含有海藻糖的用于預(yù)防肺栓塞形成的哺乳動(dòng)物細(xì)胞懸浮液的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明的課題是提供能夠預(yù)防在經(jīng)由血管施予哺乳動(dòng)物干細(xì)胞等哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)的肺栓塞形成的哺乳動(dòng)物細(xì)胞懸浮液、和預(yù)防在經(jīng)由血管施予哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)的肺栓塞形成的預(yù)防劑。本發(fā)明的特征在于將哺乳動(dòng)物干細(xì)胞等哺乳動(dòng)物細(xì)胞懸浮于含有海藻糖或其衍生物或它們的鹽作為有效成分的生理性水溶液中，從而制作含有哺乳動(dòng)物細(xì)胞及海藻糖或其衍生物或它們的鹽作為有效成分的、用于預(yù)防在經(jīng)由血管施予哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)的肺栓塞形成的哺乳動(dòng)物細(xì)胞懸浮液。作為所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞，除哺乳動(dòng)物干細(xì)胞以外，還可以舉出胰島細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、α·βT細(xì)胞、γ·δT細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞等，此外，作為上述哺乳動(dòng)物干細(xì)胞，可以合適地舉出哺乳動(dòng)物間充質(zhì)干細(xì)胞或哺乳動(dòng)物亞全能干細(xì)胞。
【專利說(shuō)明】含有海藻糖的用于預(yù)防肺栓塞形成的晡乳動(dòng)物細(xì)胞懸淳液

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及含有哺乳動(dòng)物細(xì)胞及海藻糖或其衍生物或它們的鹽的、用于預(yù)防在經(jīng) 由血管施予哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)的肺栓塞形成的哺乳動(dòng)物細(xì)胞懸浮液，還涉及含有海藻糖或其 衍生物或它們的鹽作為有效成分的、預(yù)防在經(jīng)由血管施予哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)的肺栓塞形成的 預(yù)防劑等。

【背景技術(shù)】
[0002] 近年來(lái)，由于干細(xì)胞研究的迅速發(fā)展，向再生醫(yī)療中應(yīng)用的形勢(shì)高漲，其知識(shí)和理 解不僅在研究者中、在普通人中也得到了廣泛普及。使用干細(xì)胞的再生醫(yī)療是以利用干細(xì) 胞所具有的自復(fù)制能力和多分化能力、干細(xì)胞分泌的因子來(lái)恢復(fù)因各種疾病而受到損傷的 細(xì)胞和組織的功能為目的的醫(yī)療。若對(duì)白血病、再生不良性貧血等血液疑難病患者進(jìn)行骨 髓移植，則造血干細(xì)胞在患者體內(nèi)成活，有可能在幾乎一生內(nèi)維持造血能力。此外，近來(lái)很 多研究者以使用除造血干細(xì)胞以外的干細(xì)胞的臨床應(yīng)用為目標(biāo)，對(duì)中樞神經(jīng)、末梢神經(jīng)、骨 髓、小腸等中的干細(xì)胞進(jìn)行鑒定，已開(kāi)始實(shí)踐針對(duì)外傷性疾病和組織變性疾病進(jìn)行組織干 細(xì)胞移植治療（非專利文獻(xiàn)1?3)。
[0003]認(rèn)為為了將哺乳動(dòng)物干細(xì)胞效率良好地移植至目標(biāo)損傷部位（患部），實(shí)現(xiàn)干細(xì) 胞移植方法（移植途徑）的優(yōu)化是重要的。目前為止，作為干細(xì)胞的移植方法，已知主要有 4種方法，即，定位性[直接]移植法、髓腔內(nèi)[腦脊液內(nèi)]移植法、經(jīng)靜脈移植法以及經(jīng)動(dòng) 脈移植法。其中，定位性移植法是直接向患部移入干細(xì)胞的方法。使用定位性移植法時(shí)，雖 然侵入性略高，但是由于直接施予至患部，所以成活的供體干細(xì)胞多，因此可減少施予的干 細(xì)胞數(shù)。此外，髓腔內(nèi)移植法是通過(guò)腦室穿刺將干細(xì)胞移入髓腔內(nèi)的方法。髓腔內(nèi)移植法 是主要為了用于治療腦梗塞、腦挫傷、脊髓損傷等腦疾病而正被研究的方法，但在臨床應(yīng)用 上仍留有諸多問(wèn)題，如腦室穿刺潛在導(dǎo)致新的腦損傷的風(fēng)險(xiǎn)等。
[0004]經(jīng)靜脈移植法及經(jīng)動(dòng)脈移植法是將干細(xì)胞等細(xì)胞分別移入靜脈及動(dòng)脈內(nèi)的方法 (經(jīng)由血管施予法）。使用經(jīng)由血管施予法時(shí)，雖然成活的供體干細(xì)胞數(shù)比使用定位性移 植法時(shí)要少，但侵入性較低，并且可以使干細(xì)胞等細(xì)胞、干細(xì)胞等細(xì)胞分泌的因子在全身循 環(huán)。目前，作為在臨床中進(jìn)行的經(jīng)由血管施予法，已知有下述方法：針對(duì)腦梗塞疾病以經(jīng)靜 脈的方式移植間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal Stem Cells ;MSC)的方法；針對(duì)腦梗塞疾病以 經(jīng)靜脈的方式移植單核細(xì)胞的方法；和向I型糖尿病患者以經(jīng)靜脈的方式移植胰島細(xì)胞的 方法等。
