含有蛋白酶抑制物的組合物、包含前者的組合物和用于產(chǎn)生和使用前者的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了用于口服施用治療性蛋白的方法和組合物、改善的蛋白酶抑制物制備物，用于產(chǎn)生前者的方法，和包含前者的組合物。
【專利說明】含有蛋白酶抑制物的組合物、包含前者的組合物和用于產(chǎn) 生和使用前者的方法
[0001] 本申請要求2012年2月1日提交的美國臨時申請61/632, 868和2012年3月6 日提交的美國臨時申請61/634, 753的權(quán)益，所述文獻通過引用方式完整并入本文。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本申請?zhí)峁┝擞糜诳诜┯弥委熜缘鞍椎姆椒ê徒M合物、改善的蛋白酶抑制物制 備物，用于產(chǎn)生所述組合物的方法，和包含所述組合物的組合物。

【背景技術(shù)】
[0003] 基于蛋白質(zhì)/肽的藥物一般易在胃腸道中降解和/或不被從小腸以生物活性形式 有效吸收到血流中。正在開發(fā)用于基于蛋白質(zhì)的藥物（如胰島素）的口服遞送制劑（Ziv等 人，1994 ;Nissan 等人，2000, Kidron 等人，2004, Eldor 等人，2010A，Eldor 等人，2010B)。 一種此類口服胰島素產(chǎn)品安排了 II期試驗的測試并且目前正在就IND狀態(tài)評審。
[0004] 源自大豆（Glycine max)的胰蛋白酶抑制物可容易獲得并且認為它們對人類消費 是安全的。所述胰蛋白酶抑制物包括由抑制胰蛋白酶的KTI (Kunitz胰蛋白酶抑制物）和 抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的BBI (Bowman-Birk抑制物）組成的SBTI (大豆胰蛋白酶抑 制蛋物）。這類胰蛋白酶抑制物可獲自，例如美國Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo.。用于制 備BBI的方法描述在，例如US7, 404, 973中。
[0005] 發(fā)明概述
[0006] 發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在藥物組合物中使用時，市售SBTI制備物產(chǎn)生高度可變的結(jié)果。 據(jù)推測，KTI和BBI的活性應(yīng)當是各自優(yōu)化的，以改善藥物組合物的活性。為此目的，從商 業(yè)來源獲得SBTI作為KTI和BBI的獨立制備物。但是，發(fā)現(xiàn)這些制備物均遭受另一種活性 污染。使問題復(fù)雜化的是，發(fā)現(xiàn)制備物，特別是在大規(guī)模制備物中，BBI活性存在明顯變異 性，這一點通過防止腸道酶降解蛋白質(zhì)（例如胰島素）的可變能力得到印證。
[0007] 因此，根據(jù)本申請描述的某些實施方案，開發(fā)了純化SBTI的改進方法，其中將每 種產(chǎn)物按其自身規(guī)格制備達到高水平活性，并且使高分子量（MW)雜質(zhì)的水平最小化。根據(jù) 其他實施方案，該方法避免使用PEG和第二色譜步驟并且以較高產(chǎn)率為特征。根據(jù)其他實 施方案，該產(chǎn)物特別合適用于藥物組合物（例如口服施用治療性蛋白的組合物）中。此外， 根據(jù)其他實施方案，KTI活動和BBI活性的完全分離允許更精確調(diào)節(jié)包含治療性蛋白和BBI 和/或KTI的藥物組合物的抗胰蛋白酶活性和抗胰凝乳蛋白酶活性，從而獲得藥物組合物 的更穩(wěn)健和/或可重復(fù)更高的體內(nèi)活性。
[0008] 進一步發(fā)現(xiàn)需要乳化劑以便利地制備含有肽/蛋白質(zhì)的藥物的大規(guī)模制備物。然 而，需要根據(jù)經(jīng)驗檢驗添加特定乳化劑是否可以在不影響制劑的口服功效情況下有效的防 止在基于油的制備物中的沉淀。所描述的其他實施方案因此涉及特定乳化劑或乳化劑組合 與改進的SBTI -起存在于含有治療性肽和治療性蛋白質(zhì)的基于油的藥物組合物中。
[0009] 術(shù)語"蛋白質(zhì)"和"肽"在本文中互換使用。除非明確地指出限制，否則這兩種術(shù) 語的任一個均不旨在對存在的氨基酸的數(shù)目加以限制。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0010] 以下圖是說明性例子并且不意在視為限制要求保護的發(fā)明。
[0011] 圖I. SBTI純化的流程圖。A. SBTI中間生產(chǎn)。B.產(chǎn)生BBI和KTI的下游純化。
[0012] 圖2.DEAE瓊脂糖凝膠?(S印harose?)柱分離的色譜圖。在DEAE柱洗脫期間收集 0. 3L級分。
[0013] 圖3.純化的BBI和KTI的SDS-PAGE分析。進行電泳，掃描凝膠，并且使用 ImageScanner?III 和 ImageQuant?TL(二者均來自 General Electric)定量條帶。將每毫 升1毫克（mg/ml)的樣品加載于20% Phastgel?上。泳道1 :對照（老舊SBTI制備物）。 泳道2 :純化的KTI，條帶量=100%。泳道3 :純化的BBI，下部條帶量=89. 2%，上部條帶 量=10. 8%。
[0014] 圖4.使用改進的流程的小規(guī)模柱層析運行報道。方框、圓圈和三角形分別表示電 導(dǎo)率曲線、pH和OD 28tl。垂直軸：電導(dǎo)率曲線（毫西門子）、pH和OD28tl (任意單位）。水平軸： 柱體積和級分編號。
[0015] 圖5.來自圖4中所示層析的級分的20% SDS-PAGE。A.從左至右顯示級分4-18 和匯集的級分5-11。"C"指現(xiàn)有技術(shù)的胰蛋白酶抑制物（Sigma-Aldrich目錄號T9003)。 B.從右至左顯示級分6-15,包括洗液+通流物（flowthrough) (W+FT)和標準物（來自大豆 (Glycine max)的胰蛋白酶抑制物；"ST"）。
[0016] 圖6.僅額外純化BBI的步驟的SDS-PAGE分析。ST =標準物（見圖5圖注），2mg/ ml。泳道：1 :來自柱的BBI匯集物。2 :30KDa過濾的滲透物。3 :1:40稀釋的30KDa過濾的 截留物質(zhì)。4:1:4稀釋的5KDa濃縮的截留物質(zhì)。
[0017] 圖7.僅純化BBI的lmg/ml終產(chǎn)物的SDS-PAGE分析。ST =標準物（見圖5圖 注），lmg/ml〇
[0018] 圖8.下游純化BBI和KTI的改進方案的流程圖。
[0019] 圖9.使用替代工序的柱層析運行報告。
[0020] 圖10.相對于標準物（通道3)，使用替代工序（泳道1-2)純化的BBI的兩份重復(fù) 樣品與標準物（泳道3)的SDS-PAGE分析。
[0021] 圖11.各種乳化劑制劑的檢驗結(jié)果。泡沫形成評分為1-5,其中1表示無泡沫，5 表示因泡沫而見不到液體。對于混懸試驗，數(shù)字1-5分別表示完全相分離；具有一些較大油 泡的部分相分離；小油泡，乳狀稠度；起初無泡，稍后相分離；和穩(wěn)定乳液。
