原中，構(gòu)象（或不連續(xù)）表位的特征在 于在基本序列中被隔開的2個或更多個不連續(xù)氨基酸殘基的存在，但是當所述多肽折疊成 天然三維結(jié)構(gòu)以構(gòu)成表位時，所述不連續(xù)氨基酸殘基在分子表面上彼此鄰近地定位（Sela， (1969) Science 166，1365 和 Laver, (1990) Cell 61，553-6)。促成表位的 2 個或更多 個不連續(xù)氨基酸殘基存在于單獨的部分中，或甚至存在于抗原的一個或多個（多）肽鏈中。 相比而言，線性表位或連續(xù)表位由在（多）肽鏈的單個線性段中彼此鄰近地定位的2個或 更多個不連續(xù)氨基酸殘基組成。
[0023] 與術(shù)語"Fynomer"在本文中互換使用的術(shù)語"Fyn SH3衍生的多肽"表示從人 Fyn SH3結(jié)構(gòu)域衍生出的非免疫球蛋白衍生的結(jié)合（多）肽（例如如上所述的所謂支架）。 Fyn SH3衍生的多肽是本領域眾所周知的，且已經(jīng)描述在例如Grabulovski等人（2007) JBC, 282，第 3196-3204 頁或 TO 2008/022759，Bertschinger 等人（2007) ProteinEng Des Sel 20(2):57-68, Gebauer 和 Skerra (2009) Curr Opinion in Chemical Biology 13:245-255)。
[0024] Fyn激酶的SH3結(jié)構(gòu)域（Fyn SH3)包含63個殘基，即Semba等人（1986)報道的 序列的氛基酸 83-145 (Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 83 (15) : 5459-63)和 Kawakami 等人（1986) (Mol Cell Biol. 6(12) : 4195-201),其具有序列GVTLFVALYDYEARTEDDLSFHK GEKFQILNSSEGDffffEARSLTTGETGYIP SNYVAPVDSIQ，如在 SEQ ID NO: 164 中所示。Fyn 是 Src 家族的酪氨酸激酶的59 kDa成員。作為選擇性剪接的結(jié)果，F(xiàn)yn蛋白以2種不同異構(gòu)體 存在，所述異構(gòu)體的差別在于它們的激酶結(jié)構(gòu)域：一種形式存在于胸腺細胞、脾細胞和一些 淋巴造血系統(tǒng)細胞系中，而第二種形式主要積累在腦中（Cooke和Perlmutter (1989) ,New Biol. 1(1): 66-74)。Fyn (它是一種細胞內(nèi)蛋白）的生物學功能是不同的，且包括經(jīng)由 T細胞受體的信號傳遞、腦功能的調(diào)節(jié)以及粘附介導的信號傳遞（Resh (1998) Int. J. Biochem. Cell Bioh 30(11): 1159-62)。正如其它 SH3 結(jié)構(gòu)域一樣，F(xiàn)yn SH3 由 2 個反 平行的β -折疊組成，且含有2個柔性環(huán)（RT-Src環(huán)和n-Src環(huán)），以便與其它蛋白相互作 用。2個柔性環(huán)（被稱作RT-Src環(huán)和n-Src環(huán)）的序列分別標有下劃線和雙下劃線。Fyn SH3的氨基酸序列在人類、小鼠、大鼠和猴（長臂猿）中是完全保守的。
[0025] 如在本領域中已經(jīng)證實的（W0 2008/022759; Grabulovski 等人（2007) JBC, 282，第3196-3204頁），F(xiàn)yn SH3結(jié)構(gòu)域是特別有吸引力的用于制備結(jié)合蛋白（即 Fynomers)的支架。其原因是，因為Fynomers (i)可以以可溶形式在細菌中大量表達，（ii) 當在溶液中儲存時不會聚集，（iii)是非常穩(wěn)定的（Tm 70. 5°C)，（iv)缺少半胱氨酸殘基， 和（V)最初衍生自特征在于從小鼠至人類完全保守的氨基酸序列的人，由此減少了不希望 的免疫原性反應。
[0026] 在本領域中已經(jīng)描述了特異性地結(jié)合特定靶抗原的Fyn SH3衍生的多肽的衍生 化。例如，可以建立不同F(xiàn)yn SH3的文庫，其中已經(jīng)改變了如在上面SEQ ID NO: 164中所示 的序列。優(yōu)選地，在以下位置進行改變：（i)代表RT-環(huán)的序列，或任選地，在所述序列附近 至多2個氨基酸的位置（即如上面在SEQ ID NO: 164中所述的序列DYEARTEDDL)，或（ii) Scr環(huán)，或任選地，在所述序列附近至多2個氨基酸的位置（即如上面在SEQ ID NO: 164中 標有雙下劃線的序列LNSSEG)，或（iii)同時在2個序列中。優(yōu)選地，所述改變是如本領域 中所述的取代、缺失或添加（參見例如WO 2008/022759; Grabulovski等人（2007) JBC， 282,第3196-3204頁）。用于改變氨基酸序列的方式和方法是本領域眾所周知的，且描述 在本領域中，例如在Grabulovski等人（2007) JBC，282，第3196-3204頁中。
