具有血液穩(wěn)定劑的樣品采集裝置制造方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了用于采集血液或血漿和使血液和血漿穩(wěn)定的裝置，該裝置包含抗凝劑、抗血小板藥物和增溶劑，并且該裝置可以可選擇地包括至少一種其他血液穩(wěn)定劑。還提供制造和在臨床醫(yī)學(xué)中利用該裝置的方法。
【專利說(shuō)明】具有血液穩(wěn)定劑的樣品采集裝置
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求2012年2月2日提交的美國(guó)第61/594, 152號(hào)臨時(shí)專利申請(qǐng)的申請(qǐng)日 的權(quán)益，該申請(qǐng)的公開(kāi)的內(nèi)容參考結(jié)合于此。

【背景技術(shù)】
[0003] 相關(guān)領(lǐng)域的說(shuō)明
[0004] 乙二胺四乙酸（EDTA)是包含四個(gè)羧酸基和兩個(gè)胺基的多元酸，其具有螯合鈣和 數(shù)個(gè)其他金屬離子的孤對(duì)電子?；贓DTA的保持細(xì)胞以及因此確保例如全部血球數(shù)（CBC) 和外周血涂片（peripheral blood smears)這樣的臨床血液測(cè)試的準(zhǔn)確性的能力，EDTA 長(zhǎng)期推薦為血液采集領(lǐng)域和臨床血液病學(xué)中抗凝劑的選擇。I丐對(duì)凝血級(jí)聯(lián)（coagulation cascade)的廣范圍的酶反應(yīng)是必要的。干擾隨后的血液測(cè)試的鈣從采集的血液中的去除對(duì) 在采集裝置中的血液的存儲(chǔ)過(guò)程中防止血液凝結(jié)的目的是至關(guān)重要的。
[0005] 實(shí)驗(yàn)室測(cè)試量和復(fù)雜性的顯著增長(zhǎng)已經(jīng)擴(kuò)大了該抗凝劑的應(yīng)用的潛在范圍，包括 血漿蛋白質(zhì)組學(xué)研究領(lǐng)域的各種創(chuàng)新試驗(yàn)，例如其在測(cè)量細(xì)胞因子、蛋白質(zhì)和肽以及心臟 疾病的其他標(biāo)記中的使用。EDTA的螯合作用在這里是有利的，原因在于許多蛋白酶的活性 需要金屬。所以，EDTA是用于對(duì)易受體外高度酶促降解影響的分子的采集和存儲(chǔ)的抗凝劑 的選擇。一些分子僅僅通過(guò)EDTA不能得到有效地穩(wěn)定，因此需要添加其他抗蛋白質(zhì)水解的 物質(zhì)，例如蛋白酶抑制劑。參見(jiàn)例如美國(guó)第7, 309, 468號(hào)專利。
[0006] 然而，EDTA的使用可能會(huì)被會(huì)由該抗凝劑引起的血液細(xì)胞的改變極大地阻礙。 例如，血小板暴露于EDTA會(huì)導(dǎo)致他們的形態(tài)的畸變，包括形狀改變和凝聚團(tuán)的形成，致使 EDTA不適合于作為全血輪廓（full blood profile)的一部分的血小板活化的測(cè)量以及不適 合于血小板的功能化驗(yàn)。附加的問(wèn)題是抗凝的EDTA標(biāo)本中假性血小板減少的發(fā)展，典型地 以由于血小板凝集或粘附白血球造成的低的血小板計(jì)數(shù)為特征。假性血小板減少會(huì)使獲得 具有潛在血小板減少的疾病的病人中血小板計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確確定復(fù)雜化。
[0007] 更普遍地，采集的血液樣品中的血小板凝集會(huì)引起自動(dòng)化血液儀器的不準(zhǔn) 確結(jié)果。采集到包含只有EDTA的管中的不下于百分之十（10% )的臨床血標(biāo)本具有 一定程度的凝集（薩維奇（Savage)等人發(fā)表在美國(guó)臨床病理學(xué)雜志（Am. J. Cl in. Path〇l.)81:317-322(1984)中）。盡管當(dāng)代的血液分析器編程為提醒操作者注意凝集的 樣品，但這些算法并非總是完美地起作用。在該情況下，血涂片在顯微鏡下檢查凝集的存 在。然而，當(dāng)EDTA血液位于試管中時(shí)，細(xì)胞形態(tài)的改變?cè)缭谝恍r(shí)的后采集時(shí)開(kāi)始發(fā)生， 這造成了解釋困難（納拉辛哈? A(Narasimha A)等人發(fā)表在印度血液學(xué)與輸血研究雜志 (Indian J. Hematol. Blood Transfus.) 24:43_8(2〇〇8)中）。
[0008] 而且，EDTA引起血小板活化，這減損了其抗凝劑特性。血小板活化以細(xì)胞內(nèi)鈣的 動(dòng)員、a-顆粒膜蛋白質(zhì)的表面表達(dá)、P-選擇素和a-顆粒的內(nèi)容物的選擇性釋放為特征， 他們中的許多涉及創(chuàng)面修復(fù)、凝血和炎癥。所以，某些細(xì)胞因子、趨化因子和生長(zhǎng)因子的水 平擴(kuò)大，使得他們可能不再反映存在于體循環(huán)中的實(shí)際量。該結(jié)果提出了對(duì)于EDTA在蛋白 組學(xué)分析、在分子生物學(xué)領(lǐng)域、病毒和傳染病以及樣品穩(wěn)定性需要得到確保的應(yīng)用一例 如血庫(kù)或基于細(xì)胞的治療一中的使用的挑戰(zhàn)。
[0009] 正因如此，所屬【技術(shù)領(lǐng)域】需要一種允許例如EDTA這樣的抗凝劑在阻止凝血中起 作用但不引起血小板活化的血液和血漿采集裝置。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的第一方面針對(duì)一種用于采集血液或血漿和使血液或血漿穩(wěn)定的裝置，包 含第一端和第二端以及至少一個(gè)限定用于容納全血或全血漿的貯存部的內(nèi)壁，并且其包含 抗凝劑、抗血小板藥物和增溶劑，其中抗血小板藥物包含前列腺素、環(huán)前列腺素、磷酸二酯 酶抑制劑、環(huán)氧化酶抑制劑或者他們的兩種或更多種的組合，并且其中抗凝劑和抗血小板 藥物每一個(gè)以使血液或血漿穩(wěn)定的量存在。在一些實(shí)施例中，例如，當(dāng)對(duì)（與病情相關(guān)的） 生物標(biāo)記的存在或生物標(biāo)記的量隨后分析采集的血液或血漿時(shí)，裝置優(yōu)選地在其貯存部中 還包含至少一種且最好是蛋白酶抑制劑的混合物和/或至少一種酯酶抑制劑。
[0011] 本發(fā)明的另一方面針對(duì)一種在存儲(chǔ)過(guò)程中使血液或血漿穩(wěn)定的方法，包含將全血 或全血漿采集到包含第一端和第二端以及至少一個(gè)限定用于容納全血或全血漿的貯存部 的內(nèi)壁的裝置中，并且該裝置包含抗凝劑、抗血小板藥物和增溶劑，其中抗血小板藥物包含 前列腺素、環(huán)前列腺素、磷酸二酯酶抑制劑、環(huán)氧化酶抑制劑或者他們的兩種或更多種的組 合，并且其中抗凝劑和抗血小板藥物每一個(gè)以使血液或血漿穩(wěn)定的量存在。本發(fā)明的又一 方面針對(duì)一種測(cè)量血液或血漿的參數(shù)的方法，包含a)將全血或全血漿采集到包含第一端 和第二端以及至少一個(gè)限定用于容納全血或全血漿的貯存部的內(nèi)壁的裝置中，并且該裝置 包含抗凝劑、抗血小板藥物和增溶劑，其中抗血小板藥物包含前列腺素、環(huán)前列腺素、磷酸 二酯酶抑制劑、環(huán)氧化酶抑制劑或者他們的兩種或更多種的組合，并且其中抗凝劑和抗血 小板藥物每一個(gè)以使血液或血漿穩(wěn)定的量存在；以及b)測(cè)量在采集之后的預(yù)先確定時(shí)間 的血液參數(shù)，以及將測(cè)量的血液參數(shù)和對(duì)照進(jìn)行比較。
[0012] 在一些實(shí)施例中，裝置還包含分離器。在一些實(shí)施例中，裝置還包含（例如設(shè)置在 貯存部中和/或設(shè)置在內(nèi)壁上的）附加的血液穩(wěn)定劑，該血液穩(wěn)定劑可以包括蛋白酶抑制 齊IJ、酯酶抑制劑或二者。在一些其他實(shí)施例中，附加的穩(wěn)定劑包括多種蛋白酶抑制劑（例如 絲氨酸蛋白酶抑制劑、半胱氨酸蛋白酶抑制劑、外肽酶抑制劑和二肽基肽酶抑制劑以及他 們的兩種或更多種的組合）或者蛋白酶抑制（例如絲氨酸蛋白酶抑制劑、半胱氨酸蛋白酶 抑制劑、外肽酶抑制劑和二肽基肽酶抑制劑以及他們的兩種或更多種的組合）的混合物， 連同或不連同酯酶抑制劑。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0013] 圖1是本發(fā)明的血液采集裝置的透視圖。
[0014] 圖2A是表示EDTA觸發(fā)血小板a -顆粒釋放但非致密顆粒/溶酶體釋放（比較％ ⑶62P表達(dá)與⑶63的）的柱狀圖。圖2B是顯示伊洛前列素在⑶62P+血小板的平均百分比 (柱狀圖土SD)(以及中值熒光強(qiáng)度（MFI))方面抑制EDTA介導(dǎo)脫粒以及顯示貫穿伊洛前列 素的寬濃度范圍出現(xiàn)的抑制的柱狀圖。
[0015] 圖3A和B是表示伊洛前列素對(duì)于a -顆粒（3A)和對(duì)于致密/溶酶體釋放（3B) 抑制EDTA中的激動(dòng)劑誘導(dǎo)血小板脫粒的柱狀圖。每一種情況的CD62P+事件的百分比所示 為3位受試者的平均土SD。每一種情況的⑶63P+事件的百分比所示為3位受試者的平均 土 SD.