[0005]作為采用經(jīng)血管施予法移植干細(xì)胞等細(xì)胞時(shí)的風(fēng)險(xiǎn)，已指出經(jīng)動(dòng)脈或經(jīng)靜脈施予 的細(xì)胞在通過(guò)肺時(shí)成為在肺動(dòng)脈的毛細(xì)血管中堵塞的狀態(tài)（肺栓塞），結(jié)果導(dǎo)致肺功能、心 功能降低（肺栓塞癥），根據(jù)情況存在致死的危險(xiǎn)性。為了將肺栓塞形成、肺栓塞癥防患于 未然，在臨床的現(xiàn)場(chǎng)中，在用脈搏氧飽和度儀（Pulse oxymeters)監(jiān)測(cè)干細(xì)胞施予中的末梢 血氧分壓的同時(shí)進(jìn)行干細(xì)胞的移植。
[0006] 另一方面，海藻糖（trehalose)為葡萄糖以1，1-糖苷鍵鍵合而成的二糖之一。海 藻糖呈甜味、且具有高的保水力，因此被用于各種食品、化妝品中。此外，海藻糖具有使細(xì)胞 膜穩(wěn)定、抑制細(xì)胞損傷的性質(zhì)，因此被用作移植器官時(shí)的器官保護(hù)液的有效成分。已研制了 ET-Kyoto液和New ET-Kyoto液等含有海藻糖的優(yōu)異的器官保存液（專利文獻(xiàn)1及2,非專 利文獻(xiàn)4)。但是，將干細(xì)胞等細(xì)胞懸浮于含有海藻糖的溶液中、經(jīng)由血管施予細(xì)胞懸浮液 時(shí)，由細(xì)胞引起的肺栓塞形成的風(fēng)險(xiǎn)是否降低、肺栓塞癥是否能被預(yù)防尚不明確。
[0007] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0008] 專利文獻(xiàn)
[0009] 專利文獻(xiàn)1:日本專利第3253131號(hào)公報(bào)
[0010] 專利文獻(xiàn)2:國(guó)際公開(kāi)第2007/043698號(hào)小冊(cè)子
[0011] 非專利文獻(xiàn)
[0012] 非專利文獻(xiàn) 1:Gage, F.H. Science 287:1433-1438(2000)
[0013]非專利文獻(xiàn) 2:Morrison, S. J. et al.，Cell 96:737-749(1999)
[0014]非專利文獻(xiàn) 3:Batle，E. et al.，Cell 111:251-263(2002)
[0015]非專利文獻(xiàn) 4: Chem, F. et al.，Yonsei Med. J. 45:1107-1114 (2004)


【發(fā)明內(nèi)容】

[0016] 本發(fā)明的課題在于提供能夠預(yù)防在經(jīng)由血管施予哺乳動(dòng)物干細(xì)胞等哺乳動(dòng)物細(xì) 胞時(shí)的肺栓塞形成的哺乳動(dòng)物細(xì)胞懸浮液、和預(yù)防在經(jīng)由血管施予哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)的肺栓 塞形成預(yù)防劑。
[0017] 本申請(qǐng)的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，如果將哺乳動(dòng)物干細(xì)胞懸浮于含有海藻糖的溶液中，則哺 乳動(dòng)物干細(xì)胞的凝集將被抑制、存活率的降低將被抑制（日本專利申請(qǐng)2010-251273)。作 為由干細(xì)胞移植引起的肺栓塞形成的原因，認(rèn)為是干細(xì)胞凝集產(chǎn)生的細(xì)胞塊堵塞了肺動(dòng)脈 的毛細(xì)血管，但是，干細(xì)胞、例如間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal Stem Cells ;MSC)的大小為 10?50 ii m，而與之相對(duì)，肺動(dòng)脈的毛細(xì)血管的內(nèi)徑為10 ii m，MSC比肺動(dòng)脈的毛細(xì)血管內(nèi)徑 更大，因此，還可充分地認(rèn)為單純地僅通過(guò)阻礙細(xì)胞凝集無(wú)法阻礙由干細(xì)胞引起的肺栓塞 形成。本申請(qǐng)的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)：將MSC懸浮于含有海藻糖的乳酸林格溶液（Lactated Ringer Solution)中、將含有海藻糖的懸浮有MSC的乳酸林格溶液靜脈施予大鼠的情況下，在施予 期間或施予后未發(fā)現(xiàn)血氧分壓降低，此外，MSC群在肺中的集聚與對(duì)照組（使用不含海藻糖 的乳酸林格溶液或生理鹽水作為懸浮液）相比有所減少，本申請(qǐng)的發(fā)明人從而完成了本發(fā) 明。
[0018] 即，本發(fā)明涉及下述哺乳動(dòng)物細(xì)胞懸浮液：⑴含有哺乳動(dòng)物細(xì)胞及海藻糖或其 衍生物或它們的鹽的、用于預(yù)防在經(jīng)由血管施予哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)的肺栓塞形成的哺乳動(dòng)物 細(xì)胞懸浮液；（2)如上述（1)所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞懸浮液，其中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞為哺乳動(dòng)物 干細(xì)胞；（3)如上述（2)所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞懸浮液，其中，哺乳動(dòng)物干細(xì)胞為哺乳動(dòng)物間 充質(zhì)干細(xì)胞或哺乳動(dòng)物亞全能干細(xì)胞；(4)如上述（1)?（3)中任一項(xiàng)所述的哺乳動(dòng)物細(xì) 胞懸浮液，其中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括處于單一細(xì)胞狀態(tài)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞；（5)如上述（1)? (4)中任一項(xiàng)所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞懸浮液，其中，海藻糖或其衍生物或它們的鹽的濃度在 0. 1?20%的范圍內(nèi)。