[0027] 隨后，可以將該Fyn SH3文庫克隆進噬粒載體例如pHENl (Hoogenboom等人. "Multi-subunit proteins on the surface of filamentous phage: methodologies for displaying antibody (Fab) heavy and light chains u, Nucleic Acids Res, 19(15):4133-7, 1991)中，隨后將該文庫在噬菌體上展示，并針對各個抗原進行淘選，優(yōu)選 重復幾輪淘選，例如至少2輪淘選，更優(yōu)選至少3輪淘選。隨后，通過確立的技術(shù)，例如單克 隆噬菌體-ELISA，可以進行對結(jié)合（多）肽的篩選。然后可以將如此鑒別的克隆的測序用 于揭示富集的序列?？梢赃M一步對如此鑒別的結(jié)合（多）肽進行其它成熟步驟，例如通過 基于鑒別的序列的改變和重復的噬菌體展示和淘選步驟來制備額外文庫。最后，可以分析 得到的Fyn SH3衍生的多肽的交叉反應性和免疫原性，并可以選擇對靶抗原特異性的Fyn SH3衍生的多肽。
[0028] 結(jié)合（多）肽的這些噬菌體展示篩選和優(yōu)化的方法通常是本領域已知的。
[0029] 在（b)中定義的第二結(jié)合（多）肽特異性地結(jié)合所述在腫瘤細胞上表達的抗原的 第二表位。因此，如上文中所述，這意味著，該第二結(jié)合（多）肽結(jié)合相同抗原，但是結(jié)合 所述抗原上的不同表位。術(shù)語"不同"表位表示這樣的表位：其不與第一結(jié)合（多）肽所 特異性地結(jié)合的表位重疊。因此，根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合（多）肽之一的結(jié)合不會阻斷第二結(jié) 合（多）肽的結(jié)合，從而實現(xiàn)兩個結(jié)合（多）肽的同時結(jié)合。所述第二結(jié)合（多）肽可以 是能夠特異性地結(jié)合靶表位的任意（多）肽，所述靶表位是例如抗體或上述的非免疫球蛋 白衍生的結(jié)合試劑或支架中的任一種，優(yōu)選選自以下的支架：親和體（affibodies)(基于葡 萄球菌蛋白A的Z-結(jié)構(gòu)域）、Kunitz型結(jié)構(gòu)域、adnectins (基于人纖連蛋白的第10個結(jié) 構(gòu)域、anticalins (衍生自脂質(zhì)運載蛋白）、DARPins (衍生自錨蛋白重復蛋白）、親和體 (avimerX基于多聚化的LDLR-A)。所有這些支架是本領域眾所周知的，且已經(jīng)描述在上文 引用的參考文獻中。
[0030] 在本發(fā)明的結(jié)合分子中包含的結(jié)合（多）肽可以形成單個多肽鏈，或者可以作為 幾個多肽鏈存在于本發(fā)明的結(jié)合分子中，所述多肽鏈可以彼此共價地或非共價地結(jié)合。在 所述結(jié)合（多）肽形成單個多肽鏈的情況下，它們可以以任意次序排列在所述分子內(nèi)，例 如（a)-(b)或（b)-(a)。更優(yōu)選地，（a)和（b)的結(jié)合（多）肽以列舉的次序排列，例如在 N-端至C-端方向以次序（a)至（b)。在所述結(jié)合（多）肽沒有形成單個多肽鏈的情況下， 它們?nèi)匀豢梢孕纬芍辨湥渲兴鼈儽舜私Y(jié)合。在該情況下，它們也可以以任意次序排列在所 述直鏈內(nèi)，例如（a)-(b)或（b)-(a)。更優(yōu)選地，（a)和（b)的結(jié)合（多）肽以列舉的次序 排列，例如以次序（a)至（b)。所述結(jié)合（多）肽可以以頭至尾次序朝向彼此排列，即一個 結(jié)合（多）肽用它的N-端（共價地或非共價地）結(jié)合另一個結(jié)合（多）肽的C-端，或者 它們可以以頭至頭或尾至尾次序排列，即偶聯(lián)一個結(jié)合（多）肽用它的N-端（共價地或非 共價地）結(jié)合另一個結(jié)合（多）肽的N-端，或者用它的C-端（共價地或非共價地）結(jié)合 另一個結(jié)合（多）肽的C-端。應當理解，所述結(jié)合（多）肽還可以形成非線性排列。還應 當理解，本文描述的所有結(jié)合分子的要求是，在形成結(jié)合分子（即通過2個結(jié)合（多）肽的 共價或非共價結(jié)合）以后，2個結(jié)合（多）肽與它們各自的表位的結(jié)合活性如下文中所定義 得到保留或基本上保留。在由幾個（多）肽鏈形成結(jié)合分子的情況下，優(yōu)選的是，這些鏈彼 此共價地結(jié)合。