[0016] 圖4A 1-2是顯示依據(jù)與只有EDTA的情況下相比較的⑶62P表達(dá)輪廓的示例（1位 受試者），伊洛前列素抑制滿24小時(shí)的樣品保壓的EDTA介導(dǎo)血小板脫粒的能力的直方圖。 圖4B是表示對(duì)于在每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)顯示為對(duì)于10位受試者的平均土SD的EDTA和EDTA連 同伊洛前列素的CD62P+事件的百分比的在中間部分的柱狀圖。
[0017] 圖5是表示在EDTA中的白細(xì)胞-血小板聚集體的增加的水平被伊洛前列素抑制 的柱狀圖（n = 6)。
[0018] 圖6是顯示與只有EDTA的情況下相比，EDTA和伊洛前列素的組合降低血小板平 均容積（MPV)的CBC分析的圖表。
[0019] 圖7A-E是顯示與只有EDTA的情況下相比，由在存在伊洛前列素的情況下的roGFa/ a(A)、TGF @ 丨(B)、VEGF(C)、IL-8(CXCL8) (D)和 RANTES (CCL5) (E)的降低水平顯示的生物 標(biāo)記（生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和趨化因子）的EDTA介導(dǎo)自發(fā)釋放的抑制的點(diǎn)圖（dot plot graph)〇
[0020] 圖8A-E是顯示當(dāng)測(cè)量在24小時(shí)內(nèi)EDTA血漿中的血小板衍生標(biāo)記（CD62P(A)、 TGF P JBhRANTES(CCLS) (C)、H)GFa/a(D)和VEGF (E))時(shí)伊洛前列素降低背景水平變化并提 高所有受試者的一致性的圖表。
[0021] 圖9A-E是表示⑶62P如通過(guò)⑶62P的表面表達(dá)和選擇因子（PDGFa/a (A)和 TGF P i (C))之間的強(qiáng)相關(guān)顯示的那樣，是用于血小板衍生生物標(biāo)記的測(cè)量的良好的代理標(biāo) 記的圖表。針對(duì)RANTES (CCL5) (B)和VEGF (D)確定弱相關(guān)，并且針對(duì)IL-8 (E)確定無(wú)相關(guān)。
[0022] 圖10是表示在存在和缺少伊洛前列素的情況下，⑶62P的表達(dá)與EDTA和EDTA連 同蛋白酶抑制劑混合物之間類似的柱狀圖，表明EDTA/蛋白酶抑制劑背景中的生物標(biāo)記的 人工釋放被伊洛前列素抑制。
[0023] 圖11是表示在（2-羥丙基）-0 -環(huán)糊精的存在的情況下提高的伊洛前列素回收 的柱狀圖。

【具體實(shí)施方式】
[0024] 本發(fā)明的采集裝置用于采集血液或血漿和使血液或血漿穩(wěn)定。概括地，本發(fā)明的 血液樣品采集裝置可以包含任何采集裝置，這些采集裝置包括：例如試管、毛細(xì)管和離心管 這樣的管；例如真空采血管、采集袋這樣的封閉系統(tǒng)血液采集裝置；注射器，尤其是預(yù)填充 注射器（pre-filled syringe);導(dǎo)管；微量滴定板和其他多孔板（multi-well plate);陣 列；例如燒瓶、旋轉(zhuǎn)瓶（spinner flask)、滾瓶、玻璃小瓶、顯微鏡載片、顯微鏡載片總成、蓋 玻片、薄膜和多孔基質(zhì)和總成這樣的實(shí)驗(yàn)室器皿；移液管和吸管端；組織和其他生物樣品 采集容器；以及適合保存生物樣品的任何其他容器，還有涉及轉(zhuǎn)移樣品和進(jìn)行血液成分分 離（apheresis)的容器和元件（后者的說(shuō)明在美國(guó)第7,582,049號(hào)專利中進(jìn)行了描述）。 若干這樣的裝置的示例和說(shuō)明在共同擁有的美國(guó)第7, 309, 468號(hào)專利中公開(kāi)。
[0025] 同樣在美國(guó)第7, 309, 468號(hào)專利中說(shuō)明的圖1示出了在本發(fā)明中有用的典型的血 液采集裝置10,其包括限定內(nèi)室或貯存部14的容器12。在所示的實(shí)施例中，容器12是具 有側(cè)壁16、封閉底端18和敞開(kāi)頂端20的中空管。可選擇地，分離部件13設(shè)置在容器室14 內(nèi)。分離部件13用來(lái)例如通過(guò)離心法協(xié)助分離血液樣品的成分。容器12制成用于采集合 適的血量的尺寸。用于覆蓋敞開(kāi)端20以封閉容器12的封閉物（closure) 22在要求無(wú)菌產(chǎn) 品的情況下是必要的。在一些實(shí)施例中，管配置有螺帽。然而，在管是真空管的實(shí)施例中， 緊密連接的彈性塞總體上用來(lái)在需要的存儲(chǔ)期期間控制真空。封閉物22最好形成能夠有 效地封閉容器12并且將生物樣品保持在室14中的密封。封閉物22可以是包括但不限于 橡膠封閉物、HEMOGUARD?封閉物、金屬密封、金屬帶橡膠密封和不同聚合物和設(shè)計(jì)的密封的 各種形式之一。保護(hù)屏24可以覆在封閉物22上。
[0026] 容器12可以由適合實(shí)驗(yàn)室器皿的任何材料制成，這些材料包括例如塑料（例如聚 烯烴、聚酰胺、聚酯、硅酮、聚氨酯、環(huán)氧樹(shù)脂、丙烯酸樹(shù)脂、聚丙烯酸酯、聚酯、聚砜、聚甲基 丙烯酸酯、PEEK、聚酰亞胺和含氟聚合物）和包括硅玻璃的玻璃制品。容器12最好是透明 的。用于容器12的適合的透明熱塑性材料的示例包括聚碳酸酯、聚乙烯、聚丙烯和聚對(duì)苯 二甲酸乙二醇酯。塑料材料可以是空氣不可滲透材料或可以包含空氣不可滲透或半透層。 作為選擇，容器12可以由水和空氣可滲透塑料材料制成。
[0027] 選擇室14中的壓力從而將預(yù)先確定量的生物樣品吸入室14中。封閉物22最好 由能夠維持大氣壓力和小于大氣的壓力之間的內(nèi)部壓力差的彈性材料制成。封閉物22是 這樣的：如所屬【技術(shù)領(lǐng)域】已知的那樣，其可以被針狀物26或其他套管刺穿以將生物樣品引 導(dǎo)到容器12中。封閉物22最好是可重新密封的。用于封閉物22的適合的材料包括例如 硅橡膠、天然橡膠、丁苯橡膠、乙丙共聚物和聚氯丁烯。
[0028] 容器12的合適的示例包括單壁和多層管。
[0029] 容器12還還以包含分離器，例如膠體（gel)、機(jī)械分離器或其他類型的分離部 件（例如濾紙或類似物）。分離器對(duì)血液血漿制備有用，具體地對(duì)從人類或動(dòng)物全血中 分離血楽有用。膠體是合乎需要的觸變聚合物膠體制劑（thixotropic polymeric gel formulation)。膠體可以是均聚物或共聚物，并且可以包括例如聚硅氧烷這樣的基于硅酮 的膠體，或者例如聚丙烯酸化物、聚酯、聚烯烴、氧化的順丁二烯、聚丁烯、環(huán)氧大豆油和氯 代烴的共混物、二酸和丙二醇（propandiol)的共聚物、氫化環(huán)戊二烯以及a烯烴與馬來(lái)酸 二乙酯（dialkylmaleates)的共聚物這樣的基于有機(jī)經(jīng)的膠體。在本發(fā)明中有用的機(jī)械分 離器的示例在美國(guó)第6, 516, 953、6, 406, 671、6, 409, 528和6, 497, 325號(hào)專利中進(jìn)行了描 述。
[0030] 容器12還可以適宜從全血樣品的較重相中離心分離淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。在這 樣的實(shí)施例中，裝置還可以包含液體密度梯度介質(zhì)（liquid density gradient medium)和 用于防止在離心之前液體密度梯度介質(zhì)與血液樣品混合的工具。合適的淋巴細(xì)胞/單核細(xì) 胞采集管的示例在美國(guó)第5, 053, 134號(hào)專利中公開(kāi)。
[0031] 除了圖1中所示的實(shí)施例以外，適合于用在本發(fā)明中的其他市售血液采集管包 括如下：VACUTAINER* EDTA 管（例如目錄號(hào)：367650、367653、366450、367841、367856 和 367861) ; VACUTAINIiP) PST 管（例如目錄號(hào)：367960、367964、367962 和 367961); VACITAIXKP. CPT管（例如目錄號(hào)362753和362760);以及VACUTAIME勝肝素管（例如目 錄號(hào)：367884、367671 和 367874)和 VACUA IXKRH朽1 檬酸管（citrate tube)(例如目錄號(hào)： 363083、366415 和 369714) VACUTAINER? ACD 管（例如目錄號(hào) 364606、364012 和 364816)以 及具有BD MicrogarcT封閉物的非真空BD Microtainer*:管（例如目錄號(hào)：365987、365965 和 365974)、傳統(tǒng)的 BD Microtainer? 管（例如目錄號(hào)：365956、365957、365958、365959、 365971和365973);以及BDMicrotainer? MAP管（例如目錄號(hào)363706)，所有這些管均由新 澤西州富蘭克林湖的BD公司（Becton, Dickinson and Company)銷售，所有注冊(cè)和商標(biāo)歸 BD公司所有。許多商業(yè)血液采集管具有標(biāo)準(zhǔn)體積，該標(biāo)準(zhǔn)體積典型地從250微升到10. Oml 并包括10. Oml并且在一些情況下達(dá)到16ml的范圍。典型的體積包括250、400和500微升， 以及 2. 0ml、3. 5ml、4. 0ml、5. 0ml、8. 0ml、8. 5ml 和 10. 0ml。
[0032] 在其他實(shí)施例中，裝置可以包含集成在測(cè)試盒（testing cartridge)中的C存部， 該貯存部能夠保存在2到200微升范圍內(nèi)的全血量，更優(yōu)選地能夠保存50-150微升的全 血量。這樣的測(cè)試盒例如以商品名i-STAT?丨床邊快速檢測(cè)系統(tǒng)（Point of Care System) 由雅培公司（伊利諾伊州雅培科技園）銷售，并且利用能夠與測(cè)試盒相連接的手持式分析 儀，測(cè)試盒是便于使用的。這樣的測(cè)試盒以及本發(fā)明便于使用的手持式分析儀的示例分別 包括i-STAT? CHEM8+測(cè)試盒以及i STAT* 1手持式分析儀。例如在美國(guó)第5, 096, 669、 5, 112, 455、5, 821，399、5, 628, 961、7, 419, 821、6, 750, 053 號(hào)專利和美國(guó)第 D337, 164 號(hào)文 獻(xiàn)中教導(dǎo)了這樣的裝置。
[0033] 抗凝劑
[0034] 可以適合于用在本發(fā)明中的抗凝劑的典型示例包括肝素、檸檬酸鹽、草酸鹽、乙二 胺四乙酸（EDTA)及其鹽--例如二鉀鹽，檸檬酸鹽、茶堿、腺苷和潘生丁的組合（被稱為 CTAD)、聚茴香磺酸鈉和枸櫞酸葡萄糖。在一些實(shí)施例中，抗凝劑是EDTA、二鉀鹽。概括地， 抗凝劑在裝置中以對(duì)抑制凝血有效的量存在。這個(gè)量相對(duì)于采集到裝置中的血量或血漿 量，總體上從大約ImM到大約200mM的濃度的范圍，并且在一些其他實(shí)施例中，從大約IOmM 到大約50mM的范圍。
[0035] 抗血小板藥物
[0036] 適合于用在本發(fā)明中的抗血小板藥物包括前列腺素、環(huán)前列腺素、磷酸二酯酶抑 制劑、環(huán)氧化酶抑制劑以及他們的兩種或更多種的組合。前列腺素根據(jù)他們的結(jié)構(gòu)分為不 同的族，每一族由字母（A、E、F、G、H或I)命名。除了該字母以外，每個(gè)前列腺素帶有指示 在其脂肪酸側(cè)鏈中雙鍵的數(shù)量的數(shù)字。例如前列腺素El (PGEl)屬于E族并且在其側(cè)鏈中 僅具有一個(gè)雙鍵。除了 PGEl以外，可以在本發(fā)明的實(shí)踐中有用的另一前列腺素的示例包括 PGE2。
[0037] 被稱為環(huán)前列腺素的各種環(huán)前列腺素類似物也可以在本發(fā)明的實(shí)踐中 作為抗血小板藥物有用。典型的示例包括PGI2 (也被稱為環(huán)前列腺素）、卡巴前 列環(huán)素（carbaprostacyclin)、貝前列腺素、伊洛前列素、5, 6-二氫環(huán)前列腺素 (5, 6-dihydroprostacyclin)、西前列烯、利馬前列素、13, 14-脫氫-15-環(huán)己基卡巴前列環(huán) 素（13, 14-dehydr〇-15_cyclohexyl carbaprostacyclin)、他前列稀和曲前列環(huán)素（及其 鹽，例如曲前列尼爾二乙醇胺（treprostinil diethanolamine),也被稱為UT-15C)。在某 些實(shí)施例中，環(huán)前列腺素是伊洛前列素。另一方面，他前列烯會(huì)不適合用在本發(fā)明中。
[0038] 磷酸二酯酶抑制劑還可以在本發(fā)明的實(shí)踐中作為抗血小板藥物有用。磷酸二酯 酶抑制劑阻止一種或多種磷酸二酯酶酵素（phosphodiesterase enzyme) (PDE)的子類型 (PDE1、H)E2、PDE3、H)E4, PDE5和TOE10)并且抑制細(xì)胞內(nèi)環(huán)腺苷酸（cAMP)和環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷 (cGMP)的失活，細(xì)胞內(nèi)環(huán)腺苷酸（cAMP)和環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷（cGMP)被稱為細(xì)胞中的第二信使。 非選擇性和選擇性PDE抑制劑會(huì)是有用的。PDE抑制劑的典型示例包括MEP-1、米力農(nóng)、西 洛酰胺（Cilostamine)、潘生丁、敏喘寧和IBMX(3-異丁基-1-甲基黃嘌呤咖啡因、茶堿、可 可堿、氨茶堿、膽茶堿、二羥丙茶堿（還被稱為喘定）、己酮可可堿、異丁基甲基黃嘌呤以及 罌粟堿。