[0022] 圖12.施用含有多種乳化劑的口服胰島素制劑后的血糖曲線。A.制劑A(左上）、 B(左下）、C(右上）和D(右下）。B.制劑E(左）和F(右）。
[0023] 圖13.患者記錄薄。A.血糖記錄。B.調(diào)查問卷。
[0024] 圖14.低血糖評審薄。對記錄的低血糖的每次出現(xiàn)給予分數(shù)，同時根據(jù)經(jīng)受的神 經(jīng)低血糖癥狀或缺少神經(jīng)低血糖癥狀給予額外的評分。癥狀的定義的例子如下：視覺，目艮 不能凝視、視力受損、復(fù)視；行為，不能睡眠、易怒、壓力大、神經(jīng)、"喜臥懶動（want to sit down and do nothing)";其他神經(jīng)學(xué)，頭暈、眩暈、虛弱、疲勞、犯困、行走或說話困難、反應(yīng) 遲緩、運動技巧遲緩、喪失平衡；意識模糊，不能進行簡單算術(shù)、感覺"寂寞"。即便也存在一 些神經(jīng)低血糖癥狀，但如果存在充分警示即將發(fā)生低血糖的自主癥狀，則不給予分數(shù)。對需 要外部幫助以確認或處理這個事件，給予額外分數(shù)。
[0025] 圖15.用各種劑量口服胰島素治療的受試者中的葡萄糖反應(yīng)。
[0026] 實施方案的具體描述
[0027] 在一個方面，提供從大豆產(chǎn)品分離的BBI，根據(jù)在多種實施方案中通過十二烷基硫 酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE)、亮藍染色或成像儀定量法的測量，其中所述BBI是 至少85%純的。在某些實施方案中，大豆產(chǎn)品是大豆粉。
[0028] 在又一個方面，提供從大豆粉分離的BBI，其中通過BCA (雙喹啉-4-羧酸）測定法 測量，BBI的蛋白質(zhì)含量大于95%。
[0029] 在又一個方面，提供從大豆粉分離的BBI，其中BBI含有小于0. 1 %的高分子量雜 質(zhì)，例如，通過SDS-PAGE和成像儀定量法所測定。
[0030] 在其他實施方案中，分離的BBI中存在的抗胰蛋白酶活性對抗胰凝乳蛋白酶活 性的比率在1.5:1和1:1之間，包括1.5:1和1:1。在更具體的實施方案中，該比率可 以在1. 4:1-1. 1:1之間，包括1. 4:1和1. 1:1。在更具體的實施方案中，該比率可以在 1. 35:1-1. 2:1之間，包括1. 35:1和1. 2:1。在更具體的實施方案中，該比率可以是1. 28:1。
[0031] 除非另外指明，否則將本文中提及的抗胰凝乳蛋白酶活性利用具有40BTEE單位/ mg胰凝乳蛋白酶活性的胰凝乳蛋白酶測量，并且以每mg的測試蛋白抑制的胰凝乳蛋白酶 的mg數(shù)（mg抑制的胰凝乳蛋白酶/mg測試蛋白）表示。BTEE指N-苯甲?；?L-酪氨酸乙 酯（見Sigma-Aldrich第B6125號產(chǎn)品說明）。
[0032] 除非另外指明，否則將本文中提及的抗胰蛋白酶活性利用具有10, 000ΒΑΕΕ單位 /mg胰蛋白酶活性的胰蛋白酶測量，并且以每mg的測試蛋白抑制的胰蛋白酶的mg數(shù)（mg 抑制的胰蛋白酶/mg測試蛋白）表示。BAEE指Na-苯甲?；?L-酪氨酸乙酯溶液（見 Sigma-Aldrich第B4500號產(chǎn)品說明）。例如，在常見的測定法中，一單位對應(yīng)于將胰蛋 白酶活性減少一個苯甲?；?L-精氨酸乙酯單位（BAEE-U)的抑制物的量。一個BAEE-U 是在ρΗ7· 6和25°C將253nm處吸光度增加0· 001/分鐘的酶量。參見，例如，1(.0抑冊，1 Laskowski, 1966, J. Biol. Chem. 241:3955 ;和 Y. Birk, 1976, Meth. Enzymol. 45:700。
[0033] 本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，在BBI與藥物組合物的一種或多種其他組分混合之前，通 常對關(guān)于其蛋白質(zhì)含量、雜質(zhì)水平或效力的上述每種純度要求進行評定。
[0034] 在再一個方面，提供從大豆粉分離的KTI3,其中所述KTI3是至少85%純的，如在 多種實施方案中通過SDS-PAGE、亮藍染色或成像儀定量法所測量。
[0035] 在又一個方面，提供從大豆粉分離的KTI3,其中KTI3的蛋白質(zhì)含量大于95%，如 通過BCA測定法所測量。
[0036] 在又一個方面，提從大豆粉分離的KTI3,其中KTI3含有小于0. 1%的高分子量雜 質(zhì)，例如，如通過SDS-PAGE和成像儀定量法所評定。
[0037] 本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，在KTI3與藥物組合物的一種或多種其他組分混合之前，通 常對關(guān)于其蛋白質(zhì)含量、雜質(zhì)水平或效力的上述每種純度要求進行評定。
[0038] 在某些實施方案中，含有KTI3的藥物組合物還包含在其與藥物組合物的一種或 多種其他組分混合之前滿足至少一種以上純度要求的BBI。
[0039] 在某些實施方案中，配制上述的藥物組合物用于口服施用。在更具體的實施方案 中，該藥物組合物還包含抵抗胃中降解的包衣。在甚至更具體的實施方案中，該包衣是pH 敏感膠囊或可選地，是軟明膠膠囊。
[0040] 在其他實施方案中，上述的藥物組合物還包含達100千道爾頓的治療性蛋白作為 活性成分活性成分。在其他實施方案中，活性成分活性成分是對人消化道中降解或失活敏 感的非蛋白質(zhì)分子。
[0041] 在另一個實施方案中，提供一種包含基于油的液態(tài)制劑的口服藥物組合物，其中 所述基于油的液態(tài)制劑包含達100千道爾頓（kDa)的治療性蛋白、二價陽離子螯合劑和分 離的BBI。在其他實施方案中，該液態(tài)制劑基本上由達IOOkDa的治療性蛋白、二價陽離子螯 合劑、分離的BBI和油組成。在其他實施方案中，該液態(tài)制劑基本上由達IOOkDa的治療性 蛋白、二價陽離子螯合劑、分離的BBI、油和乳化劑組成。在其他實施方案中，該液態(tài)制劑基 本上由達IOOkDa的治療性蛋白、二價陽離子螯合劑、分離的BBI、油和兩種乳化劑組成。 [0042] 在另一個方面，提供一種包含基于油的液態(tài)制劑的口服藥物組合物，其中所述基 于油的液態(tài)制劑包含達100千道爾頓（kDa)的治療性蛋白、二價陽離子螯合劑和源自大豆 的BBI，其中所述液態(tài)制劑含有小于0. 05%的分子量大于30, 000的源自大豆的物質(zhì)。
[0043] 在另一個方面，提供一種包含基于油的液態(tài)制劑的口服藥物組合物，其中基于油 的液態(tài)制劑包含達IOOkDa的治療性蛋白和二價陽離子螯合劑，并且所述液態(tài)制劑具有至 少抑制50mg胰凝乳蛋白酶/ml液態(tài)制劑的抗胰凝乳蛋白酶活性。在其他實施方案中，該液 態(tài)制劑具有至少抑制35、40、45、55或60mg胰凝乳蛋白酶/ml液態(tài)制劑的抗胰凝乳蛋白酶 活性。在另外的實施方案中，該液態(tài)制劑具有抑制35-70、40-70、45-70、50-70或40-60mg 胰凝乳蛋白酶/ml液態(tài)制劑的抗胰凝乳蛋白酶活性。在其他實施方案中，該液態(tài)制劑還包 含至少抑制25mg胰蛋白酶/ml液態(tài)制劑的抗胰蛋白酶活性。在其他實施方案中，該液態(tài)制 劑還包含至少抑制30、35、40、45或50mg胰蛋白酶/ml液態(tài)制劑的抗胰蛋白酶活性。或者， 該液態(tài)制劑還包含抑制25-50、30-50、35-50、25-40或25-45mg胰蛋白酶/ml液態(tài)制劑的抗 胰蛋白酶活性。