[0031] 通過本領域已知的生產(chǎn)（多）肽的方法中的任一種，可以生產(chǎn)本發(fā)明的結(jié)合分子。 例如，如在下文中更詳細地描述的，可以在合適的宿主中表達一種或多種編碼本發(fā)明的結(jié) 合分子的核酸分子，并可以隨后分離如此生產(chǎn)的結(jié)合分子。一種用于生產(chǎn)本發(fā)明的結(jié)合分 子的替代方法是mRNA的體外翻譯。根據(jù)本發(fā)明使用的合適的無細胞表達系統(tǒng)包括：兔網(wǎng)織 紅細胞裂解物、麥胚提取物、犬胰腺微粒體膜、大腸桿菌S30提取物和偶聯(lián)的轉(zhuǎn)錄/翻譯系 統(tǒng)諸如TNT-系統(tǒng)（Promega)。這些系統(tǒng)允許在添加含有編碼區(qū)和適當啟動子元件的克隆載 體、DNA片段或RNA序列以后表達重組（多）肽。
[0032] 除了重組生產(chǎn)以外，可以合成地生產(chǎn)本發(fā)明的結(jié)合分子，例如通過使用固相技術(shù) 的直接膚合成（參見Stewart等人（1969) Solid Phase Peptide Synthesis; Freeman Co, San Francisco; Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85 (1963)，2149-2154)。使用手工技術(shù) 或通過自動化，可以進行合成法蛋白合成。例如，使用Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer (Perkin Elmer, Foster City CA),根據(jù)生產(chǎn)商提供的說明書，可以實現(xiàn)自 動化合成。使用化學方法可以單獨地化學合成各個片段并組合以產(chǎn)生全長分子。如上面 指出的，可以使用化學合成，諸如 Houghton Proc. Natl. Acad. Sci. USA (82) (1985)， 5131-5135描述的固相操作。此外，可以半合成地生產(chǎn)本發(fā)明的結(jié)合分子，例如通過重組和 合成生產(chǎn)的組合。
[0033] 根據(jù)本發(fā)明，令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，包含F(xiàn)yn SH3衍生的多肽和第二結(jié)合（多）肽的結(jié) 合分子會在腫瘤細胞上產(chǎn)生優(yōu)良的抗增殖活性，所述第二結(jié)合（多）肽對相同抗原、但是對 所述抗原的不同表位具有結(jié)合特異性。該活性高于單特異性的Fyn SH3衍生的多肽（以二 價形式作為Fc融合體）或單獨的第二結(jié)合（多）肽的活性，且最令人驚奇的是，也高于聯(lián) 合施用的兩種化合物的抗增殖作用。因此，與2種單獨的結(jié)合（多）肽相比，本發(fā)明的結(jié)合 分子的制備會導致改善的作用。
[0034] 因此，本發(fā)明提供了一種結(jié)合分子，其中所述結(jié)合分子與在它們的表面上表達各 種靶抗原的腫瘤細胞的結(jié)合會導致改善的腫瘤活性抑制，所述抑制高于通過2種單特異 性的結(jié)合蛋白的組合結(jié)合得到的腫瘤活性抑制，其中所述第一種單特異性的結(jié)合蛋白包含 (a)的Fyn SH3衍生的多肽或由其組成，且所述第二種單特異性的結(jié)合蛋白包含（b)的結(jié) 合（多）肽或由其組成。優(yōu)選地，與通過2種單特異性的結(jié)合蛋白的組合結(jié)合得到的腫瘤 活性抑制相比，所述改善的腫瘤活性抑制是協(xié)同效應，即超過累加效應。
[0035] 在本發(fā)明的結(jié)合分子的一個優(yōu)選實施方案中，所述在腫瘤細胞上表達的抗原選 自：HER2,其它EGFR家族成員（包括HER1、HER3和HER4)，其它受體酪氨酸激酶家族(包括 ALK、AXL、DDR、EPH、FGFR、EPH、FGFR、INSR、MET、MUSK、PDGFR、PTK7、RET、R0R、R0S、RYK、TIE、 TRK、VEGFR、AATYK 家族），EpCAM，CD20, CD33, CD52 和 CD30。
[0036] HER2根據(jù)相關(guān)領域進行定義，且是指人表皮生長因子受體2型（也被稱作HER2/ neu或ErbB-2,參見上面），即在1984年首次被描述的185-kDa受體（Schlechter等人 (1984) Nature 312:513-516)。人HER2 (SEQ ID NO: 171)由 NCBI 索引：NP_004439 (公 開日期2012年2月26日）表示，且已經(jīng)描述在本領域中，例如在Robinson等人（2000) Oncogene 19:5548-5557以及上文引用的參考文獻中。受體酪氨酸激酶家族（EGFR、ALK、 AXL、DDR、EPH、FGFR、EPH、FGFR、INSR、MET、MUSK、PDGFR、PTK7、RET、R0R、R0S、RYK、TIE、 TRK、VEGFR、AATYK)的其它靶標是本領域眾所周知的，且已經(jīng)被描述，包括在Robinson等人 (2000) Oncogene 19:5548-5557 中的 NCBI 索引。