[0039] 環(huán)氧酶抑制劑也可以在本發(fā)明的實(shí)踐中作為抗血小板藥物有用。也被稱為前列腺 素內(nèi)過(guò)氧化物合酶（PTGS)的環(huán)氧酶（COX)催化包括前列腺素、環(huán)前列腺素和血栓素的前列 腺素類化合物（prostanoids)的合成。環(huán)氧酶抑制劑的典型示例包括非留類消炎劑，例如 阿司匹林、消炎痛、布洛芬、萘普生、美洛昔康、雙氯芬酸、吡羅昔康、替諾昔康、替尼達(dá)普以 及他們的兩種或更多種的組合。
[0040] 概括地，抗血小板藥物在裝置中以對(duì)抑制血小板聚集有效的量存在。這個(gè)量相對(duì) 于采集到裝置中的血液量或血漿量，總體上從大約IxKr ltl到大約IxKT1M的范圍，并且在一 些其他實(shí)施例中，從大約1〇_8到大約KT 4M的范圍，并且在一些其他實(shí)施例中，從大約IxKT7 到大約IxKT5M的范圍。
[0041] 增溶劑
[0042] 增溶劑可以存在于本發(fā)明的裝置中。除了其他優(yōu)勢(shì)，他們?cè)谥圃爝^(guò)程中促進(jìn)和 增強(qiáng)抗血小板藥物（以及可以存在的任何其他血液穩(wěn)定劑）的穩(wěn)定性?？梢栽诒景l(fā)明的 實(shí)踐中有用的穩(wěn)定劑的典型示例包括聚乙二醇（PEG)、單甲氧基聚乙二醇（MPEG)、PEG脂 質(zhì)、白蛋白、牛血清白蛋白（BSA)和環(huán)糊精。環(huán)糊精的示例在羅夫森（Loftsson)發(fā)表在藥 物科學(xué)雜志（J. Pharm. Sci. ) 93 (5) : 1091-1099 (2004)、羅夫森等人發(fā)表在藥物傳輸專家評(píng) 論（Expert Opin. Drug Del. )2:335-51 (2005)以及詹森（Jansook)等人發(fā)表在藥物科學(xué) 雜志99(2):719-29(2010)中的文章中進(jìn)行了描述。首選的環(huán)糊精是2-羥丙基-￠-環(huán)糊 精。概括地，增溶劑在裝置中相對(duì)于采集到裝置中的血液量或血漿量，以大約IxKT 6到大約 lxl02mg/ml的濃度存在，并且在一些實(shí)施例中，以大約IxKT3到大約lxKTmg/ml的濃度存 在。
[0043] 附加的血液穩(wěn)定劑
[0044] 在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的血液采集容器可以包括至少一種附加的穩(wěn)定劑，該穩(wěn) 定劑的類型和數(shù)量可以基于例如應(yīng)用血液或血漿進(jìn)行的臨床試驗(yàn)的類型這樣的因素進(jìn)行 選擇。穩(wěn)定劑可以包括蛋白酶抑制劑（除了 EDTA)。在本發(fā)明中有用的蛋白酶抑制劑呈現(xiàn) 對(duì)包括例如絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、絲氨酸/半肽氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶、天冬 氨酸/ I丐蛋白酶（calpain proteases)、外肽酶和二肽基肽酶這樣的一類或多類蛋白酶的 抑制活性。本發(fā)明可以預(yù)期這些蛋白酶的兩種或更多種的任何和所有組合。因此，裝置可以 包含這樣的抑制劑的兩種或更多種的混合物，包括例如絲氨酸蛋白酶的抑制劑和外肽酶的 抑制劑，絲氨酸蛋白酶的抑制劑和半胱氨酸蛋白酶的抑制劑，絲氨酸蛋白酶的抑制劑和二 肽基肽酶的抑制劑，外肽酶的抑制劑和二肽基肽酶的抑制劑，絲氨酸蛋白酶的抑制劑、外肽 酶的抑制劑、二肽基肽酶的抑制劑和半胱氨酸肽酶的抑制劑，以及絲氨酸蛋白酶的抑制劑、 外肽酶的抑制劑和二肽基肽酶的抑制劑。參見(jiàn)例如美國(guó)第7, 309, 468號(hào)專利。例如絲氨酸 蛋白酶的抑制劑這樣的至少一種蛋白酶抑制劑的存在與蛋白質(zhì)組學(xué)有關(guān)是可取的，如這里 所描述的，需要測(cè)量已知的與病情相關(guān)的或懷疑要與病情相關(guān)的蛋白質(zhì)的或肽生物標(biāo)記的 存在或蛋白質(zhì)的或肽生物標(biāo)記的量。
[0045] 絲氨酸蛋白酶抑制劑的典型示例包括抗痛素、抑肽酶、抗凝血酶、胰凝乳蛋白酶抑 制劑、DFP、彈性蛋白酶抑制劑、APMSF、苯甲基磺酰氟（PMSF)、AEBSF、TLCK、TPCK、亮抑酶肽、 胰蛋白酶以及大豆胰蛋白酶抑制劑。絲氨酸蛋白酶抑制劑的濃度總體上從大約〇. I U M到 大約IOOiiM的范圍。
[0046] 可以在本發(fā)明中有用的外肽酶抑制劑的典型示例包括氨肽酶抑制劑、苯丁抑制 素、抑二肽素A和抑二肽素B。外肽酶抑制劑的濃度總體上從大約0. OlmM到大約ImM。
[0047] 存在于循環(huán)中的二肽基肽酶活性（其包括DPP IV和DPP IV之類的活性）在從在 肽底物的N-末端順序的倒數(shù)第二的位置中具有脯氨酸或丙氨酸的生物活性肽的N-末端釋 放二肽方面具有高的特異性。葡萄糖依賴性促胰島素多肽GIPl 42和GLP 17 36、來(lái)自胰 腺（腸促胰島素）的加強(qiáng)葡萄糖誘導(dǎo)胰島素分泌是DPP IV的底物。DPP IV酵素分別從體 外和體內(nèi)的這些肽的N-末端釋放二肽酪氨酰基丙氨酸（dipeptides tyrosinyl alanine) 和組氨?；彼幔╤istidyl alanine)。蒙特雷（Mentlein)等人發(fā)表在歐洲生物化學(xué)雜 志（Eur.J.Biochem.)214,829(1993)中。可以在本發(fā)明中有用的二肽基肽酶IV(DPP IV) 的抑制劑的典型示例包括維達(dá)列汀、西他列汀、沙克列汀、利拉利汀和阿格列汀。其他的DPP IV抑制劑包括由例如異亮氨酸、Asn、Asp、Glu、His、Pro和Val這樣的氨基酸和噻唑烷或 吡咯烷基，以及例如其L-蘇式和L-別形式的立體異構(gòu)體，以及其無(wú)機(jī)和有機(jī)鹽（例如磷酸 鹽、硫酸鹽、醋酸鹽、酒石酸鹽、琥珀酸鹽和延胡索酸鹽）形成的二肽化合物。二肽化合物的 具體事例包括L-蘇式-異亮氨酰-噻唑烷、L-別-異亮氨酰-噻唑烷，L-蘇式-異亮氨 酰-吡咯烷以及L-別-異亮氨酰-吡咯烷。二肽基肽酶抑制劑的濃度總體上從大約0. OlmM 到大約ImM的范圍。
[0048] 其他穩(wěn)定劑包括其他種類的蛋白酶的抑制劑。因此，在另外的實(shí)施例中，血液采集 裝置還可以包含半肽氨酸蛋白酶的抑制劑（例如IAA (吲哚乙酸）和E 64)、絲氨酸/半肽氨 酸蛋白酶（例如亮抑霉肽、TPCK、PLCK HCL、2庚酮HCL和抗痛素HC1)、天冬氨酸蛋白酶（例 如胃酶抑素和VdLPFFVdL)、金屬蛋白酶（例如EDTA、苯丁抑制素、1，10鄰二氮雜菲和膦酰二 肽（phosphoramodon))、巰基蛋白酶、天冬氨酸/1 丐蛋白酶（胃酶抑素、N-乙酰亮氨酸亮氨 酸正亮氨酸（N-acetyl leu leu norleucinal)和N-乙酰亮氨酸亮氨酸蛋氨酸（N-acetyl 1611161111161：11；[011；[1^1))、半肽天冬酶、肽鏈內(nèi)切酶（例如€[2巨球蛋白（被稱為通用的肽 鏈內(nèi)切酶抑制劑）、a 1抗胰蛋白酶和塞奧芬）以及他們的兩種或更多種的組合。蛋白酶抑 制劑的附加示例包括大豆或利馬豆胰蛋白酶抑制劑、胰蛋白酶抑制劑、蛋白卵囤蛋白（egg white ovostatin)和蛋白半胱氨酸蛋白酶抑制劑。蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員領(lǐng)會(huì)到特定 的抑制劑會(huì)顯示出對(duì)相同種類的蛋白酶中的一種或多種蛋白酶的抑制活性，以及對(duì)不同種 類的蛋白酶中的一種或多種蛋白酶的抑制活性。苯丁抑制素和氨肽酶抑制劑例如顯示出對(duì) 金屬蛋白酶和外肽酶的抑制活性。
[0049] 在一些實(shí)施例中，附加的穩(wěn)定劑可以包括酯酶的抑制劑，例如諸如丁酰膽堿酯酶 和乙酰膽堿酯酶這樣的羧基酯酶。這些穩(wěn)定劑可以提供對(duì)需要脂肪族酯基團(tuán)生物活性的蛋 白質(zhì)和肽的體外降解的附加保護(hù)。示例是胃饑餓素（ghrelin)，其是例如糖尿病這樣的新陳 代謝疾病的標(biāo)記。酯酶抑制劑可以提供其他神經(jīng)肽的增強(qiáng)的穩(wěn)定性。
[0050] 人們認(rèn)為也被稱為血清或血漿膽堿酯酶的丁酰膽堿酯酶（BChE) (E. C. 3. I. 1. 8) 在代謝可卡因和例如琥珀酰膽堿和阿司匹林這樣的其他藥物中起作用。參見(jiàn)洛克里奇 (Lockridge)發(fā)表在卡勞（Kalow)(編輯）、帕加蒙出版社（Pergamon Press，Inc)出版的紐 約藥物代謝的遺傳藥理學(xué)（Pharmacogenetics of Drug Metabolism New York)pp. 15-50 中的"人類血清丁酰膽堿酯酶的遺傳變異體對(duì)肌肉松弛劑琥珀酰膽堿的代謝作用的影響 (Genetic Variants of Human Serum Butyrylcholinesterase influence the metabolism of the muscle relaxant succinylcholine)，'。BChE 以大約 5mg/l (或大約 5U/ml)的量 存在于人類血漿中。在本發(fā)明中有用的BChE抑制劑具有不大于大約0.5uM(500nM)的Ki 值，或者在一些實(shí)施例中，不大于大約0.05 u M(50nM)的Ki，或者在另外的實(shí)施例中，不大 于大約0.010 U M(IOnM)的Ki (并且包括其中的所有子范圍）。Ki是動(dòng)力學(xué)變量（與例如 分子量、熔點(diǎn)和沸點(diǎn)等這樣的物理性質(zhì)截然相反）并且同樣地，可以經(jīng)受相對(duì)寬的變化，尤 其取決于用于確定該值的方法。因此，這里使用的術(shù)語(yǔ)"大約"連同Ki值指的是50%的變 化性（即正/負(fù)值）。
[0051] 在本發(fā)明中有用的BChE抑制劑是化合物9-氨基-1，2, 3, 4四氫吖啶，也被稱為他 克林（及其衍生物）。參見(jiàn)美國(guó)第4,816, 456號(hào)專利。他克林是FDA批準(zhǔn)的用于阿耳滋海默 氏病的治療的中樞作用膽堿酯酶抑制劑。其以商品名COGNEX由希爾制藥（Sciele Pharma) 銷售。在美國(guó)第4, 754, 050號(hào)專利（其中的公式（I))中教導(dǎo)了適合用于本發(fā)明中的他克 林衍生物的典型示例。
[0052] 在'050號(hào)專利中公式（I)所包含的具體他克林衍生物包括如下：9_氨基-3, 4-二 氫 R丫陡-1(2H)_ 酮（9-Amin〇-3,4-dihydroacridin_l(2H)-〇ne) ;9_ 氨基 _3,4_ 二 氫-6-甲基R丫陡-I (2H)-酮（9_Amin〇-3, 4-dihydr〇-6-methylacridin_l (2H)-〇ne) ;9_ 氨 基-3, 4_ 二氫-6-甲氧基R丫陡-I (2H)-酮（9_Amin〇-3, 4-dihydr〇-6-methoxyacridin_l (2 H) -one) ;9_ 氨基 _3, 4_ 二氫-6-氟R丫陡-I (2H)-酮（9_Amin〇-3, 4-dihydro_6-fluoroacri din_l (2H) -one) ;9_ 氛基-6-氣 _3, 4_ 二氧R丫陡-I (2H)-麗（9-Amin〇-6_chlor〇-3, 4-dihy droacridin-l (2H) -one) ;9_ 氨基-7-氯-3, 4-二氫R丫陡-I (2H)-酮（9-Amin〇-7_chlor〇-3 ，4-dihydroacridin-l (2H) -one) ;9_ 氛基 _3, 4_ 二氧 _6_ 三氣甲基R丫陡-1 (2H)-麗（9_Ami no_3, 4-dihydr〇-6_trif luoromethylacridin-l (2H) -one) ;9_ 氨基 _3, 4_ 二氫-7-硝基口丫 P定-I (2H)-酮（9_Amin〇-3, 4-dihydr〇-7-nitroacridin_l (2H) -one) ;7, 9-二氨基-3, 4-二 氫口丫陡-I (2H)-酮（7, 9_Diamin〇-3, 4-dihydroacridin-l (2H) -one) ;N_[9_ 氨基 _3, 4_ 二 氫-I (2H)-含氧 R丫陡-7-基]乙酉先胺（N-[9_Amin0-3, 4_dihydr0-l (2H) -0xoacridin_7-yl]acetamide) ;3,4_ 二氫-9-甲氨基 R丫陡 _1(2H)_ 酮（3,4-Dihydr〇-9_methylaminoac ridin_l(2H)-〇ne) ;3,4_ 二氫-9-甲氨基-7-硝基R丫陡 _1(2H)_ 酮（3,4-Dihydr〇-9_met hylamin〇-7-nitroacridin_l (2H)-〇ne) ;3, 4_ 二氫-9-丙氨基R丫陡-I (2H)-酮（3, 4_Dih ydr〇-9-propylaminoacridin-l(2H)_one) ;3,4_ 二氫-9_[2_(二甲氨基）乙基]氨基口丫 P 定-1(2H)_ 酮（3,4-Dihydr〇-9-[2-(dimethylamino)ethyl]aminoacridin-l(2H)-〇ne); 9-節(jié)基氨基-3, 4_ 二氫 R丫陡-I (2H)-酮（9_Benzylamin〇-3, 4-dihydroacridin-l (2H)-〇116);9-節(jié)基氛基-3,4-二氧-6-甲基口丫陡-1(211)-麗（9-6611271&111；[110-3,4-(1;[]17(11'〇-6-methylacridin-l (2H) -one) ;9_ 節(jié)基氛基 _3, 4_ 二氧 _6_ 氣 R丫陡 _1 (2H)-麗（9_Ben zylamino-3, 4-dihydr〇-6-fluoroacridin-1 (2H) -one) ;9_ 節(jié)基氨基 _6_ 氯-3, 4_ 二氫 口丫陡 _1(2H)_ 酮（9-Benzylamin〇-6-chlor〇-3,4-dihydroacridin-l(2H)-〇ne) ;9_ 節(jié)基 氨基-3, 4_ 二氫-6-三氟甲基卩丫陡-I (2H)-酮（9_Benzylamin〇-3, 4-dihydr〇-6_trifI 11〇1'〇1116七1171&。