[0044] 在另一個方面，提供一種用于制備藥物組合物的方法，包括以下步驟：(a)提供 分離的BBI、達100千道爾頓的治療性蛋白和二價陽離子螯合劑的制備物；和（b)將所述 分離的BBI、治療性蛋白和螯合劑混合至基于油的液態(tài)制劑中?？梢詫⒎蛛x的BBI的鑒定 (identity)、純度和效力的本文所述每個實施方案并入該方法。此外，可以將其他成分的和 可以存在的額外成分的本文所述每個實施方案并入該方法。在其他實施方案中，提供通過 這種方法制備的藥物組合物。
[0045] 在另一個方面，提供用于制備藥物組合物的方法，包括將分離的BBI、達100千道 爾頓的治療性蛋白和二價陽離子螯合劑混合至基于油的液態(tài)制劑中的步驟?？梢詫⒎蛛x的 BBI的鑒定、純度和效力的本文所述每個實施方案并入該方法。此外，可以將其他成分的和 可以存在的額外成分的本文所述每個實施方案并入這種方法。在其他實施方案中，提供通 過這種方法制備的藥物組合物。
[0046] 如本文所用的"液體"指在20°C的粘度為1-1000 (包含1和1000)毫帕斯卡秒的 組合物。例如，魚油在環(huán)境條件下是液體。該術(shù)語包括基于油的溶液、懸液及其組合。
[0047] 如本文所用的"分離的'?ΒΙ指相對于其他組分而言富含BBI的制備物。在更具體 的實施方案中，BBI指Bowman-Birk抑制物；Uniprot編號P01055 [2013年1月28日獲得的 數(shù)據(jù)庫])。
[0048] BBI的代表性前體序列是：
[0049] MVVLKVCLVL LFLVGGTTSA NLRLSKLGLL MKSDHQHSND
[0050] DESSKPCCDQ CACTKSNPPQ CRCSDMRLNS CHSACKSCIC
[0051] ALSYPAQCFC VDITDFCYEP CKPSEDDKEN(SEQ ID NO:1)〇
[0052] 這110個殘基當中，殘基1-19是信號肽，20-39是前肽并且成熟鏈BBI鏈由殘基 40-110(71 個 AA)組成。
[0053] 在多個實施方案中，在所述的方法和組合物中利用的BBI的制備物是至少85%、 90 %、92 %、94 %或95 %純的，如通過SDS-PAGE、亮藍染色或成像儀定量法（例如根據(jù)本文 所述的方案）所評定。在藥物組合物的情況下，該值涉及在BBI與藥物組合物的一種或多 種其他組分混合之前BBI的特征。在可選實施方案中，可以利用SDS-PAGE和銀染法，任選 地隨后利用成像儀定量法。
[0054] 在其他實施方案中，分離的881具有至少0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3或1.411^抑 制的胰凝乳蛋白酶/mg抑制物的抗胰凝乳蛋白酶活性。在其他實施方案中、抗胰凝乳蛋白 酶活性處于 〇· 8-1. 8、0· 9-1. 8、I. O-L 8、I. 1-1. 8、L 2-1. 8、L 3-1. 8 或 L 4-1. 8mg 抑制的胰 凝乳蛋白酶/mg抑制物的范圍內(nèi)。在更具體的實施方案中，該活性是0. 8-1. 8mg抑制的胰 凝乳蛋白酶/mg抑制物。在其他實施方案中，該活性處于0. 8-1. 5mg抑制的胰凝乳蛋白酶/ mg抑制物的范圍內(nèi)。在藥物組合物的情況下，該值涉及在BBI與藥物組合物的一種或多種 其他組分混合之前BBI的特征。
[0055] 在多種實施方案中，BBI制備物含有5 %或更少的KTI，如通過SDS-PAGE、亮藍染色 或成像儀定量法（根據(jù)本文所述的方案）所評定。在可選實施方案中，可以利用SDS-PAGE 和銀染法。
[0056] 在其他實施方案中，分離的BBI具有至少抑制0. 8、0. 9、1. 0、1. 1、1. 2、1. 3或I. 4mg 胰凝乳蛋白酶/mg抑制物的抗胰凝乳蛋白酶活性。在其他實施方案中，抗胰凝乳蛋白酶活 性為抑制 〇· 8-1. 8、0· 9-1. 8、I. 0-1. 8、I. 1-1. 8、1. 2-1. 8、1. 3-1. 8 或 1. 4-1. 8mg胰凝乳蛋白 酶/mg抑制物。在更具體的實施方案中，該活性是抑制0. 8-1. 8mg胰凝乳蛋白酶/mg抑制 物。在其他實施方案中，該活性為抑制0.8-1. 5mg胰凝乳蛋白酶/mg抑制物。在藥物組合 物的情況下，該值涉及在BBI與藥物組合物的一種或多種其他組分混合之前BBI的特征。
[0057] 在多種實施方案中，BBI制備物含有5 %或更少的KTI，如通過SDS-PAGE、亮藍染色 或成像儀定量法（根據(jù)本文所述的方案）所評定。在可選實施方案中，可以利用SDS-PAGE 和銀染法。
[0058] 在更具體的實施方案中，如本文所用的KTI指KTI3(Uniprot編號P01070 ;2013年 1月3日獲得數(shù)據(jù)庫）。KTI3的代表性前體序列是：
[0059] MKSTIFFLFL FCAFTTSYLP SAIADFVLDN EGNPLENGGT YYILSDITAF
[0060] GGIRAAPTGN ERCPLTVVQS RNELDKGIGT IISSPYRIRF IAEGHPLSLK
[0061] FDSFAVIMLC VGIPTEffSVV EDLPEGPAVK IGENKDAMDG
[0062] WFRLERVSDD EFNNYKLVFC PQQAEDDKCG DIGISIDHDD
[0063] GTRRLVVSKN KPLVVQFQKL DKESLAKKNH GLSRSE(SEQ ID N0:2)〇
[0064] 以上序列當中，殘基1-24是信號肽，206-216是前肽，成熟KTI鏈由殘基 25-205(181 個 AA)組成。
[0065] 在其他實施方案中，BBI制備物的蛋白質(zhì)含量大于95%，通過BCA測定法測量（例 如使用Micro BCA蛋白質(zhì)分析試劑盒[目錄號#23225，Thermo Scientific Rockford，IL])。 在藥物組合物的情況下，該值涉及它與藥物組合物的一種或多種其他組分混合之前的特 征。在其他實施方案中，BBI制備物含有小于0.1%的1?分子量雜質(zhì)（換而言之，分子量大 于30, 000的物質(zhì)）。在其他實施方案中，BBI已經(jīng)在不使用聚乙二醇（PEG)的情況下分離。
[0066] 在其他實施方案中，在所描述的方法和組合物中的分離的BBI是重組BBI，例如已 經(jīng)工程化以表達BBI的微生物（如細菌）產(chǎn)生并隨后分離的BBI。在另外的實施方案中， BBI是合成性BBI。合成性BBI的例子是已經(jīng)在無細胞裝置如肽合成儀中產(chǎn)生的BBI。肽合 成儀，例如自動肽合成儀，是本領(lǐng)域熟知的并且是商業(yè)可獲得的。本文還提供包含合成BBI 的藥物組合物。本文還提供包含合成性BBI的藥物組合物。