[0019] 此外，本發(fā)明涉及下述預(yù)防劑：(6)含有海藻糖或其衍生物或它們的鹽作為有效 成分，預(yù)防在經(jīng)由血管施予哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)的肺栓塞形成的預(yù)防劑；(7)如上述（6)所述的 預(yù)防劑，其中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞為哺乳動(dòng)物干細(xì)胞；(8)上述（7)所述的預(yù)防劑，其中，哺乳動(dòng) 物干細(xì)胞為哺乳動(dòng)物間充質(zhì)干細(xì)胞或哺乳動(dòng)物亞全能干細(xì)胞。
[0020] 進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及下述應(yīng)用：(9)海藻糖或其衍生物或它們的鹽用于制備預(yù) 防在經(jīng)由血管施予哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)的肺栓塞形成的預(yù)防劑的應(yīng)用；（10)如上述（9)所述的 應(yīng)用，其中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞為哺乳動(dòng)物干細(xì)胞。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明，能夠減少在經(jīng)由血管施予哺乳動(dòng)物干細(xì)胞等哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)的肺栓 塞形成的風(fēng)險(xiǎn)，能夠降低肺栓塞癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0022] [圖1]為表不對(duì)分別施予了 3種MSC懸浮液（懸浮有MSC的生理鹽水[…▲…]、 懸浮有MSC的乳酸林格溶液[…?…]以及含有海藻糖的懸浮有MSC的乳酸林格溶液[一 一])的大鼠的血氧分壓（P〇2)進(jìn)行測(cè)定所得的結(jié)果的圖?？v軸表示血氧分壓。需要說(shuō) 明的是，血氧分壓以將MSC懸浮液施予前（0分鐘）的血氧分壓設(shè)為1時(shí)的相對(duì)值的方式表 示。此外，橫軸表示MSC懸浮液施予開(kāi)始后的時(shí)間。
[0023][圖2]為表示對(duì)分別施予了 3種MSC懸浮液（懸浮有MSC的生理鹽水、懸浮有MSC 的乳酸林格溶液以及含有海藻糖的懸浮有MSC的乳酸林格溶液）的大鼠（分別為圖中的左 偵I中間及右側(cè)）的MSC體內(nèi)分布進(jìn)行成像（imaging)分析所得的結(jié)果的圖。

【具體實(shí)施方式】
[0024]作為本發(fā)明的用于預(yù)防在經(jīng)由血管施予哺乳動(dòng)物干細(xì)胞等哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)的肺 栓塞形成的哺乳動(dòng)物細(xì)胞懸浮液，只要為含有哺乳動(dòng)物干細(xì)胞等哺乳動(dòng)物細(xì)胞及海藻糖或 其衍生物或它們的鹽（以下，稱作海藻糖類）的懸浮液即可，沒(méi)有特別限定，此外，作為本發(fā) 明的預(yù)防在經(jīng)由血管施予哺乳動(dòng)物干細(xì)胞等哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)的肺栓塞形成的預(yù)防劑，只要 為含有海藻糖類作為有效成分的組合物即可，沒(méi)有特別限定，作為上述哺乳動(dòng)物，可以舉出 小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠、豚鼠等嚙齒類，兔等兔形目，豬、牛、山羊、馬、綿羊等有蹄目，狗、貓等食肉 目，人、猴、獼猴、食蟹猴、狨猴、猩猩（orangutanan)、黑猩猩等靈長(zhǎng)類等，其中，可以合適地 舉出小鼠、豬、人，此外，作為上述哺乳動(dòng)物細(xì)胞，除了在再生醫(yī)療等中經(jīng)由血管施予的哺乳 動(dòng)物干細(xì)胞以外，可以舉出經(jīng)靜脈施予至I型糖尿病患者的哺乳動(dòng)物胰島細(xì)胞、經(jīng)靜脈施 予至癌癥患者的哺乳動(dòng)物樹(shù)突狀細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、a ? 0 (a 0)T細(xì)胞、Y ? S (Y S)T 細(xì)胞、細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte ;CTL)等。
[0025] 此外，上述"干細(xì)胞"是指具有自復(fù)制能力及分化?增殖能力的未成熟的細(xì)胞。干細(xì) 胞根據(jù)分化能力包括亞全能干細(xì)胞（pluripotent stem cell)、多能干細(xì)胞（multipotent stem cell)、單能干細(xì)胞（unipotent stem cell)等亞群。所謂亞全能干細(xì)胞，是指雖然其 自身不能形成為個(gè)體、但具有能分化成構(gòu)成生物體的所有組織和細(xì)胞的能力的細(xì)胞。所謂 多能干細(xì)胞，是指雖不能分化成所有種類的組織和細(xì)胞，但具有能分化成多種組織和細(xì)胞 的能力的細(xì)胞。所謂單能干細(xì)胞，是指具有能分化成特定的組織和細(xì)胞的能力的細(xì)胞。