1'1(1;[11-1(21{)-0116);3,4-二氫-9-(2-甲節(jié)基氨基）口丫陡-1(21{)-酮（3,4 -Dihydr0-9-(2-methylbenzylamino)acridin-l(2H)-0ne) ;3,4_ 二氫-9-(3-甲節(jié)基氨 基）R丫陡-1(2H)_ 酮（3,4-Dihydr0-9-(3-methylbenzylamino)acridin-l(2H)-0ne); 3.4- 二氫-9-(4-甲節(jié)基氨基）口丫陡-1(211)-酮（3,4-0;[117(11'0-9-(4116七1171匕6112：71&111；[11 o)acridin-l(2H)_one) ;3,4_ 二氫-9-(2-甲氧基芐基氨基）吖啶-1(2H)_ 酮（3,4-Dih ydr0-9-(2-methoxybenzylamino)acridin-l (2H)-0ne) ;3, 4_ 二氫-9-(3-甲氧基節(jié)基氨 基）R丫陡-1(2H)_ 酮（3,4-Dihydr0-9-(3-methoxybenzylamino)acridin-l(2H)-0ne); 3, 4_ 二氫-9- (4_ 甲氧基節(jié)基氨基）R丫陡-I (2H)-酮（3, 4_Dihydr0-9- (4-methoxyben 2又1&111；[110)&。1^(1;[11-1(21{)-0116);3,4-二氫-9-(2-氟節(jié)基氨基）口丫陡-1(21{)-酮（3,4 -Dihydr0-9- (2_fluorobenzylamino) acridin-1 (2H) -one) ;3, 4_ 二氫-9- (3_ 氟節(jié)基氨 基）R丫陡-1(2H)_ 酮（3,4-Dihydr0-9-(3-fluorobenzylamino)acridin-l(2H)_one); 3, 4_ 二氫-9- (4_ 氟節(jié)基氨基）R丫陡-I (2H)-酮（3, 4_Dihydr0-9- (4_f Iuorobenzylami no) acridin-l (2H) -one) ;6_ 氯-3, 4-二氫-9- (4-氟芐基氨基）吖啶-I (2H)-酮（6-C hloro-3,4-dihydr0-9-(4-fluorobenzylamino)acridin-1(2H)-one) ;9_(2_ 氯節(jié)基氨 基）_3, 4_ 二氫 R丫陡-I (2H)_ 酮（9-(2_Chlorobenzylamino)-3, 4-dihydroacridin-l (2H) -one) ;9_(3_ 氣節(jié)基氛基）_3, 4_ 二氧R丫陡-I (2H)_ 麗（9-(3_Chlorobenzylamino)-3, 4_ dihydroacridin-l (2H)-0n) ;9_(4_ 氯節(jié)基氨基）_3, 4_ 二氫R丫陡-I (2H)-酮（9-(4_Chlo robenzylamino) _3, 4-dihydroacridin-l (2H) -one) ;3, 4_ 二氫 _9_[ (2, 3, 4, 5, 6-五氟節(jié) 基）氨基]口丫陡 _1 (2H)-酮（3, 4_Dihydr〇-9- [ (2, 3, 4, 5, 6-pentaf luorobenzyl) amino] &。!^犯11-1(211)-〇1^);3,4-二氫-9-(2-三氟甲基芐基氨基）吖啶-1(211)-酮（3,4-0讓 7(1 r〇-9- (2-trif luoromethylbenzylamino) acridin-1 (2H) -one) ;3, 4_ 二氫 _6_ 氟 _9_ (2_ 三 氟甲基節(jié)基氨基）fJ丫陡-I (2H)_ 酮（3, 4-Dihydr〇-6-fluor〇-9-(2_trif luoromethylben zylamino)acridin_l (2H)-〇ne) ;3, 4_ 二氫-9-(3-三氟甲基節(jié)基氨基）R丫陡-I (2H)-酮 (3,4-Dihydr〇-9- (3~trifluoromethylbenzylamino)acridin-1(2H) -one) ;3, 4-二 氫-9-(4-三氟甲基節(jié)基氨基）卩丫陡-I (2H)_ 酮（3, 4-Dihydr〇-9-(4_trifluoromethyl benzylamino) acridin-1 (2H) -one) ;3, 4_ 二氧 _9_ 苯乙基氛基 R丫陡 _1 (2H)-麗（3, 4-D ihydr〇-9-phenethylaminoacridin-l (2H)-〇ne) ;3, 4_ 二氫 _9_(4, 4_二苯基丁基）氨 基 R丫陡-1(2H)_ 酮（3,4-Dihydr〇-9-(4,4-diphenylbutyl)aminoacridin_l(2H)-〇ne); 3, 4-二氫-9- (4, 4-二苯基丁基氨基）-6-三氟甲基吖啶-I (2H)-酮（3, kDitiycto-g-( 4.4- diphenylbutylamino)-6-trifluoromethylacridin-1(2H)-one) ;9_[4,4_ 雙（3_ 氟 苯基）丁基氨基]_3, 4_ 二氫卩丫陡-I (2H)_ 酮（9_[4, 4_Bis(3-fluorophenyl)butylamin 0]-3,4-(1;[]17(11'〇&。1'1(1;[11-1(211)-0116);9-[4,4-雙（4-氣苯基）丁基氛基]-3,4-二氧口丫 P定 _1(2H)_ 酮（9-[4,4-bis(4-fluorophenyl)butylamino]-3,4-Dihydroacridin-l(2H)-〇116);3,4-二氧-9-(3-苯氧基丙氛基）0丫陡-1(211)-麗（3,4-〇;[]17(11'〇-9-(3-卩]1611〇17卩1'〇 口又1&111；[110)&。1'1(1;[11-1(21{)-0116);9-[2-[雙（4-氣苯基）甲氧基]乙基氛基-3,4-二氧口丫 P定 _1(2H)_ 酮(9-[2-[Bis(4-fluorophenyl)methoxy]ethylamino-3, 4-dihydroacridin- 1(211)-〇116);9-[4-(芐氧基）芐基氨基]-3,4-二氫吖啶-1(211)-酮（9-[4-(8 611^10巧） benzylamino]_3, 4-dihydroacridin-l (2H)-〇ne) ;3, 4_ 二氫-9_[(2_ 噻吩基）甲基氨 基]R丫陡-1(2H)_ 酮（3,4-Dihydr〇-9-[(2-thienyl)methylamino]acridin-l(2H)-〇ne); 9-氛基-2, 3_ 二氧-環(huán)戊并[b]唆琳-1-麗（9_Amin〇-2, 3-dihydro_cyclopenta[b] quinolin-l-one) ;9_ 氨基 _1，2, 3, 4-四氫 R丫陡-1-醇（9_Amin〇-l，2, 3, 4-tetrahydroac ridin-1-ol) ;9_ 氨基-6-氯-1，2, 3, 4-四氫R丫陡-1-醇（9-Amin〇-6_chlor〇-l，2, 3, 4_te trahydroacridin-l-ol) ;9_ 氨基-7-氯 _1，2, 3, 4-四氫R丫陡-1-醇（9-Amin〇-7_chlor〇-1，2, 3, 4-tetrahydroacridin_l-〇l) ;9_ 氨基-6-甲氧基 _1，2, 3, 4-四氫R丫陡-1-醇（9-A mino-6-methoxy-l，2, 3, 4-tetrahydroacridin_l-〇l) ;9_ 氨基 _6_ 氟 _1，2, 3, 4_ 四氫口丫 P定-1-醇（9_Amin〇-6-fluoro-1，2, 3, 4-tetrahydroacridin_l-〇l) ;9_ 氨基 _1，2, 3, 4-四 氫-6-三氟甲基 R丫陡-1-醇（9_Amin〇-l，2, 3, 4-tetrahydro_6-trifluoromethylacr idin-l-ol) ;9_ 甲基氨基 _1，2, 3, 4-四氫 R丫陡-1-醇（9_Methylamin〇-l，2, 3, 4-tetr ahydroacridin-l-ol) ;9_ 丙胺基 _1，2, 3, 4-四氫 R丫陡-1-醇（9-Propylamin〇-l，2， 3, 4-tetrahydroacridin_l-〇l) ;9_[2_(二甲基氛基）乙基]氛基 _1，2, 3, 4_ 四氧口丫 P定(9_ [2_ (Dimethylamino) ethyl] amino-1，2, 3, 4-tetrahydroacridin_l-〇) ;9-節(jié)基 氨基-1，2, 3, 4-四氫 R丫陡-1-醇（9_Benzylamin〇-l，2, 3, 4-tetrahydroacridin_l-〇l); 9-節(jié)基氨基-6-甲基 _1，2, 3, 4-四氫R丫陡-1-醇（9-Benzylamin〇-6-methyl_l，2, 3, 4_t etrahydroacridin-l-ol) ;9_ 節(jié)基氨基-6-氟 _1，2, 3, 4-四氫 R丫陡-1-醇（9-Benzylam in〇-6-fluoro-1，2, 3, 4-tetrahydroacridin_l-〇l) ;9_ 節(jié)基氨基-6-氯 _1，2, 3, 4-四氫 口丫陡-1-醇（9-Benzylamin〇-6_chlor〇-l，2, 3, 4-tetrahydroacridin_l-〇l) ;9_ 節(jié)基氨 基-1，2, 3, 4-四氫-6-三氟甲基R丫陡-l-〇 (9_Benzylamin〇-l，2, 3, 4-tetrahydr〇-6_trif 111〇!'〇1116也71&。1^(1;[11-1-0);9-(2-甲節(jié)基氨基）-1，2,3,4-四氫口丫陡-1-醇（9-(2-]^七117 lbenzylamino)_l，2, 3, 4-tetrahydroacridin_l-〇l) ;9_(3_ 甲節(jié)基氨基）_1，2, 3, 4_ 四氫 口丫陡-1-醇（9-(3-Methylbenzylamino)-l，2,3,4-tetrahydroacridin-l_ol) ;9_(4_ 甲 節(jié)基氨基）-1，2, 3, 4_ 四氫 R丫陡-1-醇（9-(4_Methylbenzylamino)-l，2, 3, 4-tetrahydr oacridin-l-ol) ;9_(2_ 甲氧基節(jié)基氨基）_1，2, 3, 4_ 四氫 R丫陡-l-(9-(2_Methoxybenzyl amino)_l，2, 3, 4-tetrahydroacridin_l-〇l) ;9_(3_ 甲氧基節(jié)基氨基）_1，2, 3, 4_ 四氫口丫 P 定-1-醇（9-(3-Methoxybenzylamino)-l，2,3,4-tetrahydroacridin-l_ol) ;9_(4_ 甲 氧基節(jié)基氨基）-1，2, 3, 4_ 四氫 R丫陡-1-醇（9-(4_Methoxybenzylamino)-l，2, 3, 4-tetr ahydroacridin-l-ol) ;9_ (2-氟節(jié)基氨基）_1，2, 3, 4_ 四氫 R丫陡-1-醇（9- (2-Fluorobe nzylamino) _1，2, 3, 4-tetrahydroacridin_l-〇l) ;9_(3_ 氟節(jié)基氨基）_1，2, 3, 4_ 四氫口丫 P定-1-醇（9-(3_Fluorobenzylamino)-l，2, 3, 4-tetrahydroacridin_l-〇l) ;9_(4_ 氟節(jié)基 氨基）-1，2, 3, 4_ 四氫 R丫陡-1-醇（9-(4_Fluorobenzylamino)-l，2, 3, 4-tetrahydroacri din-1-ol) ;6_ 氯-9-(4-氟芐基氨基）-1，2, 3, 4-四氫吖啶-1-醇（6-Chloro_9-(4-fluor obenzylamino)_l，2, 3, 4-tetrahydroacridin_l-〇l) ;9_(2_ 氯節(jié)基氨基）_1，2, 3, 4_ 四氫 口丫陡-1-醇（9-(2-Chlorobenzylamino)-l，2,3,4-tetrahydroacridin-l-〇l) ;9_(3_ 氯 節(jié)基氨基）-1，2, 3, 4_ 四氫 R丫陡-1-醇（9_ (3-Chlorobenzylamino) _1，2, 3, 4-tetrahydr oacridin-l-ol) ;9_(4-氯節(jié)基氨基）_1，2, 3, 4_ 四氫 R丫陡-1-醇（9-(4-Chlorobenzyla mino)_l，2, 3, 4-tetrahydroacridin_l-〇l) ;1，2, 3, 4-四氫-9-(2-三氟甲節(jié)基）氨基口丫 P定-1-酉享(1,2,3,4-Tetrahydr〇-9-(2-trifluoromethylbenzyl)aminoacridin-l-〇l)； 6-氟-1，2, 3, 4-四氫-9-(2-三氟甲芐基氨基）吖啶-I-醇（e-Fluoro-l，2, 3, 4-tetra hydr〇-9-(2-trifluoromethylbenzylamino)acridin-l_ol) ;1，2, 3, 4_ 四氫-9-(3-三氟 甲節(jié)基氨基）R丫陡 _1_ 醇（1，2, 3, 4-Tetrahydr〇-9-(3_trifIuoromethylbenzylamino) acridin-l-ol) ;1，2,3,4-四氫-9-(4-三氟甲節(jié)基氨基）R丫陡-1-醇（l，2,3,4_Tetrahy dr〇-9_ (4-trif luoromethylbenzylamino) acridin-l-ol) ;9_[ (2, 3, 4, 5, 6_ 五氟節(jié)基）氨 基]-1，2, 3, 4_ 四氫R丫陡-1-醇（9_[(2, 3, 4, 5, 6_Pentafluorobenzyl)amino]-l，2, 3, 4_tet rahydroacridin-l-ol) ;9_ 苯乙基氨基 _1，2, 3, 4_ 四氫R丫陡-1-醇（9-Phenethylamino-l， 2, 3, 4-tetrahydroacridin_l-〇l) ;9_(4, 4_ 二苯基丁基）氨基 _1，2, 3, 4-四氫口丫陡-1-醇 (9-(4, 4-Diphenylbutyl)amino-1, 2, 3, 4-tetrahydroacridin-l-〇l) ;9_[4,4_ 雙（3_ 氟 