[0067] 在某些實施方案中，描述的BBI是所描述的方法和組合物中的唯一蛋白酶抑制 物。盡管較低效力的SBTI需要額外的蛋白酶抑制物，例如抑蛋白酶肽（aprotinin)，以有效 地在人消化道中保護某些治療性蛋白，但是認為描述的分離的BBI能夠減少在這個方面對 額外蛋白酶抑制物的需求。
[0068] 額外的蛋白酶抑制物
[0069] 在某些實施方案中，在所描述的方法和組合物中利用的基于油的液態(tài)制劑還包含 不同于分離的BBI的胰蛋白酶抑制物。在其他實施方案中，在所描述的方法和組合物中利 用的基于油的液態(tài)制劑還包含不同于分離的KTI3的胰蛋白酶抑制物。根據(jù)本申請公開的 內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，可以利用多種胰蛋白酶抑制物。在胰蛋白酶抑制物是蛋白質(zhì)的 情況下，大小一般將達l〇〇kDa。
[0070] 如本文所用，術(shù)語"胰蛋白酶抑制物"指能夠抑制胰蛋白酶對底物的作用的任何物 質(zhì)?？梢允褂帽绢I(lǐng)域熟知的測定法測量某物質(zhì)抑制胰蛋白酶的能力。
[0071] 本領(lǐng)域已知的一些胰蛋白酶抑制物對胰蛋白酶特異，而其他則抑制胰蛋白酶和其 他蛋白酶如胰凝乳蛋白酶。胰蛋白酶抑制物可以源自動物來源或植物來源：例如大豆、玉 米、利馬豆和其他豆類、南瓜（squash)、向日葵、牛和其他動物的胰和肺、雞和火雞的卵清、 基于大豆的嬰兒配方食品和哺乳動物血液。胰蛋白酶抑制物也可以是微生物來源的：例如， 抗痛素（antipain);見，例如，H. Umezawa, 1976, Meth. Enzymol. 45, 678。胰蛋白酶抑制物也 可以是精氨酸模擬物或賴氨酸模擬物或其他合成性化合物：例如芳基胍、苯甲脒、3, 4-二 氯異香豆素、二異丙基氟磷酸酯、甲磺酸加貝酯或苯基甲磺酰氟。如本文所用，精氨酸模擬 物或賴氨酸模擬物是能夠與胰蛋白酶的P 1袋結(jié)合和/或干擾胰蛋白酶活性部位功能的化 合物。
[0072] 在某些實施方案中，在所描述的方法和組合物中利用的額外胰蛋白酶抑制物選 自：利馬豆胰蛋白酶抑制物、抑蛋白酶肽（又稱作胰腺胰蛋白酶抑制物或堿性胰腺胰蛋白 酶抑制物[ΒΡΤΙ] ;Uniprot編號Ρ00974[2013年1月2日訪問數(shù)據(jù)庫])、Kazal抑制物（胰 分泌性胰蛋白酶抑制物）、Kazal抑制物（胰分泌性胰蛋白酶抑制物）、卵類粘蛋白、a 1抗 胰蛋白酶、皮質(zhì)醇結(jié)合球蛋白、中心素（[SERPINA9/GCET1 (生發(fā)中心B細胞表達的轉(zhuǎn)錄物 I) ]、PI_6 (Sun 等人 1995)、PI_8 (Sprecher 等人 1995)、Bomapiru進化枝 A 絲氨酸蛋白酶抑 制蛋白[例如 Serpina3(NCBI 基因 ID :12)、Serpina6(NCBI 基因 ID :866)、Serpinal2(NCBI 基因 ID :145264)、SerpinalO (NCBI 基因 ID :51156)、Serpina7(NCBI 基因 ID :6906)、 Serpina9(NCBI 基因 ID :327657)、Serpinall (NCBI 基因 ID :256394)、Serpinal3(NCBI 基因 ID :388007)、Serpina2 (NCBI 基因 ID :390502)和 Serpina4 (NCBI 基因 ID :5104)]、 Yukopin(Serpinbl2 ;基因 ID :89777)、抗痛素、苯甲脒、3, 4-二氯異香豆素、二異丙基氟磷 酸酯和甲磺酸加貝酯。在其他實施方案中，選擇以上抑制物之一。
[0073] 抑蛋白酶肽的代表性前體序列是：
[0074] MKMSRLCLSV ALLVLLGTLA ASTPGCDTSN QAKAQRPDFC
[0075] LEPPYTGPCK ARIIRYFYNA KAGLCQTFVY GGCRAKRNNF
[0076] KSAEDCMRTC GGAIGPffENL(SEQ ID N0:3)〇
[0077] 這100個殘基當中，殘基1-21是信號肽，22-35和94-100是前肽并且成熟鏈BBI 鏈由殘基36-93 (58個AA)組成。
[0078] 在其他實施方案中，在所描述的方法和組合物中利用的基于油的液態(tài)制劑包含分 離的BBI和分離的KTI兩者，在更具體的實施方案中包含分離的BBI和分離的KTI3兩者。 如本文所用的"分離的KTI"指相對于其他組分富含KTI的制備物。在多種實施方案中，在 所述的方法和組合物中利用的KTI制備物是至少85%純的，如通過SDS-PAGE、亮藍染色或 成像儀定量法（例如根據(jù)本文所述的方案）所評定。在其他實施方案中，KTI制備物的蛋 白質(zhì)含量大于95%，如通過BCA測定法所測量。在藥物組合物的情況下，這些值涉及在KTI 與藥物組合物的一種或多種其他組分混合之前KTI的特征。在其他實施方案中，KTI制備 物含有5 %或更少的BBI，如通過SDS-PAGE所評定。在其他實施方案中，KTI制備物含有小 于0. 1 %高分子量雜質(zhì)（換而言之，分子量大于30, 000的物質(zhì)）。在其他實施方案中，KTI 已經(jīng)在不使用PEG的情況下分離。
[0079] 在仍更具體的實施方案中，所描述的方法和組合物包含所描述的BBI和KTI，在更 具體的實施方案中包含BBI和KTI3,作為僅有的蛋白酶抑制物。在其他實施方案中，所描述 的方法和組合物包含KTI和抑蛋白酶肽，在更具體的實施方案中包含KTI3和抑蛋白酶肽， 作為僅有的蛋白酶抑制物。在其他實施方案中，分離的BBI、分離的KTI和抑蛋白酶肽均存 在于該基于油的液態(tài)制劑中。
[0080] 在其他實施方案中，分離的KTI3具有至少抑制0. 8、0. 9、1. 0、1. 1、1. 2或I. 3mg 胰蛋白酶/mg抑制物的活性。在其他實施方案中，KTI3的活性為抑制0. 8-1. 8、0. 9-1. 8、 1. 0-1. 8、1. 1-1. 8、1. 2-1. 8或I. 3-1. 8mg胰蛋白酶/mg抑制物。在更具體的實施例中， KTI3的活性是抑制0. 8-1. 7mg胰蛋白酶/mg抑制物。在其他實施方案中，該活性是抑制 0. 8-1. 4mg胰蛋白酶/mg抑制物。
[0081] 在其他優(yōu)選實施方案中，分離的KTI是重組KTI，例如由已經(jīng)工程化以表達KTI的 微生物（如細菌）產(chǎn)生的KTI。在其他仍優(yōu)選的實施方案中，KTI是合成性KTI。合成性KTI 的例子是已經(jīng)在無細胞裝置如肽合成儀中產(chǎn)生的KTI。
[0082] 其他實施方案涉及所述藥物組合物中存在的抗胰凝乳蛋白酶活性對組合物的抗 胰蛋白酶活性的比率。在一些實施方案中，這個參數(shù)在1.5:1和1:1之間，包括1.5:1和 1:1。在更具體的實施方案中，該比率可以在1. 4:1-1. 1:1之間，包括1. 4:1和1. 1:1。在更 具體的實施方案中，該比率可以在1. 35:1-1. 2:1之間，包括1. 35:1和1. 2:1。