[0026] 作為亞全能干細(xì)胞，可以舉出胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）、EG細(xì)胞、iPS細(xì)胞等。ES 細(xì)胞可以通過(guò)將內(nèi)部細(xì)胞塊于飼養(yǎng)細(xì)胞（feeder cell)上或含有LIF的培養(yǎng)基中進(jìn)行培 養(yǎng)來(lái)制造。ES細(xì)胞的制造方法已記載在例如W096/22362、W002/101057、US5、843、780、 US6、200、806、US6、280、718等中。EG細(xì)胞可以通過(guò)將原始生殖細(xì)胞于含有mSCF、LIF及 bFGF的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)來(lái)制造（Cell, 70:841-847, 1992)。iPS細(xì)胞可以通過(guò)向體細(xì)胞 (例如成纖維細(xì)胞、皮膚細(xì)胞等）中導(dǎo)入0ct3/4、Sox2及Klf4 (根據(jù)需要還可導(dǎo)入c-Myc 或 n_Myc)等重編程因子（Reprogramming factor)來(lái)制造（Cell, 126:p. 663-676, 2006 ; Nature, 448:p. 313-317, 2007 ；Nat Biotechnol, 26 ；p, 101-106, 2008 ；Cell 13l:p. 861 - 872, 2007 ;Science，318:p. 1917-1920, 2007 ;Cell Stem Cells l:p. 55-70, 2007 ;Nat Biotechno1，25:p. 1177-1181，2007 ;Nature，448:p. 318-324, 2007 ; Cell Stem Cells 2:p. 10-12, 2008; Nature 45 1 :p. 14 1-146, 2008 ； Science, 318:p. 1917-1920, 2007)。此外，通過(guò)對(duì)移植體細(xì)胞的細(xì)胞核而制作獲得的早 期胚進(jìn)行培養(yǎng)而建立的干細(xì)胞也優(yōu)選用作為亞全能干細(xì)胞（Nature，385, 810(1997); Science, 280, 1256 (1998) ； Na t u r e Biotechnology, 17, 456 (1999)； Nature, 394, 369 (1998) ；Nature Genetics, 22, 127 (1999) ；Proc. Nat l.Acad. Sci. USA, 96, 14984 (1999) )，Rideout III 等人（Nature Genetics, 24, 109 (2000))。
[0027] 作為多能干細(xì)胞，可以舉出能分化成脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等細(xì) 胞的間充質(zhì)干細(xì)胞，能分化成白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板等血細(xì)胞系細(xì)胞的造血干細(xì)胞，能分 化成神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞等細(xì)胞的神經(jīng)干細(xì)胞，骨髓干細(xì)胞、生殖干細(xì)胞 等成體干細(xì)胞等。多能干細(xì)胞優(yōu)選為間充質(zhì)干細(xì)胞。所謂間充質(zhì)干細(xì)胞，是指能分化成成 骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞及成脂肪細(xì)胞中的全部或幾種的干細(xì)胞。功能性干細(xì)胞可以通過(guò)本身 已知的方法從生物體分離得到。例如，間充質(zhì)干細(xì)胞可以采用已知的一般性方法從哺乳動(dòng) 物的骨髓、脂肪組織、末梢血、臍帶血等中采集。例如，可以通過(guò)骨髓穿刺后的造血干細(xì)胞等 的培養(yǎng)、傳代來(lái)分離人間充質(zhì)干細(xì)胞（Journal of Autoimmunity, 30 (2008) 163-171)。多能 干細(xì)胞也可以通過(guò)將上述亞全能干細(xì)胞于合適的誘導(dǎo)條件下進(jìn)行培養(yǎng)來(lái)獲得。
[0028] 作為本發(fā)明的哺乳動(dòng)物細(xì)胞懸浮液中含有的干細(xì)胞等細(xì)胞，可以舉出貼附性的細(xì) 胞。雖然貼附性的細(xì)胞容易在懸浮液中發(fā)生凝集，但由于本發(fā)明的懸浮液中含有海藻糖類， 所以可以有效地抑制該凝集。本說(shuō)明書中，所謂"貼附性"細(xì)胞，是指可通過(guò)粘附于支持物 上來(lái)進(jìn)行生存、增殖、物質(zhì)生產(chǎn)的支持物依賴性細(xì)胞。作為貼附性干細(xì)胞，可以舉出亞全能 干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞、生殖干細(xì)胞等。貼附性干細(xì)胞優(yōu)選為間充 質(zhì)干細(xì)胞或亞全能干細(xì)胞。