苯基）丁基氨基]_1，2, 3, 4_ 四氫R丫陡-1-醇（9_[4, 4_Bis (3_fluorophenyl)butylamino ]-l，2,3,4-tetrahydroacridin_l-〇l) ;9_[4,4_ 雙（4-氟苯基）丁基氨基]_1，2,3,4_ 四 氫 R丫陡-1-醇（9-[4,4-Bis(4-fluorophenyl)butylamino]-l，2,3,4-tetrahydroacrid in_l-〇l) ;9_ (3_ 苯氧基丙胺基）_1，2, 3, 4_ 四氫卩丫陡-1-醇（9_ (3-Phenoxypropylami no)-l，2,3,4-tetrahydroacridin-l_ol) ;9_[[2_ [雙（4-氟苯基）甲氧基]乙基]氨 基]-1，2, 3, 4_ 四氫R丫陡-1-醇（9_[[2_[Bis (4_f luorophenyl)methoxy] ethyl] amino] _1， 2, 3, 4-tetrahydroacridin_l-〇l) ;9_[4_(節(jié)氧基）節(jié)基氨基]-1，2, 3, 4_ 四氫R丫陡-I-醇 (9-[4-(Benzyloxy)benzylamino]_l，2, 3, 4-tetrahydroacridin_l-〇l) ;9_[ (2-噻吩基） 甲基氨基]-1，2, 3, 4_ 四氫 R丫陡-1-醇（9_[ (2_Thienyl)methylamino]-l，2, 3, 4-tetra hydroacridin-l-ol) ;9_ 氨基-3, 4_ 二氫 R丫陡（9_Amin〇-3, 4-dihydroacridine) ;9_ 氨 基-I-甲基-1，2, 3, 4-四氫 R丫陡-I-醇（9-Amin〇-l-methyl_l，2, 3, 4-tetrahydroacridi n-1-ol) ;9_ 氨基 _3, 4_ 二氫-2-亞甲基R丫陡-I (2H)-酮（9_Amin〇-3, 4-dihydr〇-2_methy leneacridin-1 (2H) -one) ;9_ 氛基 _1，2, 3, 4_ 四氧-環(huán)戊并[b]唆琳-1-醇（9_Amin〇-l， 2, 3, 4-tetrahydr〇-cyclopenta[b]quinolin-l-〇l) ;2_(3_ 含氧環(huán)己烯-1-基）氨基節(jié)臆 (2_(3-〇xoclohexen_l-yl) aminobenzonitrile);以及 4_ 氯 _2_(3_ 含氧環(huán)己烯-1-基）氨 基節(jié)臆（4-Chlor〇-2-(3_oxocyclohexen-l-yl)aminobenzonitrile) 〇
[0053] 可以適合于用在本發(fā)明中的其他丁酰膽堿酯酶抑制劑包括例如普粑嗪、愛(ài)普王巴 嗪這樣的他克林二聚體及其衍生物。參見(jiàn)例如美國(guó)第2, 607, 773和4, 833, 138號(hào)專利。普 粑嗪、鹽酸化物鹽已經(jīng)被FDA批準(zhǔn)用于帕金森氏癥的治療。
[0054] 其他的丁酰膽堿酯酶抑制劑包括他克林和（-)_石杉?jí)A甲A(其是從石杉 科，石松屬的石松蛇足石杉（Huperzia serrata)中分離出的對(duì)映體的石松定生 物堿）的混合物。石杉?jí)A甲A他克林混合物的示例在所屬【技術(shù)領(lǐng)域】?jī)?nèi)公知為化 合物5a、5b和5c以及石杉?jí)A甲雜合體（Huprine X)。他們的對(duì)應(yīng)的化學(xué)名如下： ((9￡)41-(7-(1，2,3,4-四氫吖啶-9-基氨基）庚基）-9-亞乙基-4,4,7-三甲基雙環(huán) [3. 3. 1]壬 _6_ 烯-1，3_ 二胺）（5a) (((9E)-N1-(7_(1，2, 3, 4-tetrahydroacridin_9-ylam ino)heptyl)-9-ethylidene_4, 4, 7_tr imethylbicyclo [3. 3. l]non-6-ene-l, 3-diamine) (5a)) ;((9E)-Nl-(7-(l，2,3,4-四氫吖啶-9-基氨基）庚基）-9-亞乙基-47-甲基雙 環(huán)[3. 3. 1]壬 _6_ 烯-1，3_ 二胺）（5b) (((9E) -NI- (7_ (1，2, 3, 4-tetrahydroacridin_9-ylamino)heptyl)-9-ethylidene-47-methy lbicyclo [3.3. 1]non-6-ene-l, 3-diamine) (5b)) ;((9E)-Nl-(7-(l，2,3,4-四氫吖啶-9-基氨基）庚基氨基）-9-亞乙基-3-甲 基雙環(huán)[3.3.1]壬-3-烯-1-羧酸甲酯）（5c)(((9E)-Nl-(7-(l，2,3,4-tetrahyd roacridin-9-ylamino)heptylamino)-9-ethylidene-3-m ethylbicyclo[3. 3. 1] non-3-ene-l-carboxylic Acid Methyl Ester)(5c));以及（13)-7-氯-15-乙基_1〇-氮 雜異伍茲烷[II. 3. I. 0~ {2, 11} ? 0~ {4, 9}]十七-2 (II)，3, 5, 7, 9, 14-己烷-3-胺）（（IS)-7 -chlor〇-15-ethyl-l〇-azatetracyclo [11. 3. 1.0' {2, 11}. 0' {4, 9} ]heptadeca~2 (11), 3, 5 ,7, 9, 14-hexaen-3_amine))(石杉?jí)A甲雜合體）。
[0055] BChE的濃度總體上從大約5 ii M到大約500mM(即5xl08nM)的范圍，并且在一些實(shí) 施例中，從大約0. 5 ii M到大約50mM的范圍，以及在另外的實(shí)施例中，從大約0. I ii M到大約 IOmM的范圍。這些范圍內(nèi)的所有子范圍也是可以預(yù)期的。正如在Ki值的情況下，所使用的 術(shù)語(yǔ)"大約"連同這里公開(kāi)的所有濃度值指的是50%的變化性（正/負(fù)值）。
[0056] 附加穩(wěn)定劑還可以包括另一類型的血清酯酶的抑制劑，以及具體地另一 B酯酶 的抑制劑（BChE是其中一員）。這些酯酶包括乙酰膽堿酯酶（AChE) (EC 3. I. 1. 7)和非特 異性的羧酸酯酶（EC 3. I. 1. 1)。AChE的抑制劑對(duì)膽堿酯酶起作用并且抑制其破壞在身 體中作為神經(jīng)傳遞素起作用的乙酰膽堿。為人所熟知的是例如他克林和石杉?jí)A甲A這樣 的一些BChE抑制劑也抑制乙酰膽堿酯酶。據(jù)報(bào)導(dǎo)他克林對(duì)于AChE的Ki是6. 9nm(本查 瑞特（Bencharit)等人發(fā)表在生物化學(xué)雜志（Chem. Biol.) 10:341-9(2003)中）。據(jù)報(bào) 導(dǎo)石杉?jí)A甲A對(duì)于AChE的Ki是47nm(杰瑪（Gemma)等人發(fā)表在藥物化學(xué)雜志（J. Med. Chem. )49:3421-5(2006)中）?？紤]到BChE構(gòu)成人類血清中總酯酶活性的重要部分（即 與AChE的0. 008mg/L相比，為大約5mg/L的BChE)，在血液采集管中的抑制劑的內(nèi)含物 (inclusion)是可選擇的。
[0057] 適合于用在本發(fā)明中的AChE抑制劑的Ki典型地大約500nm或更少，并且在其他 實(shí)施例中，小于大約 40〇11111、30〇11111、20〇11111、10〇11111、5〇111]1或1〇111]1。如這里公開(kāi)的，特定4〇1￡抑 制劑的Ki值可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)分析技術(shù)（standard assay techniques)確定。
[0058] 因此，可以在本發(fā)明中有用的其他AChE抑制劑包括如下：石杉?jí)A甲雜 合體（（lS)-7-氯-15-乙基-10-氮雜異伍茲烷[11.3. 1.0~{2, 11}.0~{4,9}] 十七-2(11)，3,5,7,9，14_ 己燒 n_3-胺（（lS)-7_chlor〇-15-ethyl-l〇-azatetracy clo[11.3. 1.0"{2, 11}.0"{4,9}] heptadeca-2 (11), 3, 5, 7, 9, 14-hexae n-3-amine)) (0? 026nm的Ki);他克林二聚物4a(甲基雙[3-(1，2, 3, 4-四氫吖啶-9-基氨基）丙基] 胺(methylbis[3-(1, 2, 3, 4-tetrahydroacridin-9-ylamino)propyl]amine)) (0.06nm 的Ki);他克林二聚物4d(2-{:雙[3-(1，2, 3, 4-四氫吖啶-9-基氨基）丙基]氨基}乙 醛-1-醇|N，N-雙[3-[(1，2,3,4_四氫吖啶-9-基）氨基]丙基]-N-羥乙胺（2-{bis[ 3-(1, 2, 3, 4-tetrahydroacridin-9-ylamino)propyl]amino}ethan-l-〇l|N, N-Bis[3-[( I, 2, 3, 4-tetrahydroacridin-9-yl) amino]propyl]-N-hydroxyethylamine)) (0. 65nm StJ Ki);他克林衍生物 2(6, 8-二氯-1，2, 3, 4-四氫吖啶-9-胺（6, 8-dichloro-l, 2, 3, 4-te trahydroacridin-9-amine)) (I. Onm的Ki);他克林二聚物3b (同型二聚體他克林類似物 3b |N-[7-(l，2, 3, 4-四氫吖啶-9-基氨基）庚基]-1，2, 3, 4-四氫吖啶-9-胺I他克林同 型二價(jià)化合物 3a(Homodimeric Tacrine Analog 3b|N-[7_(l, 2,3, 4-tetrahydroacridi n-9-ylamino)heptyl]-I, 2, 3, 4-tetrahydroacridin-9-am ine|tacrine homobivalent compound 3a)) (I. 3nm 的 Ki);他克林二聚體 4c (N，N-雙[3-[ (1，2, 3, 4-四氫卩丫陡-9-基） 氨基]丙基]_N_烯丙胺I丙-2-丙烯基-1-基雙[3-(1，2, 3, 4-四氫R丫陡-9-基氨基） 丙基]胺（N，N-Bis[3-[(l，2,3,4-tetrahydroacridin-9-yl)amino]propyl]-N-allylam ineIprop-2-en-l-ylbis[3_(1，2, 3, 4-tetrahydroacridin_9-ylamino)propyl]amine)) (I. 6nm的Ki);他克林二聚體3c (同型二聚體他克林類似物3c|N-[8-(l，2, 3, 4-四氫吖 P定-9-基氨基）辛基]_1，2, 3, 4_ 四氫卩丫陡-9-胺（Homodimeric Tacrine Analog 3c IN _[8_(1，2, 3, 4-tetrahydroacridin_9-ylamino)octyl]-l，2, 3, 4-tetrahydroacridin_9-ami ne))(1.9mn 的 Ki);他克林二聚體4b(N，N-雙[3-[(l，2,3,4-四氫吖啶-9-基）氨 基]丙基]-N-乙胺I乙基雙[3-(1，2, 3, 4-四氫吖啶-9-yl氨基）丙基]胺（N，N-Bis [3-[ (1, 2,3,4-tetrahydroacridin-9-yl)amino]propyl]-N-ethylamine|ethylbis[3-( 1，2, 3, 4-tetrahydroacridin_9-ylamino) propyl] amine)) (2. 8nm 的 Ki);他克林異型二 價(jià)化合物3c(N-{7-[(6,8-二氯-1，2,3,4-四氫吖啶-9-基）氨基]庚基}-l，2,3,4-四 氫 R丫陡-9-胺（N-{7-[(6,8-dichlor0-l，2,3,4-tetrahydroacridin_9-yl)amino] heptyl}_l，2, 3, 4-tetra hydroacridin-9-amine)) (6. Onm 的 Ki);石杉喊甲 A-他克林混 合物5c ((9E) -7- (7- (1，2, 3, 4-四氫吖啶-9-基氨基）庚基氨基）-9-亞乙基-3-甲基雙環(huán) [3. 3. 1]壬-3-烯-1-羧酸甲酯I甲基（IS)-9-亞乙基-3-甲基-7-{[7-(1，2, 3, 4-四氫吖 啶-9-基氨基）庚基]氨基}雙環(huán)[3. 3. 1]壬-3-烯-1-羧酸酯（(9E) -7- (7- (1，2, 3, 4-Tetrahydroacridin-9-ylamino)heptylamino)-9-ethylidene-3-met hylbicyclo[3. 3. 1] non-3-ene-l-carboxylic Acid Methyl Ester|methyl (IS)-9-ethylidene-3-methyI -7- {[7_ (1，2, 3, 4-tetrahydroacridin_9-ylamino)heptyl]ami no}bicyclo [3.3.1] non-3-ene-l-carboxylate)) (6. 4nm 的 Ki);他克林二聚體 4j (N-甲基 _N_(1，2, 3, 4-四 氫吖啶-9-基）-N-[3-(l，2, 3, 4-四氫吖啶-9-基磺?；┍鵠-1，3-丙二胺I甲基 [3- (1，2, 3, 4-四氫吖啶-9-基氨基）丙基][3- (1，2, 3, 4-四氫吖啶-9-基磺?；┍鵠 胺（N-Methyl_N-(l，2, 3, 4-tetrahydroacridin-9-yl)-N-[3-(l，2, 3, 4-tetrahydroacrid in-9-ylsulfanyl)propyl]-I, 3-propanediamine|methyl[3-(1, 2, 3, 4-tetrahydroacridi n-9-ylamino)propyl][3-(1, 2, 3, 4-tetrahydroacrid in-9-ylsulfanyl)propyl]amine)) (9. Imn的Ki);石杉?jí)A甲A-他克林混合物51^(郵)41-(7-(1，2,3,4-四氫吖啶-9-基氨基） 庚基）-9-亞乙基-7-甲基雙環(huán)[3. 