[0083] 在某些實施方案中，在所描述的方法和組合物中利用的BBI和/或KTI (如果存在 的話）已經(jīng)隨防腐劑一起儲存。在其他實施方案中，BBI和/或KTI已經(jīng)在不使用防腐劑 的情況下制備并儲存。
[0084] 在某些實施方案中，在所描述的方法和組合物中利用的BBI和/或KTI (如果存在 的話）從大豆粉獲得。術(shù)語"大豆粉"指從大豆（Glycine max)物種獲得的粉末。在其他 實施方案中，可以利用來自大豆屬（Glycine)的任何物種。用于獲得大豆粉的方法是本領(lǐng) 域熟知的。所述的方法被認為適用于任何類型的大豆粉，而無論它怎樣產(chǎn)生。
[0085] 治療件蛋白
[0086] 在一些實施方案中，用于本文所述的組合物和方法的治療性蛋白在納入所述的藥 物組合物中之前分離。在這個方面，"分離"排除將治療性蛋白作為含有大量摻雜性蛋白質(zhì) 的均化組織制備物或其他形式提供。分離的蛋白質(zhì)或肽的優(yōu)選例子是重組蛋白或肽。一個 甚至更優(yōu)選的實施方案是合成性蛋白質(zhì)，換而言之在無細胞裝置中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。本領(lǐng)域 技術(shù)人員根據(jù)本申請公開的內(nèi)容理解，野生型和突變的治療性蛋白均可以利用。
[0087] 某些蛋白質(zhì)和肽已知是胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶的特異性抑制物，包括但不 限于本文所述的作為胰蛋白酶抑制物和/或胰凝乳蛋白酶抑制物的那些。這類蛋白質(zhì)不旨 在用作所述組合物中的治療性組分，并且從本文所用的"治療性蛋白"定義排除。
[0088] 本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本申請公開的內(nèi)容理解，多種治療性蛋白可以用于所描述的 方法和組合物中。在某些實施方案中，治療性蛋白的大小是達100千道爾頓（kDa)，一般在 I-IOOkDa之間，包括1和lOOkDa。在更具體的實施方案中，該大小是達90kDa。在其他實施 方案中，該大小是達80kDa。在其他實施方案中，該大小是達70kDa。在其他實施方案中，該 大小是達60kDa。在其他實施方案中，該大小是達50kDa。優(yōu)選地，該大小在l-90kDa之間， 包括1和90kDa。在其他實施方案中，該大小在l-80kDa之間，包括1和80kDa。在其他實 施方案中，該大小在WOkDa之間，包括1和70kDa。在其他實施方案中，該大小在l-60kDa 之間，包括1和60kDa。在其他實施方案中，該大小在l-50kDa之間，包括1和50kDa。
[0089] 適用于本文中的治療性蛋白包括經(jīng)修飾（即，通過非氨基酸部分與蛋白質(zhì)共價連 接）的衍生物。例如，但不限于，該蛋白質(zhì)包括已經(jīng)例如通過用已知保護基團/封閉基團糖 基化、乙?；?、PEG化、磷酸化、酰胺化或衍生化所修飾的蛋白質(zhì)。高分子量PEG可以在采用 或不采用多功能接頭的情況下，通過PEG與其N末端或C末端的位點特異性連接或通過賴 氨酸殘基上存在的ε-氨基，與治療性蛋白連接。另外，衍生物可以含有一個或多個非經(jīng)典 氨基酸。
[0090] 在某些更具體的實施方案中，在所描述的方法和組合物中利用的治療性蛋白選自 胰島素、流感血凝素、流感神經(jīng)氨酸酶、胰高血糖素、干擾素 Y、干擾素 β、干擾素 α、生長 激素、促紅細胞生成素、GLP-I、GLP-I類似物、粒細胞集落刺激因子（G-CSF)、腎素、生長激 素釋放因子、甲狀旁腺激素、促甲狀腺激素、促卵泡激素、降鈣素、促黃體激素、胰高血糖素、 凝血因子（例如，因子VII、因子VIIIC、因子DC、組織因子（TF)和凝血酶）、抗凝血因子 (例如蛋白質(zhì)C)、心鈉素 （atrial natriuretic factor)、表面活性蛋白A(SP-A)、表面活性 蛋白B(SP-B)、表面活性蛋白C(SP-C)、表面活性蛋白D(SP-D)、纖維蛋白溶酶原激活物（例 如，尿激酶或人尿或組織型纖維蛋白溶酶原激活物（t-PA))、鈴蟾肽（bombesin)、造血生長 因子（又稱作集落刺激因子，多種）、腫瘤壞死因子（TNF)蛋白（例如，TNF-α、TNF-β、 TNFβ -2、4_1BBL)、腦啡肽酶、RANTES(活化時受調(diào)節(jié)、通常由T-細胞表達和分泌）、人巨噬 細胞炎性蛋白（MIP-1-α)、血清白蛋白、繆勒管抑制物質(zhì)、松弛素、小鼠促性腺素釋放激素、 DNA酶、抑制素、活化素、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF)、神經(jīng)營養(yǎng)因子（例如，腦衍生神經(jīng)營養(yǎng) 因子[BDNF])、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)、神經(jīng)生長因子、血 小板衍生的生長因子（PDGF)、成纖維細胞生長因子（例如，a -FGF和β -FGF)、轉(zhuǎn)化生長因 子（TGF)(例如，TGF-α 和 TGF-β、包括 TGF-1、TGF-2、TGF-3、TGF-4 和 TGF-5)、胰島素樣 生長因子-I和-Π (IGF-I和IGF-II)、des (l-3)-IGF-I (腦IGF-I)、胰島素樣生長因子結(jié) 合蛋白（包括 IGFBP-l、IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5 和 IGFBP-6)、角質(zhì)形成細胞生 長因子、骨誘導(dǎo)因子、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP)-2、BMP-7、集落刺激因子（CSF)(例如，M-CSF和 GM-CSF)、白介素（IL)(例如IL-I至IL-13和IL-15、IL-18和IL-23)、超氧化物歧化酶、衰 變加速因子、趨化因子家族成員（例如嗜酸性粒細胞趨化因子（eotaxin)和MCP-1)和補體 因子（例如C3和C5)。
[0091] 在仍更具體的實施方案中，治療性蛋白是胰島素?？蛇x地，治療性蛋白可以是 GLP-I抑制物。在一個更具體的實施方案中，治療性蛋白是胰高血糖素樣肽。在其他實施 方案中，胰島素和艾塞那肽（exenatide)存在于所描述的組合物中。在其他實施方案中，該 液態(tài)制劑基本上由胰島素、艾塞那肽、二價陽離子螯合劑、分離的BBI和油組成。在其他實 施方案中，該液態(tài)制劑基本上由胰島素、艾塞那肽、二價陽離子螯合劑、分離的BBI、至少一 種乳化劑和油組成。在另外的實施方案中，該液態(tài)制劑基本上由胰島素、艾塞那肽、二價陽 離子螯合劑、分離的KTI3、抑蛋白酶肽和油組成。在另外的實施方案中，該液態(tài)制劑基本上 由胰島素、艾塞那肽、二價陽離子螯合劑、分離的KTI3、抑蛋白酶肽、至少一種乳化劑和油組 成。
[0092] 本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本申請公開的內(nèi)容理解，多種類型的胰島素適用于所描述的 方法和組合物。示例性胰島素蛋白質(zhì)包括但不限于野生型和突變的胰島素蛋白，包括合成 人胰島素、合成牛胰島素、合成豬胰島素、合成鯨胰島素和胰島素的金屬復(fù)合物，如胰島素 的鋅復(fù)合物、魚精蛋白鋅胰島素和珠蛋白鋅。