[0029] 哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以是從生物體內(nèi)分離而獲得的，也可以是在體外進(jìn)行傳代培養(yǎng)而 獲得的。此外，本發(fā)明的哺乳動(dòng)物細(xì)胞懸浮液中含有的哺乳動(dòng)物細(xì)胞（群）優(yōu)選是經(jīng)分離 或純化而獲得的。本說(shuō)明書中，所謂"分離或純化"，是指施行將除目標(biāo)成分以外的成分除去 的操作。經(jīng)分離或純化獲得的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的純度（相對(duì)于總細(xì)胞數(shù)而言的、哺乳動(dòng)物干 細(xì)胞數(shù)等目標(biāo)細(xì)胞的比例）通常為30%以上、優(yōu)選為50%以上、更優(yōu)選為70%以上、進(jìn)一步 優(yōu)選為90%以上（例如100% )。
[0030]本發(fā)明的懸浮液中含有的哺乳動(dòng)物細(xì)胞（群）優(yōu)選含有單一細(xì)胞（單個(gè)細(xì)胞， single cell)狀態(tài)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。本說(shuō)明書中，所謂"單一細(xì)胞狀態(tài)"，是指未與其他細(xì)胞 聚集成塊（即，未凝集的狀態(tài)）。單一細(xì)胞狀態(tài)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以通過(guò)用胰蛋白酶/EDTA 等對(duì)經(jīng)體外培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行酶處理來(lái)制備。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中含有的單一細(xì)胞狀態(tài) 的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的比例通常為70%以上、優(yōu)選為90%以上、更優(yōu)選為95%以上、進(jìn)一步優(yōu) 選為99%以上（例如100% )。單一細(xì)胞狀態(tài)的細(xì)胞的比例可如下進(jìn)行確定：將哺乳動(dòng)物 細(xì)胞分散于PBS中，于顯微鏡下對(duì)其進(jìn)行觀察，調(diào)查隨機(jī)選擇的多個(gè)（例如1000個(gè)）細(xì)胞 是否凝集。
[0031] 本發(fā)明的懸浮液中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞優(yōu)選處于游離狀態(tài)。本說(shuō)明書中，所謂"游離"， 是指細(xì)胞以不與容納懸浮液的容器內(nèi)壁接觸的方式被保持在懸浮液中。
[0032] 作為本發(fā)明中使用的海藻糖類中的海藻糖，除了作為兩分子a-葡萄糖以1，1_糖 苷鍵鍵合而成的二糖類的a，a-海藻糖以外，還可以舉出作為a-葡萄糖和葡萄糖以 1，1_糖苷鍵鍵合而成的二糖類的a，海藻糖、作為兩分子葡萄糖以1，1-糖苷鍵鍵 合而成的二糖類的0，海藻糖，其中，優(yōu)選a，a-海藻糖。上述海藻糖可以通過(guò)化學(xué)合 成、利用微生物的生產(chǎn)、利用酶的生產(chǎn)等任意已知的方法來(lái)制造，也可以使用市售品。例如， 可以舉出a，a-海藻糖（林原商事銷售公司制）、a，a-海藻糖（和光純藥公司制）等市 售品。
[0033] 作為本發(fā)明中使用的海藻糖類中的海藻糖衍生物，只要為在二糖類的海藻糖上鍵 合有1個(gè)或更多個(gè)糖單元的糖基海藻糖類即可，沒(méi)有特別限定，糖基海藻糖類包括葡糖基 海藻糖、麥芽糖基海藻糖、麥芽三糖基海藻糖（Maltotriosyltrehalose)等。
[0034] 作為本發(fā)明中使用的海藻糖類中的海藻糖或其衍生物的鹽，可以舉出例如鹽酸 鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、磷酸鹽、硝酸鹽、硫酸鹽、乙酸鹽、丙酸鹽、甲苯磺酸鹽、琥珀酸鹽、 草酸鹽、乳酸鹽、酒石酸鹽、乙醇酸鹽、甲磺酸鹽、丁酸鹽、戊酸鹽、檸檬酸鹽、富馬酸鹽、馬來(lái) 酸鹽、蘋果酸鹽等酸加成鹽，鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽等金屬鹽，銨鹽、烷基銨鹽等。需要說(shuō)明的是， 上述鹽在使用時(shí)制成溶液來(lái)使用，其作用優(yōu)選與使用海藻糖的情況效果相同。上述鹽類也 可以形成水合物或溶劑合物，此外，可以單獨(dú)使用任一種或適當(dāng)?shù)亟M合使用2種以上。
[0035] 作為適用于本發(fā)明的哺乳動(dòng)物細(xì)胞懸浮液和肺栓塞形成預(yù)防劑中的海藻糖類濃 度，只要為能夠預(yù)防由干細(xì)胞等細(xì)胞引起的肺栓塞形成的濃度即可，可以根據(jù)懸浮的細(xì)胞 數(shù)、細(xì)胞濃度進(jìn)行適當(dāng)選擇，優(yōu)選為足以抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞凝集和存活率降低的濃度。海藻 糖類的濃度越高，在除了能預(yù)防肺栓塞形成的效果之外、對(duì)凝集和存活率降低的抑制效果 也越高，但是如果海藻糖類濃度過(guò)高，則可能對(duì)細(xì)胞的存活率產(chǎn)生不利影響。例如，應(yīng)用于 本發(fā)明的哺乳動(dòng)物細(xì)胞懸浮液和肺栓塞形成預(yù)防劑的海藻糖類濃度通常為〇. 1 %以上、優(yōu) 選為0.5%以上、更優(yōu)選為1.0%以上，此外，從避免對(duì)干細(xì)胞的存活率產(chǎn)生不利影響的觀 點(diǎn)考慮，通常為20%以下、優(yōu)選為15%以下、更優(yōu)選為5. 0%以下。因此，懸浮液中的海藻糖 類的濃度為〇? 1?20%、優(yōu)選為0.5?15%、更優(yōu)選為1.0?5.0%。