3. 1]壬-6-烯-1，3-二胺I N-(7-{[ (IS)-I-氨基-9-亞 乙基-7-甲基雙環(huán)[3.3. 1]壬-6-烯-3-基]氨基}庚基）-1，2, 3, 4-四氫吖啶-9-胺（(9E )-NI-(7-(1，2, 3, 4-Tetrahydroacridin-9-ylamino)heptyl)-9-ethylidene-7-methylb icyclo [3.3. 1] non-6-ene-l，3-diamine I N-(7-{[(IS)-l-amin0-9-ethylidene-7-meth ylbicyclo[3.3. 1]non-6-en-3-yl]amino}hepty I)-1，2, 3, 4-tetrahydroacridin-9_a mine)) (15. 70nm 的 Ki);石杉?jí)A甲 A-他克林混合物 5a ((9E)-NI-(7-(1，2, 3, 4-四氫吖 啶-9-基氨基）庚基）-9-亞乙基-4, 4, 7-三甲基雙環(huán)[3. 3.1]壬-6-烯-1，3-二胺 一-(7-{[(13)-1-氨基-9-亞乙基-4,4,7-三甲基雙環(huán)[3.3.1]壬-6-烯-3-基]氨基} 庚基）-1，2, 3, 4_ 四氫R丫陡 _9_胺（(9E) -NI- (7_ (1，2, 3, 4-Tetrahydroacridin_9-ylamino) heptyl)-9-ethylidene_4, 4, 7_tri methylbicyclo[3. 3. l]non-6-ene-l, 3-diamine|N-(7 -{[(IS) -l-amin0-9-ethylidene_4, 4, 7-trimethylbicyclo [3.3. 1]non-6-en_3-yl]amin o}heptyl)-l，2,3,4-tetrahydroacridin-9-amine))(16.50nm 的 Ki) ;AP22383_(4_{[節(jié) 基（甲基）氨基]甲基}_苯基）-6,7_二甲氧基-2H-2-苯并吡喃酮|3-(4-{[節(jié)基（甲 基）氨基]甲基}苯基）-6, 7-二甲氧基-2H-苯并卩比喃-2-酮）（3-(4-{[Benzyl (methyl) amino]methyl}-phenyl)-6, 7-dimethoxy-2H-2-chromenone|3- (4- {[benzyl (methyl) amino]methyl}phenyl)_6, 7-dimethoxy-2H-chromen-2_one)) (21. 70nm 的 Ki);他克林二 聚體4i (N-(1，2, 3, 4-四氫吖啶-9-基）-N-[8-(1，2, 3, 4-四氫吖啶-9-基）辛基-I-基] 胺 |N-[8-(l，2, 3, 4-四氫吖啶-9-基）辛基]-1，2, 3, 4-四氫吖啶-9-胺（N-(l，2, 3, 4-T etrahydroacridin-9-yl)-N-[8_(1，2, 3, 4-tetrahydroacridin_9-yl)oct-1-yl]amine IN-[8_(1，2, 3, 4-tetrahydroacridin_9-yl)octyl]-l，2, 3, 4-tetrahydroacridin-9_amine)) (30nm的Ki);他克林異型二價(jià)化合物3g(6, 8-二氯-N-[7-(l，2, 3, 4-四氫吖啶-9-基磺 酉先基）庚基]_1，2, 3, 4_ 四氧 R丫陡 _9_ 胺（6, 8-dichloro_N-[7-(l，2, 3, 4-tetrahydroacr idin_9-ylsulfanyl)heptyl]-l，2, 3, 4-tetr ahydroacridin-9_amine)) (41nm 的 Ki);他 克林二聚體4m(N-[3-(l，2,3,4-四氫吖啶-9-基氨基）丙基]-N-[4-(l，2,3,4-四氫吖 P定-9-基橫酉先基）丁基]乙酉先胺（N-[3-(l，2,3,4-Tetrahydroacridin-9_ylamino)propyl ]-N-[4-(1, 2, 3, 4-tetrahydroacri din-9-ylsulfanyl)butyl]acetamide))(47nm 的 Ki)； 9-氨基-6-氯-2-甲氧基 R丫陡（9-Amin〇-6-Chlor〇-2_Methoxyacridine) (6-氯-2-甲 氧基卩丫陡-9-胺（6-chlor〇-2-methoxyacridin-9_amine)) (49nm 的 Ki);他克林二聚體 4k(N-[3-(l，2, 3, 4-四氫吖啶-9-基氨基）丙基]-N-[3-(l，2, 3, 4-四氫吖啶-9-基磺酰 基）丙基]乙酉先胺（N-[3-(l，2,3,4-Tetrahydroacridin-9-ylamino)propyl]-N-[3_(l，2,3 ，4_tetrahydroacri din_9-ylsulfanyl)propyl]acetamide)) (50nm 的 Ki);他克林異型二 價(jià)化合物3i (N-[6-(1，2, 3, 4-四氫吖啶-9-基磺?；┘夯鵠-1，2, 3, 4-四氫吖啶-9-胺 (N-[6-(l, 2, 3, 4-tetrahydroacridin-9-ylsulfanyl)hexyl]-I,2,3,4-tetrahydroacr idin-9-amine)) (IOOnm 的 Ki);他克林同型二價(jià)化合物 3b (6, 8-二氯-N- {7- [ (6, 8-二 氯-1，2, 3, 4-四氫吖啶-9-基）氨基]庚基}-1，2, 3, 4-四氫吖啶-9-胺（6, 8-dichlOT 〇-N-{7_[ (6, 8_dichlor0-l，2, 3, 4-tetrahydroacridin_9-yl) amino]heptyl} _1，2, 3, 4_t etrahydroacridin-9-amine)) (150nm 的 Ki);他克林二聚物 3a(N_[5_(l，2, 3, 4_ 四氫口丫 P定-9_ 基氨基）戊基]-1，2, 3, 4-四氫R丫陡-9-胺（?^-[5-(1，2,3,4-七6奸&117(11'0&。1'1(1;[11-9-ylamino)pentyl]-l，2,3,4-tetrahydroacridin-9-amine)) (210nm 的 Ki);他克林二聚 物4g(N-[8-(l，2,3,4-四氫吖啶-9-基磺?；┬粱鵠_1，2,3,4_四氫吖啶-9-胺（N-[ 8_(1，2, 3, 4-tetrahydroacridin_9-ylsulfanyl)octyl]-l，2, 3, 4-tetrahydroacridin_9 -amine)) (250nm 的 Ki);他克林異型二價(jià)化合物 3f (N-{7-[(6, 8-二氯-1，2, 3, 4-四氫吖 啶-9-基）磺?；鵠庚基}_1，2, 3, 4-四氫吖啶-9-胺（^{7-[(6,8-沿吐101'0-1，2,3,4-tetrahydroacridin-9-yl)sulfanyl]heptyl}_1，2, 3, 4_te trahydroacridin-9-amine)) (290歷的燈）；基于1，2-二酮的化合物，8(1，2-二氫化萘-1，2-二酮|1，2-萘醌）（320馗 的Ki);他克林二聚體4f(N-[7-(1，2, 3, 4-四氫吖啶-9-基磺?；└鵠-1，2, 3, 4-四氫 口丫陡-9-胺 I 他克林異型二價(jià)化合物 3e(N_[7_(l，2, 3, 4-tetrahydroacridin_9-ylsulfa nyl)heptyl]_1，2, 3, 4-tetrahydroacridin-9_amineI tacrine heterobivalent compound 3e)) (340nm 的 Ki);以及 6, 9_ 二氨基-2-乙氧基R丫陡（6, 9-Diamin〇-2_Ethoxyacridine) (7-乙氧基R丫陡 _3, 9_ 二胺（7-ethoxyacridine_3, 9-diamine)) (490nm 的 Ki)。這里公開(kāi)的 對(duì)于前述AchE抑制劑的Ki值在杰瑪（Gemma)等人發(fā)表在藥物化學(xué)雜志49:3421-5(2006)、 坎佩尼（Campiani)等人發(fā)表在藥物化學(xué)雜志48:1919-29(2005)、王（Wong)等人發(fā)表在美 國(guó)化學(xué)會(huì)志（J. Am. Chem. Soc. ) 125:363-73(2003)、薩維尼（Savini)等人發(fā)表在生物有機(jī) 化學(xué)與醫(yī)藥化學(xué)通訊（Bioorg. Med. Chem. Lett. ) 11:1779-82 (2001)、皮亞齊（Piazzi)等人 發(fā)表在藥物化學(xué)雜志46:2279-82(2003)、上述的本查瑞特的文章以及海特（Hyatt)等人發(fā) 表在藥物化學(xué)雜志50:5727-34(2007)的文章中進(jìn)行了報(bào)導(dǎo)。
[0059] 可以在本發(fā)明中有用的AChE抑制劑的另外的示例包括如下：有機(jī)磷酸酯（例如 敵百蟲、二乙氧膦酰硫膽堿、二異丙基氟磷酸鹽、環(huán)沙林、樂(lè)果、沙林、索曼、塔崩、VX、VE、VG、 VM、地亞農(nóng)、馬拉息昂和柏拉息昂）；氨基甲酸鹽（例如毒扁豆堿、新斯的明、吡斯的明、安貝 氯銨、地美卡林、利凡斯的明、涕滅威、惡蟲威、合殺威、胺甲萘、多菌靈、長(zhǎng)殺草、呋喃丹、氯 草靈、氯苯胺靈（Chloropropham)、殺蟲丹、伐蟲脒、滅蟲威、滅多威、殺線威、苯敵草、抗姆威 (Pinmicarb)、抗姆威（抗姆威）、霜霉威、苯胺靈和殘殺威）；菲衍生物（例如加蘭他敏）； 哌啶（例如多奈哌齊（E2020) (2. 9nm的Ki));騰喜龍；以及天然化合物（例如加蘭他敏和 昂池多（Onchidal))。
[0060] 由于一些BChE抑制劑還顯示出有效的AChE抑制活性，所以本發(fā)明的實(shí)施例可以 包括擁有BChE和AChE抑制活性的單個(gè)酯酶抑制劑。
[0061] 可以存在于血液采集裝置中的附加的血清酯酶抑制劑的濃度總體上從大約 0. I U M到大約70mM的范圍，并且在一些實(shí)施例中，從大約ImM到大約7mM的范圍。
[0062] 在另一實(shí)施例中，混合物包括絲氨酸蛋白酶和例如半肽氨酸蛋白酶抑制劑這樣的 至少一種其他種類的蛋白酶抑制劑，和/或至少一種酯酶抑制劑。血液穩(wěn)定劑（例如抗凝 齊U、抗血小板藥物和任何附加的血液穩(wěn)定劑）和增溶劑（全體被稱為"穩(wěn)定劑"）可以以任 何合適的形式存在于裝置中，這些形式包括液體（例如溶液和懸浮液）和固體（例如丸、片 齊U、膠囊、噴霧干燥材料、冷凍干燥材）料（freeze dried material、粉末、顆粒、結(jié)晶體和 凍干材料（lyophilized material))以及半固體（例如膠體）。凍干會(huì)是尤其有用的，因 為其提供良好的穩(wěn)定性（例如就最大化穩(wěn)定劑的保存期限而言）并且還允許隨后的滅菌。 例如，可以將穩(wěn)定劑以液相成分（liquid composition)的形式引入到裝置的容器中，然后 采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)使穩(wěn)定劑凍干。冷凍干燥例如需要使液相成分冷凍，然后在冷凍之后緩慢加 溫，在此期間同時(shí)應(yīng)用真空，使得冷凍干燥的粉末保持在采集裝置中?？梢詫⒗鏟VP或海 藻糖這樣的各種添加劑在冷凍干燥之前添加到液相組分中以促進(jìn)穩(wěn)定劑的微粒化以及當(dāng) 與血液接觸時(shí)凍干劑的重新構(gòu)建。真空干燥還可以用在添加液相組分之后。在其他實(shí)施例 中，穩(wěn)定劑形成為液體或固體氣溶膠并噴在容器內(nèi)部的一個(gè)或多個(gè)表面上。以片劑的形式 封裝或配制穩(wěn)定劑保護(hù)其免受曝光并阻止抑制劑和容器里的其他組成部分之間的其他不 需要的相互作用。制作片劑和膠囊有用的、當(dāng)樣品采集時(shí)溶解的封裝材料和賦形劑是所屬

【技術(shù)領(lǐng)域】眾所周知的。
[0063] 除了設(shè)置在貯存部中以外，穩(wěn)定劑可以設(shè)置在接觸采集的血液的采集裝置的任何 表面上。例如，穩(wěn)定劑還可以設(shè)置在用于封閉裝置的塞子和密封物上，或者設(shè)置在機(jī)械部件 上，或者設(shè)置在放置在裝置內(nèi)的其他插入物上。
[0064] 除了穩(wěn)定劑以外，本發(fā)明的裝置還可以包含載體介質(zhì)（例如水或乙醇）、穩(wěn)定或重 新構(gòu)建介質(zhì)（例如聚乙烯吡咯烷酮、海藻糖、甘露醇等）和/或在血液和血漿采集領(lǐng)域有用 的一種或多種其他添加劑，他們對(duì)于肽和蛋白質(zhì)是實(shí)質(zhì)上惰性的。典型的添加劑包括苯酚、 苯酚/氯仿混合物、醇、醛、酮、有機(jī)酸、有機(jī)酸的鹽、鹵化物的堿金屬鹽、有機(jī)螯合劑、熒光 染料、抗體、粘合劑、抗氧化劑、還原劑和緩沖劑。在抑制劑是片劑形式的情況下，若需要，可 以包括所屬【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員公知的藥物片劑粉碎材料。
[0065] 用于本發(fā)明的裝置的有用的制造過(guò)程包含：獲得例如管這樣的采集溶劑；通過(guò)將 添加劑的溶液或懸浮液噴到容器中的過(guò)程將抗凝劑、抗血小板藥物、增溶劑和任何其他穩(wěn) 定劑添加到容器中，然后通過(guò)強(qiáng)制通風(fēng)干燥去除溶劑?？梢栽谟袡C(jī)溶劑或者最好是水中配 制添加劑的溶液或懸浮液。作為選擇，凍干可以用于去除溶劑。然后對(duì)容器進(jìn)行抽空和滅 菌。若需要，分離部件可以增加到容器中。合適的凍干/抽空過(guò)程的示例如下：在大約760_ 的壓力、大約40°C的溫度下冷凍容器大約6到8小時(shí)；當(dāng)溫度從40°C增加到大約25°C時(shí)在 大約0. 05mm的壓力下干燥容器大約8到10小時(shí)；然后在大約25°C的溫度和大約120mm的 壓力下抽空容器大約0. 1小時(shí)。滅菌技術(shù)最好是利用鈷60輻射。