[0037] EpCAM根據(jù)相關(guān)領域進行定義，且是指上皮細胞粘附分子，其為在幾乎所有癌上表 達的泛-上皮分化抗原。人EpCAM由UniProtKB/Swiss-Prot登錄號：P16422.2 (公開 日期2012年2月22日）表示且已經(jīng)描述在本領域中，例如在Strnad等人（1989) Cancer Res. 49(2) :314-317 中。
[0038] ⑶20根據(jù)相關(guān)領域進行定義，且是指B-淋巴細胞抗原⑶20。人⑶20由NCBI參 照序列：NP_690605. 1 (
【公開日】期2012年1月8日）表示，且已經(jīng)描述在本領域中，例如 在 Dawidowicz 等人（2011) Clin Exp Rheumatol 29(5) :839-842 中。
[0039] ⑶33根據(jù)相關(guān)領域進行定義，且是指⑶33抗原。人⑶33由NCBI參照序列： NP_001763. 3 (
【公開日】期2011年12月18日）表示，且已經(jīng)描述在本領域中，例如在Raponi 等人（2011) LeuL Lymphoma 52(6) :1098-1107 中。
[0040] ⑶52根據(jù)相關(guān)領域進行定義，且是指⑶52抗原（阿侖單抗（CAMPATH) -1抗原）。 人⑶33由GenBank登錄號：EAX07822.1 (
【公開日】期2010年2月4日）表示，且已經(jīng)描述 在本領域中，例如在 Venter 等人（2001) Science 291 (5507) :1304-1351 中。
[0041] ⑶30根據(jù)相關(guān)領域進行定義，且是指⑶30抗原。人⑶30由GenBank登錄號： AAA51947. 1 (
【公開日】期1994年11月1日）表示，且已經(jīng)描述在本領域中，例如在Durkop, H 等人（1992) Cell 68(3) :421-427 中。
[0042] 在本發(fā)明的雙特異性的結(jié)合分子的一個優(yōu)選實施方案中，所述抗原是HER2。
[0043] 在本發(fā)明的結(jié)合分子的另一個優(yōu)選實施方案中，所述第二結(jié)合（多）肽是抗體。
[0044] 所述抗體可以是任意抗體類別的單克隆或多克隆抗體。術(shù)語"抗體"也包含仍然 保留相應全長或未修飾抗體的結(jié)合特異性的抗體片段或其衍生物。本發(fā)明的抗體還包括實 施方案諸如合成抗體、嵌合抗體、單鏈抗體和人源化抗體。
[0045] 術(shù)語"抗體片段"是指這樣的片段，諸如⑴Fab片段、（ii) F(ab'）2片段、（iii) Fd片段（由VHC和CHl結(jié)構(gòu)域組成）、（iv) Fv片段和（V)具有足夠框架以特異性地結(jié)合 的分離的互補決定區(qū)（CDR)，例如，可變區(qū)的抗原結(jié)合部分。術(shù)語"抗體衍生物"在本發(fā)明 范圍內(nèi)定義了化學修飾的抗體和抗體片段。這包括scFv片段、單結(jié)構(gòu)域抗體等。因此，抗 體衍生物經(jīng)常是從抗體分子衍生出的（多）肽和/或通過化學/生化方法或分子生物學 方法修飾的（多）肽?？贵w片段與它的特定表位的特異性相互作用的最低要求是，在允許 抗體片段和表位的配合的背景下，存在一個或多個得自親本抗體的可變重鏈（V h)和/或可 變輕鏈（')的CDR。這樣的背景可以通過使用抗體的合適框架來提供。如本領域已知的， 術(shù)語"框架"在抗體或抗體衍生物的背景下定義了這樣的氨基酸序列：其充當CDR之間的 隔離物，以及延長其N-端和C-端，并提供允許CDR形成抗原結(jié)合位點的結(jié)構(gòu)。通過分子生 物學方法對框架或CDR序列的修飾(例如為了提高結(jié)合親和力）可以包括：使用本領域已知 的常規(guī)技術(shù)修飾（多）肽，例如，通過單獨或聯(lián)合使用氨基酸一個或多個缺失、一個或多個 插入、一個或多個取代、一個或多個添加和/或一個或多個重組和/或本領域已知的任意其 它一個或多個修飾（例如翻譯后修飾和化學修飾，諸如糖基化和磷酸化）。在免疫球蛋白 鏈的氨基酸序列的基礎DNA序列中引入這樣的修飾的方法是本領域技術(shù)人員眾所周知的； 參見，例如，Sambrook 等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 年第 2 版和 2001 年第 3 版；Gerhardt 等人，Methods for General and Molecular Bacteriology, ASM Press, 1994; Lefkovits, Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques, Academic Press, 1997 ;或Golemis, Protein-Protein Interactions: A Molecular Cloning Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2002。