[0093] 也可以利用多種類別的胰島素，例如速效胰島素、慢胰島素、半慢胰島素、特慢胰 島素、NPH胰島素、甘精胰島素、賴脯胰島素、門冬胰島素或以上類型胰島素的兩種或更多種 的組合。
[0094] 在一個特別優(yōu)選的實施方案中，所描述的方法和組合物的胰島素是野生型人胰島 素 （Uniprot ID P01308;SEQ ID N0:4)。110個氨基酸當中，第1-24氨基酸是信號肽，第 25-54氨基酸形成胰島素 B鏈，第57-87氨基酸形成C肽，并且第90-110氨基酸形成胰島 素 A鏈。在一個優(yōu)選的實施方案中，人胰島素作為重組蛋白在細菌細胞中產(chǎn)生。在另一個 優(yōu)選實施方案中，合成產(chǎn)生人胰島素。
[0095] GLP-I類似物在本領(lǐng)域中也稱作GLP-I模擬物。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本申 請公開的內(nèi)容理解，所描述的組合物可以包含至少一種以下GLP-I類似物：艾塞那肽 (Byetta? ;CAS 編號 141732-76-5 ;SEQ ID NO:5)、利西拉來（Iixisenatide) (CAS 編號 320367-13-3)、利拉魯肽（CAS 編號 204656-20-2)、艾塞那肽-9(CAS 編號 133514-43-9)、 AC3174 ([Leu (14)]促膜島素分泌膚-4，Amylin Pharmaceuticals, Inc.)、他司魯泰 (CAS 編號 275371-94-3)、阿必魯肽（albiglutide) (CAS 編號 782500-75-8)、索馬魯肽 (semaglutide) (CAS編號 910463-68-2)、LY2189265(dulaglutide? ;CAS編號 923950-08-7) 和CJC-1134-PC (與重組人白蛋白綴合的修飾艾塞那肽-4類似物，由ConjuChem?制造）。 全部CAS記錄均在2011年12月19日訪問。因此，在某些實施方案中，所描述的方法或組 合物利用任一種上文列出的GLP-I類似物。在其他實施方案中，選擇上文列出的GLP-I類 似物之一。根據(jù)本文中展示的研究結(jié)果，本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，其他GLP-I類似物也可以用 于所描述的方法和組合物中。
[0096] 乳化劑
[0097] 本文中提及乳化劑和去垢劑的"重量/重量"百分比利用制劑中油基礎(chǔ)物（oil base)(例如魚油）的量作為分母；因此，將500mg魚油中的60mg Gelucir視為12% w/w，而 無論其他組分的重量。類似地，將與500mg魚油混合的50mg Tween-80視為10% Tween-80。
[0098] 在某些實施方案中，除治療性蛋白，螯合劑和BBI之外，在所描述的方法和藥物組 合物中利用的基于油的液態(tài)制劑，或在其他實施方案中，存在的每種基于油的液態(tài)制劑還 包含脂肪酸的聚乙二醇（PEG)酯，例如單酰甘油、二酰甘油、三酰甘油的PEG酯或其混合物。 在更具體的實施方案中，PEG酯可以作為以下的混合物提供：(a)游離單酰甘油、游離二酰 甘油、游離三酰甘油或其混合物；和（b)脂肪酸的PEG酯，例如單酰甘油、二酰甘油、三酰甘 油的PEG酯或其混合物。在這個方面，術(shù)語"單酰甘油"、"二酰甘油"和"三酰甘油"各自不 必指單個化合物，而可以包括化合物的混合物，例如具有長度不同的脂肪酸的單酰甘油、二 酰甘油或三酰甘油的混合物。在某些優(yōu)選的實施方案中，在所描述的方法和組合物中利用 的單酰甘油，二酰甘油或三酰甘油，例如用來生成PEG酯的那些，來自通常視為安全（GRAS) 的油源。GRAS油的例子是椰油、玉米油、花生油、大豆油、Myvacet9-45(C-18脂肪酸的二乙 ?；瘑熙８视停?。（a)的更具體實施方案是(： 8_(：18單酰甘油、二酰甘油和三酰甘油的混合物。 組分（b)的更具體實施方案是一種或多種C 8-CliJg肪酸的PEG單酯和二酯的混合物。
[0099] 在更具體的實施方案中，除脂肪酸的PEG酯之外，液態(tài)制劑還包含游離PEG。在仍 更具體的實施方案中，除PEG酯和游離PEG之外，存在額外的非離子型去垢劑，例如基于聚 山梨醇酯的去垢劑。
[0100] 在所述方法和組合物的仍更具體的實施方案中，液態(tài)制劑包含：(a) C8-C18單酰甘 油、二酰甘油和三酰甘油的混合物；(WC8-C18脂肪酸的混合物的PEG-32單酯和二酯；和（c) 游離PEG-32。在甚至更具體的實施方案中，組分（a)對組分（b) + (c)的總和的重量/重量 比在10:90-30:70之間（包括10:90和30:70);更具體地在15:85-25:75之間（包括15:85 和25:75);更具體地是20:80。在某些實施方案中，組分（a)-(c) -起占基于油的液態(tài)制劑 的8-16%重量/重量（包括8%和16% )。在更具體的實施方案中，該量是9-15% (包括 9%和15%)。在更具體的實施方案中，該量是10-14% (包括10%和14%)。在更具體的 實施方案中，該量是11-13 % (包括11 %和13 %)。在更具體的實施方案中，該量是12 %。
[0101] 在其他實施方案中，除治療性蛋白、螯合劑和BBI之外，在所描述的方法和藥物組 合物中利用的基于油的液態(tài)制劑還包含自乳化組分。盡管自乳化組分的一些實施方案是前 述段落中描述的組分的混合物，但是這些混合物不限制本文所用的術(shù)語"自乳化組分"的定 義。本文所用的"自乳化組分"指自發(fā)形成乳液的組分。一般，與含水介質(zhì)接觸時，這類組 分將形成乳液，形成細分散體，即微乳液（SMEDDS)。這類組分的某些實施方案包括三酰甘油 和高親水 / 親油平衡值（HLB;見 Griffin WC :Griffin WC: "Calculation of HLB Values of Non-Ionic Surfactants, "J Soc Cosmetic Chemists 5:259(1954))表面活性劑的三醜甘 油混合物。自乳化組分的其他實施方案具有蠟狀、半固態(tài)稠度。
[0102] 優(yōu)選地，在所描述的方法和組合物中利用的自乳化組分的HLB是10或更大。在其 他實施方案中，HLB在11-19之間（包括端值）。在其他實施方案中，它在12-18之間（包括 端值）。在其他實施方案中，它在12-17之間（包括端值）。在其他實施方案中，它在12-16 之間（包括端值），表示水包油（0/W)乳化劑。在其他實施方案中，它在13-15之間（包括 端值）。在其他實施方案中，它是14。自乳化組分的仍更具體的實施方案具有12-16(包括 端值）的HLB并且包含與PEG、游離三酰甘油和游離PEG結(jié)合的中等鏈和長鏈三酰甘油。在 其他實施方案中，自乳化組分具有12-16(包括端值）的HLB并且由與PEG、游離三酰甘油和 游離PEG結(jié)合的中等鏈和長鏈三酰甘油的混合物組成。在其他實施方案中，自乳化組分具 有14的HLB并且包含與PEG、游離三酰甘油和游離PEG結(jié)合的中等鏈和長鏈三酰甘油。在 其他實施方案中，自乳化組分具有14的HLB并且由與PEG、游離三酰甘油和游離PEG結(jié)合的 中等鏈和長鏈三酰甘油的混合物組成。