[0066] 其包含全血或全血漿的成分可以在沒(méi)有任何干預(yù)過(guò)程步驟的情況下從患者直接 取回到血液采集裝置中。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)直接從患者采集全血以及將樣品直接引入包含穩(wěn)定劑的 裝置中實(shí)質(zhì)上阻止了在將樣品與穩(wěn)定劑結(jié)合之前存儲(chǔ)樣品時(shí)在其他方面出現(xiàn)的蛋白質(zhì)的 活化。本發(fā)明的方法在敞開(kāi)式采集裝置和其中開(kāi)口被閉合裝置封閉的封閉式采集裝置中都 是有用的。
[0067] 在優(yōu)選實(shí)施例中，采集裝置是用于直接從患者抽取全血樣品的、用于將要采集時(shí) 立即穩(wěn)定血小板的管。采集管可以是用于采集血液的抽空系統(tǒng)。作為選擇，管可以是用于 采集血液的部分抽空或非抽空系統(tǒng)（例如毛細(xì)采集管）。抽空系統(tǒng)的合適的示例是閉管 (closed tube)。手動(dòng)式注射器抽取是部分抽空和非抽空系統(tǒng)的合適的示例。非抽空系統(tǒng) 還可以包括自動(dòng)抽取系統(tǒng)。抽空系統(tǒng)是尤其優(yōu)選的。
[0068] 利用本發(fā)明采集的其包含血液或血小板的部分然后可以進(jìn)行許多臨床分析。
[0069] 例如，血液學(xué)包含血細(xì)胞或他們的構(gòu)成部分--例如血紅素--的分析。最常進(jìn) 行的試驗(yàn)是全部血球數(shù)（CBC)，也稱為全血計(jì)數(shù)（FBC)。在實(shí)踐中，不同復(fù)雜性的血液分析 儀("血細(xì)胞計(jì)數(shù)器")在所有但最小的血液學(xué)實(shí)驗(yàn)室中用于細(xì)胞計(jì)數(shù)。除了提供細(xì)胞計(jì)數(shù)和 恢復(fù)的信息的圖形顯示以外，這些儀器還提供發(fā)現(xiàn)非典型細(xì)胞的警告（"標(biāo)志（flag)"）并 提供該異常的假定識(shí)別。血小板凝集會(huì)導(dǎo)致自動(dòng)血液儀器上的錯(cuò)誤地降低的血小板結(jié)果， 這被典型地編程為提醒操作者警惕凝集的樣品（這些算法不一定總是適當(dāng)?shù)仄鹱饔玫模?在這種情況下，血液涂片在顯微鏡下檢查凝集的存在。如果需要準(zhǔn)確的血小板計(jì)數(shù)，則新鮮 的血液樣品在相同的抗凝劑（EDTA)或檸檬酸鹽中從患者那里獲得。多達(dá)10%的采集到只 有EDTA中的臨床血液試樣具有相同程度的血小板凝集。外周血液涂片包含外周血液的顯 微鏡檢查以補(bǔ)充由自動(dòng)血液分析儀提供的信息。血液學(xué)也慣常地用在獸醫(yī)學(xué)中以評(píng)估動(dòng)物 和家禽的健康狀態(tài)，并且EDTA是哺乳動(dòng)物中血液學(xué)的抗凝劑的選擇。然而，確定準(zhǔn)確的血 小板計(jì)數(shù)往往受血小板的顯著聚集和受太大而不能進(jìn)行計(jì)數(shù)的血小板的存在的不利影響， 尤其是當(dāng)使用阻抗類型血液分析儀時(shí)。本發(fā)明可以用來(lái)減少血小板凝集的發(fā)生率。因此， 在這些背景下的本發(fā)明的使用將是有利的。
[0070] 血漿蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域通過(guò)對(duì)與病情的診斷相關(guān)的或者是病情的診斷的血清/血 漿中的蛋白質(zhì)或肽的識(shí)別得到發(fā)展。從監(jiān)控對(duì)治療的反應(yīng)的角度來(lái)看，測(cè)量這些生物標(biāo)記 的存在或水平也會(huì)是臨床上有利。這些生物標(biāo)記易受系統(tǒng)的內(nèi)源蛋白酶降解的影響，幾乎 從循環(huán)系統(tǒng)中立即去除。由于其螯合作用，EDTA是血漿蛋白質(zhì)組學(xué)的抗凝劑的選擇。然而， 由EDTA介導(dǎo)的血小板的自發(fā)活化可以導(dǎo)致體外（ex vivo)蛋白質(zhì)降解并引起血漿樣品中 的明顯的以及多個(gè)肽信號(hào)。利用本發(fā)明的血液的穩(wěn)定性可以減少由蛋白酶酵素催化的生物 標(biāo)記的降解量。
[0071] 包含在血小板a -顆粒中的許多因子涉及創(chuàng)面修復(fù)、凝血和炎癥，這些因子例如 TGFP 1、TOGF、纖連蛋白、￠-血小板球蛋白、vWF、纖維蛋白原、FV和FXIII。這些因子中 的一些的準(zhǔn)確測(cè)量具有重要的臨床結(jié)果。例如，包括冠狀動(dòng)脈疾病和惡性腫瘤的TGF3 1 的測(cè)量會(huì)被血液采集和/或血漿制備過(guò)程中不受控制的血小板TGFP 1的體外釋放混淆， 其中，在人類疾病中已經(jīng)報(bào)導(dǎo)TGFPl的升高的水平（邁耶（Meyer)等人發(fā)表在血液雜志 (Blood) 119:1064-74(2012)中）。
[0072] 除了他們的止血活性以外，血小板還起提高免疫力和引起炎癥的細(xì)胞的作用（森 普爾（Semple)等人發(fā)表在自然免疫學(xué)評(píng)論（Nat. Rev. Immunol.) 11:264-74 (2011)中）。血 小板的促炎癥反應(yīng)活性通過(guò)多種機(jī)能發(fā)生，這些機(jī)能包括受體介導(dǎo)交叉對(duì)話與不同細(xì)胞的 活化，以及存儲(chǔ)在他們的顆粒中的有效的生物活性介體的釋放。當(dāng)活性細(xì)胞相應(yīng)地使血小 板活化時(shí)，該相互作用是雙向的。這擴(kuò)大了某些細(xì)胞因子、趨化因子和生長(zhǎng)因子的水平，這 樣分析，使得他們不再反映存在于體循環(huán)中的實(shí)際量。例如，與T-細(xì)胞的相互作用（通過(guò) CD40-CD40L)導(dǎo)致血小板活化并觸發(fā)顆粒狀的RANTES的釋放、急性和慢性炎癥的介體（丹 尼斯（Danese)等人發(fā)表在免疫學(xué)雜志（J. Immunol.) 172:2011-5 (2004)中）。因此，當(dāng)用于 細(xì)胞因子測(cè)量時(shí)，EDTA-抗凝的血液應(yīng)當(dāng)盡快得到處理，以便避免由血小板活化引起的假性 釋放。本發(fā)明的裝置的使用降低了假性釋放的發(fā)生率。
[0073] 血庫(kù)一每年輸數(shù)百萬(wàn)的血液制品；許多生命因此直接關(guān)注輸血。用在輸血中的 三個(gè)主要的不穩(wěn)定的血液制品是紅細(xì)胞濃縮液、血小板濃縮液和新鮮冷凍的血漿。來(lái)自全 血捐獻(xiàn)的血液制品制備的標(biāo)準(zhǔn)程序如下：一俟采集到包含枸櫞酸磷酸葡糖（CPD)抗凝劑的 塑料袋中，就使全血離心分離，以便根據(jù)他們的尺寸和密度分離血細(xì)胞。紅血球（RBC)下 沉，而血漿保持在上部。白血球和血小板（PLT)在分界面形成"血沉棕黃層"。最后，通過(guò)對(duì) 包含原來(lái)的全血捐獻(xiàn)的離心包施加半自動(dòng)壓力，三種成分分布在無(wú)菌互相連接的血袋中。
[0074] 實(shí)際上，由于白細(xì)胞可以是包含病原體的細(xì)胞，血液制品系統(tǒng)化地白細(xì)胞耗盡。然 而，在存儲(chǔ)的過(guò)程中，那些成分的變異或退化會(huì)發(fā)生，并且被稱為存儲(chǔ)損傷。對(duì)于RBC，存儲(chǔ) 引起生物力學(xué)改變，影響流變性能（形變、變形性、聚集率和細(xì)胞內(nèi)粘度）并且影響蛋白質(zhì) 的氧化態(tài)。血小板存儲(chǔ)損傷（PSL)包含形態(tài)學(xué)改變、血小板活化、血小板蛋白質(zhì)水解和血小 板表面受體表達(dá)。血小板膜糖蛋白的改變已經(jīng)進(jìn)行了報(bào)導(dǎo)。在PLT存儲(chǔ)過(guò)程中發(fā)生顆粒 釋放和血小板活化，如分別由存儲(chǔ)介質(zhì)中的P -血小板球蛋白和血小板因子4的積聚以及 P-選擇素（⑶62P)的表面水平的增加所表明的那樣。因此，體內(nèi)血液老化以及體外不穩(wěn)定 的血液制品存儲(chǔ)損傷的生物標(biāo)記發(fā)現(xiàn)對(duì)輸血醫(yī)療社區(qū)來(lái)說(shuō)是高利的。所有這些血液相關(guān)的 研究會(huì)受到例如抗凝劑的選擇這樣的預(yù)分析的沖擊。根據(jù)本發(fā)明通過(guò)緩解血小板活化，血 液存儲(chǔ)損傷得到降低甚至消除，這保留了不穩(wěn)定的生物標(biāo)記的品質(zhì)并確保輸血治療的有效 性。
[0075] 富含血小板血漿（PRP)是自體血小板的集中來(lái)源并且包含若干不同的增長(zhǎng)因子 和刺激骨頭和軟組織的復(fù)原的其他細(xì)胞因子。PRP用在若干醫(yī)學(xué)應(yīng)用中，這些醫(yī)學(xué)應(yīng)用包括 矯形術(shù)和運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)，或心臟、整形和口腔外科。PRP制備包含全血到基于檸檬酸鹽的抗凝劑 中的采集、PRP部分和活化的分離以便釋放刺激復(fù)原過(guò)程的因子。治療的PRP通過(guò)大致超過(guò) 基線五倍來(lái)濃縮血小板（奧爾諾茨基（Arnoczky)發(fā)表在美國(guó)體育醫(yī)學(xué)雜志（Am. J. Sports Med. )39:NP8-9(2011)中）。在體育醫(yī)學(xué)中的手術(shù)方法）。然而，血小板濃縮技術(shù)的變化 性會(huì)改變血小板脫粒特性并影響臨床結(jié)果?？鼓齽┑慕巧戎匾?yàn)槠浔仨氈С盅?板的新陳代謝需要并使血小板以未損壞的方式可行的分離。盡管在較小程度上，檸檬酸鹽 抗凝劑也公知為誘導(dǎo)人工血小板活化（阿納迪（Ahnadi)等人發(fā)表在血栓形成與止血雜志 (Thromb. Haemost. )90:940-8(2003)中），但根據(jù)本發(fā)明的人工血小板活化的緩解保留了 PRP樣品的品質(zhì)并確保治療的有效性。
[0076] 基于細(xì)胞的免疫療法已經(jīng)得到證明對(duì)一些癌癥有效并利用例如淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì) 胞、樹(shù)突細(xì)胞等等這樣的免疫效果細(xì)胞。免疫療法的活性劑共同地稱為免疫調(diào)節(jié)劑并且表 示很多不同的重組體、合成和天然制劑，常常是細(xì)胞因子或趨化因子，例如CCL3。也稱為巨 噬細(xì)胞炎癥蛋白-I a (MIP-1 a )的CCL3涉及康復(fù)中的急性炎癥狀態(tài)和多形核白細(xì)胞的活 化，并且還可以從活化的血小板中釋放。通過(guò)本發(fā)明的使用緩和人工血小板活化降低甚至 消除了為治療而準(zhǔn)備的細(xì)胞制劑中的這些免疫調(diào)節(jié)劑的釋放。
[0077] 微粒子（MP)是當(dāng)活化時(shí)從多種細(xì)胞中釋放的小（?0. I ii m)膜囊（membrane vesicle)。在血液中檢測(cè)到的絕大多數(shù)MP源于血小板，但例如白血球、紅血球、內(nèi)皮細(xì)胞以 及甚至惡性細(xì)胞這樣的其他血細(xì)胞也會(huì)流出MP (袁娜（Yuana)等人發(fā)表在血栓與凝血雜志 (Thromb. Haemost.) 105:396 - 408(2011)中）。MP的血漿水平在許多病理狀態(tài)下升高，這些 病理性狀態(tài)包括血管病變、癌癥和自身免疫?。游鱽啠℅arcia)等人發(fā)表在蛋白質(zhì)組研究 雜志（J. Proteome Res.) 4:1516-1521 (2005)中）。因此，存在對(duì)MP在生理和病理中的作用 的研究的日益增長(zhǎng)的興趣。然而，各個(gè)研究使用非常多種的預(yù)分析和分析程序，所有都會(huì)影 響MP測(cè)量的結(jié)果。在血液采集過(guò)程中，有必要防止體外血小板活化，因?yàn)檠“寤罨瘜?dǎo) 致阿爾法和致密顆粒以及血小板MP的釋放。因此，在該背景下本發(fā)明的使用將也顯示出優(yōu) 越性。
[0078] 現(xiàn)在將通過(guò)以下非限制性示例描述本發(fā)明。
[0079] 示例1--伊洛前列素抑制EDTA介導(dǎo)的自發(fā)性血小板脫粒
[0080] 血小板活化會(huì)導(dǎo)致a -顆粒、致密顆粒和溶酶體的穩(wěn)健且快速的釋放，其含量用 來(lái)促進(jìn)各種自分泌和旁分泌信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件。⑶62P(P_選擇素）是粘附分子，在a顆粒釋 放之后其短暫地表達(dá)在血小板質(zhì)膜上并且其可以通過(guò)與白細(xì)胞表達(dá)的P-選擇素糖蛋白配 體I (PSGL-1/⑶162)的連接來(lái)介導(dǎo)血小板-白細(xì)胞聚集體。盡管與⑶63表面表達(dá)沒(méi)有區(qū) 另Ij，但可以測(cè)量致密顆粒和溶酶體釋放。之前的研究顯示ETDA誘導(dǎo)⑶62P和⑶63的表面 表達(dá)。