[0046] 根據(jù)本發(fā)明的抗體能夠與表位特異性地結(jié)合/相互作用。所述表位可以是多肽結(jié) 構(gòu)以及不包含氨基酸的化合物，例如多糖。術(shù)語"與……特異性地結(jié)合/相互作用"如上文 定義。
[0047] 優(yōu)選地，所述抗體是單克隆抗體。甚至更優(yōu)選地，所述（單克?。┛贵w屬于IgG、 IgA、IgE、IgD 或 IgM 類別（以及其亞型（例如，IgGl、IgG2、IgG3 和 IgG4))。
[0048] 應當理解，代表第一結(jié)合（多）肽的Fyn SH3衍生的多肽可以在任意可能位置與 抗體偶聯(lián)，只要2個結(jié)合（多）肽的結(jié)合能力如下文中定義得到保留或基本上保留。例如， 在采用完整抗體的情況下，代表第一結(jié)合（多）肽的Fyn SH3衍生的多肽可以在重鏈或輕 鏈中的任一個的N-端末端或C-端末端與抗體偶聯(lián)。優(yōu)選地，將Fyn SH3衍生的多肽與抗 體的輕鏈的N-端末端偶聯(lián)。
[0049] 在本發(fā)明的結(jié)合分子的另一個優(yōu)選實施方案中，所述第一和第二結(jié)合（多）肽通 過接頭連接。
[0050] 根據(jù)本發(fā)明使用的術(shù)語"接頭"是指氨基酸的結(jié)果（即肽接頭）和非肽接頭，其隔 開本發(fā)明的結(jié)合分子的結(jié)合（多）肽。應當理解，在本發(fā)明的結(jié)合分子是單個多肽鏈的情 況下，所述接頭是膚接頭。
[0051] 所述接頭的性質(zhì)即長度和/或組成（例如氨基酸序列）可以改變或增強分子的穩(wěn) 定性和/或可溶性，它可以增加得到的結(jié)合分子的柔性和/或可以通過減小空間阻礙而改 善與靶抗原的結(jié)合。接頭的長度和組成取決于本發(fā)明的結(jié)合分子的各個結(jié)合（多）肽的組 成。技術(shù)人員熟知試驗不同接頭的適合性的方法。例如，當使用不同類型的接頭時，通過分 析結(jié)合分子的結(jié)合親和力，可以容易地試驗所述結(jié)合分子的性能。另外，可以進行單獨的 每種結(jié)合（多）肽的各自測量，并與結(jié)合分子的結(jié)合親和力進行對比。通過本領域已知的 方法，例如使用ELISA方法確定在人血清中在37°C溫育幾個時間段以后分子的殘余結(jié)合能 力，可以測量得到的分子的穩(wěn)定性。
[0052] 本發(fā)明預見到的肽接頭是由多個氨基酸組成的（多）肽接頭。優(yōu)選地，所述接頭 的長度是1-100個氨基酸。更優(yōu)選地，所述接頭的長度是5-50個氨基酸，且甚至更優(yōu)選地， 所述接頭的長度是10-20個氨基酸。最優(yōu)選地，所述接頭的長度是15個氨基酸。在一個 優(yōu)選實施方案中，所述接頭是使用例如氨基酸丙氨酸和絲氨酸或甘氨酸和絲氨酸的柔性接 頭。優(yōu)選地，所述接頭序列是（Gly 4Ser)P (Gly4Ser)2或（Gly4Ser)3。最優(yōu)選地，所述接頭是 (Gly4Ser)3O
[0053] 根據(jù)本發(fā)明使用的術(shù)語"非肽接頭"表示具有2個或更多個反應基團但是不包括 如上定義的肽接頭的連接基團。例如，所述非肽接頭可以是在兩端具有反應基團的聚合物， 例如聚乙二醇，所述反應基團個別地結(jié)合本發(fā)明的分子的結(jié)合部分的反應基團，例如，氨基 端、賴氨酸殘基、組氨酸殘基或半胱氨酸殘基。所述聚合物的反應基團包括羥基、醛基、丙醛 基、丁醛基、馬來酰亞胺基、酮基、乙烯基砜基、硫醇基、酰肼基、羰基二咪唑（CDI)基、碳酸 硝基苯酯（NPC)基、甲苯磺酸酯（trysylate)基、異氰酸酯基和琥珀酰亞胺衍生物。琥珀酰 亞胺衍生物的例子包括琥珀酰亞胺基丙酸酯（SPA)、琥珀酰亞胺基丁酸（SBA)、琥珀酰亞胺 基羧甲酸酯（SCM)、琥珀酰亞胺基琥珀酰胺（SSA)、琥珀酰亞胺基琥珀酸酯（SS)、琥珀酰亞 胺基碳酸酯和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS)。在非肽聚合物的兩端處的反應基團可以相同或不 同。例如，所述非肽聚合物可以具有在一端處的馬來酰亞胺基和在另一端處的醛基。優(yōu)選 地，所述聚合物是聚乙二醇。
[0054] 最優(yōu)選地，所述接頭是肽接頭。
[0055] 在另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子還包含至少一個額外（多）肽。
[0056] 這樣的額外（多）肽的非限制性例子是例如藥學上和/或診斷上有活性的組分， 包括標簽或適合于改善本發(fā)明的結(jié)合分子的性能的功能性（多）肽。