[0036] 本發(fā)明中，所謂經(jīng)由血管施予時(shí)的"肺栓塞形成"，是指經(jīng)動(dòng)脈或經(jīng)靜脈移植（施 予）的哺乳動(dòng)物細(xì)胞形成堵塞肺的末梢動(dòng)脈系統(tǒng)（例如1條或2條以上的肺動(dòng)脈的毛細(xì)血 管）的狀態(tài)。所謂上述移植的哺乳動(dòng)物細(xì)胞將肺的末梢動(dòng)脈系統(tǒng)"堵塞的狀態(tài)"，不一定要 細(xì)胞停止在肺的末梢動(dòng)脈系統(tǒng)中，只要妨礙了該處的血流即可。此外，此時(shí)的血流不需要完 全停止，從廣義上來(lái)講只要產(chǎn)生了使肺功能降低的程度的血流降低即可。上述"肺功能"在 根本上是指向血中攝入來(lái)自空氣中的氧，但也包括二氧化碳或其他氣體的排出。如果發(fā)生 由細(xì)胞引起的肺栓塞形成，則肺動(dòng)脈的毛細(xì)血管中的血流降低，產(chǎn)生呼吸急促（呼吸數(shù)增 力口）或心動(dòng)過(guò)速（心跳數(shù)增加），肺動(dòng)脈壓等血壓上升，或者血氧分壓降低。因此，通過(guò)預(yù) 防由細(xì)胞移植引起的肺栓塞的形成，可以減小由肺栓塞引起的呼吸急促、心動(dòng)過(guò)速、血壓上 升、血氧分壓降低等的風(fēng)險(xiǎn)。此外，如果由細(xì)胞移植而引起肺栓塞形成，則根據(jù)情況有可能 會(huì)導(dǎo)致肺功能降低、心功能（使血液移動(dòng)至動(dòng)脈內(nèi)部的功能和心臟使血液移動(dòng)至靜脈外部 的功能等）降低等肺栓塞癥發(fā)病。進(jìn)一步地，本發(fā)明中的肺栓塞形成也包括形成哺乳動(dòng)物 細(xì)胞堵塞肺的外周動(dòng)脈系統(tǒng)并且堵塞除此以外的血管的狀態(tài)的情況。
[0037]本發(fā)明的哺乳動(dòng)物細(xì)胞懸浮液中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞通常被懸浮于含有海藻糖類作為 有效成分的生理性水溶液中。另一方面，本發(fā)明的肺栓塞形成預(yù)防劑可大致分為液體型和 非液體型。液體型預(yù)防劑通常作為其中含有海藻糖類作為有效成分的生理性水溶液的形式 構(gòu)成，如果將哺乳動(dòng)物細(xì)胞懸浮于所述液體型預(yù)防劑中，則可以制備本發(fā)明的哺乳動(dòng)物細(xì) 胞懸浮液。此外，非液體型預(yù)防劑通常作為將被添加進(jìn)懸浮有哺乳動(dòng)物細(xì)胞的生理性水溶 液中的粉狀等的含有海藻糖類的物質(zhì)的形式構(gòu)成，如果將所述非液體型預(yù)防劑加入懸浮有 哺乳動(dòng)物細(xì)胞的生理性水溶液中，則可以制備本發(fā)明的哺乳動(dòng)物細(xì)胞懸浮液。
[0038]進(jìn)而，作為不同于本發(fā)明的哺乳動(dòng)物細(xì)胞懸浮液的方案，可以舉出在經(jīng)由血管施 予含有哺乳動(dòng)物細(xì)胞及海藻糖類的哺乳動(dòng)物細(xì)胞懸浮液的干細(xì)胞等細(xì)胞移植中預(yù)防肺栓 塞形成的方法，此外，作為不同于本發(fā)明的肺栓塞形成預(yù)防劑的方案，可以舉出海藻糖類用 于制備預(yù)防在經(jīng)由血管施予哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)的肺栓塞形成的預(yù)防劑的應(yīng)用。
[0039] 作為上述生理性水溶液，可以舉出例如生理鹽水、磷酸緩沖生理鹽水、Tris緩沖 生理鹽水、HEPES緩沖生理鹽水、林格液（乳酸林格液、乙酸林格液、碳酸氫鹽林格液等）、 5%葡萄糖水溶液、用于哺乳動(dòng)物培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基、等滲劑（葡萄糖、D-山梨糖醇、D-甘 露糖醇、乳糖、氯化鈉等）的水溶液等等滲水溶液，其中，優(yōu)選林格液，更優(yōu)選乳酸林格液、 乙酸林格液或碳酸氫鹽林格液，進(jìn)一步優(yōu)選乳酸林格液。本說(shuō)明書中"等滲"是指浸透壓在 250?380m0sm/l的范圍內(nèi)。生理性水溶液可以進(jìn)一步含有穩(wěn)定劑（例如，人血清白蛋白、 聚乙二醇等）、緩沖劑（例如，磷酸鹽緩沖液、乙酸鈉緩沖液）、螯合劑（例如，EDTA、EGTA、檸 檬酸、水楊酸鹽）、助溶劑、保存劑、抗氧化劑等。
[0040] 可以將葡聚糖類與海藻糖類并用，對(duì)于所述葡聚糖類，本申請(qǐng)的發(fā)明人已確認(rèn)了 其與海藻糖類同樣地具有預(yù)防肺栓塞形成的作用。此外，也可以替代海藻糖類或者與海藻 糖類聯(lián)合使用可預(yù)期與海藻糖類同樣地具有預(yù)防肺栓塞形成的作用的麥芽糖、葡萄糖、蔗 糖、乳糖、阿洛糖、半乳糖、山梨糖醇、木糖醇、糊精、環(huán)糊精等。
[0041] 本發(fā)明的細(xì)胞懸浮液中含有的干細(xì)胞等細(xì)胞以游離狀態(tài)存在，雖然游離狀態(tài)的細(xì) 胞通常容易發(fā)生凝集，但是通過(guò)本發(fā)明的由海藻糖類產(chǎn)生的效果，細(xì)胞凝集被抑制，可以長(zhǎng) 時(shí)間地維持單一細(xì)胞的狀態(tài)。
[0042] 哺乳動(dòng)物細(xì)胞向含有海藻糖類的生理性水溶液中的懸浮可以通過(guò)吹吸 (pipetting)或輕拍（tapping)等該【技術(shù)領(lǐng)域】中的公知方法來(lái)實(shí)施。本發(fā)明的哺乳動(dòng)物細(xì) 胞懸浮液的溫度通常在〇?37°C的范圍內(nèi)、優(yōu)選在0?25°C的范圍內(nèi)。關(guān)于本發(fā)明的懸浮 液中的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的密度，只要為能夠預(yù)防由干細(xì)胞等細(xì)胞引起的肺栓塞形成的密度即 可，較優(yōu)選為能夠?qū)崿F(xiàn)抑制由海藻糖類引起的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的凝集和存活率降低的效果的 密度，通常在1〇 3?101CI個(gè)/ml的范圍內(nèi)。