[0103] 某些更具體的實施方案利用包含（a)單酰甘油、二酰甘油、三酰甘油或其混合物； 和（b)脂肪酸的聚乙二醇（PEG)酯的自乳化組分。在這個方面，術(shù)語"單酰甘油"、"二酰甘 油"和"三酰甘油"均不需要指單個化合物，而可以包括化合物的混合物，例如具有不同長度 的脂肪酸的單酰甘油、二酰甘油或三酰甘油的混合物。更具體的實施方案是C 8-C18單酰甘 油、二酰甘油和三酰甘油的混合物。組分（b)的更具體實施方案是C8-C liJg肪酸的混合物 的PEG單酯和二酯的混合物。
[0104] 在其他更具體的實施方案中，自乳化組分還包含游離PEG。
[0105] 用于所描述的組合物和方法中的某些PEG部分含有5-100個單體。在更具體的實 施方案中，PEG可以含有15-50個單體。在仍更具體的實施方案中，PEG可以含有25-40個 單體。在更具體的實施方案中，PEG可以含有32個單體。
[0106] 在所述方法和組合物的仍更具體的實施方案中，本文中所用的自乳化組分包含： (a) C8-C18單酰甘油、二酰甘油和三酰甘油的混合物；(b) C8-C18脂肪酸的混合物的PEG-32單 酯和二酯；和（c)游離PEG-32 ;并且組分（a)對組分（b) + (c)的重量/重量比是20:80。在 某些實施方案中，這種組分占基于油的液態(tài)制劑的8-16%重量/重量（包括端值）。在更 具體的實施方案中，該量是9-15% (包括端值）。在更具體的實施方案中，該量是10-14% (包括端值）。在更具體的實施方案中，該量是11-13% (包括端值）。在更具體的實施方 案中，該量是12%。
[0107] 符合上述的自乳化組分的例子是Gelucire?44/14、Gelucire?53/10和 GeluCireTM50/13。更具體的實施方案是GeluCire TM44/14。后綴44和14分別指其熔點和 其親水/親油平衡值（HLB)。通過利用PEG-32對氫化椰油（中等鏈和長鏈三酰甘油）的聚 乙二醇解獲得 Gelucire?44/14(Gattefoss6 SAS，Saint-Priest,法國）。它的親水 / 親油 平衡值為14。它由C8-C18單酰甘油、二酰甘油和三酰甘油的限定混合物（20% w/w) ;PEG-32 單酯和二酯以及游離PEG-32(80%W/w)組成。存在的主要脂肪酸是月桂酸，平均占總脂肪 酸含量的45%。它是由處于120A層狀相具有螺旋構(gòu)象的PEG酯部分和處于六方堆積的 酰基甘油部分組成的固態(tài)分散體。Gelu CireTM44/14的模擬胃腸道脂解作用的主要產(chǎn)物是 PEG-32單酯和二酯。在更具體的實施方案中，所描述的組合物包含約12% GeluCire44/14 作為唯一乳化劑，或在其他實施方案中，連同另一種乳化劑。在其他實施方案中，所描述的 組合物包含約 12% Gelucire44/14 和約 10% Tween-80。
[0108] 非離子型去垢劑
[0109] 在某些實施方案中，除自乳化組分之外，在所描述的方法和藥物組合物中利用的 基于油的液態(tài)制劑還包含非離子型去垢劑。在某些實施方案中，非離子型去垢劑選自聚山 梨醇酯-20、聚山梨醇酯-40、聚山梨醇酯-80、聚桂醇400 (lauromacrogol400)、硬脂酸聚乙 二醇40酯、聚氧乙烯氫化蓖麻油10、50和60、單硬脂酸甘油酯、聚山梨醇酯40、60、65和80、 蔗糖脂肪酸酯、甲基纖維素、羧甲基纖維素、正辛基葡糖苷、正-十二烷基葡糖苷、正-十二 烷基麥芽糖苷、辛酰-N-甲基葡萄糖酰胺、癸?；?N-甲基葡萄糖酰胺、Trit 〇n?-X-100、 Trit〇nTM-X-114、ThesitTM、異十三?；郏ㄒ叶济眩?n、3-[(3-膽酰胺丙基）二甲基氨 基]_1_丙橫酸鹽（CHAPS)、3_[(3_膽醜胺丙基）二甲基氨基]_2_輕-1-丙橫酸鹽（CHAPSO) 和N-十二烷基=N，N-二甲基-3-氨基-1-丙磺酸酯。在其他實施方案中，選擇上文列出 的非離子型去垢劑之一。
[0110] 在某些更具體的實施方案中，在所描述的方法和組合物中使用的非離子型去垢劑 是基于聚山梨醇酯的去垢劑?；诰凵嚼娲减サ娜ス竸┑睦邮峭ㄟ^聚乙氧基化脫水山梨 糖醇與脂肪酸共價結(jié)合所衍生的去垢劑。基于聚山梨醇酯的去垢劑的更具體實施方案是聚 山梨醇酯-20、聚山梨醇酯-40和聚山梨醇酯-80。
[0111] 例如，聚山梨醇酯80 (Tween-80)是從聚乙氧基化脫水山梨糖醇和油酸衍生并具 有以下結(jié)構(gòu)的非離子型去垢劑：
[0112]

【權(quán)利要求】
1. 包含基于油的液態(tài)制劑的口服藥物組合物，其中，所述基于油的液態(tài)制劑包含達 100千道爾頓的治療性蛋白、二價陽離子的螯合劑和分離的BBI。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的口服藥物組合物，其中，通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝 膠電泳（SDS-PAGE)測量，所述BBI已經(jīng)純化到至少85%的純度。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的口服藥物組合物，其中，通過BCA(二羧基二喹啉）的測定法， 所述BBI已經(jīng)純化到大于95%的蛋白質(zhì)含量。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的口服藥物組合物，其中，所述BBI含有小于0. 1 %高分子量雜 質(zhì)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的口服藥物組合物，其中，所述基于油的液態(tài)制劑還包含不同 于所述BBI的胰蛋白酶抑制物。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的口服藥物組合物，其中，所述胰蛋白酶抑制物是KTI3。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的口服藥物組合物，其中，通過SDS-PAGE測量，所述KTI3已經(jīng) 純化到至少85 %的純度。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的口服藥物組合物，其中，所述KTI3已經(jīng)純化到通過BCA測定 法所測量的大于95%的蛋白質(zhì)含量。
9. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的口服藥物組合物，其中，所述KTI3含有小于0. 1%高分子量 雜質(zhì)。