[0057] 藥學上和/或診斷上有活性的組分可以例如選自細胞因子、有毒化合物、趨化因 子、酶、熒光染料和光敏劑、促凝血因子，優(yōu)選組織因子、放射性核素或調(diào)節(jié)本發(fā)明的結(jié)合分 子的血清半衰期的組分。
[0058] 細胞因子的非限制性例子包括例如IL-2、IL-12、TNF-a、IFNa、IFN^、IFNy、 IL-10、IL-15、IL-24、GM-CSF、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-11、IL-13、LIF、CD80、 B70、TNF β、LT- β、CD-40 配體、Fas-配體、TGF- β、IL-I a 和 IL-I β。
[0059] 有毒化合物的例子包括、但不限于，卡奇霉素、美坦辛類、新制癌菌素、埃斯波霉 素、達內(nèi)霉素、可達菌素、maduropeptin、多柔比星、柔紅霉素、耳他汀、菌麻蛋白-A鏈、蒴蓮 根毒蛋白、截短的假單胞菌外毒素 A、白喉毒素和重組白樹毒素。
[0060] 趨化因子的非限制性例子包括 IL-8、GRO a、GRO β、GRO γ、ENA-78、LDGF-PBP、 GCP-2、PF4、Mig、IP-lO、SDF-la/0、BUNZ0/STRC33、I-TAC、BLC/BCA-1、MIP-I α、MIP-I β、 MDC、TECK、TARC、RANTES、HCC-I、HCC-4、DC-CKl、MIP-3 a、MIP-3 β、MCP-1-5、嗜酸性粒細胞 趨化因子、嗜酸性粒細胞趨化因子-2、I_309、MPIF-l、6Ckine、CTACK、MEC、淋巴細胞趨化因 子和 Fractalkine0
[0061] 熒光染料包括例如Alexa Fluor或Cy染料，且光敏劑包括例如光毒性的紅色熒光 蛋白KillerRed或血P卜啉。
[0062] 酶的非限制性例子包括前藥活化酶，優(yōu)選選自羧肽酶、葡糖醛酸糖苷酶和葡萄糖 苷酶的酶。
[0063] 放射性核素可以選自例如：發(fā)射Y的同位素的組，優(yōu)選99mTc、123I、 mIn ;正電子發(fā) 射體的組，優(yōu)選18F、64Cu、68Ga、 86Y、124I ; β -發(fā)射體的組，優(yōu)選131I、9°Y、mLu、67Cu ;或α -發(fā)射 體的組，優(yōu)選213Bi、211At。
[0064] 調(diào)節(jié)血清半衰期的組分的例子包括、但不限于，聚乙二醇（PEG)、抗體的Fe結(jié)構(gòu) 域、白蛋白-結(jié)合蛋白和構(gòu)象上混亂的多肽序列。
[0065] 標簽的非限制性例子包括Strep-標簽、His-標簽、Myc-標簽、TAP-標簽或 Flag-標簽。額外功能（多）肽是例如分泌肽，諸如κ分泌前導序列或提供N-糖基化位點 的肽。
[0066] 如上文中所述，一些額外（多）肽可以具有額外的藥物或診斷活性，或可以增強本 發(fā)明的結(jié)合分子的穩(wěn)定性，由此增強它的抗致瘤活性，而其它額外（多）肽可以替代性地促 進結(jié)合分子的制備和/或純化。
[0067] 將上面定義的額外（多）肽添加給本發(fā)明的結(jié)合分子的方法是技術(shù)人員眾所周知 的,且描述在例如Sambrook, 2001，在上述引文中。應當理解，所述額外（多）肽可以非共 價地結(jié)合本發(fā)明的結(jié)合分子，或可以共價地結(jié)合，例如它們可以與結(jié)合分子形成融合蛋白， 例如它們可以形成單個多肽鏈。這樣的融合蛋白可以例如由單個核酸分子編碼。
[0068] 本發(fā)明還包括由本發(fā)明的結(jié)合分子形成的多聚體，例如二聚體、三聚體、四聚體 等，其任選地包括如上文定義的額外（多）肽。這樣的多聚體可以通過共價或非共價結(jié)合、 優(yōu)選地通過共價結(jié)合而形成。優(yōu)選地，多聚體經(jīng)由如上文定義的接頭(優(yōu)選上面定義的肽接 頭）而形成。更優(yōu)選地，所述接頭是（Gly 4Ser)P (Gly4Ser)2或（Gly4Ser)3。最優(yōu)選地,所述 接頭是（Gly 4Ser)315
[0069] 在本發(fā)明的結(jié)合分子的另一個優(yōu)選實施方案中，所述第一結(jié)合（多）肽包含以下 氨基酸序列或由其組成：（i)選自SEQ ID NO: 1-152的氨基酸序列，或（ii)與SEQ ID NO: 1的氨基酸序列具有至少65%序列同一性的氨基酸序列。