[0043]本發(fā)明的哺乳動(dòng)物細(xì)胞懸浮液中，通過(guò)海藻糖類抑制了哺乳動(dòng)物細(xì)胞的凝集，因 此，通過(guò)使用本發(fā)明的懸浮液來(lái)實(shí)施細(xì)胞移植，可以減少細(xì)胞的凝集物在插管（cannula) 中堵塞的風(fēng)險(xiǎn)。此外，就本發(fā)明的哺乳動(dòng)物細(xì)胞懸浮液而言，通過(guò)海藻糖類，能夠抑制懸浮 液中的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的存活率降低，因此，若使用本發(fā)明的懸浮液，則可以利用狀態(tài)更好的 細(xì)胞來(lái)實(shí)施細(xì)胞移植，可以預(yù)期治療效果的提高。
[0044] 關(guān)于本發(fā)明的哺乳動(dòng)物細(xì)胞懸浮液和肺栓塞形成預(yù)防劑，可以通過(guò)容納至合適的 滅菌容器內(nèi)，制成哺乳動(dòng)物細(xì)胞懸浮液制劑和肺栓塞形成的預(yù)防制劑。作為上述容器，可以 舉出瓶、小瓶（vial)、注射器、輸液袋等可塑性袋、試管等。上述容器可由玻璃或塑料這樣的 各種材料形成。此外，在用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞懸浮液制劑的容器上，可以以能將容器內(nèi)的本發(fā) 明的哺乳動(dòng)物細(xì)胞懸浮液點(diǎn)滴注入至患者的方式連接插管和/或注射針。
[0045] 以下，通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更具體的說(shuō)明，但本發(fā)明的技術(shù)范圍并不限定于 這些示例。
[0046] 實(shí)施例1
[0047] 1.對(duì)本發(fā)明的干細(xì)胞懸浮用溶液能夠用于預(yù)防由干細(xì)胞引起的肺栓塞形成的確 認(rèn)
[0048] 1-1方法
[0049] 1-1-1用于靜脈施予至大鼠的MSC懸浮液的制備
[0050] 〔1〕通過(guò)胰蛋白酶消化處理來(lái)剝離來(lái)自Lew/SsN Sic系雌性大鼠脂肪的MSC，然后 以200 Xg離心3分鐘，回收細(xì)胞。
[0051] 〔2〕將1^0用011]^6(^〇磷酸緩沖鹽水（0-?1^)(1鮮;[1：1'08611公司制）制備成2\10 6 細(xì)胞/ml，然后將1 X 107細(xì)胞（5ml)分別注入3個(gè)試管中，分別向其中添加13 yl的8. 3mg/ ml XenoLight DiR熒光試劑（Caliper公司制，產(chǎn)品編號(hào)125964)，于37°C下對(duì)MSC標(biāo)記30 分鐘。
[0052] 〔3〕以200Xg離心3分鐘，除去標(biāo)記溶液，然后加入5ml的D-PBS，再次以200Xg 離心3分鐘，除去上清。將沉淀的細(xì)胞分別懸浮于生理鹽水（Otsuka Pharmaceutial Factory, Inc?制"大塚生食注")、乳酸林格溶液（Otsuka Pharmaceutial Factory, Inc?制 "Lactec Injection"）以及含有3% (30mg/ml)海藻糖（和光純藥公司制）的乳酸林格溶 液中，使MSC濃度為2 X 106細(xì)胞/ml，制作了 MSC懸浮生理鹽水、MSC懸浮乳酸林格溶液及 含有海藻糖的MSC懸浮乳酸林格溶液。
[0053] 1-1-2MSC懸浮液向大鼠的靜脈施予
[0054] 〔1〕大鼠使用Lew/SsN Sic系、雌性10周齡的大鼠。需要說(shuō)明的是，在施予MSC懸 浮液的24小時(shí)前施行了禁食。
[0055] 〔 2〕為了確保向大鼠施予的途徑，用固定器固定大鼠，將24G的Surf 1〇留置針插入 尾靜脈內(nèi)。
[0056] 〔3〕將50mg/kg戊巴比妥（共立制藥株式會(huì)社制）迅速施予至尾靜脈內(nèi)，進(jìn)行麻 醉處理。為了維持麻醉狀態(tài)，在1小時(shí)后補(bǔ)充施予25mg/kg戊巴比妥（共立制藥株式會(huì)社 制）。
[0057] 〔4〕為了防止血液凝固，經(jīng)由尾靜脈施予途徑施予100IU/kg肝素（持田制藥株式 會(huì)社制）。
[0058] 〔5〕通過(guò)切開(kāi)頸部暴露左頸動(dòng)脈，插入?固定聚氯乙烯管。
[0059]〔6〕使用體溫維持裝置（將株式會(huì)社Neuroscience制直腸溫探針插入3. 5cm)，將 體溫保持在37°C。
[0060] 〔7〕在氣管內(nèi)插管16G的塑料制留置針，留置針的另一端與呼吸機(jī)（respirator) 連接，設(shè)置于人工呼吸管理下（利用空氣進(jìn)行換氣，換氣量：l〇ml/kg/次，換氣次數(shù)：約70 程（stroke) / 分鐘）。
[0061] 〔8〕為了避免出現(xiàn)自發(fā)呼吸，經(jīng)由尾靜脈施予途徑施予肌肉松弛藥（2或4mg/kg Mioblock靜注；MSD株式會(huì)社制）。
[0062] 〔9〕為了對(duì)MSC懸浮液施予前的血液氣體分壓（氧分壓[p02]及二氧化碳分壓） (mmHg)進(jìn)行測(cè)定，從頸動(dòng)脈線（line)采血300ii 1。
[0063] 〔10〕將通過(guò)上述"1-1-1用于大鼠靜脈施予的MSC懸浮液的制備"中所述的方法 制作的3種MSC懸浮液（懸浮有MSC的生理鹽水、懸浮有MSC的乳酸林格溶液及含有海藻 糖的懸浮有MSC的乳酸林格溶液）通過(guò)尾靜脈分別施予至大鼠，施予進(jìn)行40分鐘。需要說(shuō) 明的是，以將懸浮有MSC的生理鹽水、懸浮有MSC的乳酸林格溶液及含有海藻糖的懸浮有 MSC的乳酸林格溶液分別靜脈施予至大鼠的組，分別作為懸浮有MSC的生理鹽水施予組（n =4)、懸浮有MSC的乳酸林格溶液施予組（n = 4)以及含有海藻糖的懸浮有MSC的乳酸林 格溶液施予組（n = 4)。