10. 包含基于油的液態(tài)制劑的口服藥物組合物，其中，所述基于油的液態(tài)制劑包含達 100千道爾頓的治療性蛋白和二價陽離子的螯合劑，并且所述液態(tài)制劑具有抑制至少40mg 胰凝乳蛋白酶/ml液態(tài)制劑的抗胰凝乳蛋白酶活性。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的口服藥物組合物，其中，所述液態(tài)制劑還包含抑制至少 20mg胰蛋白酶/ml液態(tài)制劑的抗胰蛋白酶活性。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項所述的口服藥物組合物，其中，所述治療性蛋白選 自：胰島素、流感血凝素、流感神經(jīng)氨酸酶、胰高血糖素、干擾素 Y、干擾素 β、干擾素 α、 生長激素、促紅細胞生成素、GLP-1、GLP-1類似物、粒細胞集落刺激因子（G-CSF)、腎素、 生長激素釋放因子、甲狀旁腺激素、促甲狀腺激素、促卵泡激素、降鈣素、促黃體激素、胰高 血糖素、凝血因子、抗凝血因子、心鈉素、表面活性蛋白A(SP-A)、表面活性蛋白B(SP-B)、 表面活性蛋白C(SP-C)、表面活性蛋白D(SP-D)、纖維蛋白溶酶原激活物、鈴蟾肽、造血生 長因子（集落刺激因子，多種）、腫瘤壞死因子（TNF)蛋白、腦啡肽酶、RANTES(活化時受 調(diào)節(jié)，通常是T-細胞表達和分泌）、人巨噬細胞炎性蛋白（MIP-1-α )、血清白蛋白、繆勒 管抑制物質(zhì)、松弛素、小鼠促性腺素釋放激素、DNA酶、抑制素、活化素、血管內(nèi)皮生長因子 (VEGF)、神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-4、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-5或神經(jīng)營養(yǎng)蛋 白-6 (NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)、神經(jīng)生長因子、血小板衍生的生長因子（PDGF)、成纖維細 胞生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF)、胰島素樣生長因子-I和胰島素樣生長因子-II (IGF-I和 IGF-II)、des(l-3)-IGF-I (腦 IGF-I)、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白 l(IGFBP-l)、IGFBP-2、 IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5、IGFBP-6、角質(zhì)形成細胞生長因子、骨誘導(dǎo)因子、骨形態(tài)發(fā)生蛋 白（BMP)-2、BMP-7、集落刺激因子（CSF)、白介素（IL)、超氧化物歧化酶、衰變加速因子、趨 化因子家族成員和補體因子。
13. 根據(jù)權(quán)利要12求所述的口服藥物組合物，其中，所述治療性蛋白選自胰島素和 GLP-1類似物。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1-13中任一項所述的口服藥物組合物，其中，所述螯合劑是EDTA。
15. 根據(jù)權(quán)利要求中1-14任一項所述的口服藥物組合物，其中，所述基于油的液態(tài)制 劑還包含單酰甘油、二酰甘油、三酰甘油或其混合物的聚乙二醇（PEG)酯。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的口服藥物組合物，其中，所述基于油的液態(tài)制劑還包含游 離的PEG。
17. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的口服藥物組合物，其中，所述PEG酯作為以下的混合物提 供：(a)單酰甘油、二酰甘油、三酰甘油或其混合物；和（b)脂肪酸的聚乙二醇（PEG)酯。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的口服藥物組合物，其中所述混合物的部分（a)包含C8-C18 單酰甘油、二酰甘油和三酰甘油。
19. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的口服藥物組合物，其中，所述混合物的部分（b)包含C8-C18 脂肪酸的混合物的PEG單酯和二酯。
20. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的口服藥物組合物，其中，所述混合物的部分（a)包含C8-C18 單酰甘油、二酰甘油和三酰甘油；所述混合物的部分（b)包含C8-C18脂肪酸的混合物的 PEG-32單酯和二酯；所述基于油的液態(tài)制劑還包含（c)游離PEG-32 ;并且所述混合物的部 分（a)對所述混合物的部分（b)和（c)的總和的重量/重量比在10:90和30:70之間，包 括端值。
21. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的口服藥物組合物，其中，（a)、(b)和（c) 一起占所述基于油 的液態(tài)制劑的8-16%重量/重量，包括端值。
22. 根據(jù)權(quán)利要求15-21中任一項所述的口服藥物組合物，還包括非離子型去垢劑。
23. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的口服藥物組合物，其中，所述非離子型去垢劑是基于聚山 梨醇酯的去垢劑。
24. 根據(jù)權(quán)利要求23所述的口服藥物組合物，其中，所述基于聚山梨醇酯的去垢劑是 聚山梨醇酯80。
25. 根據(jù)權(quán)利要求24所述的口服藥物組合物，其中，所述聚山梨醇酯80占所述基于油 的液態(tài)制劑的3-10%重量/重量，包括端值。
26. 根據(jù)權(quán)利要求1-25中任一項所述的口服藥物組合物，其中，所述油是魚油。
27. 根據(jù)權(quán)利要求1-26中任一項所述的口服藥物組合物，其中，所述基于油的液態(tài)制 劑是無水的。
28. 根據(jù)權(quán)利要求1-27中任一項所述的口服藥物組合物，還包含抵抗胃中降解的包 衣。
29. 根據(jù)權(quán)利要求28所述的口服藥物組合物，其中，所述包衣是pH敏感膠囊。
30. 根據(jù)權(quán)利要求28所述的口服藥物組合物，其中，所述包衣是軟明膠膠囊。
31. 根據(jù)權(quán)利要求1-30中任一項所述的口服藥物組合物，用于向受試者口服施用治療 性蛋白。
32. 根據(jù)權(quán)利要求1-30中任一項所述的口服藥物組合物在制備向受試者口服施用治 療性蛋白的藥物中的用途。
33. 向受試者口服施用治療性蛋白的方法，所述方法包括以下步驟：向受試者施用根 據(jù)權(quán)利要求1-30中任一項所述的口服藥物組合物，由此向受試者口服施用治療性蛋白。
【文檔編號】A61K9/08GK104244969SQ201380018355
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2013年1月31日 優(yōu)先權(quán)日:2012年2月1日
【發(fā)明者】亞伯拉罕·赫斯赫克 申請人:奧拉姆德有限公司