[0070] 在其中結(jié)合（多）肽包含列舉的氨基酸序列（而不是由其組成）的那些實施方案 中，額外氨基酸在特定序列上在N-端末端或C-端末端或二者處延伸。優(yōu)選地，不超過50個 額外氨基酸存在于N-端末端，且不超過50個額外氨基酸存在于C-端末端。更優(yōu)選地不超 過40個、諸如不超過30個、更優(yōu)選地不超過20個、諸如不超過10個、不超過9個、不超過8 個、不超過7個、不超過6個、不超過5個、不超過4個、不超過3個、不超過2個、且甚至更 優(yōu)選地不超過1個額外氨基酸獨立地存在于N-端末端或C-端末端中的任一個或兩個處。 應當理解，先決條件是，在有這些額外氨基酸存在下，結(jié)合分子與靶抗原的2個不同表位的 結(jié)合能力如下文中定義得到保留或基本上保留。額外序列可以包括例如為了例如純化而引 入的序列。優(yōu)選地，所述第一結(jié)合（多）肽由在（i)或（ii)中列舉的氨基酸序列組成。更 優(yōu)選地，所述第一結(jié)合（多）肽由SEQ ID NO: 1的氨基酸序列組成。
[0071] 根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語"％序列同一性"描述了與構(gòu)成氨基酸序列或核酸的總長度（或 其整個對比部分）的氨基酸殘基或核苷酸的數(shù)目相比，2個或更多個比對的氨基酸或核酸 序列的相同氨基酸/核苷酸的匹配（"命中"）的數(shù)目。在其它方面，使用比對，對于2個或 多個序列或子序列，當在對比窗上或在指定區(qū)域上為了最大對應而對比和比對（子）序列 時(使用如本領域已知的序列對比算法測量)，或當手工比對和肉眼檢查時，可以確定相同 的氨基酸殘基或核苷酸的百分比（例如，65%或80%同一性）。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選（多）肽 是這樣的（多）肽：其中所述的同一性存在于長度為至少約15-25個氨基酸的區(qū)域上，更優(yōu) 選地，長度為至少約30-50個氨基酸的區(qū)域上。根據(jù)本發(fā)明的更優(yōu)選的（多）肽是在本文 具體地列舉的（多）肽的整個長度上具有所述的序列同一性的那些（多）肽。本領域技術(shù) 人員將知道如何確定序列之間的序列同一性百分比，例如，使用算法諸如基于NCBI BLAST 算法（Stephen F. Altschul, Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller,和 David J. Lipman (1997)， "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs"， Nucleic Acids Res. 25:3389-3402)、CLUSTALW 計算機程序（Thompson Nucl. Acids Res. 2 (1994)， 4673-4680)或 FASTA (Pearson 和 Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci.，1988，滯；2444) 的那些算法。
[0072] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選地采用NCBI BLAST算法。用于氨基酸序列的BLASTP程序使用3 的字長（W)和10的期望值（E)作為默認值。用于核酸序列的BLASTN程序使用11的字長 (W)、10的期望值（E)、M=5、N=4和兩條鏈的對比作為默認值。BL0SUM62評分矩陣（Henikoff， Proc. Natl. Acad. Sci.，1989，89:10915)使用 50 的比對（B)UO 的期望值（E)、M=5、 N=4和兩條鏈的對比。因此，用NCBI BLAST程序確定為具有至少80%的序列同一性的所有 (多）肽落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0073] 根據(jù)本發(fā)明的該實施方案，還包括具有至少65%序列同一性、諸如至少70%、至少 80%、至少85%和至少90%序列同一性的序列。甚至更優(yōu)選地，所述同一性是至少95%，諸如 至少98%、至少99%和最優(yōu)選地至少99. 5%。
[0074] 與SEQ ID NO: 1的氨基酸序列具有至少65%序列同一性的氨基酸序列優(yōu)選地具 有下式I :
【權(quán)利要求】
1. 結(jié)合分子，其特異性地結(jié)合在腫瘤細胞上表達的抗原的2個不同表位，其中所述結(jié) 合分子包含： (a) 第一結(jié)合（多）肽，其特異性地結(jié)合所述在腫瘤細胞上表達的抗原的第一表位，其 中所述第一結(jié)合（多）肽是Fyn SH3衍生的多肽；和 (b) 第二結(jié)合（多）肽，其特異性地結(jié)合所述在腫瘤細胞上表達的抗原的第二表位。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)合分子，其中所述在腫瘤細胞上表達的抗原選自：HER2、 HER 1、HER3、HER4、胰島素受體、PDGF、FGF、VEGF、HGF、Tr k、Eph、AXL、LTK、TIE、ROR、RET、KLG、 RYK、MuSK 家族、EpCAM、CD20、CD33、CD52 和 CD30。