[0081] 如通過(guò)⑶62P和⑶63表面表達(dá)判斷的EDTA對(duì)血小板活化的影響在存在或缺少血 小板穩(wěn)定劑（伊洛前列素）的情況下進(jìn)行評(píng)估。以〇. 5、5和50 y M的最終濃度將全血采集 到包含EDTA或EDTA連同伊洛前列素的管中。將包含之前確定的量的a⑶61PerCP(多甲藻 黃素-葉綠素-蛋白質(zhì)復(fù)合物）、a⑶62P PE、a⑶63Alexa Fluor? 647和/或合適的同型 對(duì)照的抗體混合物加入錐形底微量滴定板上。對(duì)于每一個(gè)染色反應(yīng)，改良的JEPES-蒂羅德 (HEPES-Tyrode)的緩沖液用于使最終體積平衡到100 ii L。血小板表面染色通過(guò)將5 ii L的 全血加入合適的染色混合物中并且在黑暗條件下、在室溫下培養(yǎng)15分鐘。然后，整個(gè)反應(yīng) 轉(zhuǎn)移到包含ImL的HEPES-蒂羅德的緩沖液的5mL圓底聚苯乙烯彈扣蓋管（snap cap tube) 中用于每一個(gè)樣品的最終稀釋。使樣品短暫地渦旋并且利用BD流式細(xì)胞儀（FACScalibur instrument)獲取數(shù)據(jù)。為了從RBC和WBC群體中分辨血小板大小和形態(tài)，按照對(duì)數(shù)標(biāo)尺 (log scale)建立FSC和SSC設(shè)置。為了進(jìn)一步分辨血小板特異性事件，PerCP單獨(dú)對(duì)照用 于建立CD61+門。由于CD63不是血小板特異性標(biāo)記，所以其需要在單個(gè)血小板形態(tài)種群上 進(jìn)一步畫門以避免來(lái)自血小板結(jié)合的白細(xì)胞的⑶63識(shí)別標(biāo)志。PerCP單獨(dú)對(duì)照還用于為 ⑶62P-/⑶63-種群設(shè)置突光檢測(cè)器電壓。一俟電壓和補(bǔ)償設(shè)置完成，對(duì)于每一個(gè)試驗(yàn)樣品， 獲得10, 000⑶617單個(gè)血小板事件。
[0082] 如圖2A和B所示，以0. 5、5和50 ii M的滴定量增加伊洛前列素使⑶62P表達(dá)的頻 率從44. 7%分別下降到15. 0%、14. 1%和13. 9%。盡管利用任何濃度的伊洛前列素沒(méi)有消 除⑶62P表達(dá)，但中值PE熒光從只有EDTA的情況的44. 7沿著滴定曲線下降到7. 31、7. 12 和7. 06,表明表達(dá)水平在伊洛前列素處理的樣品中剩余的⑶62P+血小板中較低。
[0083] 示例2--伊洛前列素抑制EDTA中對(duì)于a -顆粒和對(duì)于致密/溶酶體釋放的激動(dòng) 劑誘導(dǎo)血小板脫粒。
[0084] 在強(qiáng)血小板活化劑、ADP和凝血酶受體活化肽（TRAP)存在的情況下研究伊洛前列 素對(duì)血小板活化的影響。通過(guò)將300 ii L血液添加到包含10 ii L的鹽水（0. 85% )、ADP或 TRAP-6的微型離心管中并且在室溫下培養(yǎng)大約2分鐘來(lái)完成血小板刺激。ADP和TRAP-6 的最終濃度分別是6. 5 ii M和32 ii M。之后，如上所述完成全血流式細(xì)胞術(shù)。如示例1中所 述完成血液采集和流式細(xì)胞術(shù)。
[0085] ADP的添加使CD62P表達(dá)從只有EDTA的情況下（不活躍樣品（resting sample)) 的44. 6%增加到85. I %，而TRAP活化達(dá)到99. 4% (圖3A)。在添加0. 5 ii M的伊洛前列 素的情況下，伊洛前列素的添加導(dǎo)致不活躍樣品中⑶62P的表達(dá)降至15.0%并且在ADP 或TRAP活化樣品中降至17. 3 %或33. 4%。表達(dá)對(duì)于不同的伊洛前列素濃度保持完全一 致。對(duì)于⑶63 (圖3B)，ADP的添加導(dǎo)致與未刺激的情況相比（2. 13% )表面表達(dá)的邊際增 加（7. 67% )。伊洛前列素的添加使未刺激的和ADP刺激的⑶63表達(dá)降低至從1. 17%到 1. 30%的范圍，有效地阻礙了 ADP反應(yīng)。利用TRAP的刺激產(chǎn)生了穩(wěn)健的向上調(diào)節(jié)的⑶63 表達(dá)至69. 3%，在添加伊洛前列素的情況下，其降低到4. 3%到5. 2%的范圍。同時(shí)，響應(yīng)于 ADP或TRAP的⑶62P和⑶63的結(jié)合的向上調(diào)節(jié)通過(guò)伊洛前列素的添加得到顯著地降低。
[0086] 示例3--伊洛前列素抑制滿24小時(shí)的樣品保壓（sample dwell)的EDTA介導(dǎo)脫 粒。
[0087] 如圖4A所示，如示例1中所述在樣品保壓的t = 0、2、8和24小時(shí)分析⑶62P的 表達(dá)。圖4B表示在每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)、每一種情況的CD62+事件的百分比，所示為對(duì)于10位受 試者的平均土SD。以下表格表示在每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)于10位受試者的所有血小板事件的中 值熒光強(qiáng)度。
[0088]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于采集血液或血漿和使血液或血漿穩(wěn)定的裝置，其特征在于，包含第一端和 第二端以及至少一個(gè)限定用于容納全血或全血漿的貯存部的內(nèi)壁，并且該裝置包含抗凝 齊IJ、抗血小板藥物和增溶劑，其中抗血小板藥物包含前列腺素、環(huán)前列腺素、磷酸二酯酶抑 制劑、環(huán)氧化酶抑制劑或者他們的兩種或更多種的組合，并且其中抗凝劑和抗血小板藥物 每一個(gè)以使血液或血漿穩(wěn)定的量存在。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于，抗凝劑選自由EDTA或其鹽、草酸鹽、檸檬 酸鹽、肝素，檸檬酸鹽、茶堿、腺苷和潘生丁的組合物（CTAD)、聚茴香磺酸鈉、枸櫞酸葡萄糖 以及他們的兩種或更多種的組合構(gòu)成的群組。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于，抗凝劑相對(duì)于采集到裝置中的血液量或 血漿量以大約1 mM到大約200 mM的濃度存在。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于，抗血小板藥物是前列腺素。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的裝置，其特征在于，前列腺素包含前列腺素 E1、前列腺素 E2 或他們的組合。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于，環(huán)前列腺素包含卡巴前列環(huán)素、貝前列 腺素、伊洛前列素、5, 6-二氫環(huán)前列腺素、西前列烯、利馬前列素、13, 14-脫氫-15-環(huán)己基 卡巴前列環(huán)素、他前列烯，和/或他們的兩種或更多種的組合。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于，抗血小板藥物包含伊洛前列素。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于，抗血小板藥物相對(duì)采集到裝置中的血液 量或血漿量以大約1 X 1(T1CI到大約1 X ΚΓ1 Μ的濃度存在。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于，抗血小板藥物相對(duì)于采集到裝置中的血 液量或血漿量以大約1 X ΚΓ7到1 X 1(Γ5 Μ的濃度存在。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于，磷酸二酯酶抑制劑選自由ΜΕΡ-1、米力 農(nóng)、西洛酰胺、潘生丁、敏喘寧和ΙΒΜΧ以及他們的兩種或更多種的組合構(gòu)成的群組。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于，環(huán)氧化酶抑制劑是非留類消炎劑。
12. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的裝置，其特征在于，非甾類消炎劑選自由阿司匹林、消炎 痛、布洛芬、萘普生、美洛昔康、雙氯芬酸、吡羅昔康、替諾昔康、替尼達(dá)普以及他們的兩種或 更多種的組合構(gòu)成的群組。
13. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于，增溶劑選自由聚乙二醇（PEG)、單甲氧 基聚乙二醇（MPEG)、PEG脂質(zhì)、白蛋白、牛血清白蛋白（BSA)和環(huán)糊精構(gòu)成的群組。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的裝置，其特征在于，增溶劑是環(huán)糊精。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的裝置，其特征在于，環(huán)糊精是2-羥丙基-β -環(huán)糊精。
16. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于，抗凝劑、抗血小板藥物和增溶劑設(shè)置在 裝置的貯存部中。
17. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于，抗凝劑設(shè)置在裝置的內(nèi)壁的至少一部 分上。
18. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于，抗凝劑、抗血小板藥物和增溶劑通過(guò)噴 涂應(yīng)用設(shè)置在裝置中或者以粉末、結(jié)晶、凍干或液體形式設(shè)置在裝置中。
19. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于，進(jìn)一步包含蛋白酶抑制劑或一種或多 種蛋白酶抑制劑的混合物。
20. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于，內(nèi)壁包含塑料或玻璃。
21. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于，進(jìn)一步包含分離部件。
22. 根據(jù)權(quán)利要求21所述的裝置，其特征在于，分離部件包含觸變膠體組分。
23. 根據(jù)權(quán)利要求21所述的裝置，其特征在于，分離部件包含機(jī)械分離部件。
24. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于，進(jìn)一步包含采集的血液或其包含血小 板的部分。
25. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于，裝置是至少部分抽空的。
26. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于，裝置已經(jīng)滅菌。
27. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于，裝置是管。
28. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的裝置，其特征在于，裝置是毛細(xì)采集管。
29. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的裝置，其特征在于，抗凝劑是EDTA、二鉀鹽，抗血小板藥物 是伊洛前列素，并且增溶劑是2-輕丙基-β -環(huán)糊精。
30. 根據(jù)權(quán)利要求29所述的裝置，其特征在于，進(jìn)一步包含蛋白酶抑制劑。
31. 根據(jù)權(quán)利要求30所述的裝置，其特征在于，蛋白酶抑制劑包含絲氨酸蛋白酶抑制 劑和不同種類的蛋白酶的抑制劑。
32. 根據(jù)權(quán)利要求1或30所述的裝置，其特征在于，進(jìn)一步包含酯酶抑制劑。
33. 根據(jù)權(quán)利要求31所述的裝置，其特征在于，進(jìn)一步包含兩種或更多種蛋白酶抑制 劑的混合物，其中混合物選自由以下述構(gòu)成的群組：a)絲氨酸蛋白酶的抑制劑和外肽酶的 抑制劑；b)絲氨酸蛋白酶的抑制劑和半胱氨酸蛋白酶的抑制劑；c)絲氨酸蛋白酶的抑制劑 和二肽基肽酶的抑制劑；d)絲氨酸蛋白酶的抑制劑、外肽酶的抑制劑、二肽基肽酶的抑制劑 和半胱氨酸肽酶的抑制劑；以及e)絲氨酸蛋白酶的抑制劑、外肽酶的抑制劑和二肽基肽酶 的抑制劑。
34. -種在存儲(chǔ)過(guò)程中使血液或血漿穩(wěn)定的方法，其特征在于，包含將全血或全血漿 采集到裝置中，其中裝置包含第一端和第二端以及至少一個(gè)限定用于容納全血或全血漿的 貯存部的內(nèi)壁，并且裝置包含抗凝劑、抗血小板藥物和增溶劑，其中抗血小板藥物包含前列 腺素、環(huán)前列腺素、磷酸二酯酶抑制劑、環(huán)氧化酶抑制劑或者他們的兩種或更多種的組合， 并且其中抗凝劑和抗血小板藥物每一個(gè)以使血液或血漿穩(wěn)定的量存在。
35. 根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其特征在于，血液或血漿直接采集到裝置中。
36. -種測(cè)量血液或血漿的參數(shù)的方法，其特征在于，包含a)將全血或全血漿采集到 裝置中，裝置包含第一端和第二端以及至少一個(gè)限定用于容納全血或全血漿的貯存部的內(nèi) 壁，并且裝置包含抗凝劑、抗血小板藥物和增溶劑，其中抗血小板藥物包含前列腺素、環(huán)前 列腺素、磷酸二酯酶抑制劑、環(huán)氧化酶抑制劑或者他們的兩種或更多種的組合，并且其中抗 凝劑和抗血小板藥物每一個(gè)以使血液或血漿穩(wěn)定的量存在；以及b)測(cè)量在采集之后的預(yù) 先確定時(shí)間的血液參數(shù)，以及使測(cè)量的血液參數(shù)和對(duì)照相關(guān)聯(lián)。
37. 根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，血液參數(shù)是血細(xì)胞計(jì)數(shù)。
38. 根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，血液參數(shù)是用于疾病或病理狀態(tài)的生 物標(biāo)記的存在或數(shù)量。
【文檔編號(hào)】A61M1/02GK104244902SQ201380016577
【公開(kāi)日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2013年2月1日 優(yōu)先權(quán)日:2012年2月2日
【發(fā)明者】蘭德?tīng)?艾倫.霍克, 賈斯蒂娜.杜道爾尼克, 基思.A.莫斯科維奇, 弗蘭克.市奈科特 申請(qǐng)人:Bd公司