[0064] 1-1-3施予了 MSC懸浮液的大鼠的血氧分壓及MSC成像分析
[0065]〔 1〕從MSC懸浮液施予起到60分鐘后為止，每10分鐘從頸動(dòng)脈系統(tǒng)采血300 ill， 通過(guò)Chiron 348 (Siemens公司制）對(duì)血液氣體分壓（氧分壓[p02]及二氧化碳分壓） (mmHg)進(jìn)行測(cè)定。
[0066] 需要說(shuō)明的是，作為對(duì)照，使用在上述"1-1-2MSC懸浮液向大鼠的靜脈施予"的工 序〔8〕中于施予所制備的MSC懸浮液前采集的血液。
[0067] 〔2〕從MSC懸浮液施予起經(jīng)過(guò)60鐘后，由頸動(dòng)脈放血，使其安樂(lè)死。
[0068] 〔3〕摘出肺，通過(guò)使用 IVIS Spectrum(Caliper Lifesciences 公司制）的成像分 析對(duì)熒光及發(fā)光強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)定（激發(fā)波長(zhǎng)710nm，吸收波長(zhǎng)780nm)。
[0069] 1-2結(jié)果
[0070] 1-2-1對(duì)施予了 MSC懸浮液的大鼠的血氧分壓分析
[0071] 作為MSC懸浮液使用生理鹽水及乳酸林格溶液的情況下，確認(rèn)到血氧分壓從MSC 懸浮液施予開(kāi)始后降低，明確了至少到施予結(jié)束后經(jīng)過(guò)20分鐘的時(shí)刻（施予后60分鐘） 為止血氧分壓有所降低（圖1，表1)。另一方面，作為MSC懸浮液使用含有海藻糖的乳酸林 格溶液的情況下，在施予期間（施予開(kāi)始〇?40分鐘后）和施予后（施予開(kāi)始40?60分 鐘后）的至少20分鐘內(nèi)未觀察到血氧分壓的降低（圖1，表1)。根據(jù)上述結(jié)果可知，認(rèn)為 在施予（移植）在不含海藻糖的溶液（生理鹽水或乳酸林格溶液）中懸浮了 MSC而得的制 品時(shí)發(fā)生了肺栓塞形成，而與此相對(duì)，認(rèn)為在施予（移植）在含有海藻糖的乳酸林格溶液中 懸浮了 MSC而得的制品時(shí)，肺栓塞形成得以預(yù)防。
[0072]表1
[0073]

【權(quán)利要求】
1. 哺乳動(dòng)物細(xì)胞懸浮液，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞懸浮液含有哺乳動(dòng)物細(xì)胞及海藻糖或其衍 生物或它們的鹽，用于預(yù)防在經(jīng)由血管施予哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)的肺栓塞形成。
2. 如權(quán)利要求1所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞懸浮液，其中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞為哺乳動(dòng)物干細(xì)胞。
3. 如權(quán)利要求2所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞懸浮液，其中，哺乳動(dòng)物干細(xì)胞為哺乳動(dòng)物間充 質(zhì)干細(xì)胞或哺乳動(dòng)物亞全能干細(xì)胞。
4. 如權(quán)利要求1?3中任一項(xiàng)所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞懸浮液，其中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括處 于單一細(xì)胞狀態(tài)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
5. 如權(quán)利要求1?4中任一項(xiàng)所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞懸浮液，其中，海藻糖或其衍生物或 它們的鹽的濃度在〇. 1?20%的范圍內(nèi)。
6. 預(yù)防在經(jīng)由血管施予哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)的肺栓塞形成的預(yù)防劑，所述預(yù)防劑含有海藻 糖或其衍生物或它們的鹽作為有效成分。
7. 如權(quán)利要求6所述的預(yù)防劑，其中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞為哺乳動(dòng)物干細(xì)胞。
8. 如權(quán)利要求7所述的預(yù)防劑，其中，哺乳動(dòng)物干細(xì)胞為哺乳動(dòng)物間充質(zhì)干細(xì)胞或哺 乳動(dòng)物亞全能干細(xì)胞。
9. 海藻糖或其衍生物或它們的鹽用于制備預(yù)防在經(jīng)由血管施予哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)的肺 栓塞形成的預(yù)防劑中的應(yīng)用。
10. 如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞為哺乳動(dòng)物干細(xì)胞。
【文檔編號(hào)】A61P9/00GK104271735SQ201380023401
【公開(kāi)日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2013年5月2日 優(yōu)先權(quán)日:2012年5月8日
【發(fā)明者】和田圭樹(shù), 土居雅子, 菊地健志, 小林英司 申請(qǐng)人:株式會(huì)社大塚制藥工場(chǎng)