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的結(jié)合分子，其中所述第二結(jié)合（多）肽是抗體。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中的任一項所述的結(jié)合分子，其中所述第一和第二結(jié)合（多）肽 通過接頭連接。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中的任一項所述的結(jié)合分子，其中所述接頭是肽-接頭。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5中的任一項所述的結(jié)合分子，所述結(jié)合分子還包含至少一個額外 (多）肽。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6中的任一項所述的結(jié)合分子，其中所述第一結(jié)合（多）肽包含以 下氨基酸序列或由其組成： (i) 選自SEQ ID NO: 1-152的氨基酸序列；或者 (ii) 與SEQ ID NO: 1的氨基酸序列具有至少65%序列同一性的氨基酸序列。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1-7中的任一項所述的結(jié)合分子，其中所述第二結(jié)合（多）肽是抗體， 其中 (i) 所述抗體的重鏈包含SEQ ID NO: 154的氨基酸序列或由其組成，且所述抗體的輕 鏈包含SEQ ID NO: 155的氨基酸序列或由其組成； (ii) 所述抗體的重鏈包含SEQ ID NO: 160或由其組成，且所述抗體的輕鏈包含SEQ ID NO: 163的氨基酸序列或由其組成； (iii) 所述抗體的重鏈包含與SEQ ID NO: 154的氨基酸序列具有至少65%序列同一 性的氨基酸序列或由其組成，且所述抗體的輕鏈包含與SEQ ID NO: 155的氨基酸序列具有 至少65%序列同一性的氨基酸序列或由其組成；或 (iv) 所述抗體的重鏈包含與SEQ ID NO: 160的氨基酸序列具有至少65%序列同一性 的氨基酸序列或由其組成，且所述抗體的輕鏈包含與SEQ ID NO: 163的氨基酸序列具有至 少65%序列同一性的氨基酸序列或由其組成。
9. 核酸分子，其編碼根據(jù)權(quán)利要求1-8中的任一項所述的結(jié)合分子。
10. 載體，其包含根據(jù)權(quán)利要求9所述的核酸分子。
11. 用根據(jù)權(quán)利要求12所述的載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞或非人宿主。
12. 用于生產(chǎn)結(jié)合分子的方法，所述結(jié)合分子特異性地結(jié)合在腫瘤細胞上表達的抗原 的2個不同表位，所述方法包括：在合適的條件下培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求11所述的宿主細胞，和 分離生產(chǎn)的結(jié)合分子。
13. 組合物，其包含以下的至少一種： (i)根據(jù)權(quán)利要求1-8中的任一項所述的結(jié)合分子； (ji)根據(jù)權(quán)利要求9所述的核酸分子； (iii) 根據(jù)權(quán)利要求10所述的載體；或 (iv) 根據(jù)權(quán)利要求11所述的宿主細胞。
14. 用于腫瘤治療用途的根據(jù)權(quán)利要求1-8中的任一項所述的結(jié)合分子或根據(jù)權(quán)利要 求9所述的核酸分子或根據(jù)權(quán)利要求10所述的載體或根據(jù)權(quán)利要求11所述的宿主細胞。
15. 用于根據(jù)權(quán)利要求14所述的用途的結(jié)合分子或核酸分子或載體，其中所述腫瘤選 自：乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、唾液腺癌、子宮內(nèi)膜癌、胰腺癌、甲狀腺癌、腎癌、肺癌、涉及上 胃腸道的癌癥、結(jié)腸癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、頭和頸的鱗狀細胞癌、宮頸癌、膠質(zhì)母細胞瘤、 惡性腹水、淋巴瘤和白血病。
【文檔編號】A61P35/00GK104284675SQ201380014237
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2013年3月8日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月16日
【發(fā)明者】S.布拉克, F.穆爾拉內(nèi), I.托勒, R.伍茲, J.貝欽格, D.格拉布洛夫斯基, B.沙德, K.克盧普施, H.哈赫米 申請人:科瓦根股份公司